luận văn công nghệ sinh học Thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu Artemisinin

Khoá luận tốt nghiệp
LỜI MỞ ĐẦU
Việc nghiên cứu, sử dụng các hợp chất thiên nhiên làm thuốc để chữa
trị các bệnh của con người đang là hướng thu hút sự tập trung của các nhà
khoa học, đặc biệt là các nhà hoá học hữu cơ và các nhà hoá học các hợp chất
thiên nhiên. Nhờ những nghiên cứu này mà một loạt các thuốc có nguồn gốc
từ thảo dược đã và đang được sử dụng rộng rãi trong y dược. Điểm thuận lợi
của các hợp chất này là Ýt độc, dễ hoà hợp với người và nguồn cung cấp
chúng thường rất phong phú với việc gây trồng có thể thực hiện được dễ
dàng.
Artemisinin, mét sesquiterpen có trong cây Artemisia annua hay còn
gọi là thanh hao hoa vàng có hoạt tính kháng sốt rét rất mạnh, hợp chất này đã
được các nhà nghiên cứu Trung Quốc phân lập từ những năm 70. Gần đây,
các nhà khoa học Mỹ còn nhận thấy, hợp chất này có khả năng tiêu diệt các tế
bào ung thư vú và bạch cầu. Do vậy, việc phân lập, xác định cấu trúc và
nghiên cứu hoạt tính chống sốt rét và chống ung thư của hợp chất này góp
phần làm sáng tỏ phần động của hoá học các hợp chất thiên nhiên đó là môi
tương quan giữa hoạt tính sinh học và cấu trúc của hợp chất hữu cơ.
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001
Khoá luận tốt nghiệp
PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ TERPEN.
1.1.1. Định nghĩa terpen và sự phân bố trong tự nhiên.
Khái niệm terpen được dùng để chỉ một lớp hợp chất thiên nhiên mà
cấu trúc có thể phân chia ra thành các đơn vị isopren [1]. Theo qui tắc isopren
mà người ta phân biệt ra các monoterpen C
10
, sesquiterpen C
15
, diterpen
C

20
,sesterterpen C
25
, triterpen C
30
, tetraterpen C
40
, và polyterpen. Các terpen
này có thể có cấu tạo mạch hở, hoặc một, hai, ba, bốn, năm vòng; các vòng có
thể có từ ba đến mười bốn mắt vòng.
Thông thường ở các mono-, sesqui-, di- và sesterterpen, các đơn vị isopren
nối với nhau theo cách đầu nối với đuôi. Các triterpen và nhiều tetraterpen
(các carotenoid) thì hợp bởi hai mảnh C
15
hoặc C
20
nối với nhau ở giữa theo
cách đầu nối với đầu. Tính đồng nhất về mặt cấu trúc đó được thể hiện trong
các thí dụ sau:
CH
2
OH
O

OH
Monoterpen Farnesol (Sesquiterpen)
OH
O
HO H

CH
2
OH
Quinon-methin (Diterpen) Ceroplastol-1 (Sesterterpen)
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001
Khoá luận tốt nghiệp
HO

Lanosterol (Triterpen)
Hình 1: Sự đồng nhất về cấu trúc của các terpen.
Bên cạnh thuật ngữ “terpen” ta còn dùng khái niệm “terpenoid” [2] để
bao hàm rộng rãi cả các sản phẩm thoái biến tự nhiên, thí dụ các ionon, và các
dẫn xuất tự nhiên cũng như tổng hợp của các terpen, thí dụ như các terpen-
ancol, -andehit, -xeton, -axit, -este, -epoxit, v.v Tuy nhiên trong khi sử dụng
thường không có sự phân ranh giới thật rõ rệt giữa các khái niệm “terpen” và
“terpenoid” như vừa nêu. Thuật ngữ “terpen” nhiều khi được dùng để bao
hàm cả các terpen-hidrocacbon lẫn các dẫn xuất của chúng.
Các terpen phân bố rộng rãi trong tự nhiên, xuất hiện trong tất cả các
loài sinh vật nhất là trong giới thực vật bậc cao. Mỗi loài cây riêng biệt
thường có chứa những thành phần terpen đặc trưng vì vậy việc xác định thành
phần các terpen trong cây có thể góp phần vào phân loại thực vật
(Chemotaxonomie). Các mono- và sesquiterpen xuất hiện chủ yếu trong các
tinh dầu; sesqui-, di- và triterpen có trong các dầu nhựa và nhựa; tetraterpen
trong các chất màu thực vật (các carotenoid) và các polyterpen có trong nhựa
mủ cây.
1.1.2. Cấu trúc của terpen
Các terpen được cấu tạo từ các đơn phân là
isopren CH
2
= C – CH = CH

2


CH
3
Các terpen được phân chia ra làm nhiều loại, song chúng tôi chỉ giới
thiệu monoterpen và đi sâu vào nghiên cứu các sesquiterpen.
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001
Khoá luận tốt nghiệp
1.1.2.1. Monoterpen
Phần lớn các monoterpen xuất hiện trong thiên nhiên, nhất là các hợp
chất chứa oxi, có mùi dễ chịu, và vì vậy ngoài việc lấy ra từ nguồn thiên nhiên
chúng còn được tổng hợp với lượng lớn để dùng trong công nghiệp hương
liệu [3].
Trong số các monoterpen không vòng gồm ocimen, myrcen và
alloocimen thì myrcen tồn tại dưới hai đồng phân, còn mỗi hydrocacbon kia
thì đều tồn tại dưới bốn đồng phân.

α-myrcen β-myrcen cis-α-ocimen trans-α-ocimen cis-β-ocimen trans-β-ocimen
Ngoài ra các monoterpen còn chứa các nhóm chức ancol, aldehit, với
các bộ khung khác nhau.

