Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử DNA phát hiện và chọn lọc gen TGMS phục vụ công tác chọn tạo giống lúa lai hai dòng

PHẦN I: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Trong diều kiện hiện nay tốc độ đô thị hóa ngày càng cao, diện tích đất
dành cho nông nghiệp ngày càng giảm cùng với sự gia tăng mạnh mẽ về dân số
vấn đề an ninh lương thực được đặt ra hàng đầu. Do đó, để đảm bảo an ninh lương
thực cho hiện tại và tương lai thì phải tăng năng suất lúa gạo.
Một trong những hướng để tăng năng suất lúa gạo là sử dụng ưu thế lai.
Hiện nay chúng ta đang sử dụng hai hệ thống: hệ thống lúa lai hai dòng
và lúa lai ba dòng. Nhưng lúa lai hai dòng vượt trội hơn hẳn vì: cơ hội chọn
tạo các dòng bố lớn thuận lợi cho việc cải tạo chất lượng gạo, không có hiệu
ứng đồng tế bào chất nên ít bị sâu hại hơn, năng suất cao hơn lúa lai hệ ba
dòng từ 5-10% hệ thống lúa lai chỉ cần hai dòng (một là dòng TGMS hoặc
PGMS, hai là dòng cho phấn) nên giá thành giảm, tính trạng bất dục đực mẫn
cảm với điều kiện môi trường (EGMS) chủ yếu do một cặp gen lặn điều khiển
thuận lợi cho việc tạo giống mới.
Để chọn tạo lúa lai hai dòng thành công thì dòng TGMS phải nhiều và
phong phú từ đó mới tạo ra được tổ hợp cho ƯTL cao. Hiện nay các dòng
TGMS đang sử dụng (như 103S, T1S-96, 64S, 287S, 36S
2
, Kim 76S, Pải 64S và
25S) chúng ta không biết chúng thuộc gen tms nào? Để phục vụ đắc lực cho công
tác chọn tạo giống thì phải xác định được gen dạng TGMS từ đó có hướng chọn lọc
hiệu quả.
Các nhà khoa học đã tìm được 6 gen TGMS (tms1, tms2, tms3, tms4,
tms5 và tms6) mỗi gen này có ngưỡng chuyển hoá hữu dục và bất dục khác
nhau trong đó gen tms2 có ngưỡng chuyển hóa hữu dục ổn định. Nhà chọn
giống đã sử dụng các gen TGMS này lai chuyển vào các dòng, giống lúa triển
vọng để tạo dòng TGMS tốt, có khả năng phối hợp cao, tạo ra nhiều tổ hợp lai
mới cho ưu thế lai cao.
1
Khi lai chuyển gen này vào các dòng giống lúa triển vọng có nhiều cách

khác nhau như: lai tích luỹ, chọn lọc phân ly,… Tuy nhiên tất cả các cách đều cần
đến phương pháp chọn lọc cây chứa gen TGMS. Để phát hiện được cây nào chứa
gen TGMS người ta thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau như: Trồng
trong điều kiện nhiệt độ bất dục, soi hạt phấn (nhuộm màu bằng dung dịch I-KI
1%) tiến hành khi lúa bắt đầu trỗ, tự thụ bắt buộc sau đó suy đoán khả năng chứa
gen TGMS . Đối với những nơi không có khí hậu thích hợp cho bất dục thì cần phải
có nhà khí hậu nhân tạo. Do đó, việc chọn các cây mang gen TGMS rất tốn thời
gian, công sức và kinh phí.
Hiện nay, nhờ sự phát triển của Công nghệ sinh học người ta đã định vị
lập bản đồ các gen TGMS trên từng nhiễm sắc thể và xác định các chỉ thị phân
tử liên quan đến gen TGMS. Tác giả M.T.Lopez và Cs (2003) sử dụng chỉ thị
PCR xác định được marker RM11 liên kết chặt với gen tms2 là 5 cM.
Bằng việc sử dụng các AND marker (chỉ thị phân tử) thời gian chọn tạo
ra các dòng mới đã được rút ngắn. Các chỉ thị liên kết chặt với các tính trạng
kiểu hình. Do đó, có thể xác định được các tính trạng dựa trên sự có mặt của
các gen mong muốn. Kỹ thuật này không chỉ có độ chính xác cao mà còn xác
định được trên một lượng lớn vật liệu nghiên cứu. Để đáp ứng được mục tiêu
chọn giống chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân
tử DNA phát hiện và chọn lọc gen TGMS phục vụ công tác chọn tạo giống
lúa lai hai dòng”.
1.2. Mục đích và yêu cầu
1.2.1. Mục đích
- Xác định gen tms2 trong tập đoàn các dòng TGMS bằng chỉ thị phân tử.
- Nghiên cứu di truyền gen tms2.
- Khảo sát ƯTL giữa dòng TGMS 103S với các dòng bố tốt nhằm tìm ra
tổ hợp có ƯTL cao.
2
1.2.2. Yêu cầu
- Chiết tách ADN để tiến hành phản ứng PCR.
- Phát hiện được các tổ hợp chứa gen tms2 ở các dòng TGMS và thế hệ

F
2
của tổ hợp lai TH3-3 (T1S-96/R3) và Việt lai 24 (103S/IR24).
- Đánh giá được khả năng hữu bất dục bằng phương pháp truyền thống
ở các cá thể F
2
.
- Khảo sát một số đặc điểm nông sinh học của các tổ hợp lai F
1
.
3
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Hiện tượng ƯTL
2.1.1 Khái niệm về ƯTL
ƯTL (heterosis) là một thuật ngữ để chỉ tính hơn hẳn của con lai F
1
so
với bố mẹ chúng về các tính trạng hình thái khả năng sinh trưởng, sức sống,
sức sinh sản, khả năng chống chịu và thích nghi, năng suất chất lượng hạt và
các đặc tính khác. Việc sử dụng rộng rãi giống lai F
1
vào sản xuất đã góp phần
làm tăng năng suất nhiều loại cây trồng, đặc biệt là các cây lương thực, thực
phẩm làm tăng thu nhập cho người nông dân, tăng hiệu quả sản xuất nông
nghiệp, một ngành vốn có hiệu quả kinh tế thấp (Nguyễn Công Tạn, 2000) [7].
2.1.2. Cơ sở di truyền của ƯTL
Cơ sở di truyền của hiện tượng ƯTL vẫn đang là vấn đề gây tranh cãi trong
suốt quá trình phát triển lịch sử của di truyền học. Một số giả thuyết đã được nêu
ra trong thế kỷ XX để giải thích hiện tượng ƯTL và đã được nhiều người thừa
nhận như:

