Đa dạng di truyền vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học và ứng dụng xử lý nước thải sau biogas của trại chăn nuôi heo ở đồng bằng sông Cửu Long

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



HUỲNH VĂN TIỀN
MSHV: 62031104




ĐA DẠNG DI TRUYỀN VI KHUẨN
TỔNG HỢP CHẤT KẾT TỤ SINH HỌC
VÀ ỨNG DỤNG XỬ LÝ NƢỚC THẢI SAU
BIOGAS CỦA TRẠI CHĂN NUÔI HEO
Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG





LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NGÀNH VI SINH VẬT HỌC






2015

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC




HUỲNH VĂN TIỀN
MSHV: 62031104




ĐA DẠNG DI TRUYỀN VI KHUẨN
TỔNG HỢP CHẤT KẾT TỤ SINH HỌC
VÀ ỨNG DỤNG XỬ LÝ NƢỚC THẢI SAU
BIOGAS CỦA TRẠI CHĂN NUÔI HEO
Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG




LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC
MÃ NGÀNH: 62 42 01 07


CÁN BỘ HƢỚNG DẪN
PGS. TS. TRƢƠNG TRỌNG NGÔN

PGS. TS. NGÔ THỊ PHƢƠNG DUNG




2015

i



LỜI CẢM TẠ


Tôi xin chân thành cảm ơn:

PGS.TS. Trương Trọng Ngôn, GS.TS. Cao Ngọc Điệp, PGS. TS.
Hà Thanh Toàn và PGS. TS. Ngô Thị Phương Dung đã dành thời gian
quý báu tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn
thành luận án

Quý Thầy Cô giảng dạy chương trình nghiên cứu sinh chuyên ngành Vi
sinh vật học, trường Đại học Cần Thơ đã truyền đạt cho tôi những kiến thức
quý báu trong thời gian học tập.

Cán bộ phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật và Sinh học Phân tử của Viện
Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ đã
tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận án.

Cám ơn gia đình và tất cả bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt

quá trình học tập và thời gian thực hiện đề tài!


Tác
giả









HUỲNH VĂN TIỀN




ii



CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của NCS Huỳnh Văn
Tiền với sự hướng dẫn của PGS. TS. Trương Trọng Ngôn và PGS. TS. Ngô

Thị Phương Dung. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung
thực, chưa từng được công bố riêng lẻ bởi tác giả khác trong bất kỳ công
trình nào trước đây.

Người hướng dẫn khoa học





PGS. TS. TRƢƠNG TRỌNG NGÔN





PGS. TS. NGÔ THỊ PHƢƠNG DUNG
Tác giả luận văn





HUỲNH VĂN TIỀN

iii



MỤC LỤC

Trang
Lời cảm tạ i
Lời cam đoan ii
Mục lục iii
Danh sách bảng vii
Danh sách hình x
Danh mục từ viết tắt xiii
Tóm tắt xv
Abstract xvii
Chƣơng 1: Giới thiệu 1
1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1
1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 2
1.2.1 Mục tiêu đề tài 2
1.2.2 Nội dung nghiên cứu 2
1.3 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 3
1.4 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận
án 3
1.5 Cơ sở lý luận và giả thuyết khoa học 4
Chƣơng 2: Tổng quan tài liệu 5
2.1 Tổng quan về chất thải chăn nuôi heo 5
2.1.1 Đặc điểm của nước thải sau biogas chuồng trại chăn nuôi heo 5
2.1.2 Quản lý chất thải chăn nuôi heo trên thế giới 5
2.1.3 Quản lý chất thải chăn nuôi heo tại Việt Nam 6
2.2 Xử lý nƣớc thải trong chăn nuôi 7
2.2.1 Các chỉ tiêu đánh giá chất lượng nước 7
2.2.2 Biện pháp xử lý nước thải 8
2.3 Kết tụ sinh học trong nƣớc 9
2.3.1 Kết tụ sinh học (Bioflocculant) 9
2.3.2 Nghiên cứu vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học 18
2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kết tụ của vi khuẩn 23

2.3.4 Ứng dụng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học xử lý nước
thải 29

iv



2.3.5 Quy trình ứng dụng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
trong xử lý nước thải 31
Chƣơng 3: Phƣơng pháp nghiên cứu 33
3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu 33
3.1.1 Thời gian 33
3.1.2 Địa điểm 33
3.1.3 Vật liệu 33
3.1.4 Thiết bị 34
3.1.4 Hóa chất 34
3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 35
3.2.1 Chuẩn bị mẫu 35
3.2.2 Phân lập và làm thuần 36
3.2.3 Phân tích và xử lý số liệu 38
3.3 Nội dung nghiên cứu 38
3.3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 38
3.3.2 Phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kế tụ
sinh học 40
3.3.3 Nhận diện vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học bằng sinh
học phân tử 41
3.3.4 Phân tích các chỉ số đa dạng di truyền dựa trên trình tự 16S
rRNA 46
3.3.5 Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp chất
kết tụ sinh học của hai chủng vi khuẩn được tuyển chọn 47

3.3.6 Ly trích chất kết tụ sinh học 53
3.3.7 Thử nghiệm hiệu suất kết tụ nước thải chăn nuôi heo sau
biogas của vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học 54
3.7.8 Ứng dụng các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
xử lý nước thải sau biogas 55
Chƣơng 4: Kết quả và thảo luận 56
4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học… 56
4.2 Đặc điểm của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học 57
4.2.1 Đặc điểm của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
protein 57
4.2.2 Đặc điểm của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
polysaccharide 58

v



4.3 Tỷ lệ kết tụ của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh
học 59
4.3.1 Tỷ lệ kết tụ của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh
học protein 59
4.3.2 Tỷ lệ kết tụ của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh
học polysaccharide 59
4.4 Đặc điểm sinh học và mối quan hệ di truyền giữa các chủng vi
khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học cao ở các tỉnh đồng
bằng sông Cửu Long 61
4.4.1 Đặc điểm sinh học và mối quan hệ di truyền giữa các chủng vi
khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein 61
4.4.2 Đặc điểm sinh học và mối quan hệ di truyền giữa các chủng vi
khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide 68

