luận văn công nghệ sinh học Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cây hoa cúc CN01 (Standard chrysanthemum) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN
BAP : 6-benzyl amino purin
IAA : β-indole-acetic acid
IBA : Indode-3-butyric acid
Kin : Kinetin (6 fulfury amino purin)
α-NAA : α-Napthalene acelic acid
H
2
O
2
: Hydro peroxide (nước ôxy già)
HgCl
2
: Thủy ngân Clorua
ND : Nước dừa
Agar : Thạch
MS : Muashige and Skoog, 1962
AI : Activiti ingrendient (hoạt chất)
NS : Non-signficant (sai khác không có y nghĩa)
LSD
0.05
: Giới hạn nhỏ nhất sai khác có y nghĩa khi
so sánh ở xác suất 95%
LSD
0.01
: Giới hạn nhỏ nhất sai khác có y nghĩa khi
so sánh ở xác suất 95%
CV% : Hệ số biến động
1
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN

NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN
MỤC LỤC
PHẦN MỘT: MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
2. Mục đích yêu cầu
2.1. Mục đích
2.2. Yêu cầu
PHẦN HAI
2
PHẦN MỘT: MỞ ĐẦU
l. ĐẶT VẤN ĐỀ.
Hoa cúc (Chrysan Themumsp) là một trong những loài hoa được nhiều
người ưa chuộng và phổ biến nhất ở Việt Nam. Hoa cúc là một trong 4 cây
tượng trưng cho người quân tử, tượng trưng cho 4 mùa “Tứ quí”
“Xuân lan, thu cúc, đông đào
Hạ chen hoa Lựu, Mai vào gió đông”
Ngày nay cùng với sự phát triển của xã hội, đời sống vật chất cũng như
trình độ thẩm mỹ của con người được nâng cao, nhu cầu thưởng thức cái
đẹp cũng được coi trọng. Do đó nhu cầu về hoa không ngừng tăng lên.
Trong rất nhiều loài hoa thì hoa cúc đã được sự chú ý của người chơi hoa.
Khi nói đến hoa, Người Việt Nam không chỉ nói đến hoa cúc vì hoa cúc
không chỉ hấp dẫn người tiêu dùng về màu sắc, hình dáng và mùi thêm kín
đáo mà còn thu hút các nhà sản xuất kinh doanh bởi đặt trưng rất bền, mọi
đặt tính mà không phải bất kỳ loài hoa nào cũng có. Từ trước đến nay, hoa
cúc luôn được đánh giá là loài hoa có giá trị kinh tế cao, nhu cầu về loài
hoa cúc lúc nào cũng lớn trên thị trường trong và ngoài nước. Với các ưu
thế đó, hoa cúc đang được các nhà trồng hoa chú trọng đầu tư và phát
triển. Trong số các giống Cúc hiện nay, Cúc CN01 là giống có năng suất
cao, các đặt điểm về chất lượng hoa lại phù hợp với nhu cầu xuất khẩu,
nên hiện đang trồng phổ biến. Tuy nhiên, Cúc CN01 lại được trồng chính

vào mùa vụ mà thời tiết không thuận lợi, sâu bệnh nhiều… Việc nhân
giống bằng phương pháp dâm cành vẫn còn gặp nhiều khó khăn.
Thứ nhất: về chất lượng giống: các giống hoa Cúc hiện có ở Việt Nam
tuy được nhập nội và trồng chưa lâu nhưng bước đầu tiên đã giảm chất
lượng do sâu bệnh, do nhân giống và tính không được định kỳ phục trúng
3
giống. Hiện tượng này làm giảm chất lượng sản phẩm như: bông không to,
cành ngắn nhỏ… Vì vậy chưa đáp ứng nhu cầu của thị trường.
Thứ hai: Về kỹ thuật nhân giống, cây hoa Cúc nước Ta chủ yếu được
nhân giống bằng phương pháp dâm cành nên hệ số nhân giống chưa cao,
cây không sạch bệnh. Hơn nữa phương pháp nhân giống này còn phụ
thuộc nhiều vào điều kiện thời tiết, khí hậu … gây khó khăn cho việc nhân
giống trên đồng ruộng. Ngoài ra trong công cuộc chuyển đổi cơ cấu cây
trồng theo hướng sản xuất sản phẩm nông nghiệp hàng hóa có giá trị cao,
việc phát triển hoa nói chung và hoa Cúc nói riêng phục vụ tiêu dùng và
xuất khẩu đang có sự bùng phát như vậy việc nghiên cứu nhân giống
nhanh là việc rất cần thiết.
Với kỹ thuật nhân giống vô tính bằng phương pháp nuôi cấy in
vitro tỏ ra ưu việt. Có thể tạo được cây con sạch bệnh, đồng nhất về việc
duy truyền với số lượng lớn trong thời gian ngắn, đáp ứng được nhu cầu
cho thực tiễn sản xuất, chính vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
''Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cây hoa cúc CN01
(Standard chrysanthemum) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro''.
2. MỤC ĐÍCH YÊU CẦU.
2.1. Mục đích.
Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây hoa cúc CN01 để phần đáp
ứng thực tiễn sản xuất hoa cúc hiện nay.
2.2. Yêu cầu.
- Nghiên cứu các phương pháp khử trùng cho các vật liệu đưa vào nuôi cấy.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng đến việc nhân

nhanh hồi cúc.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng
hình thành rễ để tạo cây hoàn chỉnh.
4
- Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây in vi tro ở giai
đoạn vườn ươm.
5
PHẦN HAI
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
l. GIỚI THIỆU VỀ CÂY HOA CÚC.
1.1. Nguồn gốc, vị trí, phân loại và các giống hoa cúc.
Hoa cúc (Chlysanthemum sp) là một loại hoa có nguồn gốc từ Trung
Quốc, Nhật Bản, Việt Nam và một số nước Châu Âu. Hoa cúc được xếp vào
lớp hai lá mầm (Dicotyledones), phân lớp hoa cúc (Asterldae), bộ cúc
(Astelales), phân họ hoa ống (Asteloideae) chi (Chrysanthemum). Theo điều
tra hiện nay thì Chlysanthemum ở Việt Nam có 5 loài và trên thế giới có 20
loài. Các giống loài thuộc chi Chlysanthemum chủ yếu làm hoa và cây
cảnh[1].
Chi Chlysanthemum thuộc cây thân thảo, sống một năm hay lâu năm,
thường mọc thẳng đứng, đơn hoặc phân cành nhánh nhiều. Lá thường chia
thuỳ, mọc cách và không có lá kèm, mép lá cớ khía răng cưa. Hoa lưỡng tính,
tập hợp thành cụm hoa, hình đầu lớn người ta thường gọi là hoa tự đầu trạng.
Mỗi cánh hoa thực chất là một bông hoa, tràng hoa hình ống. Bộ nhụy gồm
hai lá noãn luôn luôn dính lại thành bầu dưới, có một ô và một noãn. Quả bế,
nhẵn, không cánh, chỉ có một hạt nằm trong khoang quả và đôi khi nó lại dính
với quả.
Các loài thuộc chi Chrysanthemum hoa thường to, có màu vàng, trắng,
tím đậm, tím nhạt hay hồng.
Hiện nay hoa cúc có rất nhiều chủng loại giống khác nhau:
- Giống cũ gồm có các loại: Cúc gấm, vàng Đà Lạt, hoạ mi, chi thơm, đỏ