Giả thuyết tính trội:
Theo giả thuyết này thì tính trội được hình thành trong quá trình tiến
hoá của sinh vật. Các gen trội có lợi lấn át gen lặn có hại gây hậu quả xấu. Có
nghĩa là gen trội át chế tác động của gen lặn tương ứng cùng locus trên NST
tương đồng. Ví dụ: Khi lai AABBCC với aabbcc con lai F
1
có kiểu gen
AaBbCc nên có ƯTL rõ rệt.
Giả thuyết siêu trội:
Giả thuyết này cho rằng nhiều tính trạng có lợi cho sự sinh trưởng do
gen trội kiểm soát còn gen lặn tương ứng có tác dụng ngược lại. Tính dị hợp tử
của một allen ở một vị trí nhất định sẽ sản sinh ra các vật chất có ảnh hưởng
4
đến sức sống vượt xa của các loài mang allen đồng hợp tử và do tác động
tương hỗ của các allen khác nhau trên cùng một vị trí. Theo giả thuyết này thì
cá thể có kiểu gen Aa sẽ có sức sống cao hơn hẳn cơ thể mang kiểu gen AA và
aa. Mô hình toán học tổng quát của giả thuyết này là AA < Aa > aa.
Giả thuyết cân bằng di truyền:
Theo giả thuyết này thì mỗi cơ thể sinh vật ở trạng thái cân bằng di
truyền nhất định, đảm bảo cho sự hình thành một kiểu hình thái ứng với điều
kiện sống. Khi lai các cá thể có kiểu cân bằng di truyền khác nhau, sẽ hình
thành cơ thể mới có trạng thái cân bằng di truyền mới, khác cân bằng di
truyền cũ do vậy con lai xuất hiện những tính trạng mới tốt hơn ở bố mẹ
(Hoàng Thuyết Minh, 2002) [3].
2.1.3. Duy trì ƯTL
Các giống ƯTL (F
1
) khi nhân đời sau qua sinh sản hữu tính thì thu được
quần thể phân ly F
2

. Khi đó, giá trị trung bình quần thể của tính trạng thu được sẽ
là đại lượng giảm hơn so với đại lượng này ở F
1
và tiếp tục giảm ở thế hệ tiếp
theo. Do đó, cần phải có các hệ thống sản xuất ra khối lượng lớn hạt lai F
1
tuỳ
loại cây trồng.
Ví dụ: Ở lúa là hệ thống lúa lai hai dòng, ba dòng và một dòng.
Các giống nhân giống bằng vô tính thì ƯTL cơ bản được duy trì qua
các thế hệ. Tuy nhiên, hay xảy ra hiện tượng lan truyền virus, thoái hoá do đó
cần phải làm sạch và chọn lọc.
Cũng có thể duy trì ƯTL thông qua vô phối. Phương pháp này tỏ ra có
ưu thế hơn cả (Nguyễn Hồng Minh, 2004) [8].
2.1.4. Đánh giá ƯTL
ƯTL là hiện tượng phổ biến trong trồng trọt và chăn nuôi. Ở cây lúa,
người đi tiên phong trong lĩnh vực ƯTL là J. W.Jones (1936) (Nhà di truyền học
người Mỹ) lần đầu tiên báo cáo về sự xuất hiện ƯTL trên những tính trạng số
lượng và năng suất (Anomymous, 1997; Li, 1977) về tích luỹ chất khô (Rao,
5
1965; Jenning,1967,…) ; về sự phát triển của bộ rễ (Anomymous, 1974); về
cường độ quang hợp, diện tích lá (Lin và Yuan, 1980; MC Donal và CS, 1971;
Wu và CS, 1980) (Nguyễn Công Tạn, 2002) [7].
Chúng ta đánh giá ƯTL qua các công thức sau:
ƯTL trung bình:
H
MP
% =

Trong đó: MP (mid parents) là giá trị trung bình của hai bố mẹ.

ƯTL trung bình là biểu hiện sự hơn hẳn của một tính trạng nào đó ở
con lai F
1
so với giá trị trung bình của tính trạng đó của hai bố mẹ.
ƯTL thực:
H
BP
% =

Trong đó BP (best parents) là bố hoặc mẹ tốt nhất.
ƯTL thực là biểu hiện sự hơn hẳn ở một tính trạng nào đó của con lai
F
1
so với giá trị đó của bố hoặc mẹ tốt nhất (Hoàng Thuyết Minh, 2002) [3].
Nói chung, sức sống của con lai F
1
có thể biểu hiện tăng hơn so với bố
mẹ ở một tính trạng nhất định gọi là ƯTL dương, và nếu có hiện tượng giảm
đi thì được gọi là ƯTL âm (Trần Duy Quý, 2000) [18].
2.2. Hệ thống lúa lai hai dòng
2.2.1. Khái niệm về hệ thống lúa lai hai dòng
Lúa lai hai dòng là hệ thống lúa lai khi sản xuất hạt lai F
1
phải sử dụng hai
loại dòng có bản chất di truyền khác nhau: một dòng là TGMS hoặc PGMS, hai
là dòng cho phấn (dòng bố trong sản xuất hạt lai). Thực chất là không cần đến
gen duy trì bất dục cũng như dòng B. Trong khi chọn dòng cho phấn cũng không
cần quan tâm đến gen phục hồi hữu dục (như ở hệ thống lúa lai 3 dòng). Muốn
sản xuất hạt của dòng mẹ chỉ cần điều chỉnh thời vụ gieo cấy để chúng trải qua
giai đoạn phân bào giảm nhiễm vào lúc có thời gian chiếu sáng ngày ngắn (với

6
F
1
- MP
MP
x 100
F
1
- MP
BP
x 100
dòng PGMS) và nhiệt độ dưới 24
o
C (với dòng TGMS) là có thể thu hạt tự thụ
(Hoàng Thuyết Minh, 2002) [3].
2.2.2. Ưu điểm của hệ thống lúa lai hai dòng
Lúa lai hai dòng đã khắc phục được rất nhiều nhược điểm của lúa lai hệ
ba dòng, triển vọng của ứng dụng kỹ thuật này trong thế kỷ XXI là rất lớn.
Đặc biệt khi con người không chỉ khai thác ƯTL của các giống trong cùng
một loài mà còn thực hiện các phép lai xa khác loài và khác loài phụ. Năng
suất của lúa lai không dừng lại ở mức 10 -15 tấn và có thể đạt trên 15 tấn. Tuy
nhiên công nghệ sản xuất hạt lai F
1
vẫn phức tạp và phụ thuộc rất nhiều vào
yếu tố thời tiết.
Việc ứng dụng các dòng EGMS để phát triển lúa lai so với ứng dụng
dòng CMS kinh điển có các ưu điểm hơn hẳn sau:
Quá trình sản xuất hạt lai được đơn giản hoá, không phải tổ chức một lần
lai để duy trì dòng bất dục như ở hệ “Lúa lai 3 dòng” vì không cần dòng B.
Dòng TGMS trong điều kiện nhiệt độ cao cần thiết và dòng PGMS

trong điều kiện ngày dài cần thiết để bất dục tuyệt đối, ở thời kỳ này chúng
được sử dụng làm mẹ để sản xuất hạt lai F
1
. Trong điều kiện nhiệt độ ôn hoà
hoặc ngày ngắn cần thiết để các dòng TGMS và PGMS sẽ hữu dục bình
thường, chúng được nhân giống để duy trì hạt dòng mẹ bằng tự thụ phấn.
Do tính bất dục được kiểm soát bởi các gen lặn nên hầu hết các giống
lúa thường phục hồi phấn được cho các dòng TGMS và PGMS. Như vậy việc
chọn được dòng phục hồi sẽ dễ dàng hơn, phổ cập hơn, có thể mở rộng ra
ngoài phạm vi của một loài phụ và khả năng tạo ra các tổ hợp năng suất cao
hơn được tăng lên đáng kể.
Kiểu gen của TGMS và PGMS dễ dàng được chuyển sang giống khác,
để tạo ra các dòng bất dục mới với nguồn di truyền khác nhau, tránh được
nguy cơ đồng tế bào chất và thu hẹp phổ di truyền.
Tính bất dục của các dòng TGMS và PGMS không liên quan đến tế bào
chất vì thế các ảnh hưởng của kiểu bất dục dạng dại “WA” đã được khắc
7
phục, khả năng kết hợp giữa năng suất cao và chất lượng tốt được mở rộng và
hiện thực hơn.
Chất lượng gạo của lúa lai hệ hai dòng dễ được cải thiện hơn lúa lai hệ
ba dòng, vì cơ hội chọn tạo dòng bố rất lớn.
Tóm lại, hệ thống lúa lai hai dòng đơn giản hơn nhiều so với lúa lai ba
dòng trong sản xuất hạt lai và nhân dòng bất dục. Do vậy, giá thành sản xuất hạt
lai thấp hơn và hiệu quả của lúa lai thương mại cũng cao hơn (Hoàng Thuyết
Minh, 2002) [3].
2.2.3. Phát hiện bất dục đực chức năng di truyền nhân
2.2.3.1. Phát hiện bất dục đực chức năng di truyền nhân
Năm 1973, theo dõi giống Nongken 58 (Japonica chín muộn có nguồn
gốc là bất dục đực di truyền TBC), Shi Mong Shong ở Trung tâm nghiên cứu
lúa lai tỉnh Hồ Bắc (Trung Quốc) phát hiện thấy một số cá thể bất dục phấn khi