4.5 Phân tích đa dạng di truyền các chủng vi khuẩn tổng hợp chất
kết tụ sinh học 74
4.5.1 Đa dạng về chủng giữa của các loài vi khuẩn tổng hợp chất
kết tụ sinh học dựa vào chỉ số Shannon 76
4.5.2 Đa dạng di truyền các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học 77
4.6 Xác định các điều kiện tối ƣu cho khả năng tổng hợp chất kết
tụ sinh học của chủng vi khuẩn Bacillus megaterium LA51P
(protein) và chủng vi khuẩn Bacillus aryabhattai KG12S
(polysaccharide) 91
4.6.1 Mối tương quan giữa thời gian nuôi ủ, tỷ lệ kết tụ và mật độ
vi khuẩn 91
4.6.2 Nhiệt độ nuôi ủ 93
4.6.3 Giá trị pH 94
4.6.4 Sự tương tác giữa các điều kiện nuôi sinh khối về thời gian,
pH và nhiệt độ của hai chủng vi khuẩn 97
4.6.5 Nguồn carbon, nguồn nitrogen và khoáng vô cơ 101
4.6.6 Xác định ảnh hưởng tương tác của 3 yếu tố dinh dưỡng đến
hiệu quả kết tụ sinh học 102
4.6.7 Ion kim loại bổ sung 106
4.6.8 Nồng độ dịch vi khuẩn bổ sung 108
4.6.9 Mối tương quan giữa thời gian nuôi cấy, mật số vi khuẩn và
tỷ lệ kết tụ của 2 chủng vi khuẩn sau khi tối ưu 109
4.6.10 Kết quả sử dụng các điều kiện tối ưu của hai chủng vi khuẩn
protein 110

vi

4.6.11 Kết quả sử dụng các điều kiện tối ưu của hai chủng vi khuẩn
polysaccharide 111
4.6.12 Đặc điểm sinh hóa 2 chủng vi khuẩn có tỷ lệ kết tụ sinh học
cao được chọn thử nghiệm hiệu suất ứng dụng 112
4.7 Ly trích chất kết tụ sinh học đƣợc tổng hợp từ hai chủng vi
khuẩn Bacillus megaterium LA51P và Bacillus aryabhattai
KG12S và thử nghiệm hiệu quả kết tụ sinh học 113
4.7.1 Kết quả ly trích 113
4.7.2 Hiệu suất kết tụ sinh học 114
4.8 Thử nghiệm hiệu quả xử lý nƣớc thải sau biogas từ trại chăn
nuôi heo 115
4.8.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ kết tụ (%) các chủng vi khuẩn
khi thử nghiệm ở nước thải ngoài thực tế 115
4.8.2 Thử nghiệm hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau
biogas của các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ở
thể tích 10 lít 119
4.8.3 Thử nghiệm hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau
biogas của 2 chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ở
thể tích 100 lít 121
4.9 Hiệu quả xử lý nƣớc thải chăn nuôi heo sau biogas của vi
khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ở thể tích 1 m
3
và 40 m
3
122
4.9.1 Hiệu suất xử lý ở thể tích 1 m
3
122
4.9.2 Hiệu suất xử lý ở thể tích 40 m
3

122
Chƣơng 5: Kết luận và đề xuất 125
5.1 Kết luận 125
5.2 Đề xuất 126
Tài liệu tham khảo 127
Phụ lục 145

vii



DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1 Chất kết tụ sinh học được tổng hợp từ các chủng vi khuẩn
khác nhau từ năm 2007 – 2013 16
Bảng 2.2 Một số môi trường phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ
sinh học 19
Bảng 2.3 Một số cặp mồi sử dụng để nhận diện vi khuẩn tổng hợp chất
kết tụ sinh học 20
Bảng 2.4 Ảnh hưởng của nguồn carbon, nitrogen đến hiệu quả tổng
hợp chất kết tụ sinh học đến vi khuẩn Klebsiella sp. 26
Bảng 2.5 Ảnh hưởng của nguồn carbon, nitrogen và khoáng vô cơ đến
hiệu quả tổng hợp chất kết tụ sinh học đến vi khuẩn Serratia
fiacria 27
Bảng 2.6 Ảnh hưởng của các ion kim loại đến sự kết tụ của các vi sinh
vật tổng hợp chất kết tụ sinh học 27
Bảng 2.7 Liều lượng của các vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
khác nhau cho tỷ lệ kết tụ (%) ở dung dịch kaolin 29
Bảng 2.8 Ảnh hưởng của liều lượng, nhiệt độ và pH lên khả năng kết
tụ của chất kết tụ M-1 29
Bảng 2.9 Kết quả xử lý nước thải tinh bột bởi các nhân tố kết tụ 30

Bảng 2.10 Hiệu quả xử lý các loại nước thải bởi chất kết tụ sinh học từ
vi khuẩn Serratia ficaria 31
Bảng 3.1 Một số chỉ tiêu của nước thải tại trại chăn nuôi heo (sau
biogas) ở huyện Bình Minh, tỉnh Vĩnh Long 34
Bảng 3.2 Môi trường phân lập vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học 35
Bảng 3.3 Thành phần cho 1 mẫu DNA thực hiện phản ứng PCR 42
Bảng 3.4 Nghiệm thức bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên trong thí
nghiệm 1 47
Bảng 3.5 Nghiệm thức bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên trong thí
nghiệm 2a 49
Bảng 3.6 Nghiệm thức bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên trong thí
nghiệm 2b 49
Bảng 3.7 Nghiệm thức bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên trong thí
nghiệm 3 50
Bảng 3.8 Nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát sự tương tác 3 yếu tố
thời gian, pH và nhiệt độ ủ đến tỷ lệ kết tụ của hai chủng vi
khuẩn 50
Bảng 3.9 Bố trí thí nghiệm theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 3 yếu
tố nguồn carbon, nitrogen và khoáng vô cơ 51

viii



Bảng 3.10 Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của các tỷ lệ carbon,
nitrogen và khoáng vô cơ 51
Bảng 3.11 Bố trí thí nghiệm thử nghiệm hiệu suất kết tụ nước thải ở
điều kiện phòng thí nghiệm 54
Bảng 4.1 Số mẫu phân lập và số dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp
chất kết tụ sinh học 56