H
H
3
C CH
3
CH
3
CH

2
OH

CH=O
H
3
C CH
3
CH
3
H

CH=O
H
3
C CH
3
CH
3
Geraniol Neral Citronellal
Trong khoảng ba chục năm trở lại đây người ta tìm thấy trong các cây
thuộc họ Compositae một sè monoterpen có khung cacbon được cấu tạo
không tuân theo qui tắc isopren [4]. Đó là các monoterpen mạch không vòng
thuộc các kiểu khung artemisyl, santolinyl, lavandulyl cùng với một vài
monoterpen đơn vòng thuộc khung chrysanthemyl. Về mặt nguồn gốc sinh
học, người ta cho rằng các monoterpen không vòng có cấu tạo bất bình
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001
Khoá luận tốt nghiệp
thường đó được hình thành từ một tiền chất, tiền chất này được giả định là
chrysanthemyl pyrophosphat thông qua sự chuyển vị của ion

cyclopropylcarbinyl.
Các kiểu khung:

artemisyl santolinyl lavandulyl chrysanthemyl
Ngoài ra, đáng chú ý là các monoterpen một vòng [3]. Phần lớn các
monoterpen một vòng có khung 1-metyl-4-isopropyl-xiclohexan, còn được
gọi là khung “p-menthan”. Về phương diện cấu dạng ta có thể coi các
monoterpen một vòng này là các dẫn xuất thế hai lần của xiclohexan, ở đó
nhóm isopropyl, do chiếm khoảng không gian lớn hơn nhóm metyl, nên
chiếm vị trí equatorial. Các nguyên tử cacbon của khung p-menthan được
đánh số theo qui tắc chung của danh pháp hoá học.
1
2
3
4
5
6
7
Các nhóm chức tiêu biểu thường xuất hiện trong monoterpen một vòng
Nhóm alcohol: ví dô α-terpineol, menthol, piperitol và carveol
Nhóm aldehit: ví dô perillaldehit, phellandral
Nhóm xeton: ví dô menthon, pulegon, piperiton, carvon.
Nhóm oxit: ví dô 1,8-cineole, ascaridole.
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001
Khoá luận tốt nghiệp
CH
3
H
3
C CH

3
OH

CH
3
H
3
C CH
3
OH

CH=O
H
3
C CH
2
CH=O
H
3
C CH
3
α-Terpineol Menthol Perillaldehit Phellandral
CH
3
H
3
C CH
3
O

CH
3
H
3
C CH
3
O
CH
3
H
3
C CH
3
O

CH
3
H
3
C CH
3
O
Menthon Pulegon 1,8-Cineole Ascaridole
Trong công nghiệp hương liệu, chất α-terpineol được sử dụng khá nhiều cùng
với este của nó - chất terpinylaxetat.terpineol có trong một số tinh dầu như
tinh dầu từ gỗ của một số loại thông.
Ngoài ra, các monoterpen có thể chứa 2 vòng, các monoterpen 2 vòng
tiêu biểu:
CH
3

8
7
6
5
4
3
2
1
9

CH
3

(+)-cis-thujan (+)-trans-thujan β
1.1.2.2. Sesquiterpen
Các sesquiterpen thường xuất hiện trong các thực vật thượng đẳng, một
số Ýt cũng gặp trong giới thực vật hạ đẳng và trong giới động vật (như sâu
bọ). Đa số các sesquiterpen là các hidrocacbon không no (còn có cả một số
ankyl), còn lại là các alcohol, xeton,aldehit, axit cacboxylic. Ngoài ra, chúng
còn có thể có thêm vòng este từ ba đến bảy cạnh cũng như vòng furan. Ta
cũng cần kể đến các sesquiterpen được thế bởi clo hoặc brom và các hợp chất
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001
Khoá luận tốt nghiệp
nitơ có 15 nguyên tử C (các sesquiterpenancaloid). Từ một số các
sesquiterpen đã hình thành một số hợp chất với 12 hoặc 14 nguyên tử C (các
nor-sesquiterpen).
Gần đây người ta chó ý nhiều đến việc nghiên cứu các
sesquiterpenlacton, là chất phổ biến xuÊt hiện trong các cây thuộc họ cóc
(Compositae), tuy nhiên cũng có nhiều trong họ cây khác. Hợp chất đầu tiên
thuộc nhóm này được phân lập dưới dạng tinh thể là α-santonin (1930). Đến

nay, ta đã biết đến hàng trăm sesquiterpenlacton, phân ra thành các
germacranolid, guaianolid, pseudoguaianolid, Đa số các hợp chất này là các
γ-lacton no hoặc không no α, β. Bên cạnh đó cũng có một Ýt δ-lacton, và một
vài β-lacton (như anisatin, neoanisatin). Ngoài khoảng trên hai chục dilacton,
ta cũng biết đến một trilacton là chất bilabolid.
Theo Ruzicka cũng như Hendrickson thì về mặt phát sinh sinh vật học,
chất tiền thân của hầu hết các sesquiterpen là chất 2-cis-6-trans-
farnesylpyrophosphat hoặc các hợp chất 2-trans-6-trans tương ứng, hình thành
từ coenzyme A đi qua axit mevalonic, iso pentenylpyrophosphat và
geranylpyrophosphat. Đối với một số Ýt sesquiterpen, do các nguyên nhân về
hoá lập thể mà chất tiền thân có lẽ là một cấu trúc 2-trans-6-cis-farnesyl hoặc
nerolidyl. Do tách đi nhóm pyrophosphat ra khái 2-cis-6-trans-
farnesylpyrophosphat hoặc 2-trans-6-trans-farnesylpyrophosphat mà hình
thành các cacbocation, việc biểu diễn các ion này dưới dạng các cation không
kinh điển cho phép ta hình dung được sự đóng vòng để từ mỗi cation này hình
thành được hai cation dạng vòng. Từ các cation này thông qua các chuyển
dịch hidrua 1,2 hoặc 1,3 ; các phản ứng đóng vòng tiết chế bởi các hiệu ứng
điện tử và lập thể thực hiện với hai nối đôi còn lại (đóng vòng tuân theo hoặc
không tuân theo qui tắc Maccopnhicop), các chuyển vị Wagner-Meerwein và
các chuyển dịch 1,2 của các nhóm metyl mà sinh ra đa số các sesquiterpen.Ở
đây, sự tạo thành các đồng phân đối quang và các đồng phân quang học
không đối quang theo con đường phát sinh sinh học có một ý nghĩa quan
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001
Khoá luận tốt nghiệp
trọng. ở đây cũng cần nói thêm rằng nhiều giả thuyết về sự phát sinh sinh học
của các sesquiterpen còn cần được chứng minh trong cơ thể sống.
Dưới đây là một số khung sesquiterpen và một số sesquiterpen tiêu
biểu.
HO
H