trỗ bông vào thời gian có độ dài ngày ngắn dưới 13h45phút, giai đoạn mẫn cảm
xảy ra khi phân hoá gié đến khi hình thành tế bào mẹ hạt phấn. Có thể coi đây
là công cụ đầu tiên để khai thác chọn tạo giống lúa lai hai dòng (Nguyễn Công
Tạn, 2002) [7]. Sau công trình này người ta tiếp tục tìm ra các dòng vật liệu bất
dục đực di truyền nhân cảm ứng với nhiệt độ (TGMS), các dòng vừa cảm ứng
với nhiệt độ, vừa cảm ứng với quang chu kỳ (PTGMS, TPGMS), các dòng
PGMS ngược, TGMS ngược, các dòng bất dục đực di truyền nhân cảm ứng với
điều kiện môi trường (Environmental-sensitive Genni Male Sterility EGMS)
(Nguyễn Công Tạn, 2002) [7].
2.2.3.2 Đặc điểm của dòng bất dục đực chức năng di truyền nhân mẫn cảm
với nhiệt độ - TGMS
Sự thay đổi của các dòng TGMS chủ yếu là do nhiệt độ. Các dòng TGMS
hiện có trở nên hoàn toàn bất dục đực trong điều kiện nhiệt độ cao hơn và hữu dục
trở lại dưới nhiệt độ thấp hơn. Độ dài của ngày có ít ảnh hưởng đến sự thay đổi
tính hữu thụ (Trần Duy Quý, 2000) [18].
8
Đặc điểm di truyền của dòng TGMS là dòng bất dục đực mẫn cảm với
nhiệt độ. Gen kiểm tra tính bất dục nằm trong nhân tế bào là một cặp gen lặn
tms cặp gen lặn tms cũng có hai chức năng tương tự như gen pgm. Ở vào giai
đoạn mẫn cảm nếu nhiệt độ môi trường tăng cao thì gen tms hoạt động gây
bất dục, nếu nhiệt độ môi trường giảm xuống thấp thì gen tms hoạt động theo
hướng ngược lại là gây nên tính hữu dục đực (Nguyễn Công Tạn, 2002) [7].
Theo Yuan Long Ping và XI Q.F (1995) [23] thì giai đoạn chuyển hoá
hữu dục của các dòng TGMS là từ khi hình thành tế bào mẹ hạt phấn đến
phân chia tế bào mẹ hạt phấn tức 12 - 18 ngày trước khi lúa trỗ.
Giới hạn gây bất dục đực nằm trong khoảng 23- 30
o
C tuỳ theo dòng
(Nguyễn Văn Hoan, 2006) [16].
Thời kỳ cảm ứng nhiệt độ của dòng TGMS tương đối ngắn và muộn.

Nhiệt độ tới hạn gây hữu dục và bất dục của các dòng rất khác nhau. Liu Yi
Bai và Cs (1997) (Trần Duy Quý, 2004) [18] đã đưa ra bốn giới hạn có liên
quan đến quá trình chuyển hoá hữu dục, bất dục của các dòng TGMS. Mối
liên hệ này được minh họa theo sơ đồ sau:
Biểu hiện
hữu dục
Bất dục
sinh lý
Hữu dục Bán bất dục Bất dục Bất dục
sinh lý
Ảnh hưởng
của nhiệt độ
BLT FT ST BUT
Trong đó:
BUT (Biological Upper Temperature): nhiệt độ giới hạn sinh học trên.
BLT (Biological Lower Temperature): nhiệt độ giới hạn sinh học dưới.
F.T (Fertile Temperature): nhiệt độ gây hữu dục.
S.T (Sterile Temperature): nhiệt độ gây bất dục.
Ở nước ta, theo tài liệu thống kê thì trong điều kiện miền Bắc có hai
giai đoạn mà nhiệt độ môi trường có thể phù hợp để dòng TGMS hữu dục. Đó
là giai đoạn từ 10 - 30/3 và 15 - 25/10 đặc biệt là từ 10 - 30/3. Thời kỳ này bố
9
trí duy trì dòng TGMS. Còn giới hạn để gây chuyển hoá hữu dục an toàn ở
nước ta là 24
o
C. Điều này có nghĩa trong điều kiện nhiệt độ 19 - 24
o
C, dòng
TGMS sẽ hữu dục, trong điều kiện nhiệt độ lớn hơn 26
o

C dòng TGMS sẽ bất
dục hoàn toàn (Nguyễn Văn Hoan, 2006) [16].
2.2.4. Các phương pháp chọn tạo dòng mẹ lúa lai hai dòng (EGMS)
2.2.4.1. Những yêu cầu đặc thù đối với một dòng EGMS
Theo Yuan Long Ping (1995) thì tiêu chuẩn để công nhận các dòng
TGMS và PGMS mới sử dụng cho hệ thống lúa lai hai dòng. Ngoài một số
đặc điểm tương tự dòng CMS thì cần phải có một số yêu cầu như sau:
Phải có một quần thể đủ lớn, ít nhất là 1000 cá thể ổn định và đồng nhất
về các đặc tính nông sinh học.
Tỷ lệ cây bất thụ đực trong quần thể phải đạt 100% và mật độ bất dục
khi kiểm tra bằng bao cách ly phải đạt ít nhất là 99.5%.
Trong điều kiện tự nhiên phải có thời kỳ bất dục đực ổn định tối thiểu
là 30 ngày và ở thời kỳ hữu dục tỷ lệ đậu hạt phấn phải lớn hơn 30%.
Sự chuyển hoá hữu dục của một dòng EGMS phải được thử cẩn thận
bằng việc kiểm tra trong điều kiện nhân tạo để xác định chính xác phản ứng
của dòng EMGS với quang chu kỳ và nhiệt độ.
Ở ruộng sản xuất hạt giống, tỷ lệ nhận phấn ngoài của dòng EGMS không
được kém hơn dòng CMS đang sử dụng để sản xuất hạt lai thương phẩm
(Nguyễn Thị Trâm, 2000) [10].
2.2.4.2. Phương pháp chọn tạo dòng mẹ lúa lai hai dòng (EGMS)
Có nhiều phương pháp khác nhau để chọn tạo dòng TGMS.
Các phương pháp truyền thống:
* Nhập nội:
Nhập các dòng sẵn có từ các trung tâm nghiên cứu quốc tế hoặc từ các
quốc gia khác nhằm đón đầu những thành tựu khoa học mới của thế giới, tuy
nhiên các dòng nhập nội có thể chưa thích ứng với điều kiện mới nên sau khi
nhập cần đánh giá lại và tìm biện pháp khai thác thích hợp (Nguyễn Công
10
Tạn, 2002) [7].
* Sàng lọc vật liệu EGMS trong tự nhiên.