Bảng 4.2 Các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein có
tỷ lệ kết tụ sinh học cao ở các tỉnh ĐBSCL 59
Bảng 4.3 Các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide
có tỷ lệ kết tụ sinh học cao ở các tỉnh ĐBSCL 60
Bảng 4.4 Đặc điểm sinh học của 18 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết
tụ sinh học protein 62
Bảng 4.5 Kết quả so sánh trình tự 16S rRNA của 18 dòng vi khuẩn với
các dòng vi khuẩn trên ngân hàng gene 64
Bảng 4.6 Kết quả định danh 18 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học protein 67
Bảng 4.7 Đặc điểm sinh học của 16 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết
tụ sinh học polysaccharide 69
Bảng 4.8 Kết quả so sánh trình tự 16S rRNA của 16 dòng vi khuẩn so
với các dòng vi khuẩn trên ngân hàng gene 71
Bảng 4.9 Kết quả định danh 16 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học polysaccharide 73
Bảng 4.10 Kết quả định danh các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học dựa trên cây phả hệ mối quan hệ di truyền 75
Bảng 4.11 Chỉ số đa dạng giữa các loài trong quần thể vi khuẩn tổng
hợp chất kết tụ sinh học 76
Bảng 4.12 Chỉ số đa dạng giữa các chủng trong quần thể vi khuẩn
tổng hợp chất kết tụ sinh học 77
Bảng 4.13 Giá trị Pi và Theta ở 2 nhóm vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học 83
Bảng 4.14 Các giá trị về chỉ số haplotypes của 2 nhóm vi khuẩn 85
Bảng 4.15 Giá trị Pi và Theta ở 2 nhóm vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học Bacillus megaterium và Bacillus aryabhattai 87
Bảng 4.16 Các giá trị về chỉ số haplotypes của 2 nhóm vi khuẩn tổng
hợp chất kết tụ sinh học Bacillus megaterium và Bacillus
aryabhattai 88

Bảng 4.17 Các dạng haplotype của các chủng vi khuẩn Bacillus
megaterium 88
Bảng 4.18 Các dạng haplotype của các chủng vi khuẩn Bacillus
aryabhattai 88

ix



Bảng 4.19 Mã di truyền chuỗi nucleotide 90
Bảng 4.20 Mối tương quan giữa thời gian nuôi cấy, mật số tế bào vi
khuẩn và chỉ số OD
660
92
Bảng 4.21 Ảnh hưởng của thời gian, độ pH và nhiệt độ đến tỷ lệ kết tụ
của 2 chủng vi khuẩn 98
Bảng 4.22 Phương trình hồi quy nhiều biến về mối tương quan của
yếu tố nhiệt độ, thời gian và pH đến chủng vi khuẩn
Bacillus aryhadtai KG12S 100
Bảng 4.23 Ảnh hưởng của nguồn carbon, nitrogen và khoáng vô cơ
đến tỷ lệ kết tụ của hai chủng vi khuẩn 102
Bảng 4.24 Ảnh hưởng của sự thay đổi nồng độ tinh bột, glutamate và
CaCl
2
đến tỷ lệ kết tụ sinh học 103
Bảng 4.25 Ảnh hưởng của sự thay đổi nồng độ glucose, glutamate và
K
2
HPO
4

+ KH
2
PO
4
đến tỷ lệ kết tụ sinh học 103
Bảng 4.26 Phương trình hồi quy nhiều biến về mối tương quan của 3
nhân tố dinh dưởng của chủng vi khuẩn Bacillus
megaterium LA51P 105
Bảng 4.27 Phương trình hồi quy nhiều biến về mối tương quan của 3
nhân tố dinh dưởng của chủng vi khuẩn Bacillus aryhadtai
KG12S 106
Bảng 4.28 Mối tương quan giữa thời gian nuôi cấy, mật số tế bào của
hai chủng vi khuẩn sau khi tối ưu 110
Bảng 4.29 Tỷ lệ kết tụ kaolin của các chủng vi khuẩn có bản chất
protein ở điều kiện tối ưu 111
Bảng 4.30 Tỷ lệ kết tụ kaolin của các chủng vi khuẩn có bản chất
polysaccharide ở điều kiện tối ưu 112
Bảng 4.31 Đặc điểm sinh hóa 2 chủng vi khuẩn cho tỷ lệ kết tụ sin học
cao ở 2 môi trường phân lập 113
Bảng 4.32 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn từ các mẫu chất thải
sau biogas của các trại chăn nuôi heo 116
Bảng 4.33 Hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas của các
chủng vi khuẩn ở thể tích 10 lít 120
Bảng 4.34 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hiệu suất xử lý chất thải sau
hệ thống biogas chuồng trại chăn nuôi heo ở thể tích 100 lít 121
Bảng 4.35 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hiệu suất xử lý chất thải sau
hệ thống biogas chuồng trại chăn nuôi heo ở thể tích 1 m
3
122
Bảng 4.36 Kết quả phân tích các chỉ tiêu trong nước thải sau hệ thống

biogas chuồng trại chăn nuôi heo ở thể tích 40 m
3
sau xử lý 123


x



DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1 Mô hình quản lý chất thải rắn chăn nuôi trên thế giới 6
Hình 2.2 Xử lý nguồn chất thải chăn nuôi ở Việt Nam 8
Hình 2.3 Công thức cấu tạo kaolin 10
Hình 2.4 Cơ chế kết tụ của chất kết tụ sinh học DYU500 12
Hình 2.5 Cây phả hệ về mối quan hệ di truyền dựa trên trình tự 16S
rDNA của vi khuẩn 8-37-0-1 17
Hình 2.6 Cây phả hệ về mối quan hệ di truyền dựa trên trình tự 16S
rDNA của vi khuẩn Klebsiella sp. 17
Hình 2.7 Quy trình phân lập, nhận diện vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học 18
Hình 2.8 Đa hình đơn nucleotide (SNPs) và haplotype 21
Hình 2.9 Quy trình ứng dụng chỉ số SNP trong công nghệ sinh học 22
Hình 2.10 Quy trình phân lập, tuyển chọn và ứng dụng vi khuẩn tổng
hợp chất kết tụ sinh học vào xử lý nước thải 32
Hình 3.1 Xác định mật số vi khuẩn bằng phương pháp đếm sống nhỏ
giọt 37
Hình 3.2 Sơ đồ tổng quát các bước nghiên cứu vi khuẩn tổng hợp chất
kết tụ sinh học 39
Hình 3.3 Pha loãng mẫu phân lập (A), tách ròng khuẩn lạc (B) các
dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học 40