Ấn Độ, tím hoa cà.
- Giống mới nhập nội gồm có: CN93, CN97, CN98, tím hè, vàng Đài Loan,
tím xoáy, tím Hà Lan, đỏ tiết dê, tím sen, và tập đoàn cúc chi có nguồn
gốc từ Hà Lan gồm rất nhiều giống khác nhau [ l 3].
6
l.2. Giá trị kinh tế của cây hoa cúc.
Cúc là một lại hoa đẹp thường được dùng trong các ngày lễ, tết, cưới
xin và được sử dụng với nhiều cách như trồng đại trà để cắt hoa cắm bình,
trồng trong bồn, trang trí trong nhà, trong vườn hoa và công viên.
Sản xuất và kinh doanh hoa cúc đã đem lại cho người trồng hoa nhiều
lợi nhuận. Trên mỗi sào (bắc bộ) đất trồng trọt, với mật độ trung bình: 50
cây/m
2
, người trồng có thể thu được từ 5 - 6 triệu đồng (tính giá trung bình
300đ/bông) và chi phí cho làm đất, chăm sóc, giống và các vật tư khác thì
hết l,8 - 2 triệu đồng. Trong khi đó với cây lúa thu nhập chỉ đạt 350.000 -
400.000 đ/sào [ l4].
Ngoài ra, nếu hoa được đùng xuất khẩu thì lợi nhuận còn lớn hơn
nhiều. Hiện nay, với sự thành công của các biện pháp kỹ thuật như kéo dài
tuổi thọ của hoa, điều khiển hoa ra theo ý muốn, trồng hoa trái vụ hoặc cho nở
vào các dịp lễ tết, đã làm cho giá trị của hoa được tăng lên rất nhiều lần.
Bên cạnh đó, hoa còn được dùng để chế tinh dầu thơm, pha trà, ngâm
rượu, làm thuốc trừ sâu Đối với ngành y dược, một số loại cúc còn có tác
dụng chữa bệnh đau đầu, đau mắt…
1.3. Vài nét về cây hoa cúc CN0l
CN01 là giống cúc đơn (standald Chrysanthemum). ĐÂY là giống
nhập nội của Nhật Bản, được đưa ra từ Trung tâm hoa - cây cảnh - Viện Di
truyền Nông nghiệp tháng 3 năm 2001.
Giống có đặc điểm cây cao (70 - 75 cm), thân mập cứng, lá dài xanh
bóng, bộ lá gọn. Khả năng phân cành ít nên có thể trồng dày 45 – 50 cây/m

2
.
Hoa kép to, cánh ngắn, cứng, xếp chặt, có màu và vàng cam. Thời gian sinh
trưởng từ 85 - 95 ngày, độ bền hoa cắt từ 10 - l2 ngày, được trồng chính vào
các vụ xuân hè, hè thu, và thu sớm.
7
Theo số liệu thống kê chưa đầy đủ từ Phòng nông nghiệp các tỉnh phía bắc,
năm 2003, diện tích trồng cúc CN01 đã lên đến 6,3 ha, riêng Hà Nội có 4,9 ha
[15].
l.4. Tình hình sản xuất cây hoa cúc
14.l Tình hình sản xuất cây hoa cúc trên thế giới
Trên thế giới, cây hoa cúc được trồng ở nhiều nước như Trung Quốc, Nhật
Bản, Hà Lan, Pháp, Mỹ Trong đó, Hà Lan là một trong những nước xuất
khẩu hoa cúc nói riêng và hoa cắt nói chung lớn nhất trên thế giới. Diện tích
trồng hoa ở nhà kính và ở ngoài trời từ năm l970 là 709 ha, đến năm 1984 là
5016 ha. Hàng năm, Hà Lan đã sản xuất hàng trăm triệu cành hoa cắt, hoa
chậu phục vụ cho thị trường tiêu thụ rộng lớn gồm hơn 80 nước ở khắp nơi
trên thế giới. Đặc biệt ở Nhật Bản, nhu cầu sử dụng hoa cúc rất lớn, diện tích
trồng là loại hoa này chiếm khoảng 70% tổng diện tích trồng các loại hoa
khác. Tuy vậy, hàng năm ở Nhật Bản vẫn phải nhập một số lượng lớn hoa
cúc từ Hà Lan.
Ở Thái Lan, hoa cúc là một trong những cây trồng quanh năm, với số
lượng cành cắt hàng năm là 50.841.500 cành.
Trung Quốc là một trong những nước có kỹ thuật tiên tiến trong việc
sản xuất hoa cúc khô và là nơi có nguồn hoa cúc phong phú.
1.4.2. Tình hình sản xuất hoa cúc ở Việt Nam.
Ở Việt Nam, diện tích trồng hoa cúc còn ở mức khiêm tốn, khoảng
3500 ha, tập trung chủ yếu ở các vùng trồng hoa như Hà Nơi, Hải Phòng, Đà
Lạt và chủ yếu là các giống cúc nhập nội. Riêng Hà Nội và thành phố Hồ
Chí Minh, hàng năm sản xuất hàng chục triệu cành hoa cúc cắt, cúc chậu phục