Trong tập đoàn vật liệu chọn giống lúa có thể tồn tại các dòng bất dục
do đột biến tự nhiên gây nên. Muốn chọn được cần gieo trồng cẩn thận, quan
sát vào thời kỳ lúa trỗ bông để phát hiện cây bất dục. Khi chọn được cá thể
bất dục, nhổ cả gốc đem trồng trong chậu hoặc trong ô xây để cho cây mọc
chồi chét. Chờ đến khi gặp điều kiện ngoại cảnh thuận lợi lúa chét có thể phục
hồi hữu dục. Lúc đó, xác định xem tính hữu dục chịu ảnh hưởng của yếu tố
nào: nhiệt độ hay quang chu kỳ hoặc không phải là dòng bất dục EGMS.
Trường hợp cơ sở nghiên cứu có buồng khí hậu nhân tạo thì có thể xác
định nhanh tính cảm ứng với điều kiện ngoại cảnh của các cá thể bất dục được
chọn. Cách làm như sau: Trồng cây bất dục vào chậu hoặc túi nilon, cắt bỏ
các bông bất dục đã trỗ, sau 7 - 10 ngày các chồi mới mọc lên thành cây,
chuyển chậu (hoặc túi) vào buồng xử lý nhiệt độ (hoặc quang chu kỳ) từ
10 - 12 ngày, sau đó chuyển ra nhà lưới, khi lúa trỗ tiến hành kiểm tra hạt
phấn, trên cơ sở số liệu thu được xác định dòng đó là dòng EGMS loại nào và
tiến hành nhân dòng để nghiên cứu tiếp (Nguyễn Thị Trâm, 2002) [11].
* Tạo dòng EGMS bằng phương pháp lai và chọn lọc cá thể.
Quan sát và phát hiện tất cả các dạng bất dục tuyệt đối xuất hiện trên
quần thể ruộng lúa. Dựa vào ngày trổ để xác định sơ bộ chúng thuộc dạng
TGMS hay là PGMS. Các dạng bất dục đực phát hiện được cần kiểm tra trong
điều kiện ngày ngắn và nhiệt độ ôn hòa bằng lúa chét để kiểm tra xem chúng
có phải là EMGS (Nguyễn Văn Hoan, 2006) [16].
* Tạo dòng EGMS mới bằng phương pháp đột biến nhân tạo.
Là một trong những phương pháp được sử dụng rất rộng rãi trong gây
tạo đột biến. Mục đích tạo ra các đột biến gen kiểm soát tính trạng bất dục
đực ở lúa.
Tác nhân gây đột biến là các bức xạ cực tím, các bức xạ điện từ, các bức
11
xạ hạt.
Các bước tiến hành như sau:
Chọn tác nhân đột biến: Liều lượng xử lý theo các kết quả nghiên cứu

để tạo các đột biến gen gây bất dục đực nhạy cảm với điều kiện môi trường
(EGMS), người ta thường sử dụng phóng xạ γCo
60
với liều lượng 20-25 Krab
sẽ thu được tần số bất dục đực cao.
Xác định đối tượng xử lý và bộ phận xử lý: Kết quả nghiên cứu của
nhiều tác giả đã chỉ ra rằng để tạo đột biến gen kiểm soát tính trạng bất dục đực
thì bộ phận xử lý thường được sử dụng là hạt khô, hạt ướt hoặc hạt nảy mần.
Sàng lọc đột biến: Được tiến hành sau khi thu được các đột biến bất
dục đực có khả năng di truyền cho các đời sau. Dùng nhiệt độ để đánh giá các
dòng đột biến thu được.
Nhân và sử dụng các thể đột biến thu được (Hoàng Thuyết Minh, 2002) [3].
* Phương pháp lai lại (Backcross)
Là phương pháp lai trở lại được sử dụng khi có sẵn các dòng có nhiều
đặc điểm nông sinh học tốt mà không chứa gen EGMS, đồng thời có dòng
chứa gen EGMS cần thiết từ một dòng cho (donor). Vì tính bất dục của các
dòng TGMS và PGMS đều được kiểm tra bởi gen lặn nên bắt đầu lai lại ngay
từ F
1
sẽ giữ được tính bất dục ở thế hệ sau. Phương pháp lai lại có thể chuyển
được gen EGMS giữa các giống không cùng loài phụ hoặc giữa bố mẹ không
tương hợp di truyền (Nguyễn Thị Trâm, 2002) [11].
* Nhược điểm của các phương pháp truyền thống
Các phương pháp truyền thống trên bên cạnh những ưu điểm thì cũng
có những nhược điểm như sau:
- Các phương pháp trên mất nhiều thời gian để tạo ra một giống mới,
thời gian để tạo ra một dòng TGMS mới thường mất ít nhất từ 7- 10 năm.
- Ngoài tốn nhiều thời gian và công sức thì hiệu quả chọn lọc của các
phương pháp này không cao. Tạo ra các dòng TGMS có phổ di truyền hẹp, ít có
khả năng chống được các loài sâu bệnh, các điều kiện xấu của môi trường và khả

12
năng thích ứng hẹp.
- Kết quả chọn lọc của các phương pháp này phụ thuộc nhiều vào môi
trường và kiểu hình.
2.3. Chỉ thị phân tử và ứng dụng trong chọn tạo giống lúa lai hai dòng
2.3.1. Khái niệm chỉ thị phân tử
Chỉ thị phân tử là bất kỳ chuỗi mã DNA nào được dùng để phân biệt
giữa hai cá thể, hai dòng hoặc giống khác nhau, đều có thể xem là chỉ thị
DNA (Phan Hữu Tôn, 2005) [17].
Chỉ thị phân tử được phát minh và sử dụng từ những năm 1980, là một
kỹ thuật quan trọng trong nghiên cứu di truyền và chọn tạo giống thực vật.
Những thành quả gần đây nhờ phát triển kỹ thuật vi vệ tinh (microsatellitles)
và trình tự số liệu phân tích trình tự genom đã được cung cấp một số lượng lớn
không giới hạn chỉ thị PCR trên hệ gen của lúa như SSRs (Single Squence
Reprated), SNPs (Single Nucleotide Polymorphysm),… sẽ thúc đẩy tốc độ
chọn giống lúa (Hoàng Thuyết Minh, 2002) [3].
2.3.2. Các chỉ thị phân tử dựa trên phản ứng PCR
* Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphysm)
AFLP (Đa hình chiều dài đoạn được nhân bản chọn lọc) do Vos và Cs
phát minh (1975) (Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 1995) [3]. Nguyên tắc của
phương pháp AFLP giống như RFLP, điểm khác biệt cơ bản là AFLP không
cần tiến hành lai phân tử (lai Southem blot) do vậy thực hiện nhanh hơn. Đây
là phương pháp nhân bội ADN sau khi đã được cắt bằng enym cắt giới hạn.
Phân tích AFLP gồm các bước: cắt ADN bằng enym cắt giới hạn, gắn adapter
(trình tự bổ sung với đầu cắt), nhân bội các đoạn cắt giới hạn bằng PCR, điện
di so sánh được sự đa dạng (Khuất Hữu Thanh, 2003) [4].
* Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat)
SSR (Khuếch đại các đoạn lặp lại đơn giản) còn gọi là phương pháp vi
vệ tinh hay tiểu vệ tinh. Khi nghiên cứu genom một số sinh vật, người ta đã
13

