công nghệ sinh học đại cương học viện nông nghiệp các phương pháp và ứng dụng của CNSH động vật, người và y sinh

CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƢƠNG
(SH3014)
Giảng viên:
BM CNSH TV – Khoa CNSH
1
CHƢƠNG III: CÁC PHƢƠNG PHÁP VÀ ỨNG DỤNG CỦA CNSH ĐỘNG VẬT,
NGƢỜI VÀ Y SINH (8 TIẾT)
2
BM CNSH TV – Khoa CNSH
3.1. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật
3.2. Công nghệ tế bào gốc
3.3. Công nghệ nhân bản động vật
3.4. Kỹ thuật chuyển gen vào tế bào động vật
3.5. Công nghệ vacxin tái tổ hợp và sản xuất kháng
thể đơn dòng
3.6. Dự án genom ngƣời và các ứng dụng
3.7 Công nghệ hỗ trợ sinh sản
3.1 KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
(kiến thức cần nhớ)
3
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Đặc điểm của tế bào động vật
•
10-100 microns
Có hình cầu trong dung dịch
Không có thành tế bào
Màng plasma mỏng, dễ vỡ và
dễ bị biến đổi
Bề mặt tích điện âmSinh
trƣởng trên bề mặt tích điện
dƣơng ví dụ: Collagen

3.1 KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
(kiến thức cần nhớ)
4
BM CNSH TV – Khoa CNSH
•
Chu kỳ tế bào
G1 Phase:
·Tế bào bƣớc vào pha tổng hợp
hoặc
·Thoát khỏi chu kỳ tế bào để tiến
hành phân hoá (reversible or
irreversible)
·Các tế bào rất nhạy cảm để tác
động điều khiển ở thời điểm này
S Phase: Tổng hợp DNA
G2 Phase: Tế bào chuẩn bị cho
nguyên phân Mitosis
3.1 KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
5
BM CNSH TV – Khoa CNSH
3.1.1 KHÁI NIỆM
Là nuôi cấy mô, tế bào tách rời khỏi cơ thể nếu đƣợc đặt
trong môi trƣờng đảm bảo dinh dƣỡng và nhiệt độ thích hợp
thì tế bào sẽ sống và tiếp tục phân chia.
Quá trình có thể diễn ra liên tục nếu sau từng thời gian
nhất định tiến hành rửa và bổ sung dung dịch nuôi cấy mới.
Các mô, tế bào động vật hay sử dụng trong nuôi cấy: phôi
ngƣời, phôi gà, thận khỉ, phôi lợn, màng ối ngƣời…
3.1.2 PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY
• NUÔI CẤY CƠ QUAN

• NUÔI CẤY MÔ
• NUÔI CẤY TẾ BÀO
3.1 PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO
ĐỘNG VẬT
6
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Nuôi cấy cơ quan (Organ Culture): là quá trình nuôi cấy toàn bộ phôi,
cơ quan hoặc mô đƣợc cắt ra khỏi cơ thể bằng giải phẫu mẫu sống
(vivisection) hoặc ngay sau khi não dừng hoạt động .
Đặc điểm:
Kiến trúc và các chức năng sinh lý bình thƣờng đƣợc duy trì.
Các tế bào vẫn ở trạng thái phân hóa (fully differentiated).
Tốc độ sinh trƣởng chậm.
Cần mẫu tƣơi cho mỗi lần thí nghiệm.
Hạn chế khi nuôi cấy trên quy mô lớn.
Nuôi cấy mô (Tissue Culture): Nuôi cấy những mẩu cắt ra từ các mô cắt
rời
Đặc điểm:
Một số chức năng bình thƣờng có thể vẫn đƣợc duy trì.
Tổ chức ban đầu của mô bị phá huỷ.
Có thể ứng dụng cho nuôi cấy quy mô lớn
3.1 PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ
TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
10/18/2011
7
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Nuôi cấy tế bào (Cell Culture): Mô hoặc một phần của mẫu
đƣợc làm tan rã ra, chủ yếu là bằng xử lý enzyme, thành
dịch huyền phù tế bào. Nguồn nguyên liệu này đƣợc sử dụng
cho nuôi cấy đơn lớp hoặc nuôi cấy huyền phù.