vụ cho nhu cầu trong nước.
Hải Phòng, cúc là cây quan trọng thứ hai trong cơ cấu sản xuất hoa
tươi. Cùng với layơn, cúc là một mặt hàng xuất khẩu trong những năm tới.
8
Ở các tỉnh phía Nam như Đà Lạt, Huế là nơi có diện tích trồng cúc lớn
nhất. Đà Lạt là vùng lý tưởng cho nhiều giống cúc sinh trưởng và phát triển.
Có thể nói, so với những năm trước đây sản xuất hoa cúc ở Việt Nam là
đã tăng lên đáng kể. Tuy nhiên, lương hoa sản xuất ra thực sự còn rất hạn chế
so với nhu cầu rất cao của thị trường, cũng như tiềm năng kinh tế to lớn mà
cây hoa cúc có thể mang lại nếu được đầu tư phát triển 19].
Ở Việt Nam hiện nay việc nhân giống cây hoa cúc chủ yếu bằng
phương pháp vô tính gồm hai biện pháp:
- Nhân giống bằng giâm cành: Chọn cành bánh tẻ, to khoẻ, không sâu bệnh
làm cành giâm. Cành giâm có chiều dài 6 - 8 cm, có 3 - 4 lá, sau khi giâm
phải che nắng, che mưa, giữ ẩm 70% - 80%.
- Nhân giống bằng nuôi cấy in vitro: Là phương pháp được dùng phổ biến
hiện nay ở các nước trồng cúc, bởi cây cúc dễ nhân trong ống nghiệm, hệ
số nhân cao, giá thành hạ, cây con sạch bệnh. Đặc biệt phương pháp này
có thể duy trì và nhân giống quanh năm, không phụ thuộc vào điều kiện
ngoại cảnh. Từ các mô, các cơ quan khác nhau qua nuôi cấy người ta có
thể tạo ra những cây hoàn chỉnh, hoàn toàn sạch bệnh và đồng nhất về
mặt di truyền [16].
2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÂY HOA CÚC TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở
VIỆT NAM
Do giá trị kinh tế cũng như giá trị sử dụng của cây hoa rất cao mà trên
thế giới có rất nhiều nước đi sâu nghiên cứu kỹ thuật trồng hoa, kỹ thuật nhân
và tạo giống hoa mới.
2.l. Tình hình nghiên cứu cây hoa cúc ở lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào
Năm l974, Asjes và công sự (Hà Lan) đã chứng minh rằng có thể sử
dụng nhiều bộ phận của cây hoa cúc để làm vật liệu nuôi cấy mô. Ông đã ứng

dụng thành công kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để tạo ra các giống cúc
sạch bệnh.
9
Việc sử dụng đỉnh sinh trưởng để nuôi cấy in vitro cũng được thực hiện
thành công bởi Fukai, Goi và Yanaka (1991). Các tác giả đã nghiên cứu
phương pháp tối ưu để tạo mẫu vô trùng có tỷ lệ sống và tái sinh chồi cao
nhất. Kết quả thí nghiệm cho thấy, bảo quản chồi đỉnh cúc trước nuôi cấy 2
ngày trong điều kiện lạnh dần cứ 0,2
0
C/phút đến -40
0
C Với 10% dimethyl
sufoide và 3% gluco cho tỷ lệ sống và tái sinh chồi rất cao, có loài lên tới
100% .
Ngoài chồi đỉnh, nhiều nhà nghiên cứu đã sử dụng các bộ phận khác
của cây hoa cúc để nuôi cấy như đoạn thân, mẫu lá Kaul, Miller, Hutchison,
Richards (1990) cho thấy các đoạn thân có khả năng tái sinh chồi cao hơn các
mẫu lá. Cùng năm đó Lu, Negent và Wardley đã thành công việc tái sinh cây
trực tiếp từ những đoạn thân của hoa cúc Chlysanthemum morifolium Ramat
trên môi trường cơ bản MS có bổ sung 0,2-0,5 mg/l BAP và 0,2-2 mg/l NAA.
Tỷ lệ tạo chồi cao nhất là 100%. Đối với những đoạn thân của cây đã thành
thục, khả năng phát sinh chồi cao hơn [28]. Người ta còn có thể nhân giống
hoa Cúc bằng cách tái sinh Callus từ các mẫu cấy thân và lá. Rasthasarathi,
Bhattaccharya, Satyahari, Nilanana (1960) đã nuôi cấy callus từ lá và thân của
Chrysanthemum morifoliun trên môi trường MS có bổ sung 2mg/l 2,4D trong
2 tuần. Sau đó, các tác giả đã tái sinh chồi từ callus trên môi trường đặc MS
có bổ sung 1mg/l IAA và 0,2 mg/l BAP. Sau 2 tuần 1cm
2
callus được tái sinh
2-3 chồi.

Ngoài ra, việc sử dụng cánh hoa, quả để làm nguyên liệu nuôi cấy tạo
chồi trực tiếp hoặc gián tiếp cũng được nhiều nhà khoa học nghiên cứu [32].
Cho đến nay, việc sử dụng chồi đỉnh và chồi nách để làm nguyên liệu
cho nuôi cấy mô vẫn là biện pháp phổ biến nhất bởi vì sử dụng chồi đỉnh và
chồi nách dễ thành công, ít nhiễm bệnh, có hiệu quả cao hơn so với việc sử
dụng các bộ khác của cây hoa cúc để nuôi cấy. Sử dụng phương pháp này,
cho phép tạo một số lượng lớn cây con giống, sạch bệnh đồng nhất về mặt di
10
truyền trong thời gian ngắn, hoàn toàn đáp ứng được cho sản xuất ở quy mô
công nghiệp.
Để hoàn thiện quá trình nuôi cấy mô hoa cúc, các nhà nghiên cứu đã đi
sâu tìm hiểu ảnh hưởng của một số điều kiện và yếu tố môi trường trong
nhân nhanh in vitro như ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ, điều kiện ánh
sáng. Bên cạnh đó, việc nghiên cứu giai đoạn cuối cùng của quá trình vi nhân
giống là giai đoạn đưa cây in vitro ra ngoài đất cũng rất quan trọng. Đây là
bước quyết định hiệu quả của toàn bộ quá trình vi nhân giống vào thực tiễn
sản xuất. Roberts và Smith (1990) đã nghiên cứu bảo vệ rễ bằng chất đệm
cellulose sorbarods trong môi trường nuôi cấy dạng lỏng, làm giảm thiệt hại
trong quá trình đưa cây ra ngoài [35].
2.2. Các nghiên cứu khác về cây hoa cúc.
Ngoài lĩnh vực nuôi cấy in vitro, các nhà khoa học trong và ngoài nước
quan tâm nghiên cứu cây hoa cúc ở các lĩnh vực khác như:
Năm 1982, các nhà chọn giống Ấn Độ đã xử lý tia gamma ở liều lượng
từ 0,1-0,5kr ở những cành cúc đã ra rễ và thấy, có thể làm thay đổi hình dạng
hoa. Cũng bằng phương pháp này nhưng xử lý ở liều lượng 2,5 kr ở các đoạn
thân cắt Kawai và đồng sự (1979) đã tạo ra 7 giống Chrysanthemum có màu
sắc khác nhau.
Năm 1995, Florigene là một trong những công ty đầu tiên ở Hà Lan
chuyển những giống cúc màu hồng thành màu trắng do gen
chalconsesynthase khống chế việc tổng hợp sắc tố.