phát hiện ra những đoạn AND có chiều dài khác nhau phân bố một cách ngẫu
nhiên mà trình tự của nó bao gồm các nhóm nucleotide giống nhau nhắc lại
nhiều lần. Các nhóm này thường có số lượng không vượt quá 5 nucleotide,
các đoạn ADN nhắc lại này có trình tự rất đặc trưng cho mỗi đoạn. Bởi vậy
mà trình tự đặc trưng ở hai đầu của đoạn nhắc lại này đã được sử dụng để
thiết kế mồi cho phản ứng PCR. Khi sử dụng các mồi đặc hiệu này để chạy
cho các cá thể hoặc các giống sẽ cho kết quả về sự đa dạng giữa các cá thể
hoặc các giống. SSR là chỉ thị đồng trội nên nó được sử dụng để phát hiện cá
thể dị hợp tử và lập bản đồ gen sử dụng hai quần thể F
2
. Chỉ thị SSR là công
cụ hữu hiệu của phân tích hệ gen và lập bản đồ di truyền của thực vật. Song
nó cũng có nhược điểm là quy trình thiết kế mồi rất đắt và mỗi mồi chỉ đặc
trưng cho một loài (Phan Hữu Tôn, 2005) [17].
* Chỉ thị STS (Sequence Tagged Sites)
Phương pháp STS (Điểm trật tự được đánh dấu) lần đầu tiên được
M. Olson nêu ra vào năm 1989 trong nghiên cứu lập bản đồ gen ở người sau
khi kỹ thuật PCR ra đời. STS có thể được xem như là một kỹ thuật thay thế
RFLP và RAPD. Nguyên lý của STS là: trước tiên người ta xác định trình tự
các Nucleotide ở hai đầu của các đoạn ADN sử dụng làm mẫu dò trong kỹ
thuật RELP và sản phẩm RAPD, sau đó dựa vào trình tự đã xác định, người ta
đã thiết kế những mồi PCR có chiều dài khoảng 18 - 20 Nucleotide. Với những
mồi như vậy, chúng có thể tổng hợp nên những đoạn ADN nằm trong vùng sản
phẩm RFLP và RAPD. Quy trình kỹ thuật STS cũng tương tự như với SSR, tuy
nhiên có một số điểm cần phải điều chỉnh cho phù hợp, chẳng hạn như nhiệt độ
gắn mồi (Lã Tuấn Nghĩa, Vũ Đức Quang, Trần Duy Quý, 2004) [5].
* Chỉ thị ALP (Amplion Length Polymorphysm)
Sự đa hình về chiều dài những đoạn ADN được nhân lên trên cơ sở
nhân gen PCR. Sự đa hình được phát hiện ngay bằng cách điện di sản phẩm
14

nhân gen PCR trên gel agarose và acrylamide (Phan Hữu Tôn, 2005) [17].
* Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorpism DNA)
Chỉ thị RAPD (Đa hình các đoạn DNA nhân bản ngẫu nhiên) do
William (1990), Welsh và Cs (1991) phát minh. Đây là kỹ thuật phát hiện tính
đa dạng của ADN nhân bản ngẫu nhiên dựa trên nguyên lý của kỹ thuật PCR
nhưng chỉ cần các đoạn mồi ngắn có kích thước 8 - 12 Nucleotide (thông
thường là 10 Nucleotide). Theo tính toán một mồi ngẫu nhiên gồm
10 Nucleotide thì xác suất bắt gặp của nó là ¼
10
= 1/1.048.576 nghĩa là một
đoạn ADN khuôn có 1.048.576 cặp nucleotide thì có một trình tự bắt cặp với
mồi. Như vậy với một đoạn mồi ngẫu nhiên có thể có 524 vị trí bắt cặp với
mồi, nghĩa là có thể có 262 đoạn được nhân bội. Trong thực tế số đoạn được
nhân bội nhỏ hơn rất nhiều vì nó phụ thuộc vào độ dài đoạn được nhân bội và
sự sắp xếp các trình tự bắt cặp với mồi trên ADN của bộ gen.
Các sinh vật có bộ gen giống nhau hoàn toàn khi nhân gen bằng máy PCR
với các mồi ngẫu nhiên, kết quả thu được các đoạn ADN hoàn toàn giống nhau về
kích thước và cấu trúc. Điện di kết quả nhân gen thu được điện di đồ gồm những
băng, vạch ADN ở những vị trí giống nhau trên bản gel. Khi bộ gen của các mẫu
kiểm tra có sự khác nhau (có sự đa dạng sinh học) thì sẽ cho kết quả khác nhau
trên điện di đồ.
RAPD là một kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, không mất nhiều thời
gian, ít tốn kém. Kỹ thuật này rất phù hợp cho phân tích đa dạng di truyền và
lập bản đồ gen sử dụng quần thể RIL (Recombinant Inbred Line). Tuy nhiên
nó cũng có hạn chế là rất nhạy cảm với các yếu tố tham gia phản ứng như: các
thành phần tham gia phản ứng và đặc biệt là nhiệt độ gắn mồi, đôi khi kết quả
không lặp lại được, đặc biệt là những cơ thể có bộ gen lớn như lúa mì (Devos
K.M và Cs, 1992) (Nguyễn Văn Hoan, 2004) [15]. RAPD là một chỉ thị trội,
nghĩa là chỉ thị này không phân biệt được giữa những cá thể đồng hợp tử và dị
15

hợp tử trong quần thể F
2
.
2.2.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo
lúa lai hai dòng
2.2.3.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới
Trong chọn giống, để tạo vật liệu khởi đầu mới các nhà chọn giống truyền
thống phải đánh giá vật liệu khởi đầu thông qua các chỉ thị hình thái, đánh giá
khả năng kết hợp chung, riêng, lai thử hàng loạt các cặp lai lại, đánh giá ƯTL,
chọn lọc phả hệ trong phân ly các đời sau, đánh giá ƯTL F
1
trên đồng ruộng để
tìm ra cặp lai tốt nhất, hoặc thực hiện backross để quy tụ một gen nào đó vào
một giống đã xác định. Cách làm này đòi hỏi nhiều thời gian và công sức
(Hoàng Thuyết Minh, 2002) [3].
Đối với lúa lai nói chung và lúa lai hai dòng nói riêng chỉ thị phân tử có
3 ứng dụng lớn: thứ nhất nhằm xác định các tính trạng cụ thể và bảo vệ nguồn
tài nguyên di truyền của các dòng bố mẹ, thứ hai là lập bản đồ genom và cuối
cùng là trợ giúp của chỉ thị phân tử trong công tác chọn giống (MAS- Marker
Assisted Selection) (Hoàng Thuyết Minh, 2002) [3].
Các chỉ thị phân tử liên kết chặt chẽ với các tính trạng kiểu hình đã được
sử dụng để xác định các đặc trưng của các dòng bố mẹ trong nghiên cứu lúa lai
và để xác định tiềm năng ƯTL; chỉ thị phân tử đã được sử dụng để lập bản đồ
một số gen quan trọng và định vị một số tính trạng số lượng QTLs
(Quantitative Trait Loci) thông qua liên kết di truyền. Một số gen vô cùng quan
trọng đối với nghiên cứu và phát triển lúa lai như gen kiểm soát tính trạng phục
hồi hữu dục; gen tương hợp rộng, gen kiểm soát tính trạng bất dục đực nhạy
cảm với nhiệt độ, tính trạng bất dục đực nhạy cảm với độ dài chiếu sáng,… đã
được đánh dấu phân tử. Ngoài ra nhiều nghiên cứu đã triển khai để lập bản đồ
các QTL có ảnh hưởng tổng hợp đến các tính trạng hình thái như là bất dục đực