Hình 3.4 Tóm tắt các bước nhận diện vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học bằng kỹ thuật sinh học phân tử 41
Hình 3.5 Chu kỳ gia nhiệt (thực hiện phản ứng PCR) 43
Hình 3.6 Phương pháp xác định tỷ lệ kết tụ sinh học bằng dung dịch
kaolin 48
Hình 4.1 Hình dạng khuẩn lạc của vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh
học 57
Hình 4.2 Khuẩn lạc của dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
protein 61
Hình 4.3 Cây phả hệ mối quan hệ di truyền các dòng vi khuẩn tổng
hợp chất kết tụ sinh học protein 65
Hình 4.4 Khuẩn lạc của dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
polysaccharide 68
Hình 4.5 Cây phả hệ mối quan hệ di truyền các dòng vi khuẩn tổng
hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide 72
Hình 4.6 Cây phả hệ mối quan hệ di truyền các chủng vi khuẩn tổng
hợp chất kết tụ sinh học 78

xi



Hình 4.7 Giá trị đa dạng nuleotide (Pi) biến đổi theo trình tự chuỗi
nucleotide 79
Hình 4.8 Cây phả hệ mối quan hệ di truyền các chủng vi khuẩn tổng
hợp chất kết tụ sinh học protein 81
Hình 4.9 Cây phả hệ mối quan hệ di truyền các chủng vi khuẩn tổng
hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide 82
Hình 4.10 Biến đổi giá trị Pi ở các giá trị khác nhau theo trình tự chuỗi
nucleotide 18 chủng vi khuẩn tổng hợp Protein 84

Hình 4.11 Biến đổi giá trị Pi ở các giá trị khác nhau theo trình tự chuỗi
nucleotide 16 chủng vi khuẩn tổng hợp polysaccharide 84
Hình 4.12 Biến đổi giá trị Pi ở các giá trị khác nhau theo trình tự chuỗi
nucleotide 7 chủng vi khuẩn của loài Bacillus megaterium
strain 87
Hình 4.13 Biến đổi giá trị Pi ở các giá trị khác nhau theo trình tự chuỗi
nucleotide 7 chủng vi khuẩn của loài Bacillus aryabhattai
strain 87
Hình 4.14 Ảnh hưởng của thời gian nuôi sinh khối đến hiệu quả kết tụ
sinh học của 2 chủng vi khuẩn 91
Hình 4.15 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến hiệu quả kết tụ sinh
học của hai chủng vi khuẩn 94
Hình 4.16 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi sinh khối đến hiệu quả
kết tụ sinh học của hai chủng vi khuẩn 95
Hình 4.17 Ảnh hưởng của pH môi trường kaolin đến hiệu quả kết tụ
sinh học của hai chủng vi khuẩn 96
Hình 4.18 Đồ thị mặt đáp ứng và đồ thị đường đồng mức của tỷ lệ kết
tụ theo thời gian = 120 giờ, pH = X (5 - 7) và nhiệt độ = Y
(30 - 34) 99
Hình 4.19 Đồ thị mặt đáp ứng và đồ thị đường đồng mức của tỷ lệ kết
tụ ở nhiệt độ = 33
o
C, Thời gian = X (96 - 144) và pH = Y
(5 - 7) 99
Hình 4.20 Ảnh hưởng của các muối kim loại đến hiệu quả kết tụ sinh
học của hai chủng vi khuẩn 107
Hình 4.21 Ảnh hưởng của nồng độ dịch vi khuẩn bổ sung đến khả
năng kết tụ sinh học của hai chủng vi khuẩn 108
Hình 4.22 Khối lượng chất kết tụ ly trích từ 100 ml dịch nuôi sinh
khối của hai chủng vi khuẩn 114

Hình 4.23 Tỷ lệ kết tụ của dịch sinh khối vi khuẩn và chất kết tụ sinh
học của hai chủng vi khuẩn 115

xii



Hình 4.24 Mối quan hệ thuận giữa pH chất thải và số dòng vi khuẩn
tổng hợp chất kết tụ sinh học 117
Hình 4.25 Ảnh hưởng của các muối kim loại đến hiệu quả kết tụ sinh
học của các chủng vi khuẩn 118
Hình 4.26 Nghiệm thức phối hợp chất trợ lắng với dịch vi khuẩn 118
Hình 4.27 Hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas ở thể
tích 8 lít 119
Hình 4.28 Thử nghiệm xử lý nước thải sau hệ thống biogas của trại
chăn nuôi heo 119
Hình 4.29 Hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo biogas ở thể tích 1
m
3
122
Hình 4.30 Mô hình ứng dụng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
xử lý nước thải sau biogas trại chăn nuôi heo 124
Hình 4.31 Hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas ở thể
tích 40 m
3
124
Hình 4.32 Sơ đồ quy trình ứng dụng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học trong xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas 126

xiii



DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
ANOVA Analysis Of Variance
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
BOD Biochemical Oxygen Demand
Bp Base pair
BTNMT Bộ Tài Nguyên Môi Trường
BVMT Bảo Vệ Môi Trường
C Carbon
CBI Codon Bias Index
CFU Colony-Forming Unit
COD Chemical Oxygen Demand
CTAB Cetyltrimethylammonium bromide
C/N Carbon/Nitrogen
CV Coefficient of Variation
dATP Deoxyadenosine Triphosphate
dCTP Deoxycytidine Triphosphate
ddNTPs Dideoxynucleotide Triphosphates
dGTP Deoxyguanosine triphosphate
DNA Deoxyribonucleic Acid
dNTPs Deoxynucleotide Triphosphates
dTTP Deoxythymidine Triphosphate

ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
EPS Exopolysaccharides
FTIR Fourier Transform Infrared
GDP Gross Domestic Product
HPAM Anionic Polyacrylamide
ITS Internal Transcribed Spacer
LSD Least Significant Difference
MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis
MPN Most probable number
NCBI National Center for Biotechnology Information
NC & PT Nghiên Cứu và Phát Triển
NCS Nghiên Cứu Sinh
Ngđ Ngày đêm
OD Optical Density
PAC Poly Aluminum Chloride
PAM Nonionic Polyacrylamide

xiv



PCR Polymerase Chain Reaction
PGA Poly-glutamic Acid
Pi Polymorphism in information
QCVN Quy Chuẩn Việt Nam
rDNA Ribosomal deoxyribonucleic acid
RNA Ribonucleic acid
rRNA Ribosomal ribonucleic acid
SBR Sequencing Batch Reactor