Theo Hoogeweg (1999) thời gian chiếu sáng 11 giờ cho chất lượng hoa
cúc tốt nhất. Nhưng nếu ở nhiệt độ cao thì ức chế sự ra hoa, nên vào những
năm nóng ấm sự ra hoa của cúc sẽ gặp nhiều khó khăn mặc dù điều kiện ánh
sáng đã phù hợp [27]. Theo Nishico (1987) vào thời kỳ ra hoa yêu cầu thời
11
gian chiếu sáng là 10 giờ, nhiệt độ thích hợp là 18
0
C, nếu thời gian chiếu sáng
dài cúc sẽ kéo dài thời gian sinh trưởng, cây cao, lá to, ra hoa muộn [26].
Để tăng tỷ lệ sống sót và có chiều cao cây phù hợp với giai đoạn
chuyển cúc in vitro ra vườn ươm, Obmerga và Remando (1997) đã kết luận
việc sử dụng paclobutrazol ở nồng độ 0,5g ai/ha cho giống Reddelano và
100g ai/ha cho Pinklady là có kết quả tốt trong việc rút ngắn chiều cao, tăng
lệ sống và trong một phạm vi nào đó còn trì hoãn sự nở hoa [9].
Năm 1992, Sanjaya (Indonexia) khi nghiên cứu ảnh hưởng của 6 công
thức xử lý các chất điều tiết sinh trưởng là IAA, IBA, α-NAA, biorota,
rootonef và đối chứng không xử lý đã chỉ ra IBA là có hiệu quả cao nhất
trong việc nâng cao số lượng rễ cũng như chiều dài ra rễ [35].
Khí nghiên cứu hiệu quả của IBA đến sự ra rễ của cành giâm Nongkran
(1989) đã nhận thấy ở nồng độ 1000 ppm khi xử lý ở các kiểu cúc chùm và
cúc đơn cho hiệu quả cao nhất so với nồng độ 3000ppm và 8000ppm.
2.3 Tình hình nghiên cứu về cây hoa cúc ở Việt Nam
Ở Việt Nam, mạc dù cây hoa cúc đã được nhập nội vào nước ta từ lâu
nhưng sự hiểu biết về cây hoa này cũng như kết quả nghiên cứu còn chưa
nhiều. Nhìn chung các kết quả nghiên cứu thường tập trung chủ yếu vào việc
tập hợp các kinh nghiệm trồng hoa và các phương pháp nhân giống.
Năm l969, Võ Văn Chi, Lê Khả Kế [2] khi điều tra phân loại cây cỏ ở
Việt Nam đã kết luận họ cúc rất lớn, có nhiều chi và nhiều loài, hiện nay trên
thế giới có khoảng 20.000 loài và trên l.000 giống đã được trồng phổ biến,
riêng ở Việt Nam có 75 giống, 199 loài.

Từ năm l992, Trung tâm Hoa - cây cảnh Viện Di truyền Nông nghiệp
kết hợp với Bộ môn nuôi cấy mô tế bào của Viện đã tiến hành nghiên cứu xây
dựng qui trình nhân giống cây hoa cúc bằng phương pháp nuôi cấy in vitro.
Tiến hành thu thập khảo sát và đánh giá một số giống cúc mới, kết quả là từ
12
2/1993 đến tháng 2/1999, giống cúc CN93 và CN98 đã được Hội đồng khoa
học Bộ Nông nghiệp cho phép khu vực hóa, đến tháng 4/1996 và 9/2000 lần
lược hai giống cúc CN93 và CN98 đã được công nhận là giống cúc quốc gia
[14].
Năm 1988, Nguyễn Quang Thạch và cộng sự đã xây dựng hoàn chỉnh
qui trình nhân giống bằng nuôi cấy mô cho một số giống cúc đang được trồng
phổ biến ở miền Bắc nước ta như cúc CN93, vàng Đài Loan, đỏ Hà Lan [9].
Trung tâm Hoa - cây cảnh của Viện Di truyền Nông nghiệp đã sử dụng
kích phát tố của công ty Thiên Nông với liều lượng 1g thuốc pha trong l lít
nước sạch rồi nhúng phần gốc của cành khoảng 30 phút. Sau đó, đem phần
dung dịch thuốc còn lại pha thêm 5g phân bón lá phun lại lên cành giâm. Cứ
3-5 ngày phun dung dịch này một lần có thể đảm bảo từ 80 - 90% số cây ra rễ
với thời gian rút ngắn so với đối chứng từ 3 - 5 ngày, phương pháp này
thường được áp dụng trong việc nhân giống vào mùa hè cho hiệu quả cao [14]
Theo Nguyễn Quang Thạch và các cộng sự (1998) để nâng cao tỷ lệ
sống và ra rễ của cành giâm trong nhân giống vô tính có thể sử dụng IBA
hoặc α-NAA với nồng độ 1000 ppm bằng cách nhúng phần gốc của cành
khoảng 0,5-1cm vào dung dịch thuốc từ 3-5 giây rồi cắm vào đất hoặc cát [9].
Điều tra về sâu bệnh hại trên cây hoa cúc, các tác giả của Trung tâm
hoa - cây cảnh Viện Di truyền Nông nghiệp đã đề xuất các biện pháp phòng
trừ và xác định trên cúc có 9 loại bệnh hại bao gồm 7 bệnh hại do nấm, 1
bệnh do vi khuẩn và 1 bệnh vàng lá do sinh lý. Những bệnh do nấm gây ra
bao gồm đốm lá, phấn trắng, đốm nâu, gỉ sắt, đốm vòng, héo ngọn, lở cổ rễ và
héo vi khuẩn. Trong đó, gây thiệt hại đáng kể nhất là bệnh đốm lá có thể dùng
Score 250ND, bệnh phấn trắng dùng Daconil 75WP, bệnh đốm vòng, đốm

