Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống hoa violet châu Phi (Saintpaulia) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào ppt

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH
NHÂN GIỐNG HOA VIOLET CHÂU PHI (Saintpaulia)
BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO
Lê Đức Thảo
1
, Nguyễn Thị Kim Lý
1

Summary
A study on rapid propagation protocol of Violet Châu Phi (Saintpaulia)
by tissue culture
Study on rapid propagation protocol of Violet Chau Phi (Saintpaulia) by tissue culture showed that
initial material is tender leaves. The steriliration by HgCl
2
0,1% in 6 minutes is the highest effect.
MS medium + 7,0 g/l agar + 20 g/l saccaroza + 2 g/l charcoal with supplementation of 1,0 mg/l BAP
is suitable to form callus from Violet Châu Phi leaves (94,45%). The optimal culture medium for
regeneration and shoot multiplication from callus is MS medium + 7,0 g/l agar + 20 g/l saccaroza +
2 g/l charcoal supplemented with 0,3 mg/l BAP. The best medium for root induction from invitro
shoots was MS + 7,0 g/l agar + 20 g/l saccaroza + 2 g/l charcoal with addition of 0,3 mg/l
, 100% shoots inducted roots from this medium with 37,8 roots/shoot and average
length was 0,65 cm. In nursery, the best suitable substrate for plantlets was coconut fiber with
surviving ratio 100%, the high plant 3,53 cm and number leaves/plant 9,4 after one week observed
Keywords: Saintpaulia, rapid propagation, nursery, coconut fiber, plantlets, substrates.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
1

Ngày nay, bên cạnh các loại hoa cắt,
các loại hoa trồng chậu trang trí ngày càng
được ưa chuộng và phổ biến, đặc biệt ở các
nước phát triển. Khi cuộc sống đang ngày

càng được đô thị hoá, các loại hoa trồng
chậu đã góp phần đáng kể trong việc cải
tạo môi trường sống, đáp ứng nhu cầu
trang trí, thay đổi không gian sống và làm
cho cuộc sống con người gần gũi với thiên
nhiên hơn. Có rất nhiều loại hoa trồng
chậu phổ biến và được người tiêu dùng ưa
chuộng như Begonia, Cineraria, Geranium,
Saintpaulia, Trong đó, cây Saintpaulia
hay còn gọi là Violet Châu Phi là loại cây
đẹp, đa dạng về màu sắc và đã được Viện
Di truyền Nông nghiệp nhập nội, thử

1
Viện Di truyền Nông nghiệp.
nghiệm. Kết quả cho thấy chúng sinh
trưởng phát triển tốt trong điều kiện sinh
thái Việt Nam. Để đáp ứng việc cung cấp
giống cho sản xuất với số lượng lớn, cây
con khỏe và sạch bệnh, chúng tôi tiến hành
nghiên cứu xây dựng qui trình nhân nhanh
giống Violet Châu Phi (Saintpaulia) bằng
phương pháp nuôi cấy mô tế bào.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu và mẫu ban đầu là nhng mNu
lá non, lá bánh t ca cây Violet Châu Phi
kích thưc mu 1 cm
2

.
2. Phương pháp nghiên cứu
Ct t cây Violet Châu Phi các lá non,
bánh t ra sch bng xà phòng, sau ó ct
lá thành các mNu nh cho vào các bình tam
giác ri cho vào bu cy và tin hành thao
tác kh trùng. Trưc tiên, ra mu bng
nưc ct (ã kh trùng) 2 - 3 ln, kh trùng
sơ b bng cn 70
0
C trong 30 giây. Sau ó
loi b ht nưc và kh trùng bng HgCl
2

và H
2
O
2
theo các công thc thí nghim. Ly
mu ra khi dung dch kh trùng, tráng 3 -
5 ln bng nưc ct (ã kh trùng) ri cy
vào môi trưng MS + 7,0 g/l agar + 20 g/l
saccaroza. Các mu lá sau 2 tun theo dõi
ưc cy chuyn vào môi trưng to callus,
môi trưng cơ bn: MS + 7,0 g/l agar + 20
g/l saccaroza + 2 g/l than. Tip tc nghiên
cu môi trưng to chi và ra r, to cây
hoàn chnh. Cây con sau khi ưa ra khi
bình nuôi cy ưc ra sch môi trưng bám
dính  r bng nưc sch, sau ó giâm vào