3
C CH
3
CH
3
CH
3
H
3
C CH
3
CH
3
CH
3
Nerolidol Zingiberen Bisabolen
Ngoài ra còn có rất nhiều sesquiterpen một vòng khác tiêu biểu là Zingiberen
và Bisabolan, xuất hiện khá đông đảo và phổ biến trong thiên nhiên.
H
HOH
2
C
HO
O
O
H
H

H
H

H
H
Iresin ε-bulgaren γ-amorphen α-muurolen
Ta cũng cần kể đến một nhóm riêng các hợp chất khung cadinan có
quan hệ với nhóm trên theo kiểu đối quang, nhóm chất này xuất hiện chủ yếu
trong tinh dầu Hương lau của miền Bắc Ên độ. Đại diện cho nhóm chất này là
(-)-γ
2
-cadinen và chất norsesquiterpenoid khusiton
H
H
O
H
H

γ
2
-cadinen khusiton
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001
Khoá luận tốt nghiệp
Nhóm này có rất nhiều trong những tinh dầu có màu xanh hoặc tím
hoặc tạo nên những màu như thế sau khi khử hidro với sulfur, selenium hoặc
palladium.
Cấu trúc của α- và β-vetivon được xem như là các hydroazulenon.
Dưới đây là một số chất tiêu biểu cho nhóm.
7
2
6
4

3
5
8
1

O
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
H

O
H
3
C
H
3
C
H
3
C
H
3

C

Azulen Hydroazulenon β-vetivon
Ngoài ra còn một số sesquiterpen có cấu trúc lớn và phức tạp như
caryophyllen.
H
3
C
CH
3
H
CH
3
H
Caryophyllen
Trong nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc của các hợp chất theo sự
định hướng hoạt tính sinh học, lớp sesquiterpen thường có hoạt tính cao, đặc
biệt là các hoạt tính kháng nấm, khuẩn, hoạt tính kháng viêm, chống oxi hoá
và chống ung thư. Việc nghiên cứu các sesquiterpen trong thực vật giúp
chúng ta hiểu rõ mối tương quan giữa hoạt tính và cấu trúc cũng như sự định
hướng nghiên cứu được rõ ràng hơn.
1.2. HOẠT TÍNH CHỐNG SỐT RÉT CỦA CÁC HỢP CHẤT THIÊN
NHIÊN
Các thử nghiệm in vitro [6] trở thành phương pháp có thể dùng được
trong những năm gần đây. Xa hơn nữa, từ những năm 1947, 600 thực vật từ
126 loài đã được chiết và dịch chiết đã được thử nghiệm hoạt tính in vitro
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001
Khoá luận tốt nghiệp
chống lại bệnh sốt rét của loài chim. Một số cây từ hơn 30 loại đã được tìm
thấy có một số hoạt tính này, nhưng sự ngoại suy với hoạt tính kháng sốt rét

đối với các kÝ sinh trùng sốt rét của người thì vẫn không chắc chắn. Sự tiếp
tục nuôi cấy in vitro các ký sinh trùng sốt rét người Plasmodium falciparum
đã dẫn đến một kĩ thuật cho việc đánh giá định tính về hoạt tính kháng các kÝ
sinh trùng này. Sự tiếp tục phát triển của kĩ thuật này rất tin cậy dựa vào việc
đo khả năng ức chế sự hợp nhất của
3
H-hypoxanthin vào trong trùng sốt rét.
Kĩ thuật này được ứng dụng dễ đánh giá hoạt tính của các dịch thô (etanol)
của Artermisia annua và A.vulgaris (cây ngải cứu). Thử nghiệm in vitro này
tách bạch giữa hai loại dịch chiết với giá trị IC
50
lần lượt là 3.9 µl/ml và 250
µl/ml. Artermisia annua được sử dụng trong việc điều trị bệnh sốt rét truyền
thống của Trung Quốc và chất thể hiện hoạt tính là artemisinin
(1)
mà chất này
không có trong A.vulgaris.
Điều đáng chú ý rằng hoạt tính chống sốt rét in vitro không song song
với việc thể hiện độc tính chống lại các tế bào KB (human epidernoid
carcinomax of the mouth). Bởi vậy một chất có hoạt tính gấp nhiều lần chất
kia trong việc thử nghiệm chống sốt rét nhưng lại có thể độc gấp 10 lần đối
với các tế bào KB.
1.2.1. Các phương pháp thử hoạt tính sinh học được dùng cho sự phát
hiện thuốc có khả năng chống sốt rét.
1.2.1.1. Sàng lọc in vitro
Thông thường hai dòng P.falciparum được dùng để nghiên cứu, một
dòng nhạy đối với chloroquin như 3D7 và một dòng chống lại chloroquin như
Dd2. Các hồng cầu ngoại biên của máu người được sử dụng trong các nghiên
cứu sàng lọc in vitro. Các kÝ sinh trùng được thêm vào hồng cầu và nuôi cấy
ở 37