nâu có thể dùng Zineb 80WD hoặc Boocdo 1% để phòng trừ. Về sâu hại chủ
yếu 1à sâu xanh, sâu khoang có thể dùng Pegasus 500SC Các côn trùng
13
khác như rệp muội, nhện dùng Oncol 20EC hoặc Karate 2,5EC. Để phòng trừ
có hiệu quả cao cần kết hợp với các biện pháp canh tác, diệt bỏ các tàn dừ gây
bệnh, sử dụng nguồn giống khoẻ mạnh và sạch bệnh [18] [9][ l0].
3. NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT VÀ ỨNG DỤNG TRONG
CÔNG TÁC NHÂN GIỐNG
3.1- Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các
loại nuôi cấy từ nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi
trường nhân tạo trong điều kiện vô trùng. Cho đến nay, nuôi cấy mô tế bào
thực vật được xem giải pháp công nghệ quan trọng trong công nghệ sinh học
nói chung. Trên môi trường nhân tạo, từ các môn hoặc các cơ quan thực vật
ban đầu có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh và chỉ trong một thời gian ngắn
có thể tạo ra một lượng lớn cây trồng có cấu trúc di truyền và các đặc điểm
sinh học giống hệt nhau.
3.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô và tế bào thực vật.
3.2.l. Tính toàn năng của tế bào thực vật
Mỗi một tế bào của cơ thể đa bào đều chứa đầy đủ vật chất di truyền
của cơ thể.
Tính toàn năng của một tế bào cho phép từ những cơ quan, bộ phận của
cơ thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh đồng nhất về mặt di truyền với cây mẹ.
3.2.2. Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào.
Sự phân hoá là sự chuyển các tế bào từ dạng phôi sinh sang tế bào
chuyên hoá để đảm nhận chức năng sinh lý, sinh hoá khác nhau.
Sự phản phân hóa là sự chuyển từ tế bào chuyên hóa sang tế bào phôi
sinh để thực hiện chức năng phân chia.
14
Hoạt động của các quá trình này được điều khiển bởi các chất điều hòa

sinh trưởng thực vật, cũng như các yếu tố nhiệt độ, môi trường, ánh sáng.
3.2.3. Vật liệu nuôi cấy.
Ở cơ thể thực vật đa bào đều có tính toàn năng nghĩa là đều có khả
năng phân hóa tái sinh thành một cây hoàn chỉnh từ một tế bào, mô, cơ quan
trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo và môi trường có điều kiện thích hợp.
Do vậy về nguyên tắc bất kỳ một bộ phận nào của cây cũng có thể sử dụng
làm vật liệu nuôi cấy, có thể là cơ thể thực vật nguyên vẹn như cây con, mầm
non, … các mô sẹo, các tế bào đơn, tế bào trần
Tuy nhiên, khả năng này phụ thuộc vào từng loài. Có loài dễ tái sinh từ
mô nuôi cấy như khoai tây, cà chua, thuốc lá có loài rất khó như hoa đồng
tiền, trầm hương Thông thường các giai đoạn sinh trưởng khác nhau của mô
cũng như các bộ phận khác nhau của cây, khi nuôi cấy sẽ cho những kết quả
khác nhau. Điều đáng chú ý là những mô nuôi cấy có nguồn gốc từ cây in
vitro có khả năng phát sinh, phát triển tốt hơn so với những mô nuôi cấy có
nguồn gốc là những cây ngoài tự nhiên hay trong nhà kính. Điều này đã được
Economau và Read (1986) chứng minh ở cây đỗ quyên, Liu và Sanford
( 1988) chứng minh ở cây dâu tây. Nhìn chung, tất cả các bộ phận như thân,
lá, rễ, cuống lá đều có thể sử dụng để nuôi cấy, nhưng các cơ quan này do
có sự chuyển hoá khác nhau nên quá trình giải mã các thông tin di truyền
trong đó để tạo mô, tạo chồi, tạo rễ, tái sinh cây là cũng rất khác nhau.
Kích thước mô nuôi cấy khác nhau sẽ cho các phản ứng không giống
nhau và có liên quan mật thiết với tỷ lệ sống, cũng như mức độ ổn định về
mặt di truyền của mô cấy. Do đó, tuỳ từng đối tượng, từng loại mô và mục
đích sử dụng mà người ta nuôi cấy mô có kích thước khác nhau cho phù hợp
[4].
3.2.4. Môi trường nuôi cấy
15
Mô nuôi cấy bị tách rời ra khỏi cơ thể mẹ nên mất khả năng tự dưỡng.
Vì vậy, để cho mô tồn tại, và phân hóa thì trong các giai đoạn nuôi cấy phải
tạo ra được môi trường, có đủ các chất dinh dưỡng mà cây cần thiết. Thành

phần hoá học của môi trường dinh dưỡng gồm chủ yếu là muối khoáng,
nguồn cacbon, chất điều hoà sinh trưởng Môi trường thường được sử dụng
nhiều nhất trong nuôi cấy mô là môi trường MS (Murashige Skoog, l962 ).
Môi trường này, giàu thành phần đa lượng (K
+
, Ca
+
, Mg
++
) có tác dụng tốt
đối với sự tăng trưởng của mô. Thành phần vi lượng ( Mn
++
, Co
+
, Cu
++
) cần
dùng với nồng độ thấp. Sắt cần cho sự chuyển hoá, thiếu sắt tế bào mất khả
năng phân chia. Nguồn cacbon đưa vào mới trường nuôi cấy in vitro là bắt
buộc. Đây là nguồn cung cấp năng lượng cho các quá trình sinh lý, sinh hoá
diễn ra trong mô.
Saccharo là nguồn cacbon tốt nhất trong nuôi cấy, nồng độ thường sử
dụng là 2 - 3%. Mô và tế bào nuôi cấy có tổng hợp được vitamin nhưng
không đủ, nên trong nhiều trường hợp người ta cũng bổ sung vitamin và chủ
yếu là B1, B6, m = inositol. Vitamin rất nhạy cảm với tăng trưởng của mô
nuôi nên được sử dụng ở nồng độ thấp, nó có vai trò quan trọng trong sinh
tổng hợp tế bào [4], [12], [24].
Các loại nước trái cây như nước dừa, dịch chiết chuối, dịch chiết cà
chua… các hỗn hợp axit amin nhân tạo cũng được sử dụng trong nuôi cấy in
vitro, vì thành phần của nó có nhiều chất thúc đẩy tăng trưởng của mô. Theo