khay bng xp vi các giá th khác nhau.
- iu kin nuôi cy: N hit  nuôi cy
25 - 28
0
C, ánh sáng 1500 - 2000 Lux, thi
gian 8 gi/ngày.
- Thí nghim ưc b trí ngu nhiên, 3
ln nhc li. S liu ưc x lý thng kê
trên chương trình IRRISTAT.
III. KT QU VÀ THO LUN
1. ghiên cứu phương pháp khử trùng
hoa Violet Châu Phi
 tài ã s dng ngun mu ban u
t lá cây Violet Châu Phi  to vt liu vô
trùng trong ng nghim. Mu ưc kh
trùng bng hp cht HgCl
2
và H
2
O
2
. Sau 2
tun nuôi cy ta thu ưc kt qu th hin
trong (bng 1).
Bảng 1. Hiệu quả của các phương pháp khử trùng
Công thức Tỷ lệ nhiễm (%)
Tỷ lệ sạch (%)
Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ chết (%)
CT1 73,33 23,3 3,3
CT2 23,33 60,0 16,7

CT3 16,7 36,7 46,7
CT4 86,7 13,3 0
CT5 63,3 26,7 10
CT6 53,3 33,3 13,3
Ghi chú: CT1: HgCl
2
0,1% trong 3 phút; CT2:HgCl
2
0,1% trong 5 phút; CT3: HgCl
2
0,1% trong 7 phút;
CT4: H
2
O
2
15% trong 10 phút; CT5: H
2
O
2
20% trong 10 phút; CT6: H
2
O
2
25% trong 10 phút.
Qua bng 1 cho thy: Hiu qu kh
trùng mu gia các công thc có s bin
ng như sau:
- i vi cht kh trùng H
2
O

2
: Khi
kh trùng  các nng  khác nhau vi
cùng thi gian kh trùng là 10 phút thì t
l mu sng khác nhau, t l mu cht
tăng t l thun vi nng  kh trùng và
t l nhim li t l nghch vi nng 
kh trùng. T l mu sng, sch cao nht
khi kh trùng  nng  25% t 33,3%.
- i vi cht kh trùng HgCl
2
: Khi
kh trùng  các thi gian khác nhau vi
cùng nng  là 0,1% có t l sng ca các
mu khác nhau. T l mu sng, sch cao
nht khi kh trùng trong 5 phút t 60%.
Như vậy, phương thức khử trùng tốt nhất
là sử dụng HgCl
2
0,1% trong thời gian khử
trùng là 5 phút cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất.
2. ghiên cứu môi trường tạo callus hoa
Violet Châu Phi
Chúng tôi nghiên cu nh hưng ca
mt s cht iu tit sinh trưng n kh
năng to callus t các mu lá sau khi kh
trùng. Sau 3 tun nuôi cy, kt qu ưc th
hin  bng 2.

Bảng 2. Ảnh hưởng của một số chất điều hoà sinh trưởng (phytohormon)

đến quá trình hình thành callus
Công thức Tỷ lệ mẫu tạo callus (%) Hình thái callus
CT1 59,09 Callus màu trắng yếu, kích thước nhỏ, xốp.
CT2 86,36 Callus màu xanh, có kích thước nhỏ, rắn.
CT3 60 Callus màu xanh vàng, kích thước nhỏ, rắn
CT4 94,45 Callus màu xanh, kích thước lớn, rắn
CT5 59,09 Callus màu xanh, kích thước nhỏ, rắn
CT6 81,8 Callus màu xanh, kích thước nhỏ, rắn.
CT7 22,73 Callus màu vàng nâu, kích thước nhỏ, xốp.
Ghi chú: CT1: 0 BAP (mg/l) + 0
α −
ΝΑΑ (mg/l); CT2: 0,5 BAP (mg/l) + 0
α −
ΝΑΑ (mg/l); CT3: 0,5
BAP (mg/l) + 0,5
α −
ΝΑΑ (mg/l); CT4: 1,0 BAP (mg/l) + 0
α −
ΝΑΑ (mg/l); CT5: 1,0 BAP
(mg/l) + 0,5
α −
ΝΑΑ (mg/l); CT6: 1,5 BAP (mg/l) + 0
α −
ΝΑΑ (mg/l); CT7: 1,5 BAP (mg/l) +
0,5
α −
ΝΑΑ (mg/l).
Qua kt qu  bng 2 cho thy:
Các phytohormon có nh hưng rt tích
cc n quá trình hình thành callus. Khi cy