Đặc điểm:
Phát triển dòng tế bào qua một số thế hệ
Có thể nuôi cấy trên qui mô lớn
Các tế bào có thể bị mất đi một số đặc tính phân hoá.
NUÔI CẤY ĐƠN LỚP
8
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Ƣu điểm:
Dễ dàng thay đổi môi trƣờng và rửa tế bào trƣớc khi bổ
sung môi trƣờng mới
Các tế bào liên kết nhau thể hiện dễ dàng hơn
Linh hoạt (Flexible) và có thể sử dụng đối vơi tất cả các
loại tế bào
Nhƣợc điểm:
Khó triển khai trên qui mô lớn
Cần nhiều không gian hơn so với nuôi cấy huyền phù
Khó định lƣợng các thông số cho mẫu để điều khiển sự
sinh trƣởng tế bào
Việc đo Oxygen và pH gặp khó khăn
Nuôi cấy các tế bào phát triển theo kiêu liên kết bám
dính (Anchorage Dependent Cultures)
9
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Đặc điểm:
- Sự nhân lên của các tế bào liên kết bám dính chỉ có thể xảy
ra khi tạo đƣợc bề mặt nuôi cấy phù hợp.
- Quá trình liên kết của các tế bào liên quan một loạt các
bƣớc:
• Sự bám của các yếu tố dinh kết với bề mặt nuôi cấy (Cold insoluble
globulin or other attachment glycoproteins)

• Sự liên kết giữa tế bào với bề mặt nuôi cấy
• Sự dính kết các tế bào với bề mặt đƣợc bao phủ. (các chất heparan
sulfate đa dạng được tổng hợp bởi tế bào )
• Sự phát triển lan rộng của các tế bào đã liên kết
- Bề mặt nuôi cấy phải có tính hút nƣớc và đƣợc tích điện tối
ƣu trƣớc khi qúa trình dính kết xảy ra.
NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO
10
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Đặc điểm:
Có khả năng sinh trƣởng và phân hoá mà không cần quá trình gắn
kết các tế bào với nhau.
Có thể sử dụng các thiết bị nuôi cấy trên qui mô lớn Spinner
Flasks, Stirred-Tank Bioreactors, Air lift Bioreactors
Phƣơng pháp nuôi cấy
11
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Một số khái niệm dòng tế bào
10/18/2011
12
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Dòng tế bào (Cell Lines) – là thuật ngữ dùng để chỉ một
quần thể tế bào giống hệt nhau bắt nguồn từ một tế bào ban
đầu
Dòng tế bào liên tục (Continuous Cell Lines) –là dòng tế
bào nuôi cấy trong điều kiện in vitro qua nhiều thế hệ và có
khả năng duy trì khả năng phân bào trong thời gian rất dài
hoặc vĩnh viễn mà không thay đổi đặc tính.
Sự sinh trƣởng của tế bào nuôi cấy
13

BM CNSH TV – Khoa CNSH
14
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Một số dụng cụ sử dụng trong nuôi cấy tế bào động vật
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
15
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Thành phần : các muối vô cơ,
dinh dƣỡng, các chất đệm
(phenol red).
Các muôí vô cơ (Na, K, Ca, Mg,
Cl, P), vi lƣợng (iron, zinc,
selenium), Đƣờng (glucose là
phổ biên nhât), Axit amin, vitamin
Huyết thanh
Kháng sinh
pH
Hầu hết tế bào sinh trƣởng tốt ở
pH 7.4 Một số fibroblasts cần pH
7.4-7.7
Các tế bào biến nạp pH 7.0-7.4
Các tế bào Epidermal đôi khi cần
pH 5.5
Sử dụng chỉ thị Phenol Red
– Có mầu tím ở pH 7.8
– Mầu hồng ở pH 7.6
– Mầu đỏ ở pH 7.4
– Da cam ở pH 7.0
– Vàng ở pH 6.5
Ví dụ về