SDS Sodium Dodecyl Sulfate
SEM Scanning Electron Microscope
SNP Single Nucleotide Polymorphism
SS Suspended Solid
TAE Tris-acetate-EDTA
TBE Tris-borate-EDTA
TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam
TE Tris-EDTA
TN Total Nitrogen
TP Total Phosphorus
TSS Total Suspended Solids
UASB Upflow Anaerobic Sludge Blanket
UV Ultraviolet
VSV Vi Sinh Vật
VK Vi Khuẩn
WHO World Health Organization
XPS X-ray Photoelectron Spectroscopy

xv



TÓM TẮT
Đề tài “Đa dạng di truyền vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học và ứng
dụng xử lý nước thải sau biogas của trại chăn nuôi heo ở đồng bằng sông Cửu
Long” được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật môi trường thuộc Viện
nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ và các
phòng thí nghiệm có liên quan từ tháng 10/2010 đến tháng 08/2014.
Mục tiêu luận án là (i) phân lập và tuyển chọn được một số dòng vi
khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học có tỷ lệ kết tụ cao từ nước thải sau biogas

của trại chăn nuôi heo ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long; (ii) đánh giá đa
dạng di truyền các dòng vi khuẩn đã tuyển chọn; (iii) tiến hành tối ưu hóa điều
kiện tổng hợp chất kết tụ sinh học của 2 dòng vi khuẩn có tỷ lệ kết tụ sinh học
cao nhất, đặc trưng cho từng môi trường phân lập và ứng dụng xử lý nước thải
chăn nuôi heo sau biogas.
Kết quả phân lập được 221 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
trên 2 môi trường chọn lọc có tỷ lệ kết tụ từ 1,21 - 80,28%. Khảo sát 34 dòng
vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học được tuyển chọn, có tỷ lệ kết tụ từ
21,34 - 80,28% cho thấy đa số khuẩn lạc hình tròn, có bề mặt ướt và nhày
nhớt, tế bào vi khuẩn chủ yếu có dạng hình que, chuyển động và thuộc nhóm
Gram dương. Xây dựng cây phả hệ di truyền dựa vào trình tự gen 16S rRNA
bằng phương pháp Maximum-Likelihood, đánh giá đa dạng nucleotide thông
qua chỉ số đa hình trình tự nucleotide (Pi), đa hình chiều dài nucleotide (Theta)
và số Haplotype. Kết quả xác định mối quan hệ di truyền 18 dòng vi khuẩn
tổng hợp chất kết tụ sinh học protein, có 14/18 dòng vi khuẩn tương đồng 97-
99% với các chủng thuộc loài Bacillus megaterium; có 3/18 dòng vi khuẩn
tương đồng 98-99% với các chủng thuộc loài Bacillus aryabhattai; dòng vi
khuẩn còn lại tương đồng 100% với chủng thuộc chi Bacillus sp Qua khảo
sát 16 dòng vi khuẩn tổng hợp hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide có
11/16 dòng vi khuẩn tương đồng với chi Bacillus; 3/16 dòng vi khuẩn tương
đồng với chi Klebsiella; 2/16 dòng vi khuẩn thuộc chi Sphingobacterium. Xác
định mối quan hệ di truyền các chủng vi khuẩn, có 24/34 chủng vi khuẩn
tương đồng 99-100% thuộc loài Bacillus megaterium và loài Bacillus
aryabhattai; 10/34 chủng tương đồng 98-100% thuộc loài Klebsiella
pneumoniae, Bacillus amyloliquefaciens và Sphingobacterium sp. và các chỉ
số đa dạng nucleotide giữa các chủng vi khuẩn này lần lượt là Pi = 0,090,
Theta = 0,156 và Haplotypes = 16. Từ các kết quả trên cho thấy sự đa dạng di
truyền của các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học cũng như sự đa
dạng sinh học của vi khuẩn trong tự nhiên. Kết quả tối ưu điều kiện tổng hợp

xvi



chất kết tụ sinh học của 2 chủng vi khuẩn đặc trưng cho 2 môi trường phân
lập: (1) Điều kiện tối ưu cho chủng vi khuẩn Bacillus megaterium strain
LA51P: pH môi trường nuôi cấy 5,7, nhiệt độ 29
o
C và thời gian 124 giờ với
thành phần môi trường tối ưu gồm tinh bột (0,85%), glutamate (6,6%) và
CaCl
2
(0,9%) cho tỷ lệ kết tụ 95,78% với dung dịch kaolin ở pH 7, sau 5 phút
để lắng, bổ sung dung dịch MgSO
4
(0,1%) và 0,2% dịch nuôi sinh khối vi
khuẩn. Khối lượng chất kết tụ sinh học được ly trích ở môi trường tối ưu là
4,9g/l cho tỷ lệ kết tụ tương đương với dịch vi khuẩn. (2) Điều kiện tối ưu cho
chủng vi khuẩn Bacillus aryabhattai strain KG12S: pH môi trường nuôi cấy
5,9, nhiệt độ 29
o
C và thời gian 122 giờ với thành phần môi trường tối ưu cho
khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh học gồm glucose (1,12%), glutamate
(5,7%), K
2
HPO
4
(0,4%) và KH
2
PO

4
(0,8%) cho tỷ lệ kết tụ 96,87% với dung
dịch kaolin sau 5 phút để lắng, bổ sung dung dịch CaCl
2
(0,1%) và 0,2% dịch
nuôi sinh khối vi khuẩn. Chất kết tụ sinh học được ly trích ở môi trường tối ưu
là 4,8g/l và tỷ lệ kết tụ với dung dịch kaolin tương đương với dịch vi khuẩn.
Ứng dụng 2 chủng vi khuẩn trong thử nghiệm hiệu suất xử lý nước thải
sau hệ thống biogas của trại chăn nuôi heo đều cho hiệu quả tốt, ở thể tích 40
m
3
các chỉ tiêu phân tích COD (< 75 mg/l), TSS (< 50 mg/l) và BOD (< 30
mg/l) đạt tiêu chuẩn A theo quy chuẩn QCVN_40/2011/BTNMT.
Từ khóa: Bacillus sp, đa dạng di truyền của vi khuẩn, kết tụ sinh học,
nước thải sau biogas, tỷ lệ kết tụ, vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học