o
C trong khí quyển bao gồm 2% O
2
, 5%CO
2
và 93% N
2
[7]. Ảnh hưởng
của dịch chiết thực vật hoặc các phân đoạn dịch chiết lên sự phát triển của
P.falciparum được thử bằng việc thêm 50 µl dung dịch mẫu thử vào 50 µl
hồng cầu đã được thêm kÝ sinh (5*10
8
tế bào/ml với một lượng trung bình
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001
Khoá luận tốt nghiệp
kÝ sinh trùng xấp xỉ 1%). Điều quan trọng là giữ nồng độ của dung môi đã sử
dụng để hoà tan dịch chiết thực vật thấp (điển hình là dưới 5%) nếu như dung
môi hữu cơ được sử dụng là DMSO (dimetylsulfoxit). Các kÝ sinh trùng
được phát triển rất tốt trong đĩa nuôi cấy đặc chủng. Sau đó, sự nuôi cấy được
ủ Êm 24h; 0,8 µCi của
3
H-hypoxanthin hoặc amino axit đã đánh dấu phóng xạ
chẳng hạn như phenylalanin được thêm vào và việc nuôi cấy được tiến hành
thêm 24h nữa. Sau khi việc nuôi cấy kết thúc, một khối lượng chất trao đổi đã
đánh dấu phóng xạ đã được mang trên các kÝ sinh trùng, ta tiến hành đếm
chúng. Một sự hấp thụ nhỏ hơn trong các kÝ sinh trùng đã ủ Êm với các mẫu
thử được quan sát cùng với các mẫu so sánh để đưa ra một số đo về khả năng
ức chế sự phát triển của các kÝ sinh trùng [8]. Phương pháp khác có thể dùng
để đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của các kÝ sinh trùng là đo phổ
hoạt tính dehidro hoá lactat của các kÝ sinh trùng. Phép thử này sử dụng sự

chuyển hoá các tetrazolium nitro xanh thành fomazan.
Một sù thay thế khác cũng thường được sử dụng để xác định khả năng
ức chế sự phát triển của kÝ sinh trùng là việc đếm các kÝ sinh trùng bằng
kính hiển vi. Các đốm bẩn mỏng của nuôi cấy kÝ sinh trùng nhận được sau
khi ủ Êm với các nồng độ dịch chất khác nhau hoặc các mẫu thử khác nhau
được nhuộm màu với Giemsa và kÝ sinh trùng được xác định như là phần
trăm của hồng cầu bị nhiễm.
Để thử hoạt tính của các mẫu thử trên các giai đoạn khác nhau của
hồng cầu, sự nuôi cấy xảy ra đồng thời đối với giai đoạn mới tạo vòng do
phân giải sorbitol. Các hồng cầu có kÝ sinh trùng được li tâm và viên rắn
được tạo huyền phù lại trong dung dịch D-sorbitol 5% trong 5 phút. Chúng
được phân lập bằng việc li tâm và thêm các hồng cầu vào trong các môi
trường nuôi cấy trong đó tối thiểu 90% các kÝ sinh trùng có cùng giai đoạn
phát triển. Sau đó có thể tiến hành thử các mẫu chống lại các giai đoạn hồng
cầu khác nhau của các kÝ sinh trùng bằng cách thêm chúng vào quá trình
nuôi cấy tại thời điểm thích hợp.
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001
Khoá luận tốt nghiệp
Sự chọn lọc của các phép thử sốt rét
Điều đặc biệt quan trọng cần biết khi tiến hành thử nghiệm là phương
pháp in vitro chỉ thể hiện kết quả nếu một hợp chất đã cho ức chế sự phát
triển của kÝ sinh trùng và nó không cho biết hợp chất này có độc hay không
nếu như hợp chất thử giết chết tất cả các tế bào bao gồm cả các tế bào chủ [9].
Để minh chứng cho vấn đề này một loạt các phép thử có hệ thống phải được
khảo sát. Điều thường xuyên gặp phải trong khi thử các hợp chất có khả năng
chống sốt rét là các hợp chất này lại thể hiện khả năng nghèo nàn trong việc
ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư (các tế bào KB). Một hợp chất có
khả năng ngăn ngừa cao sự phát triển của các kÝ sinh trùng trong in vitro
nhưng lại không ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư cũng nên được
quan tâm cho các nghiên cứu tiếp theo. Và sự phát triển một qui trình cho việc

kích thích các bạch cầu vôi phytobraemagglutinin được xuất hiện.
Một phép thử in vitro cho phép sàng lọc các hợp chất chống lại một
dạng tế bào thuộc hệ miễn dịch. Điều thuận lợi của protocol này là nó sẽ thể
hiện kết quả nếu hợp chất thử có khả năng ức chế hệ thống miễn dịch và hợp
chất này sẽ không được phép làm thành thuốc để chữa trị các bệnh viêm
nhiễm như là bệnh nhiễm kÝ sinh trùng.
1.2.1.2. Các mô hình Sàng lọc in vitro
a. Mô hình chuột
Các kÝ sinh trùng sử dụng.
Các loài khác nhau của kÝ sinh trùng Plasmodium được sử dụng trong các
thử nghiệm này. Các kÝ sinh trùng được sử dụng phổ biến nhất là P.berghei
K173, P.yoelii YM, P.chabaudi và P.vinckei, các dòng này gây bệnh với chuột
và giết chết các động vật bị nhiễm mà không được xử lý trong vòng từ 7-12
ngày. Trong các thử nghiệm như vậy các loài chuột khác nhau cũng được
dùng để nghiên cứu.
* Phép thử 4 ngày với chuột nhắt
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001
Khoá luận tốt nghiệp
Là phép thử phổ biến nhất, các động vật được tiêm chủng bằng đường
ven với 10
6
hồng cầu nhiễm kÝ sinh trùng đã được tạo huyền phù trong
10
2
ml. Mẫu thử có thể được điều trị bằng đường tiêm ven hay đường uống đối
với chuột. Sự điều trị đầu tiên thường được bắt đầu 3 giê sau khi nhiễm và
việc điều trị có thể được tiến hành từ 3-5 ngày phụ thuộc vào tác dụng của
mẫu thử và nửa thời gian sống (tồn tại) trong thực vật của các hợp chất hoạt
động. Các con chuột đối chứng (so sánh) cho uống nước muối bình thường.
Chloroquin hoặc các thuốc khác có thể được dùng làm chất so sánh chuẩn.