các mu ã kh trùng vào môi trưng MS
không b sung cht iu tit sinh trưng thì
t l mu to callus thp t 59,09%, mt
khác hình thái callus không tt.
Khi cy mu vào môi trưng có b sung
0,5 mg/l BAP thì t l mu to callus tăng
cao, chim 86,36%, hình thái callus tt nhưng
kích thưc vn nh. Khi b sung c 0,5 mg/l
α−ΝΑΑ
thì t l mu to callus gim i còn
60%, hình thái callus không ưc tt, callus
màu xanh vàng, kích thưc li nh.
Khi tăng nng  BAP lên 1,0 mg/l thì
t l mu to callus t 94,45%, hình thái
callus tt, callus có màu xanh, kích thưc
li ln và rắn. Nhưng khi bổ sung 0,5 mg/l
α−ΝΑΑ
thì tỷ lệ mẫu tạo callus thấp, hình
thái callus không được tốt có màu xanh,
kích thước nhỏ, rắn.
Khi tăng nồng độ BAP lên 1,5 mg/l thì cả
2 công thức (có bổ sung
α − ΝΑΑ
và không
bổ sung
α
- NAA) có tỷ lệ mẫu tạo callus
giảm xuống. Ở công thức CT6 là 81,8% và
công thức CT7 có bổ sung 0,5 mg/l
α − ΝΑΑ

có 22,73%, hình thái kém hơn,
callus thường có màu vàng nâu và nhanh
chóng chuyển sang màu nâu đen.
Trong 7 công thức thí nghiệm thì CT4
(1,0 mg/l BAP, không bổ sung NAA) là
thích hợp nhất để tạo callus từ lá bánh tẻ
cây hoa Violet Châu Phi.
3. ghiên cứu ảnh hưởng của BAP
đến quá trình tái sinh và nhân nhanh
chồi từ callus
Các callus tạo thành được chuyển sang
các môi trường có nồng độ BAP khác nhau
để nghiên cứu khả năng tái sinh chồi.
Sau 4 tuần nuôi cấy ta thu được kết quả
thể hiện bảng 3.
Bảng 3. Ảnh hưởng của BAP đến quá trình
tái sinh chồi từ callus
Công thức
Tỷ lệ tái sinh
(%)
Số chồi tái sinh trung
bình (chồi/mẫu)
CT1 73,33 7,73
CT2 93,33 10,5
CT3 66,67 7,1
CT4 46,67 4,43
CV(%) 1.6
LSD
0,05
0.2

Ghi chú: CT1: B sung 0,1 mg/l BAP;
CT2: B sung 0,3 mg/l BAP;
CT3: B sung 0,5 mg/l BAP;
CT4: B sung 0,7 mg/l BAP.
Qua bng 3 cho thy:  CT1 có nng 
0,1 mg/l BAP cho t l callus tái sinh chi
73,33%, s chi tái sinh trung bình t 7,73
chi/mu, hình thái chi tt. Trong công
thc CT2 có nng  0,3 mg/l BAP cho t l
callus tái sinh t cao nht là 93,33%, s
chi tái sinh trung bình cũng t cao nht là
10,5 chi/mu, hình thái chi tt. 3 công
thc CT3, CT4 tip tc tăng dn nng 
BAP thì t l tái sinh gim dn tương ng
66,67% và 46,67%. Nồng độ BAP càng tăng
thì càng nhiều callus sùi to và rắn chắc và
không phát triển thành chồi rõ ràng, nếu để
lâu một số callus chuyển sang màu nâu đen,
số lượng chồi/mẫu cũng giảm xuống tương
ứng 7,1 và 4,43 chồi/mẫu.
Như vậy, trong 4 công thức thí nghiệm
tái sinh chồi từ callus thì công thức CT2 (bổ
sung 0,3 mg/l BAP) có tỷ lệ callus tái sinh
chồi là cao nhất (93,33%) và tỷ lệ chồi tái
sinh đạt trung bình 10,5 chồi/mẫu cấy. Hình
thái chồi xanh, tốt.
4. ghiên cứu môi trường ra rễ Violet
Châu Phi
Trong thí nghim ra r này chúng tôi s
dng