xvii



ABSTRACT
The thesis “Analysis genetic diversity of bioflocculant-producing
bacteria and its application in piggery wastewater treament after biogas system
in Mekong Delta” was carried out in the laboratory of Biotechnology Research
& Development Institute, Can Tho University and other laboratories, from
January, 2010 to August, 2014.
The objectives were (i) isolating and selecting some high flocculant
activity bacterial strains in piggery wastewater treament after biogas system in
Mekong Delta provinces; (ii) evaluating the genetic diversity among these

strains; (iii) two strains with the highest flocculating activity were chosen to
determinate the optimal conditions for bioflocculant-producing and to apply in
piggery wastewater treament after biogas system.
The results revealed that two hundred and twenty-one bacterial isolates
with flocculant activity (from 1.21% to 80.28%) were isolated on selective
media and thirty-four isolates with high flocculating rate (from 21.34% to
80.28%) were selected from thirteen provinces or cities. The colony
characteristics of these isolates are generally round-shaped, wet and mucous
covered. Cells are mostly short rods, mobile and belong to the Gram-positive
bacteria. Then phylogenetic trees were established based on the 16S rRNA
sequences by the Maximum-Likelihood method. Nucleotide diversity were
evaluated from analyzing the sequence polymorphism (Pi), theta per sequence
(Theta) and number of Haplotypes core were done. Eighteen protein
bioflocculant-producing strains with high flocculating rate were tested, the
result showed that fourteen out of them belonged to Bacillus megaterium with
the identity from 97% to 99%; three isolates were identical with Bacillus
aryabhattai from 98% to 99% and one isolate was 100% of the identity with
Bacillus sp. Moreover, eleven out of sixteen polysaccharide bioflocculant-
producing isolates with high flocculating rate were related to Bacillus genus
with 98% to 100% identity; three isolates were related to Klebsiella genus
with 98% to 100% identity; two isolates were 98% to 99% of the identity with
Sphingobacterium genus. Based on the nucleotide sequences of thirty-four
bioflocculant-producing bacterial strains, the genetic relationships among
them were determined, twenty-four strains had from 98% to 100% identity to
Bacillus megaterium and Bacillus aryabhattai; ten strains performed the
identity from 98% to 100% with Klebsiella pneumoniae, Bacillus
amyloliquefaciens and Sphingobacterium. Genetic diversity analysis showed
that nucleotide polymorphism was 0.090, sequence polymorphism per site was

xviii

0.156 and number of haplotypes was 16. These results showed that genetic
diversity of bioflocculant-producing bacteria is as well as the biodiversity of
bacteria in the nature. The optimal conditions for the bioflocculant production
varied between two bacterial strains which were selected from selective
media: (1) Bacillus megaterium strain LA51P
reached to 95.78% after
124
hours cultivation with initial pH 5.7, cultivating temperature 29
o
C and the
optimal medium consisting of starch (0.85%), glutamate
(6.8%), CaCl
2

(0.75%) with kaolin solution after 5 minutes together with MgSO
4

(0.1%) and 0.2% inoculant (bacterial liquid). The maximal
bioflocculant production (4.9 g/l) was obtained in the optimal medium
and the
flocculant rate was the same as the broth. (2) Bacillus aryabhattai
strain KG12S
reached to
96.87%
after
122 hours cultivation at initial pH
5.9, cultivating temperature 29

o
C and the optimal medium for Bacillus
aryabhattai strain KG12S consisting of glucose (1.12%), glutamate (5.7%),
and K
2
HPO
4
(0.4%) + KH
2
PO
4
(0.8%),
with kaolin solution after 5
minutes together with
CaCl
2

(0.1%) and 0.2% inoculant (bacterial
liquid).

The maximal bioflocculant production (4.8 g/l) was obtained in
the optimized medium and
the flocculant rate was the same as the broth.
From those above results, two strains that were used to treat piggery
wastewater after biogas system performed a great potential for piggery
wastewater pretreament. For the scale of 40 m
3
, some parameters reached to A
standard of QCVN_40/2011/BTNMT such as Chemical Oxygen Demand
[COD] (< 75 mg/l); total solid suspension [TSS] (< 50 mg/l) and Biochemical

Oxygen Demand [BOD] (< 30 mg/l).
Keywords: Bacillus sp., bioflocculant-producing bacteria, flocculation,
flocculating rate, genetic diversity of bacteria, piggery wastewater


1



Chƣơng 1: GIỚI THIỆU
1.1 Tính cấp thiết của đề tài
Ô nhiễm môi trường đang là vấn đề của toàn cầu và ngày càng trở nên
nghiêm trọng do sự phát triển mạnh mẽ của công nghiệp và nông nghiệp bao
gồm trồng trọt và chăn nuôi. Đối với chăn nuôi ở dạng cơ sở hoặc hộ gia đình
thì các chất thải gây ô nhiễm môi trường có tác động trực tiếp đến cộng đồng,
làm giảm sức sống của vật nuôi từ đó dẫn đến hiệu quả chăn nuôi thấp. Theo
WHO (2005) cần phải có giải pháp làm môi trường chăn nuôi trở nên trong
sạch hơn, cần phải kiểm soát và xử lý chất thải nhằm giữ vững an toàn sinh
học và tăng cường sức sống của giống vật nuôi.
Biogas là một trong những hệ thống xử lý chất thải chăn nuôi đặc biệt là
chăn nuôi heo. Biogas gồm một chuỗi các quá trình trong đó vi sinh vật có khả
năng phân hủy sinh học các hợp chất trong điều kiện thiếu oxy. Ở ĐBSCL,
biogas được áp dụng để xử lý nước thải chuồng trại chăn nuôi và tổng hợp khí
sinh học. Tuy nhiên, nước thải sau khi qua hệ thống xử lý biogas thì các chỉ số
COD, BOD, TSS… vẫn còn cao hơn so với mức quy định và có mùi khó chịu
gây ảnh hưởng đến khu vực lân cận (Phùng Đức Tiến, 2009).
Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện nhằm tìm ra những biện pháp cũng
như những kỹ thuật hữu hiệu để loại bỏ các chất ô nhiễm vô cơ hay hữu cơ
trong nước thải chăn nuôi heo một cách hiệu quả. Trong đó, giải pháp phân lập
những vi sinh vật có khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh học để ứng dụng xử lý