Ngày thứ tư kể từ khi nhiễm, các vết bẩn mỏng được lấy từ đuôi chuột dùng
để xác định hàm lượng kÝ sinh trùng. Số chuột tử vong được xác định đến 28
ngày kể từ lần điều trị cuối cùng [10].
Để xác định hiệu lực của thuốc trong quá trình điều trị, máu từ chuột đã
điều trị được rót ra 28 ngày sau khi điều trị và được tiêm bằng đường ven vào
trong chuột mới. Hàm lượng kÝ sinh trùng và sự sống sót của chúng trong
động vật được xác định, việc không phát hiện thấy kÝ sinh trùng trong máu
14 ngày sau khi nhiễm chứng tỏ tác dụng chữa bệnh của hợp chất thử.
* Mô hình chuột cống
Các con chuột cống đã được gây nhiễm với 10
7
hồng cầu đã nhiễm kÝ
sinh trùng với dòng kÝ sinh trùng P.berghei được sử dụng. Mặt khác, các
thực nghiệm được tiến hành như đã mô tả ở phần trên đối với chuột nhắt.
Điều không thuận lợi ở các mô hình chuột.
Các chuyển hoá thuốc trong các động vật này khác với người và trong
chúng có hoạt tính huyết thanh giải độc cao. Sinh học của các loài kÝ sinh
trùng được thử trong các mô hình này là khác với sinh học của loài kÝ sinh
trùng ở người , ví dụ không có sự hình thành hypnozoid trong bất kì kÝ sinh
trùng của chuột nào. Độ mẫn cảm của kÝ sinh trùng của chuột khác với
người. Cuối cùng sự ảnh hưởng lẫn nhau giữa thuốc và hệ thống miễn dịch
chủ trong hệ thống của chuột cũng khác với người.
b. Mô hình khỉ
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001
Khoá luận tốt nghiệp
Các động vật có tay như các loài khỉ Aotus Lemurinus và Saimiri spp
nói chung thường được dùng để thử nghiệm hiệu lực chống sốt rét in vitro của
các thuốc có khả năng kháng kÝ sinh trùng sốt rét [11], các thử nghiệm cho
thấy chúng chống lại sự nhiễm kÝ sinh trùng P.falciparum. Giá cả chi phí
cũng như khả năng sẵn có của các loài khỉ làm cho mô hình này chỉ sử dụng

có giới hạn đối với các loại thuốc tiềm Èn những khả năng chữa bệnh tiềm
tàng trong mô hình murine.
Động vật có tay không phải là người như loài Macaques cũng được
dùng để thử nghiệm thuốc lại chống kÝ sinh trùng của người (P.vivax). Trong
mô hình này. P.knowlesi và P.cynomolgi được dùng để gây nhiễm các động
vật. Các kÝ sinh trùng này rất gần với kÝ sinh trùng P.vivax của người. Các
mô hình này thuận lợi ở chỗ, chúng được dùng để thử nghiệm các thuốc
chống lại các kÝ sinh trùng của người P.vivax. Khi lượng kÝ sinh trùng đạt
tới 1%, các con khỉ đã gây nhiễm được điều trị với hợp chất thử có thể bằng
đường tiêm ven hoặc đường uống. Lượng kÝ sinh trùng được xác định hàng
ngày bởi các đốm dày và bất kì khi nào nếu thấy cần thiết thì xác định bằng
PCR để nhận dạng DNA của các kÝ sinh trùng. Các hợp chất sẽ được thử tại
các điểm có hàm lượng kÝ sinh trùng cao nếu như chúng thể hiện tác dụng tốt
tại thời điểm hàm lượng kÝ sinh trùng 1%.
1.3. GIỚI THIỆU VỀ CÂY ARTEMISIA ANNUA
Artemisia annua còn gọi là cây ngải hoa vàng, hoàng hoa hao, thanh
hao thuộc họ cúc Asteraceae [12]. Đây là cây thảo, mọc hàng năm, thơm, cao
đến 1m, thân có rãnh và gần như không có lông. Lá có phiến xoan, 2-3 lần
kép thành đoạn hẹp , nhọn, không lông. Chuỳ cao ở ngọn mang chùm dài,
hẹp, hoa đầu cao 1,8-2mm, lá bắc ngoài hẹp có lông xanh, lá bắc giữa và lá
bắc trong xoan rộng, hoa hình ống cỡ 15 cái, hoa ngoài cái, hoa trong lưỡng
tính. Quả bé nhẵn, cao 0,5mm, không có mào lông. Hoa xuất hiện từ 6-11, có
quả từ tháng 10-3 và thường lụi vào tháng năm. Artemisia annua phân bố ở
Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên, Ên Độ, Việt Nam. Ở nước ta, cây mọc
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001
Khoá luận tốt nghiệp
hoang dại ở ruộng, bờ ruộng, dọc theo các làng mạc vùng núi Lạng Sơn,
Quảng Ninh. Hiện nay, chóng ta đã gây trồng và tạo được giống tốt, cho năng
suất cao.
Thành phần hoá học của Artemisia annua gồm artemisinin và tinh dầu,