Tukele và cộng sự (1981) trong thành phần nước dừa có các axit amin,
protein và axit hữu cơ, đường, auxin, cytokynin và các chất quan trọng khác
có tác dụng tốt trong việc tăng trưởng mô [l 2], [25].
3.2.5 Điều kiện nuôi cấy.
Nuôi cấy in vitro là quá trình nuôi cấy trong điều kiện vô trùng, sử dụng
nguồn ánh sáng bằng đèn Neon có thể điều khiển được. Trong phòng thí
16
nghiệm cường độ ánh sáng thường được sử dụng là 2000 - 3000 lux, điều
kiện nhiệt độ luôn luôn ổn định từ 25 - 27
0
C.
3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật.
3.3.l ảnh hưởng của nhiệt độ.
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào và quá
trình trao đổi chất trong mô. Ảnh hưởng của nhiệt độ bên trong và bên là
ngoài bình nuôi cấy đã được Murashige nghiên cứu vào năm 1947. Theo ông,
nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật nói
chung. Ngoài ra, nó còn ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển của từng tế bào
riêng rẻ và khả năng tạo các cơ quan của mô nuôi cấy.
Trong nuôi cấy in vitro, mỗi một loài có biên độ nhiệt độ thích nghi
khác nhau. Nhiệt độ luôn được hạn chế trong hệ thống nuôi cấy nên mô nuôi
cấy sẽ dễ thích nghi hơn với môi trường. Nhiệt độ thích hợp nhất cho nuôi cấy
in vitro chưa được xác định chính xác, nhưng khoảng từ 20 - 27
0
C được sử
dụng nhiều nhất [20].
Nhiệt độ cũng có tác động qua lại tương hỗ với cường độ ánh sáng, chu
kỳ chiếu sáng và những chất thêm vào trong môi trường nuôi cấy.
3.3.2. ảnh hưởng của ánh sáng.
Ánh sáng là nhân tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phân hoá của mô và

hình thái của cây. Các chỉ tiêu cần chú ý là: cường độ ánh sáng, chu kỳ chiếu
sáng và chất lương ánh sáng.
Cường độ chiếu sáng ảnh hưởng đến quá trình sinh lý, sinh trưởng và
sự hình thành các cơ quan của mô cấy.
Chu kỳ Chiếu Sáng cũng ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình nuôi cấy.
Tuy nhiên, qua thực tế nghiên cứu, người ta nhận thấy khó tách biệt ảnh
hưởng của chu kỳ chiếu sáng ra khởi ảnh hưởng của cường độ ánh sáng. Đối
với nhiều loài, thời gian chiếu sáng trong nuôi cấy tốt nhất từ l2-16 giờ/ngày.
17
Chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình sinh
trưởng của mô nuôi cấy và có liên quan đến sự thay đổi nồng độ hocmon nội
sinh [20].
3.3.3. ảnh hưởng của việc xử lý mẫu.
Mẫu vật nuôi cấy khi bị xử lý bằng hoá chất hay những tác động khác
trước khi nuôi cấy sẽ ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của nó trong quá
trình nuôi cấy. Hoạt tính của hocmon nội sinh ở mẫu vật nuôi cấy bị ảnh
hưởng rõ rệt do xử lý. Trong nghiên cứu, nhiều tác giả đồng ý với Geler và
đồng sự (1979) rằng: khả năng phát sinh cơ quan của mẫu vật sẽ yếu đi và
không thể bù đắp hoàn toàn bởi lượng hocmon thêm vào trong môi trường
nuôi cấy [5].
3.3.4. ảnh hưởng của chất điều khiển sinh trưởng.
Các chất diều khiển sinh trưởng rất nhạy cảm với sự tăng trưởng và
phát triển của mô nuôi cấy. ở nồng độ thấp thì kích thích sinh trưởng nhưng ở
nồng độ cao lai ức chế sinh trưởng. Ba nhóm chất điều khiển sinh trưởng điển
hình là: auxin, cytokinin và gibberellin. Tuy nhiên, trong nuôi cấy mô và tế
bào, người thường chỉ sử dụng hai nhóm chất chính là auxin và cytokinin [5].
Auxin là chất điều khiển sinh trưởng do Went và Thimann (1939) phát
hiện, chủ yếu kích thích sinh trưởng của tế bào nhưng cũng làm tăng phân bào
[l2]. Các chất thuộc nhóm auxin thường được sử dụng là IAA, IBA, α-NAA
và 2,4D. Các chất này can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý của mô nuôi

cấy. Thông thường, sử dụng auxin trong nuôi cấy lúc đầu ở nồng độ cao, sau
đó ở nồng độ thấp hơn để tránh tình trạng nhiễm độc [11 ].
Cytokinin được Skoog phát hiện lần đầu tiên (1950) trong khi thí
nghiệm chiết suất axit nucleic. Đó là những cấu tử của axit nucleic bị phân
huỷ thành. Cytokinin có tác dụng kích thích phân bào mạnh. Ba chất thường
dùng trong nuôi cấy mô tế bào là kinetin, BAP, và zeatin. Trong đó kinetin
18
lược sử dụng nhiều nhất. Những sản phẩm này kích thích sự phát sinh chồi
nuôi cấy, nếu phối hợp xử lý cùng auxin ở tỷ lệ nồng độ thích hợp thì sẽ kích
thích quá trình phân chia tế bào. BAP là sản phẩm tổng hợp nhân tạo. Hoạt
lực của BAP cao hơn nhiều so với kinetin và bản thân BAP bền vững hơn
zeatin với tác động của nhiệt độ cao. Zeatin ít được dùng vì quá đắt [l2].
Gibberellin điển hình là GA3 có tác dụng kích thích tăng trưởng của
đỉnh sinh trưởng, cảm ứng sự kéo dài của thân, thúc đẩy sự hoạt động của các
phôi dinh dưỡng, phôi ngủ nghỉ của hạt, chồi, kích thích ra hoa của cây ngày
dài trong điều kiện ngày ngắn. Tuy nhiên, sự tác động của gibberellin đến các
tế bào nuôi cấy in vitro là không rõ rệt [11].
3.4. Các nguyên tắc kỹ thuật về nhân giống in vitro.
Giai đoan1: Khử trùng mô cấy.
Đây là giai đoạn tối quan trọng, thậm chí quyết định toàn bộ quy trình
nhân giống in vitro. Mục đích của giai đoạn này là tạo ra được tạo ra được
nguyên liệu thực vật vô trùng để đưa vào nuôi cấy in vitro. Khử trùng mô
thực vật người ta thường dùng một số chất hoá học như HgCl
2
, Ca(OCl)
2
,
NaOCl, H
2
O