ở con lai, tỉ lệ thụ phấn chéo và ƯTL ở lúa đồng thời tăng thêm hiểu biết của
16
chúng ta về cơ sở di truyền của các tính trạng tổng hợp nêu trên. Nhờ kỹ thuật
MAS chúng ta đã thu được nhiều kết quả trên lĩnh vực cải tiến tính trạng kháng
vi khuẩn và chất lượng hạt trong một số giống lai quan trọng nhất.
Li Chengquan và Cs, Viện Nghiên cứu Lúa thuộc viện Hàn Lâm khoa
học Nông nghiệp An Hội, Trung Quốc đã sử dụng kỹ thuật MAS để quy tụ
gen Xa21 vào dòng PGMS 3418S. Dòng bất dục này rất ổn định và có khả
năng kháng bệnh bạc lá vi khuẩn tương đương giống IRBB21.
Ngoài ra MAS đã trở thành kỹ thuật thông dụng trong quy trình chọn
tạo các dòng phục hồi tại IRRI.
Các tác giả Wan Bingliangs, Yang Guacai, Qi Huaxiong, Trung tâm phát
triển lúa lai - Viện hàn lâm Khoa học Trung Quốc và Mou Tongmin, Trường
tổng hợp Huazhong, Vũ Hán - Trung Quốc (2002) đã chuyển thành công gen
kháng bệnh khô vằn (Rhizoctonia solani) vào giống lúa thuần 905, dòng bố của
tổ hợp lai hai dòng.
O.U.K. Reddy, E.A. Siddig và Cs đã lập bản đồ phân tử của 65 con lai
trong đó 31 con lai indica/indica, 34 là indica/javonica (WC) con lai giữa 24
dòng TGMS và nhiều dòng thuần khác. Đã sử dụng 10 mẫu dò có tên là
OPD-3, OPU-7, OPU-14, OPZ-18, OPZ-19, OPZ-20, OPA-7 + OPA-6 và
OPA-12 + OPA-15. Đã thiết lập đồ thị hình cây (Dendogram) về khoảng cách
di truyền giữa các bố mẹ lớn hơn. Kết quả phân tích cho thấy khoảng cách
giữa bố mẹ lớn hơn 0.7 thì độ hữu dục thấp và năng suất giảm. Sự sai khác
nằm trong khoảng 0.4 - 0.7 thì khả năng kết hợp cao và ƯTL cao.
Li Rongbai và Yang Xinqing, Viện hàn lâm Khoa học Nông nghiệp
Nam Ninh, Quảng Tây, Trung Quốc (2002), đã dùng kỹ thuật RAPD để
nghiên cứu đấu vết (fingetprinting) của 4 dòng TGMS và 15 dòng cho phấn,
các dòng bất dục đực đã lai với các dòng cho phấn và đánh giá ƯTL F
1
trên

đồng ruộng. 10 trong 15 chỉ thị RAPD biểu hiện tính đa hình rất cao trong
nghiên cứu dấu vết. Khoảng cách di truyền từ 0.22 đến 0.75 có liên kết chặt
17
chẽ và tương quan chặt đến ƯTL về năng suất F
1
. Nếu khoảng cách di truyền
giữa các dòng bố mẹ vượt 0.75 thì hệ số tương quan với năng suất không chặt.
Các tổ hợp có khoảng cách di truyền là 0.72 đều cho ƯTL chuẩn 28.5%.
Qua đây chúng ta thấy chọn giống dưới sụ trợ giúp của chỉ thị phân tử
là một hướng nghiên cứu đầy triển vọng. Nó như một nhịp cầu gắn kết giữa
công nghệ sinh học với phương pháp chọn giống cổ điển. Nó đã trở thành một
hợp phần phổ biến của các quá trình lai trở lại. Quá trình lập bản đồ cũng như
quá trình chọn lọc các tính trạng đơn gen hoặc đa gen có giá trị cao về mặt di
truyền và kinh tế. Các kỹ thuật chỉ thị phân tử được sử dụng để trợ giúp và
đảm bảo sự chính xác cho các nhà chọn giống nhận diện đúng và thiết lập
được ranh giới bản quyền của những loài mới được phát hiện (Hoàng Thuyết
Minh, 2002) [3].
2.2.3.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong nước
Nhận thức vai trò của chỉ thị phân tử DNA và bản đồ di truyền trong
công tác nghiên cứu hệ gen và công tác chọn tạo giống lúa, một số sở nghiên
cứu của Việt Nam, với sự hợp tác trong nước và quốc tế đã tiến hành triển
khai hướng nghiên cứu này (Nguyễn Công Tạn, 2002) [7].
Nguyễn Văn Đồng và Cs (1977) đã sử dụng chỉ thị microsatellite để
đánh giá mức độ thuần chủng của các dòng TGMS (làm mẹ) và các dòng
không phải TGMS (dòng bố) trước khi tiến hành lai tạo nhằm đảm bảo sự
“đồng đều” tuyệt đối của con lai F
1
. Bằng phương pháp này có thể xác định sự
đa dạng di truyền giữa các dòng bố, mẹ, trên cơ sở đó xác định, lựa chọn tổ
hợp lai, dự đoán ƯTL, thậm chí có thể định hướng trước kết quả sẽ nhận được

ở con lai F
1
và đánh giá mức độ đồng đều của con lai F
1
trước khi đưa chúng
vào sản xuất trên quy mô thương mại.
Từ năm 1999 - 2000, Nguyễn Văn Đồng và Cs được tổ chức
Rockefeller tài trợ đã tiến hành nghiên cứu và lập bản đồ gen của các dòng
bất dục đực di truyền nhân TGMS - VN1 tại phòng thí nghiệm Sinh học phân
18
tử thực nghiệm, Trường Đại học Tổng hợp Texas Tech USA. Bằng phương
pháp phân tích BSA kết hợp với kỹ thuật RELP, kỹ thuật AFLP và kỹ thuật vi
vệ tinh đã xác định gen tms4 của dòng lúa này nằm cạch tâm động trên vai
ngắn của NST số 2 cách chỉ thị phân tử E5/M12-600 là 3.3 cM (Nguyễn Công
Tạn, 2002) [7].
Nguyễn Thị Lang đã sử dụng DNA marker để định vị gen tms3 và lập
bản đồ di truyền của dòng TGMS mang gen này.
2.2.3.3. Ưu điểm của kỹ thuật chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS)
Đối với chọn giống, sự trợ giúp của chỉ thị phân tử MAS là một kỹ
thuật đã thành thục hiện nay và có ưu điểm nổi bật là có thể phát triển bản đồ
liên kết với mật độ chỉ thị phân tử cao và rất đa dạng về các dạng chỉ thị phân
tử. Cùng với kỹ thuật MAS, nhà chọn giống có thể quy tụ được nhiều tính
trạng (gen) mong muốn vào dòng bố hay dòng mẹ trong một thời gian ngắn
(Nguyễn Công Tạn, 2002) [7].
Chỉ thị di truyền cho phép nhà chọn giống thấy rõ mối quan hệ:
“Tính trạng - Gen (QTLs) - Môi trường”. Do vậy, họ dễ dàng đưa ra một
chiến lược thích hợp và chuẩn xác trong chương trình chọn giống của mình
nhằm tìm kiếm, phát hiện những biến dị di truyền trong số các cá thể, giữa
các giống trong loài.
Chỉ thị di truyền giúp các nhà chọn giống chọn lọc chính xác các tổ hợp gen