chủ yếu là artermisia keton, pinene, cineol và L-campho. Từ lâu, Artemisia
annua được dùng để chữa sốt, nóng, khát nước, phiền nhiệt ra mồ hôi, tối
nóng sáng mát, thận có chứng lao nhiệt, sốt rét cơn, bệnh vàng da và các bệnh
ngoài da. Từ lâu ngải hoa vàng cùng các chiết xuất của nó đã được dùng để
chữa bệnh sốt rét, với thành phần có hoạt tính chống sốt rét mạnh là
artemisinin. Ngày nay, chóng ta đã chọn được giống cây này cho năng suất
artemisinin cao (từ 3,5-5 kg/tấn) và có thể trồng được ở nhiều nơi trên đất
nước.
1.3.1. Artemisinin và hoạt tính kháng sốt rét.
Artemisinin là hoạt chất chính của cây ngải hoa vàng [13]. Vào thập kỉ
70, các nhà khoa học Trung Quốc là những người đầu tiên đã chiết suất thành
công artemisinin trong cây này để làm thuốc chống sốt rét, một căn bệnh cướp
đi hàng triệu sinh mạng mỗi năm, chủ yếu ở các nước nghèo Châu Á, Châu
Phi.
Thập kỉ 90, các nhà khoa học Việt Nam và công ty dược liệu Trung
Ương I đã trồng hàng trăm hecta cây thanh hao hoa vàng, chiết suất hàng tấn
artemisinin với hiệu suất cao và bán tổng hợp các loại thuốc chống sốt rét từ
artemisinin như artesunat, artemether, arteeter. Các nhà khoa khọc cũng đã
sản xuất ra hàng triệu liều thuốc chống sốt rét cung cấp cho các nhu cầu trong
nước và xuất khẩu, thu về hàng triệu dola Mỹ mỗi năm. Đầu thế kỉ 21, cụm
công trình thanh hao hoa vàng đã được nhà nước trao giải thưởng Hồ Chí
Minh.
Artemisinin và các chế phẩm từ nó là loại thuốc tương đối an toàn. Ở
liều điều trị không độc, an toàn với phụ nữ có thai và những người suy gan,
suy thận LD = 5015 mg/kg thể trọng, điều này cho thấy artemisinin và các
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001
Khoá luận tốt nghiệp
dẫn xuất từ nó an toàn cho người sử dụng. Gần đây các nhà khoa học Mỹ đã
phát hiện ra khả năng chữa ung thư của artemisinin. Đây có thể được coi là
một trong những thành công có giá trị mang lại hy vọng lớn lao cho người

bệnh bởi tính sẵn có, dễ phân lập của artemisinin từ Artemisia annua. Các
nghiên cứu thuộc trường đại học Washington đã thử nghiệm trên động vật về
khả năng chữa trị ung thư vú và ung thu bạch cầu. Kết quả thật bất ngờ, với
ung thư vú, sau khi dùng artemisinin 8 giờ thì 75% tế bào ung thư bị tiêu diệt
mà không có bất kì di chứng nào đối với các tế bào bình thường. Tương tự
vậy, các thử nghiệm với bệnh bạch cầu cũng đã chỉ ra rằng, artemisinin chỉ
tiêu diệt các tế bào bị bệnh.
1.3.2. Cơ chế tác dụng của artemisinin
Đối với các kÝ sinh trùng (KST) sốt rét thể vô tính trong hồng cầu.
Đây là giai đoạn KST sốt rét huỷ diệt hồng cầu rất nhanh, gây phản ứng rét
run ở người bệnh. Khi có mặt artemisinin, cầu “peroxit nội” của phân tử
artemisinin kết hợp với sắt, tạo ra gốc tự do. Gốc tự do mới hình thành có tác
dụng mạnh, huỷ diệt protit và lipit của KST sốt rét. Điều đáng nói là gốc tự do
này chỉ tác động đến protit, lipit của KST sốt rét mà không hề tác động đến
protit và lipit của người.
Về khả năng tiêu diệt tế bào ung thư của artemisinin, các tác giả cho
rằng, tế bào ung thư có chứa hàm lượng sắt cao cả trên bề mặt và trong tế bào.
Như đã trình bày ở trên, cầu “peroxit nội” của artemisinin rất dễ phản ứng với
sắt để tạo ra các gốc tự do phá huỷ protit và lipit của tế bào ung thư. Trong
điều tri ung thư vú, các nhà khoa học phát hiện thấy artemisinin kết hợp với
một muối sắt (sắt sulfat hoặc sắt citrat) để tiêu diệt tế bào ung thư mà không
độc với tế bào lành. Chỉ cần uống hoặc tiêm dẫn xuất của artemisinin và phối
hợp với một muối sắt sẽ tạo ra được hiệu lực điều trị các loại ung thư.
Artemisinin là hoá trị liệu rẻ tiền, dễ kiếm, Ýt độc, dung nạp tốt, có tác
dụng chống ung thư và di căn. Hiện nay, điều trị ung thư vú thường được tiến
hành bằng phẫu thuật rồi xạ trị, kết hợp với hoá trị liệu (phần lớn là các độc
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001
Khoá luận tốt nghiệp
dược bảng A gồm các loại C.M.F hay cyclophosphamid-methotrexate-5,
flusro uracib tamoxifen) và các liệu pháp miễn dịch. Ở nước ta, các loại thuốc

này phải nhập ngoại rất đắt tiền. Người bệnh nghèo không có đủ tiền để mua
đành chờ chết. Để thực hiện chính sách y dược học cổ truyền đến năm 2010
của Chính phủ, các nhà khoa học và ngành y tế đang quan tâm đến việc
nghiên cứu, sử dụng artemisinin và các dẫn xuất của nó để điều trị ung thư
ngoài việc chữa trị các bệnh sốt rét. Điều này thành công sẽ mở ra khả năng
tiềm tàng về việc sử dụng các chất có nguồn gốc thiên nhiên, đặc biệt là các
cây thuốc bản địa của Việt Nam để chữa trị các bệnh nan y với đặc tính ưu
việt sẵn có, rẻ tiền hơn nhiều so với các loại hoá trị liệu chữa ung thư hiện
dùng.
1.3.3. Sinh tổng hợp artemisinin trong Artemisia annua
Mặc dù con đường sinh tổng hợp hoàn toàn artemisinin và một vài tiền
chất của nó đến nay vẫn chưa được thiết lập hoàn toàn [14,15], tuy vậy một
vài bước biến đổi sinh học cũng đã được minh chứng ở dạng in vitro và in
vivo (Hình 2). Akhila và các cộng sự đã đề nghị một con đường sinh tổng hợp
hoàn toàn artemisinin từ axit mevalonic và izopentenyl pyrophosphat. Thứ tự
sinh tổng hợp do nhóm này đưa ra như sau
Farnesylpyrophosphat → khung germacrane → dihidrocostunolide →
cadinanolid → arteanuin B → artemisinin.
Tuy nhiên khi nghiên cứu thành phần hoá học của cây Artemisia annua
các nhà khoa học thấy rằng hàm lượng axit artemisinic là tiền chất của
artemisinin, điều mà Akhila và các đồng sự đã không đưa ra trong báo cáo
của mình. Một điều lý thú khác, Eiferaly và các cộng sự cho công bố axit
artemisinic là tiền chất sinh tổng hợp ra cả arteannuin B và artemisinin. Wang
và các cộng sự đã chuyển hoá axit artemisinic có gắn nguyên tử
3
H tại C
15
(nhóm metylen exocyclic) thành cả arteannuin B và artemisinin. Ngoài ra một
số tác giả khác cũng cho rằng axit dihidroartemisinic cũng là tiền chất của
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001