α−
NAA để nghiên cứu sự ra rễ của
chồi in vitro. Sau 4 tuần nuôi cấy, chúng tôi
được kết quả ở bảng 4.
Bảng 4. Ảnh hưởng của
α−
AA đến khả năng ra rễ của chồi Violet
Công
thức
Tỷ lệ ra rễ
(%)
Số rễ/cây
(cái)
Chiều dài trung bình
của rễ (cm)
Hình thái cây
CT1 100 10,2 0,41
Cây cao, thân còi, lá hơi nhỏ, xanh nhạt, rễ
yếu, nhỏ, màu trắng
CT2 100 23,7 0,53
Cây thấp, thân hơi còi, lá to, xanh đậm, rễ
không đều, nhỏ, màu trắng nâu
CT3 100 27,2 0,63
Cây cao, thân mập, lá to màu xanh đậm, rễ
đồng đều, to, màu nâu
CT4 100 37,8 0,65
Cây cao, thân mập, lá to, xanh đậm, rễ đồng
đều, to, màu trắng nâu
CT5 100 19,25 0,45
Cây thấp, thân còi, lá nhỏ, xanh đậm, rễ không

đồng đều, nhỏ yếu, màu trắng
CV(%)
LSD
0,05

2,5
1,3
1,7
0,07

Ghi chú: CT1: Bổ sung 0 mg/l NAA CT2: Bổ sung 0,1 mg/l NAA; CT3: Bổ sung 0,2 mg/l NAA;
CT4: Bổ sung 0,3 mg/l NAA; CT5: Bổ sung 0,5 mg/l NAA.
Qua bảng 4 cho thấy: 100% các chồi
Violet Châu Phi đều ra rễ dù được cấy
trong môi trường có bổ sung hay không
bổ sung α−NAA, điều đó chứng tỏ trong
các chồi, auxin nội sinh cũng đủ để kích
thích quá trình tạo rễ của chồi. Tuy nhiên
khi bổ sung α−NAA với các mức nồng
độ thay đổi chúng tôi nhận thấy ở nồng
độ 0,3 mg/l thì số lượng rễ trung bình
được tạo ra lớn nhất đạt 37,8 rễ/cây, so
với đối chứng là 10,2 rễ/cây. Về độ dài
và chất lượng rễ thì từ công thức đối
chứng, khi không bổ sung α − ΝΑΑ đến
khi bổ sung α − ΝΑΑ 0,1 mg/l - 0,3mg/l
thì độ dài và chất lượng rễ tăng lên rõ rệt.
Nhưng khi tăng nồng độ α − ΝΑΑ lên
0,5 mg/l thì độ dài và chất lượng rễ giảm.
Tuy nhiên theo quan sát thí nghiệm