nuôi cấy
mô não
chuột
ỨNG DỤNG CỦA NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
17
BM CNSH TV – Khoa CNSH
• Mô hình thử nghiệm và chẩn đoán bệnh
• Sản xuất các hợp chất sinh học
+ Vacxin virus
+ Hoạt chất sinh học
+ Interferon
+ Kháng thể đơn dòng
• Tạo các nguyên liệu cấy ghép
• Tạo cơ quan từ tế bào động vật nuôi cấy
• Sản xuất các virus diệt côn trùng
+Bacolovirus
3.2 CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GỐC
18
BM CNSH TV – Khoa CNSH
3.2.1 KHÁI NIỆM
Là các tế bào có khả năng phân chia liên tục trong nuôi cấy và phát
triển thành các tế bào chuyên hoá.
3.2.2 ĐẶC TRƢNG CƠ BẢN CỦA TẾ BÀO GỐC
– có khả năng tự tái tạo mới
– có thể biệt hoá thành những tế bào và tổ chức chuyên biệt đảm
nhiệm những chức năng đặc biệt.
– có thể phân lập và duy trì đƣợc ở trạng thái chƣa bịêt hoá.
– có thể tăng sinh và biệt hoá khi đƣợc chuyển vào động vật có hệ
thống miễn dịch đã bị tổn thƣơng.
PHÂN LOẠI TẾ BÀO GỐC (Theo tiềm năng biệt hóa)

19
BM CNSH TV – Khoa CNSH
•
2
các TB phôi ở giai
đoạn tiếp sau giai
đoạn nêu trên (nút
phôi và dưỡng
phôi). Phân hóa
thành các TB vài
tiềm năng
3
TB có khả năng
phân hóa thành một
loại hay một họ các
TB chuyên hóa xác
định
TB đa tiềm năng
TB toàn năng
TB vài tiềm năng
(TB mầm)
1
Tế bào hợp tử và
các tế bào phôi ở
giai đoạn 4-8 tế
bào.
Có thể phát triển
thành cơ thể hoàn
chỉnh
Day 1

Fertilized egg
Day 3-4
Multi-cell embryo
Day 5-6
Blastocyst
Day 11-14
Tissue Differentiation
PHÂN LOẠI TẾ BÀO GỐC (Theo nguồn gốc)
21
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Tế bào gốc phôi (Embryogenic Stem Cells)
Tế bào gốc trƣởng thành (Adult/Mature Stem
Cells)
ĐẶC ĐiỂM CỦA ASC VÀ ESC
22
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Tế bào gốc trƣởng thành Tế bào gốc của phôi/ bào thai
có mặt trong nhiều tổ chức của cơ thể
mặc dù với một số lƣợng rất ít.
mature body tissues, umbilical cord,
placenta
chỉ có ở một số vị trí, trong một số tổ
chức nhất định của phôi, phôi nang và
bào thai
có khả năng biệt hoá thấp hơn và chỉ
sản xuất ra những tế bào đặc hiệu
cho loại tổ chức cội nguồn của
chúng.
có thể tạo nên những cụm tế bào có
thể biệt hoá tự nhiên tạo ra nhiều

loại tế bào (toàn năng, đa năng).
Đƣợc phân lần đầu năm 1960s Phân lập lần đầu năm 1998
Đã áp dụng trị liệu thành công trên
bệnh nhân
Chỉ nên áp dụng trên động vật
TẾ BÀO GỐC PHÔI
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Có hai loại:
* Tế bào gốc bào thai (ES embryonic stem cell) lấy từ khối tế
bào nội phôi
* Tế bào mầm bào thai(EG embryonic germ cell) lấy từ rãnh
sinh dục của bào thai
ES phân chia 300-450 lần/2 năm
EG 40-80 lần /2năm
NGUỒN CUNG CẤP TẾ BÀO GỐC PHÔI
BM CNSH TV – Khoa CNSH
phôi thụ tinh in vitro
phôi nạo
NGUỒN CUNG CẤP TẾ BÀO GỐC PHÔI
BM CNSH TV – Khoa CNSH
chuyển nhân soma