Khoá luận tốt nghiệp
artemisinin. Tuy vây, các sản phẩm hoặc enzym sau fanesyl pyrophosphat và
trước axit atermisinic, arteannuin B và artemisinin vẫn chưa được phân lập.
PPO
PPO

PPO
Geranyl pyrophosphat trans-FPP cis-FPP

COOH
Axit artermisinic

COOH
O
O
O
O
O
O
O
O
Axit dihidroartemisinic Artemisinin Arteannuin B
Hình 2: Các con đường sinh tổng hợp artemisinin
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001
Khoá luận tốt nghiệp
Như vậy con đường sinh tổng hợp artemisinin nói riêng và các terpen
nói chung đều xuất phát từ axit mevalonic và đặc biệt từ isopentenyl
pyrophosphat. Mỗi sự chuyển hoá trong cây đều được kiểm soát bằng một
enzym. Trong sinh tổng hợp các terpenoid thì việc nghiên cứu các enzym
đóng vòng là vô cùng quan trọng, bởi vì từ các tiền chất geranyl pyrophosphat

(GPP), fanesyl pyrophosphat (FPP) và geranyl geranyl pyrophosphat (GGP),
nhờ các enzym đóng vòng này mà sự chuyển hoá thứ cấp xảy ra và tạo ra các
sản phẩm tương ứng là các monoterpen, sesquiterpen và diterpen nhờ rất
nhiều các phản ứng electrophin nói chung mà cơ chế đã được chỉ ra. Cũng
nhờ sự định hướng này mà rất nhiều các enzym đóng vòng đã được phân lập,
nhân dòng, biểu hiện trong thực vật và các vi sinh vật. Dưới đây là hoạt động
của một số enzym đóng vòng terpen.

Vetispiradiene
Germacrene C
OPP
H
δ-cadinene
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001
Khoá luận tốt nghiệp
5-epi-aristolochene
epi-cedron
Hình 3: Hoạt động của các enzym đóng vòng sesquiterpen
Farnesyl pyrophosphat được chuyển hoá thành các sesquiterpen khác nhau
bởi các enzym đóng vòng terpen.
Trên cơ sở các tài liệu tham khảo, khoá luận xoay quanh việc nghiên cứu
phân lập, xác định cấu trúc của các chất theo định hướng hoạt tính sinh học.
Mục tiêu của khoá luận được đưa ra như sau:
- Thu hái mẫu Artemisia annua và phân lập artemisinin.
- Xác định cấu trúc của sản phẩm phân lập được bằng các phương pháp
phổ hiện đại như IR, GC-MS,
1
H-NMR,
13
C-NMR và các phổ hai chiều.

- Thử nghiệm hoạt tính chống sốt rét của artemisinin với kÝ sinh trùng
sốt rét người
Công trình được hoàn thành vói sự trợ giúp về các kết quả nghiên cứu hoạt
tính chống sốt rét của dự án Hàn - Việt "Nghiên cứu thành phần hoá học
và hoạt tính sinh học của một số thực vật Việt Nam" của Viện hoá học các
hợp chất thiên nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001
Khoá luận tốt nghiệp
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
HOÁ CHẤT DỤNG CỤ
*Các phương pháp sắc ký
- Sắc ký bản mỏng phân tích: Sử dụng bản nhôm tráng sẵn silicagel
60F
254
(Merck), dộ dày 0,2mm và bản kính tự tráng với silicagel có bột
bó của viện kiểm nghiệm.
- Sắc ký lỏng chân không, GC-MS (sắc kí khí - khối phổ)
- Sắc ký cột: Sử dụng silicagel Merck 60, cỡ hạt 100-160 mesh và
silicagel của viện kiểm nghiệm, cỡ hạt 10 mesh
*Hệ dung môi sử dụng trong luận văn
+ n-hexan dùng để chiết nguyên liệu bằng bộ chiết Shoxlet
+ Hệ dung môi chạy bản mỏng:
- Hệ 1: n-hexan-axeton 99 : 1
- Hệ 2: n-hexan-axeton 98 : 2
- Hệ 3: n-hexan-axeton 97 : 3
- Hệ 4: n-hexan-axeton 96 : 4
- Hệ 5: n-hexan-axeton 95 : 5
+ Dung môi chạy cột: Dung môi được sử dụng để chạy cột là n-hexan, n-
hexan-axeton với các tỷ lệ khác nhau. Tất cả các dung môi chạy cột đều được
làm khan, cất cột vigro’ để thu lấy dung môi sạch sử dụng cho sắc ký.