2
. Tùy thuộc vào từng loại mô thực vật mà lựa chọn nồng độ và
thời gian xử lý hoá chất thích hợp.
Giai đoan 2: Tái sinh mô nuôi cấy.
Trong nhân giống in vitro, mẫu nuôi cấy thường được sử dụng là chồi
hoặc chồi nách của cây mẹ. Ngoài ra, tuỳ từng đối tượng mà người ta còn có
thể dùng các mẫu nuôi cấy là rễ, thân, lá, đài hoa, cánh hoa. Mục đích của giai
đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mô nuôi cấy: Quá trình này
được điều khiển chủ yếu dựa vàn tỉ lệ các hợp chất auxin/cytokinin ngoại sinh
đưa vào môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, cần phải quan tâm đến tuổi sinh lý
của mẫu cấy. Thường các mô non chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn
các mô trưởng thành đã chuyên hoá sâu. Theo Anolerson (l980) mẫu cấy của
19
cây được lấy vào thời kỳ sinh trưởng mạnh cho kết quả rất khả quan trong tái
sinh chồi.
Giai đoan 3: Nhân nhanh chồi.
Toàn bộ quá trình nhân giống in vitro xét cho cùng là nhằm mục đích
tạo ra hệ số nhân cao nhất. Chính vì vậy, giai đoạn này được xem là giai đoạn
then chốt của quá trình.
Để tăng hệ số nhân người ta thường phải đưa thêm vào môi trường dinh
dưỡng nhân tạo các chất điều hòa sinh trưởng (auxin, cytokinin,
gybberellin ). Các chất bổ sung khác như nước dừa, nước chiết nấm men,
dịch thủy phân Casein… kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp.
Tùy thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy người ta có thể nhân nhanh bằng kích
thích sự hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi), hay kích thích sự phát
triển của chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô
tính.
Giai đoan 4: Tạo cây hoàn chỉnh.
Khi đạt kích thước nhất định các chồi được chuyển từ môi trường ở giai
đoạn 3 sang môi trường tạo rễ. Thường sau từ 1-2 tuần, từ những chồi riêng lẻ

này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này, người ta
thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các auxin, vì auxin là hocmon thực
vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy [33]. Trong nhóm này,
các chất IAA, IBA, α-NAA và 2,4D được sử dụng, nghiên cứu nhiều nhất.
Giai đoan 5: Đưa cây ra đất.
Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh (có đủ thân, rễ, lá) từ ống nghiệm ra đất
là bước cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết định khả
năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất.
Cây lấy ra từ ống nghiệm phải được rửa sạch agar bám trên bề lặt rễ để
tránh sự xâm nhập của côn trùng và nấm mốc.
20
Đây là giai đoạn chuyển cây con từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống
hoàn toàn tự dưỡng. Do đó, để đảm bảo cho cây có tỷ lệ sống cao thì cần phải
đưa cây ra vườn ươm, ươm trên các giá thể thích hợp từ 10 -15 ngày. Lúc này
rễ mới được sinh ra, lá non bắt đầu hình thành. Sau đó chuyển cây ra đất với
chế độ chăm sóc bình thường.
3.5. ứng dụng của nuôi cấy in vitro trong công tác nhân giống.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể phục vụ rất nhiều lĩnh vực khác
nhau. Trong công tác nhân giống cây trồng, nuôi cấy in vitro được ứng dụng
để:
- Làm phong phú vật liệu di truyền cho công tác chọn giống.
- Nhân nhanh và duy trì các giống, cá thể có ý nghĩa khoa học và ý nghĩa
kinh tế cao.
- Làm sạch virut phục tráng giống bị thoái hoá vì bệnh.
Trong đó, ứng dụng trong nhân giống cây trồng là lĩnh vực được quan tâm
hơn cả. Nuôi cấy in vitro là một phương pháp nhân giống hữu hiệu nhất trong
các phương pháp nhân giống vô tính. Phương pháp này cho phép tạo ra một
quần thể cây con đồng đều, giữ được đặc tính của cây mẹ, có hệ số nhân
giống cao, sớm phát huy được hiệu quả kinh tế, không tốn diện tích cho nhân
giống dễ chăm sóc, khắc phục được những điều kiện bất lợi của thời tiết.

Phương pháp này đặc biệt tỏ ra ưu việt hơn với các loài cây khó nhân giống
bằng phương pháp hữu tính, các giống quý cớ số lượng giống ban đầu hạn
chế mà lại cần nhân nhanh. Theo Murashige ( 1974) có khoảng 300 loại cây
có thể nhân giống bằng các phương pháp nuôi cấy in vitro. Lợi ích của
phương pháp này còn ở chỗ: Có thể tạo ra một quần thể với số lượng lớn,
sạch bệnh, đồng nhất về mặt di truyền, phục tráng một quần thể thực vật có
nguy cơ bị diệt vong, trao đổi quốc tế nguồn gen, lưu giữ bảo quản nguồn gen
dưới dạng cây in vitro [29].
21
Khả năng ứng dụng dễ thấy nhất của phương pháp nuôi cấy mô thực vật là
phục tráng giống cây trồng. Kỹ thuật này đặc biệt có giá trị đối với khoai tây,
cây ăn quả và nhiều loại cây trồng nhân giống vô tính khác. Đối với khoai
tây, bệnh nguy hiểm nhất đó là bệnh virut - một trong những nguyên nhân
chính gây nên hiện tượng thoái hoá giống. Năm 1965 Morell và Latin đã dùng
kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tạo được cây khoai tây không có virut,
mang lại hiệu quả rất lớn cho ngành sản xuất khoai tây của thế giới.
Việc ứng dụng nuôi cấy mô thực vật trong nhân giống được Nozeran
(1980) nâng lên một mức mới khi ông nhận thấy sự trẻ hóa của các chồi nách
cây nho và cây khoai tây đem cấy chuyển nhiều lần trong ống nghiệm. Việc
ứng nuôi cấy mô trong nhân giống trên quy mô lớn đã được thể hiện ở quy
mô thương mại đối với hàng loạt cây trồng có ý nghĩa kinh tế cao như chuối,
dứa, cà, khoai tây và đã có những đóng góp to lớn cho nền nông nghiệp thế
giới.
Trong lĩnh vực sản xuất hoa cây cảnh, kỹ thuật nuôi cấy in vitro và các
nghệ sinh học khác như: tạo phôi soma, biến dị soma đã ngày càng đóng
góp rất nhiều vào thị trường hoa - cây cảnh trên thế giới. Năm 1985, kim
ngạch của thị trường này ước tính 20 - 25 tỷ USD. ở Hà Lan, kỹ thuật vi nhân
giống trở thành nền tảng của công nghệ hoa và cây cảnh. Năm l987, Thái Lan
có 20 công ty tư nhân dùng kỹ thuật nuôi cấy in vitro trên quy mô thương mại
để sản xuất hoa cắt. Colombia là nước sản xuất hoa Cẩm Chướng lớn nhất