nước thải chăn nuôi heo sau biogas là một lựa chọn mới sẽ góp phần ngăn
ngừa ô nhiễm môi trường nước trong khu vực.
Sự kết tụ (flocculation) là một quá trình cần thiết giúp lắng tụ các chất lơ
lửng và làm tăng nhanh quá trình phân hủy chất ô nhiễm. Sự kết tụ trong nước
được chia làm 3 nhóm chính gồm: Kết tụ vô cơ (như sử dụng phèn chua -
aluminium sulphate và cloride aluminium), kết tụ hữu cơ tổng hợp (các dẫn
xuất từ polyacrylamide với polyethyleneimine và các chất kết tụ tự nhiên như
chitosan, sodium alginate) và kết tụ sinh học (bioflocculants). Các hóa chất sử
dụng kết tụ có giá thành thấp nhưng lại ảnh hưởng đến sức khỏe con người và
môi trường sống như nhôm là nguyên nhân gây ra bệnh Alzheimer (Kurane et
al., 1994), còn các dẫn xuất từ polyacrylamide là độc tố cho hệ thần kinh và là
chất gây ung thư khó phân hủy trong tự nhiên (Yokoi et al., 1996). Chất kết tụ
sinh học (bioflocculants) là chất được tạo ra từ vi sinh vật, có tác dụng nhanh
chóng và an toàn cho con người và môi trường (Sheng et al., 2006). Trong
những năm gần đây, nhiều loài vi sinh vật đã được tìm thấy có khả năng tổng
hợp và phóng thích hợp chất kết tụ sinh học ở dạng đa phân tử (flocculating
2



biopolymer). Theo Sheng et al. (2006) đất và chất thải là những nguồn tốt nhất
để phân lập các vi sinh vật tổng hợp chất kết tụ sinh học (bioflocculant-
producing microorganisms).
Các vi sinh vật tổng hợp chất kết tụ sinh học có bản chất là protein,
polysaccharide và hỗn hợp cả hai loại trên (glycoprotein) được ứng dụng trong
xử lý nước thải. Ngoài ra, chất kết tụ sinh học cũng có thể được tinh sạch và
xác định được thành phần cấu tạo. Từ đó, có tiềm năng để cải thiện chất lượng
sản phẩm trong quá trình chế biến sinh học (bioprocessing).
Vì vậy, với yêu cầu xây dựng một nền nông nghiệp bền vững thì đề tài
“Đa dạng di truyền vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học và ứng dụng

xử lý nƣớc thải sau biogas của trại chăn nuôi heo ở ĐBSCL” sẽ góp phần
ứng dụng công nghệ sinh học vào thực tế cuộc sống và đẩy mạnh chăn nuôi
theo hướng phát triển bền vững. Tính mới của đề tài thể hiện ở nguồn phân lập
vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học và ứng dụng vào xử lý nước thải sau
biogas của trại chăn nuôi heo ở ĐBSCL.
1.2 Mục tiêu đề tài và nội dung nghiên cứu
1.2.1 Mục tiêu đề tài
Mục tiêu chính: Tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn có khả năng
tổng hợp chất kết tụ sinh học với tỷ lệ kết tụ cao, đánh giá được mức độ đa
dạng di truyền giữa các dòng vi khuẩn tuyển chọn dựa trên trình tự nucleotide
16S rRNA và đánh giá được hiệu suất xử lý nước thải sau biogas từ chuồng
trại chăn nuôi heo.
Mục tiêu cụ thể: (1) Phân lập và tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn
tổng hợp chất kết tụ sinh học trong nước thải sau hệ thống biogas của chuồng
trại chăn nuôi heo ở các tỉnh ĐBSCL; (2) Xác định được mối quan hệ di
truyền giữa các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học cao dựa trên trình
tự 16S rRNA và xác định được các điều kiện tối ưu cho sự tổng hợp chất kết
tụ sinh học của dòng vi khuẩn được tuyển chọn để ứng dụng xử lý nước thải
sau hệ thống biogas; (3) Đánh giá được hiệu suất xử lý nước thải sau biogas từ
chuồng trại chăn nuôi heo của các chủng vi khuẩn ở điều kiện phòng thí
nghiệm và điều kiện thực tế.
1.2.2 Nội dung nghiên cứu
Phân lập vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ở ĐBSCL dựa trên hình
dạng khuẩn lạc vi khuẩn.Tuyển chọn các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học có tỷ lệ kết tụ cao ở các tỉnh ĐBSCL, đồng thời nhận diện vi khuẩn
dựa trên sự kết hợp phương pháp sinh hóa và phương pháp sinh học phân tử.
3

Từ đó, phân tích đặc tính đa dạng di tryền ở các chủng vi khuẩn tổng hợp chất
kết tụ sinh học.
Xác định điều kiện tối ưu cho sự tổng hợp chất kết tụ sinh học của dòng
vi khuẩn có tỷ lệ kết tụ cao, tiêu biểu cho từng môi trường phân lập và thử
nghiệm hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau hệ thống biogas ở điều
kiện phòng thí nghiệm và thực tế.
1.3 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của đề tài: Các chủng vi khuẩn có khả năng tổng
hợp chất kết tụ sinh học trong nước thải sau hệ thống biogas của chuồng trại
chăn nuôi heo.
Phạm vi nghiên cứu: Các dòng vi khuẩn tổng tổng hợp chất kết tụ sinh
học bản địa được phân lập từ nước thải chăn nuôi heo sau hệ thống biogas ở
13 tỉnh thành thuộc ĐBSCL và ứng dụng xử lý nước thải sau biogas chuồng
trại chăn nuôi heo.
1.4 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án
Luận án đã nghiên cứu có tính hệ thống vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học bao gồm các khâu phân lập, tuyển chọn, xác định mối quan hệ di
truyền giữa các dòng, tối ưu khả năng tổng hợp chất kết tụ, ly trích chất kết tụ
sinh học, thử nghiệm hiệu suất kết tụ nước thải của các chủng vi khuẩn tổng
hợp chất kết tụ sinh học và ứng dụng xử lý thực tế.
Những kết quả có ý nghĩa khoa học
Nghiên cứu đã phân lập được 221 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học có nguồn gốc từ chất thải sau hệ thống biogas chuồng trại chăn nuôi
heo trên 2 môi trường chọn lọc.
Sử dụng kết hợp phương pháp truyền thống và kỹ thuật sinh học phân tử
xác định được 34 chủng vi khuẩn phân lập trên 2 môi trường tổng hợp chất kết
tụ sinh học protein và polysaccharide.
Xác định được các điều kiện tối ưu cho vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học và ứng dụng trong xử lý nước thải sau hệ thống biogas chuồng trại
chăn nuôi heo.

Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu của đề tài làm nguồn tư liệu cho việc nghiên cứu và
giảng dạy về vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học bản địa phân lập từ hệ
thống nước thải sau biogas chuồng trại chăn nuôi heo ở ĐBSCL.
4



Sử dụng các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ vào thử nghiệm ở thể
tích nước thải sau biogas ở 10 lít, 100 lít, 1 m
3
và cũng như ứng dụng trong xử
lý nước thải ở thể tích 40 m
3
.
1.5 Cơ sở lý luận và giả thuyết khoa học
ĐBSCL hiện đang phát triển mạnh ngành chăn nuôi heo nhưng chưa có
nghiên cứu nào cho thấy có sự hiện diện của vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học trong chất thải chăn nuôi heo sau hệ thống biogas. Vì vậy, nghiên cứu
về vi khuẩn xử lý môi trường, đặc biệt là tìm hiểu về vi khuẩn tổng hợp chất
kết tụ sinh học bản địa để ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi heo sau hệ
thống biogas là cần thiết.
Ô nhiễm môi trường chăn nuôi ngày càng tăng và trở thành vấn đề khó
khăn cho xã hội cần phải giải quyết, đồng thời việc sử dụng các chất hóa học
xử lý môi trường không chỉ không đảm bảo phát triển chăn nuôi bền vững mà
còn ảnh hưởng đến sự phát triển kinh tế. Do đó, nghiên cứu và tuyển chọn các
dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, có khả năng tổng hợp chất kết tụ
sinh học cao trong môi trường nuôi cấy với giá thành rẻ và ứng dụng xử lý
môi trường là hướng nghiên cứu cần thiết.
Môi trường phân lập vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein dựa

trên nghiên cứu của Hanaza et al. (2008) và môi trường phân lập vi khuẩn
tổng hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide dựa trên nghiên cứu Deng et al.
(2003).
Nhận diện vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học dựa vào nghiên cứu
của Deng et al. (2003); Lu et al. (2005) và Lixi et al. (2006).
Quá trình tuyển chọn vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học dựa vào tỷ
lệ kết tụ (%) được tính theo công thức tính tỷ lệ kết tụ của Deng et al. (2003).
Nhận diện vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học dựa trên sự kết hợp
phương pháp truyền thống và kỹ thuật sinh học phân tử với cặp mồi được sử
dụng trong nghiên cứu của Jie et al. (2006) và đánh giá đa dạng di truyền dựa
vào nghiên cứu của Hutter et al. (2006).
Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ kết tụ sinh học của vi khuẩn dựa
trên các nghiên cứu về vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học trên tạp chí
chuyên ngành từ năm 1988 đến 2013.
Đánh giá hiệu suất kết tụ của vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học được
tuyển chọn dựa vào phương pháp của các công trình nghiên cứu được công bố
trên các tạp chí chuyên ngành và các đề tài nghiên cứu khoa học từ 2000 đến
2013.
5



Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về chất thải chăn nuôi heo
Để đáp ứng nhu cầu thực phẩm của con người, ngành chăn nuôi trên thế
giới đã phát triển rất nhanh và đạt được nhiều thành tựu quan trọng. Trên thế
giới, ngành chăn nuôi hiện chiếm khoảng 70% đất nông nghiệp và 30% tổng
diện tích đất tự nhiên, hàng năm đóng góp khoảng 40% tổng GDP nông
nghiệp toàn cầu. Bên cạnh việc cung cấp một số lượng lớn sản phẩm quan
trọng cho nhu cầu của con người, ngành chăn nuôi cũng đã gây ra những hậu

quả nghiêm trọng đối với môi trường (Nguyễn Xuân Trạch, 2009).
Vì vậy, xử lý chất thải chăn nuôi ngày càng được quan tâm hơn bởi các
cơ quan quản lý nhà nước, cộng đồng và chính những người chăn nuôi. Có
nhiều chương trình và dự án hợp tác quốc tế về xử lý chất thải chăn nuôi
nhưng cho đến nay chất thải chăn nuôi ở nước ta vẫn chưa được xử lý nhiều,
hoặc có xử lý nhưng công nghệ xử lý chưa đảm bảo về tiêu chuẩn bảo vệ môi
trường. Quản lý nhà nước về bảo vệ môi trường trong chăn nuôi còn nhiều khó
khăn về các nguồn lực, sự phối hợp giữa các Bộ, Ngành liên quan và các cấp
quản lý địa phương nhằm triển khai công tác BVMT trong chăn nuôi vẫn chưa
đồng bộ.
2.1.1 Đặc điểm của nƣớc thải sau biogas chuồng trại chăn nuôi heo
Trong những năm gần đây, ngành chăn nuôi Việt Nam đã phát triển đáng
kể, tốc độ tăng trưởng bình quân giai đoạn 2001 - 2007 đạt 8,9% (Bùi Thục
Oanh, 2008). Lượng chất thải lỏng từ hoạt động chăn nuôi thải ra hàng năm
khoảng 80 triệu tấn chất thải rắn và hàng tỉ m
3
chất thải lỏng và việc xử lý chất
thải ở hầu hết các cơ sở chăn nuôi heo chỉ mới dừng lại ở mức sử dụng hệ
thống hầm biogas (Viện chăn nuôi, 2006), sau quá trình này các thành phần
gây ô nhiễm môi trường còn ở mức rất cao và cần phải được xử lý tiếp trước
khi có thể thải ra môi trường (Nguyễn Hoài Châu và Trần Mạnh Hải, 2010) cụ
thể: COD = 1251 đến khoảng 3397 mg/l; BOD = 783 đến khoảng 1339 mg/l;
P
total
= 57 đến khoảng 99 mg/l; N
total
= 205 đến khoảng 333 mg/l (Nguyễn
Hoài Châu, 2006) và theo kết quả phân tích nước thải chăn nuôi heo của
Phùng Đức Tiến (2009) cho thấy các chỉ tiêu đều vượt ngưỡng cho phép.
2.1.2 Quản lý chất thải chăn nuôi heo trên thế giới

Việc xử lý chất thải chăn nuôi heo đã được nghiên cứu triển khai ở các
nước phát triển từ cách đây vài chục năm. Theo nghiên cứu của các tổ chức và
các các nhà nghiên cứu như Boone et al. (1993) và Robert (2001), các công
nghệ áp dụng cho xử lý nước thải trên thế giới chủ yếu là các phương pháp