chúng tôi nhận thấy ở các công thức có
bổ sung α − ΝΑΑ thì các rễ đều có sức
sống cao hơn so với các rễ ở công thức
đối chứng.
Như vậy, môi trường bổ sung 0,3 mg/l
α − ΝΑΑ là thích hợp nhất cho việc ra rễ
của chồi Violet Châu Phi.
5. ghiên cứu ảnh hưởng của các loại giá
thể đến khả năng sinh trưởng và phát
triển, tỷ lệ sống của cây hoa Violet Châu
Phi
Đây là giai đoạn đưa cây con trong nuôi
cấy từ môi trường nhân tạo ra ngoài môi
trường tự nhiên, chính là chuyển cây sống
từ trạng thái dị dưỡng sang trạng thái sống
tự dưỡng và chịu nhiều tác động của các
yếu tố môi trường tự nhiên biến động (thời
tiết, đất đai ). Ở giai đoạn vườn ươm,
chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu ảnh
hưởng của các loại giá thể khác nhau đến tỷ
lệ sống của cây con. Các cây con được đưa
ra khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar bám ở rễ
và được ươm vào 4 loại giá thể. Sau 3 tuần
theo dõi, kết quả theo dõi được trình bày ở
bảng 5.
Bảng 5. Ảnh hưởng của các loại giá thể đến tỷ lệ sống của cây ngoài vườn ươm
(sau 4 tuần)
Công thức Tỷ lệ sống (%) Chiều cao cây TB (cm) Số lá/cây
CT1 76,7 6,08 9,05
CT2 90 6,12 10,3

CT3 100 6,42 10,13
CT4 100 6,53 10,4
CT1: Cát; CT2: Dn; CT3: Tru hun; CT4: Xơ da.
Qua bng 5 cho thy: Qua 4 tun u
theo dõi có s bin ng v t l sng ca
cây  các giá th,  giá th cát t t l thp
nht 76,7%, trên giá th dn t l sng t
90%. Còn 2 loi giá th tru hun và xơ da
t 100%. V ch tiêu chiu cao cây và s lá
không có s sai khác áng k gia các CT.
Cây trng trên giá th xơ da t chiu cao
trung bình cao nht 6,53 cm.
Sơ  qui trình nhân ging hoa Violet châu Phi

T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
7
IV. KẾT LUẬN VÀ §Ò NGHN
1. Kết luận
- Vật liệu ban đầu là nhng mNu lá bánh t cây hoa Violet Châu Phi (Saintpaulia), s
dng loi hóa cht kh trùng là HgCl
2
0,1% vi thi gian kh trùng là 5 phút cho hiu
qu kh trùng cao nht.
- Môi trưng có thành phn dinh dưng khoáng cơ bn MS + 7,0 g/l agar + 20 g/l
saccaroza + 2 g/l than có b sung 1,0 mg/l BAP là thích hp nht  to callus t lá cây
Violet Châu Phi (Saintpaulia) (T l mu to callus trên môi trưng này t 94,45%).
- Môi trưng ti ưu cho tái sinh và nhân nhanh chi t callus là môi trưng cơ bn
MS + 7,0 g/l agar + 20 g/l saccaroza + 2 g/l than có b sung 0,3 mg/l BAP.
- Các chi in vitro ra r thun li nht trên môi trưng MS + 7,0 g/l agar + 20 g/l
saccaroza + 2 g/l than có b sung 0,3 mg/l α − ΝΑΑ, trong môi trưng này 100% chi ra

r, s r trung bình là 37,8 (r/chi) và chiu dài r trung bình 0,65 cm.
- Giá th thích hp nht  thích nghi cây in vitro trong giai on vưn ươm là giá
th xơ da vi t l sng 100%, chiu cao cây trung bình 3,53 cm và s lá/cây là 9,4 cái
sau 1 tun u theo dõi.
2. Đề nghị
Áp dng quy trình  sn xut cây con ging phc v sn xut
TÀI LIU THAM KHO
1 Trần Văn Minh, 1996. Công nghệ sinh học thực vật. NXB. Nông nghiệp
2 guyễn Quang Thạch, guyễn Thị Lý Anh và cộng sự, 2007. Giáo trình sinh học
nông nghiệp. NXB. Nông nghiệp.
3 Bhojwani S.S and Razdan M.K, 1983. Plant tissue culture, Theory and practice,
Elsevirer science publishers, Amterdam
4 Pierik R.L.M., 1987. In vitro culture of higher plant. Martinus nijhoff publishers,
Dordrech. The Netherlands.
gười phản biện: Trần Duy Quý