quan tâm. Họ có thể quy tụ một số gen quý vào một số giống đã xác định (MAS).
Những chỉ thị di truyền liên kết chặt với những gen sẽ được sử dụng để
chọn lọc các cá thể ngay ở giai đoạn rất sớm mà không phụ thuộc vào điều kiện
môi trường. Quá trình này gọi là quá trình chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử (MAS)
hay còn gọi là chọn giống phân tử. Nhờ kỹ thuật MAS mà nhà chọn giống có thể
thực hiện chọn lọc một số tính trạng trong thời gian ngắn mà chọn giống kháng
bệnh, giống có những đặc điểm sinh lý khác nhau và giống chất lượng. MAS có
thể phát hiện giữa những cây đồng hợp tử (AA) và những cây dị hợp tử (Aa) mà
19
về mặt kiểu hình hoàn toàn giống nhau, có khả năng chọn lọc được nhiều tính
trạng trong cùng một thời gian của cùng một cây và như vậy cho phép tích góp
các gen khác nhau vào cây cần tạo (gen pyramiding). Hơn nữa, MAS không
những cho các nhà chọn giống chọn lọc những tính trạng đơn gen mà cả với
những tính trạng đa gen (Hoàng Thuyết Minh, 2002) [3].
2.3. Tình hình nghiên cứu và kết quả chọn tạo lúa lai hai dòng trong và
ngoài nước
2.3.1. Tình hình nghiên cứu lúa lai hai dòng trên thế giới
Kỹ thuật lúa lai đã thành công tại Trung Quốc hơn 25 năm trước đây, từ
đó đến nay diện tích gieo cấy lúa lai đã đạt 50% tổng diện tích lúa tại nước này.
Kỹ thuật lúa lai đã ứng dụng tại hơn 20 nước khác nhau trên phạm vi toàn thế
giới. Hàng năm khoảng 700000 ha được gieo cấy tại Việt Nam, Ấn Độ, Philippin,
Banglades, Myanmar và Mỹ. Kỹ thuật lúa lai đã góp phần làm tăng năng suất và
thu nhập của người nông dân, tạo thêm công ăn việc làm cho nông dân thông qua
sản xuất hạt giống lúa lai. Lúa lai đã góp phần đảm bảo an ninh lương thực và bảo
vệ môi trường tại Trung Quốc và hy vọng cũng mang lại lợi ích tương tự cho các
quốc gia khác ngoài Trung Quốc (Hoàng Thuyết Minh, 2002) [3].
Năng suất lúa lai tại Trung Quốc đạt bình quân 6.9 tấn/ha vượt năng
suất lúa thuần 1.5 tấn/ha. Tính đến năm 2001, diện tích lúa lai hai dòng tại
Trung Quốc đạt 2.5 triệu ha và năng suất cao hơn lúa lai ba dòng 5 - 10%.
Diện tích sản xuất hạt giống lúa lai hai dòng là 115000 ha với năng suất hạt

lai F
1
bình quân đạt 2.7 tấn/ha. Thông qua chương trình cải tiến các tính trạng
hình thái và khai thác ƯTL giữa hai loài phụ (indica/japonica), năm 2000 đã
nhận được một số giống lai siêu năng suất (10.5 tấn/ha trên diện tích 67 ha và
đạt 9.2 tấn/ha trên diện tích 1.2 triệu ha). Thành công mới trong thời gian gần
đây (2000 - 2002) đã tạo ra tổ hợp lai hai dòng năng suất siêu cao, trong phạm
vi thí nghiệm đã đạt 12 - 14 tấn/ha (Hoàng Thuyết Minh, 2002) [3].
Diện tích lúa lai của Trung Quốc đã tăng trở lại từ 14 triệu ha năm 2003
20
lên 15.8 triệu ha năm 2007, chiếm 53.4% diện tích lúa toàn Trung Quốc
(85% diện tích lúa lai toàn Châu Á). Hiện tại có tới 40 quốc gia ở Châu Á,
Châu Mỹ và Châu Phi tham gia vào tiến trình nghiên cứu phát triển lúa lai
(Nguyễn Khắc Quỳnh, 2009) [9].
Các nhà khoa học Trung Quốc, Nhật Bản, Viện Lúa quốc tế (IRRI) và
Ấn Độ,… đã xác định được 6 kiểu gen kiểm soát tính trạng bất dục đực nhạy
cảm với nhiệt độ - TGMS lần lượt là:
- Gen tms1 thu được từ đột biến tự nhiên từ giống IR54. Theo các tác
giả Sun và Cs, 1996; Yang và Cs, 1992; Wang và Cs, 1995, 1996 thì gen tms1
nằm trên NST số 8 (Nguyễn Công Tạn, 2002) [7].
- Gen tms2 do Maruyama và Cs (1991) phát hiện thông qua đột biến
bằng tia gamma, nằm trên NST số 7 [24].
- Gen tms3 do Virmani, 1993; Sabudi, 1995 tạo ra bằng đột biến được
xác định nằm trên NST số 6 (Nguyễn Công Tạn, 2002) [7].
- Gen tms4 do Nguyễn Văn Đồng (1999) và Cs xác định được từ dòng
TGMS - VN1 nằm trên NST số 2 (Nguyễn Văn Đồng, 1995) [13].
- Gen tms5 do Luxing Gui và Cs xác định được nằm trên NST số 9
(Luxing Gui, et al, 2002) [22].
- Gen tms6 do Hak Soo Suh và Cs phát hiện nằm trên NST số 5 (Hak
Soo Suh, et al, 2005) [20].

Ngoài việc xác định vị trí các gen trên NST, các chỉ thị phân tử liên kết
với các gen bất dục đực nhạy cảm với nhiệt độ (TGMS) nói trên cũng đã được
xác định. Theo kết quả nghiên cứu của M.T. Lopez et al cho thấy các marker
RM11 và RM2 (nằm trên NST số 7) liên kết chặt với gen tms2 lần lượt với
khoảng cách là 5cM và 16cM, từ đó ta có thể sử dụng hai marker này vào trong
công tác chọn giống nhằm phát hiện gen tms2 (M.T.Lopez, et al, 2003) [23].
Guangqia Zhou, Xunzhen Li và Jianlin Zhou (2002), Viện khoa học đời
sống Hồ Nam - Trung Quốc, đã xử lý đột biến nguồn Gamma Co
60
liều lượng
21
350 GY với dòng bất dục đực TGMS Shuangdis có giá trị CFP (Critical fertile
point - điểm chuyển hoá hữu dục) rất thấp, đã thu được 7 thể đột biến có cổ bông
dài từ quần thể F
2
. Sau quá trình gieo trồng và chọn lọc trong điều kiện tự nhiên
và nhân tạo tại đảo Hải Nam, các tác giả đã thu được 3 dòng TGMS mới ổn định
là Shuangdipeies - 1, Shuangdipeies - 7 và Shuangdipeies - 8. Sử dụng các dòng
TGMS này trong sản xuất hạt lai đã không phải phun GA
3
và chúng rất ổn định
về ngưỡng chuyển hoá hữu dục.
Để sản xuất các hạt tự thụ các dòng EGMS, thời vụ gieo cấy đã được xác
định vào các vụ Thu - Đông, vụ Đông hay dùng kỹ thuật tưới nước mát. Năng
suất hạt tự thụ đạt 2 đến 5 tấn/ha. Kỹ thuật sản xuất hạt lai F
1
lúa lai hai dòng đã
được hoàn thiện.
Tại Viện nghiên cứu Lúa Quốc tế IRRI, chương trình nghiên cứu tập
trung vào phát triển lúa lai cho vùng nhiệt đới, các gen tms2 từ giống Norin