+ Phát hiện vệt chất: Đèn UV 254 nm, dung dịch Iot/KI loãng dùng để phát
hiện các sesquiterpen lacton
+ Thử nghiệm hoạt tính chống sốt rét của artemisinin: phương pháp thử hoạt
tính chống sốt rét của artemisinin được tiến hành tại phòng hoá dược, Korea
Research Institute of Biosciene and Biotechnology.
+ Thiết bị
Thiết bị thuỷ tinh
-Bình cầu 2 lít ba cổ
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001
Khoá luận tốt nghiệp
-Phễu chiết Shoxlet
-Cột sắc kí
-Bình triển khai
-Máy cất quay chân không
-Cột sắc kí lỏng chân không, cột sắc kí đẩy, bản mỏng.
Các máy đo: Máy đo điểm chảy, máy đo phổ hồng ngoại, máy phổ cộng
hưởng từ hạt nhân.
CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. THU HÁI MẪU
Lá của cây Artemisia annua trồng đại trà ở Mê Linh – Vĩnh Phúc được
thu hái vào tháng 6. Mẫu cây này được sấy ở 100
0
C trong 30 phút để diệt nấm
mốc, sau đó sấy khô ở nhiệt độ 40
0
C.
2.2. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT HỒI LƯU NÓNG
0,5 kg lá cây Artemisia annua được cho vào phễu chiết Shoxlet, phễu này
được gắn trên bình cầu 2 lít được đặt vào trong bếp đun hồi lưu chuyên dụng.
Phía trên của Shoxlet được lắp sinh hàn hồi lưu hiệu lực để sự thất thoát dung

môi nhỏ nhất. Đổ vào bình cầu 2 lit khoảng 1,4 – 1,5 lit n-hexan, cho vài viên
đá bọt và bắt đầu đun hồi lưu cho đến khi dung dịch từ Shoxlet chảy xuống
bình cầu nhạt màu thì sự chiết đã hoàn thành. Ngoài ra, quá trình chiết
Artemisia annua còn được tiến hành bằng máy chiết siêu âm.
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001
Khoá luận tốt nghiệp
Hình 4: Bộ chiết siêu âm và cất quay chân không
Dung dịch chiết n-hexan được chuyển sang máy cất quay dưới áp suất
giảm để loại dung môi n-hexan, phần còn lại là dịch chiết màu xanh đen
(2,3g)
2.3. PHƯƠNG PHÁP CHẠY SẮC KÍ LỎNG CHÂN KHÔNG.
2.3.1. Chuẩn bị cột
Đổ silicagel 60 HR (EM 17744, 60 A
0
) hoặc (silicagel 60H hoặc 60G)
vào trong phễu thuỷ tinh, ổn định silicagel bằng cách gõ nhẹ vào phễu ở áp
suất thường. Bật máy chân không và Ðp chặt cứng lớp silicagel bằng nút cao
su và vừa nén vừa gõ. Sau khi đã chặt cứng, lớp silicagel đã đồng nhất thì tắt
máy chân không. Đổ dung môi phân cực cho chạy qua cột và bật máy chân
không để kiểm tra độ đồng nhất của cột. Nếu cột không đồng nhất, việc nhồi
cột cần phải được thực hiện lại, khi cột đã đồng nhất, hút khô bằng máy chân
không để loại bỏ hết dung môi phân cực. Hỗn hợp terpenoid trong dung môi
Ýt phân cực nhất mà trong đó dịch chiết hoặc hỗn hợp có thể bị hoà tan được
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001
Khoá luận tốt nghiệp
đưa cẩn thận lên trên bề mặt của cột. Tiếp theo sau, lượng dung môi dùng đủ
để bao phủ hoàn toàn trên bề mặt của chất hấp phụ. Chân không được sử dụng
nhẹ nhàng để hút mẫu vào trong cột. Ngoài ra để đưa mẫu lên cột, mẫu chiÕt
còn được trộn đều với một lượng nhỏ chất hấp phụ khác như Al
2

O
3
, SiO
2
hoặc celite trước khi đưa lên cột.
2.3.2. Tiến hành chạy sắc kí lỏng chân không
Lượng dung môi sử dụng cho mỗi phân đoạn được tính toán theo thể
tích của lớp silicagel và mẫu. Với lượng mẫu từ 1-10g, phễu thuỷ tinh dùng
cho sắc kí có dường kính 5 cm, chiều cao lớp hấp phụ là 5 cm, từ đó thể tích
dung môi cho mỗi lần chạy đễ dàng được tính theo công thức.
V = πr
2
.h
Thay π = 3,14
r = 2,5 cm
h = 5 cm
Ta được: V = 98 cm
3
hay 98 ml.
Hình 5: Cột sắc kí lỏng chân không và Shoxlet
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001
Khoá luận tốt nghiệp
Để bảo đảm tách toàn bộ các sesquiterpen ra khỏi dịch chiết, chúng tôi
chạy 20 phân đoạn với các tỷ lệ dung môi khác nhau (từ n-hexan/axeton:
100/0 → 94/6)
Các phân đoạn thu được để yên cho dung môi bay hơi hết, kiểm tra các
sản phẩm bằng sắc kí bản mỏng.
2.4. PHƯƠNG PHÁP CHẠY SẮC KÍ CỘT
Sản phẩm thu được từ phương pháp chạy sắc kí lỏng chân không vẫn
còn một số các terpen khác ngoài artemisinin, chẳng hạn như axit artemisinic,

arteannuin B Để thu lấy artemisinin tinh khiết, hỗn hợp các terpen này được
trộn đều với celite và chuyển lên trên cột sắc kí đẩy, tiến hành chạy sắc kí với
hệ dung môi n-hexan, n-hexan/axeton 99:1, n-hexan/axeton 98:2, n-
hexan/axeton 97:3, n-hexan/axeton 96:4. Các phân đoạn thu được kiểm tra
bằng sắc kí bản mỏng, bay hơi dung môi và tinh chế lại để thu lấy các sản
phẩm sạch artemisinin và loại bỏ các chất khác. Sơ đồ tổng quát cho việc
phân lập artemisinin có thể được tóm tắt như sau:
NguyÔn Thanh HuyÒn Líp KSCNSH - 0001