giới nhờ công nghệ nuôi cấy in vitro.
Tóm lại, nuôi cấy in vitro đã được đưa vào chương trình chọn và nhân
giống hiện đại. Bằng phương pháp này, con người đã xây dựng nên các hệ
thống sản xuất giống gốc, cho nhiều loại cây hoàn toàn sạch virut (khoai tây,
đu đủ…
Ở Việt Nam, từ năm 1975 nhiều phòng nuôi cấy mô trong cả nước đã
thành lập và thu được thành quả đáng kể. Tại Viện Sinh vật - Viện Khoa học
22
Việt Nam hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro một số giống cây trồng có
khả năng chống chịu như lúa, thuốc lá, khoai lang, dứa sợi Tại trường Đại
học Nông nghiệp I - Hà Nội hoàn thiện quy trình nhân giống khoai tây. Tại
các tỉnh phía Nam xây dựng được ngân hàng cà phê với 10 giống khác nhau,
hoàn thiện quy trình nhân giống cao su. Ngoài ra, các phòng thí nghiệm nuôi
cấy mô, tế bào trong cả nước đã nghiên cứu thành công nhiều quy trình nhân
giống cây hoa và cây ăn quả.
Tóm lại, nuôi cấy mô thực vật hiện nay được đưa vào trong các chương
trình chọn giống và nhân giống hiện đại, góp phần tích cực vào lý luận sinh
học cây trồng, và thực tiễn nông nghiệp. Mở ra một hướng đi mới cho nghiên
cứu di truyền học, sinh hoá, sinh lý thực vật. Đặc biệt đem lại những ứng
dụng to lớn trong công tác lai tạo và nhân nhanh giống cây trồng.
23
PHẦN BA
ĐỐI TƯỢNG, NÔI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU: Chồi đỉnh, chồi nách sát chồi đỉnh cây cúc
CN01 (Standard Chrysanthemum)
2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU:
2.1 Giai đoạn trong phòng thí nghiệm.
2.1.1. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu hiệu quả của các phương pháp khử trùng.
- Khử trùng bằng H
2

O
2
nồng độ 10% và 15% trong thời gian: 3; 5; 10 phút.
- Khử trùng bằng HgCl
2
nồng độ 0,1% và 0,2% trong thời gian: 3; 5; 10
phút.
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, với 3 lấn nhắc
lại, mỗi lần nhắc lại 5 bình, mỗi bình cấy 3 mẫu. Đánh giá thí nghiệm sau 15
ngày theo dõi.
2.1.2. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hệ số
nhân chồi cúc CN01. Thí nghiệm tiến hành trên môi trường MS cơ bản (3%
saccaro và 0,75% agar) có bổ sung BAP với nồng độ thay đổi như sau:
Công thức l: MS (đối chứng)
Công thức 2: MS + 0,1 mg/l BAP
Công thức 3: MS + 0,2 mg/l BAP
Công thức 4: MS + 0,5 mg/l BAP
Công thức 5: MS + 1 mg/l BAP
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại mỗi
lấn nhắc lại 5 bình, mỗi bình cấy 5 mẫu. Đánh giá thí nghiệm sau 4 tuần theo
dõi.
2.1.3. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nước dừa (ND) đến
hệ số nhân chồi cúc CN01. Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường MS cơ
24
bản (3% saccaro và 0,75% agar) có bổ sung 0,5 mg/l BAP và nước dừa với
nồng độ thay đổi như sau:
Công thức 1 : MS + 0,5 mg/l BAP (đối chứng)
Công thức 2: MS + 0,5 mg/l BAP +10% ND
Công thức 3: MS + 0,5 mg/l BAP +15% ND
Công thức 4: MS + 0,5 mg/l BAP +20% ND

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, với 3 lần nhắc lại mỗi
lần nhắc lại 5 bình, mỗi bình cấy 5 mẫu. Đánh giá thí nghiệm sau 4 tuần theo
dõi.
2.1.4. Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IBA đến hệ số nhân
chồi cúc CN01. Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường MS cơ bản (3%
saccaro + 0,75% agar) có bổ sung thêm 0,5 mg/l BAP + 15% ND và IBA với
nồng độ thay đổi như sau:
Công thức l : MS + 0,5 mg/l BAP + 15% ND (đối chứng)
Công thức 2 : MS + 0,5 mg/l BAP + 15% ND + 0,l mg/l IBA
Công thức 3 : MS + 0,5 mg/l BAP + 15 % ND + 0,2 mg/l IBA
Công thức 4 : MS + 0,5 mg/l BAP + 15 % ND + 0,5 mg/l IBA
Công thức 5 : MS + 0,5 mg/l BAP + 15 % ND + 1 mg/l IBA
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, với 3 lần nhắc
lại mỗi lần nhắc lại 5 bình, mỗi bình cấy 5 mẫu. Đánh giá thí nghiệm sau 4
tuần theo dõi.
2.1.5.Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ α-NAA đến quá
trình hình thành rễ của chồi cúc CN01. Thí nghiệm được tiến hành trên môi
trường MS cơ bản (3% saccaro + 0,7% agar) có bổ sung α-NAA với nồng độ
thay đổi như sau:
25