PL.12 và tms3 từ dòng đột biến IR32364S đã được sử dụng để tạo ra các dòng
TGMS mới. Như dòng ID24 được đưa vào Ấn Độ đã được sử dụng để chọn
tạo và sản xuất lúa lai hai dòng. Các dòng TGMS IR73827 - 23S và
IR73824S được chọn tạo từ ID24 đã ổn định về tính trạng bất dục đực. Tuy
nhiên các dòng này cần phải thử nghiệm trên đồng ruộng trong vụ Mùa khi có
nhiệt độ thấp hơn vụ Xuân tại IRRI từ 1 - 2
o
C. Việc nhân hạt tự thụ của các
dòng này được thực hiện tại các vùng có vĩ độ cao.
Tại Viện nghiên cứu lúa Quốc tế (2002), B.C Viraktamath và S.S
Virmani đã đánh giá 16 dòng TGMS trong những điều kiện nhiệt độ khác
nhau để xác định ngưỡng chuyển hóa bất dục (Critical sterile point - CSP) và
ngưỡng chuyển hóa hữu dục (Critical ferile point - CFP). Kết quả nghiên cứu
đã chỉ ra rằng hầu hết các dòng TGMS nghiên cứu có ngưỡng nhiệt độ hữu
dục là 27/21
o
C. Các dòng Norin PL.12, IR68939-2-4-40 và IR68301-11-6-4-
4-3 có ngưỡng chuyển hóa bất dục và hữu dục như sau: dòng có giá trị CFP
22
thấp giá trị CSP cũng thấp và ngược lại dòng có CFP cao thì CSP cũng cao.
Năm dòng TGMS được gieo và đánh giá trong điều kiện tự nhiên tại Los
Banos chỉ có hai dòng có thể sử dụng để sản xuất hạt lai F
1
trong mùa khô,
còn ba dòng NorinPL12, ID24 và IR68949-11-5-31 có thể sản xuất cả hai vụ
khô và ướt. Nhưng việc sản xuất hạt tự thụ của dòng ID24 có khó khăn vì giá
trị CFP thấp. Từ kết quả đánh giá các dòng trong điều kiện tự nhiên cũng
tương tự như trong phytotron các tác giả đã cho rằng việc sàng lọc các dòng
TGMS có thể thực hiện tốt ở Los Banos, ngay cả những nơi không có thiết bị
phytotron. Điều này đã mở ra triển vọng cho việc sử dụng các dòng TGMS

trong nghiên cứu và phát triển lúa lai hai dòng tại Philippin.
Theo công bố của M. Ilyas Ahmed và các cộng sự Viện nghiên cứu
Lúa Hyderabad Ấn Độ (2002), các tác giả đã tiến hành đánh giá ngưỡng
chuyển hóa bất dục, hữu dục, tỷ lệ thò vòi nhụy, tỷ lệ thụ phấn chéo và các
tính trạng nông sinh học khác của 31 dòng TGMS được chọn tạo tại IRRI và
trên 50 dòng TGMS khác của Ấn Độ. Kết quả thu được các dòng TGMS có
triển vọng biểu hiện bất dục hoàn toàn ở 25
o
C (tháng 7), hữu dục và kết hạt
khi nở hoa vào tháng 9 đến tháng 3 tại Hyderabad là IR68945-11S, IR68948-
12S, IR68949-11S, TS.29 (ID24), IR68294-7-1S và IR68297-1S. Dòng
IR32364-120 kết hạt ở nhiệt độ thấp. Các tác giả đã rút ra kết luận điều kiện
khí hậu của vùng Hyderabad hoàn toàn phù hợp cho việc nhân các dòng
TGMS và sản xuất hạt lai F
1
lúa lai hệ hai dòng.
Cũng tại Hyderabad, 4 dòng TGMS DRIRTG-1, DRIRTG-2, DRIRTG-3
và MLT-4 được sử dụng để lai tạo ra 289 tổ hợp lai hai dòng sử dụng trong nghiên
cứu tìm tổ hợp cho ƯTL cao. Đã xác định các tổ hợp có năng suất cao vượt xa đối
chứng là DRIRTG-2/IR64, DRIRTG-3/Krishna Hamsa, MLTG-4/INJAV-99,
MLTG-4/SC5-2-2-21 và MLTG-4/PLYT-317. Tổng số có 10 tổ hợp lai hai dòng
đang được sản xuất hạt lai trên diện rộng để tham gia khảo nghiệm quốc gia và
23
mở rộng sản xuất (Hoàng Thuyết Minh, 2002) [3].
2.3.2. Thành tựu chọn tạo giống lúa lai hai dòng ở Việt Nam
Việt Nam bắt đầu nghiên cứu lúa lai vào những năm đầu của thập kỷ
80. Từ năm 1992, đề tài độc lập cấp Nhà nước về nghiên cứu lúa lai đã được
thực hiện và sau đó vấn đề nghiên cứu lúa lai được triển khai trong khuôn khổ
của chương trình KN - 01 và KHCNH - 08. Nguồn vật liệu chủ yếu nhập từ
IRRI hoặc các dòng mới chọn tạo ra cũng mang các gen tms từ vật liệu nhập

nội được chuyển vào các giống địa phương hay vật liệu mới chọn tạo trong
nước. Các dòng TGMS đã được sử dụng trong nghiên cứu để xác định CSP,
CFP, lai thử để tìm tổ hợp lai cho ƯTL cao,… Số lượng các tổ hợp lai hai
dòng chọn tạo trong nước đang được đánh giá tại các cơ sở nghiên cứu, một
số tổ hợp đang được tham gia trong mạng lưới khảo nghiệm quốc gia (Hoàng
Thuyết Minh, 2002) [3].
Những kết quả nghiên cứu bước đầu về lúa lai hai dòng đã được những
thành công bước đầu đó là sự chọn tạo ra các giống lúa lai hai dòng đầu tiên ở
nước ta như các giống Việt lai 20 (103S/R20) (Nguyễn Văn Hoan và Cs,
2004) [11], Việt lai 24 (103S/IR24) (Nguyễn Văn Hoan và Cs, 2006), HYT83
(IR58025/IRQ5) (Nguyễn Trí Hoàn, 2005) [12], TH3-3 (T1S-96/R3) (Nguyễn
Thị Trâm và Cs, 2007),… được công nhận giống quốc gia và một số giống
được công nhận giống tạm thời như: HTY100, HC1, TM4,… Mặt khác để có
vật liệu cho lúa lai hai dòng các nhà khoa học ở nước ta đã nghiên cứu và
chọn tạo thành công các đòng TGMS mới như sau:
24
Bảng 1: Các dòng TGMS được chọn tạo tại Việt Nam
(Hoàng Thuyết Minh, 2002) [3]
STT Tên dòng
Cơ quan chọn
tạo
STT Tên dòng Cơ quan chọn tạo
1 VN-01 Viện DTNN 11 T25 Đại học NNI
2 TGMSVN1 ‘’ 12 T26 ‘’
3 6S ‘’ 13 T27 ‘’
4 7S ‘’ 14 VNTGMS3
Viện
KHKTNNVN
5 8S ‘’ 15 VNTGMS6 ‘’
6 11S ‘’ 16 VNTGMS7 ‘’

7 T29S Đại học NNI 17 VNTGMS8 ‘’
8 103S ‘’ 18 VNTGMS9 ‘’
9 T1S ‘’ 19 VNTGMS10 ‘’
10 T24S ‘’ 20 VNTGMS11 ‘’
25