Quy trình định tính Salmonella trong công nghệ thực phẩm

Bộ môn; PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM
Đề tài: QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH
SALMONELLA
GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh
Nhóm: 5
DANH SÁCH NHÓM

Lê Thị Ngọc

Huỳnh Thị Quỳnh Nga

Dương Thị Hồng Diễm

Lâm Tây Sơn

Mai Nhật Long
NỘI DUNG
Các bước tiến hành
Quy trình phân tích
Môi trường và hóa chất
Nguyên tắc
Phạm vi áp dụng
Tổng quan về Salmonella
Kết quả
Tình hình ngộ độc Salmonella
TÌNH HÌNH NGỘ ĐỘC THỰC
SALMONELLA
TÌNH HÌNH NGỘ ĐỘC THỰC
SALMONELLA

Theo thống kê, mỗi năm VN có chừng 250-500 vụ ngộ

độc thực phẩm với 7.000-10.000 nạn nhân và 100 –
200 ca tử vong.

Vi khuẩn Salmonella là nguyên nhân của 70% vụ ngộ
độc.

Salmonella có trong nhiều loại thực phẩm (đồ nguội,
thịt nguội, nghêu sò, gà chưa nấu chín, chế phẩm từ
sữa sống…) nhất là các món ăn chế biến từ trứng tươi
hoặc còn hơi tươi sống.

Triệu chứng của ngộ độc do salmonella: Tiêu chảy,
Đau bụng, Buồn ói và ói, Sốt, Đau đầu… Ngộ độc
salmonella là một vấn đề xã hội rất phức tạp và khó
giải quyết .
Tổng quan về Salmonella

Trực khuẩn, Gram (-), kỵ
khí tùy nghi, di động.

Sinh acid từ glucose và
mannitol, sinh H2S.

Không lên men Saccharose
và lactose, không sinh
Indol, không phân giải Ure.

Không cho phép có mặt
Salmonella trong 25g/25ml
mẫu.


Kém chịu nhiệt.
PHẠM VI ÁP DỤNG
TCVN 4829:2005
Phát hiên Salmonella
trong tất cả các loại
thực phẩm
NGUYÊN TẮC

Kết luận: Có hay không sự hiện diện của
Salmonella trên lượng mẫu đã lấy.

Bắt buộc trải qua 5 giai đoạn, và phải sử dụng
chủng đối chứng trong suốt quá trình phân tích.
+ Tiền tăng sinh
+ Tăng sinh
+ Phân lập
+ Phục hồi
+ Khẳng định

MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHẤT
Môi trường và hóa chất Mục đích
DD Buffered Peptone Water
(BPW)
Tăng sinh sơ bộ
Canh Rappaport – Vasilia Soya
Peptone (RVS)
Tăng sinh chọn lọc
Selenit xystin/ Tetrathionat (TT)
Xylose Lysine Desoxycholate

(XLD)
Phân lập
Hektoen Entric Agar (HE)
Tryptone Soy Agar (TSA) Phục hồi
Voges – Proskauer (VP) Thử nghiệm sinh hóa để khẳng
định Salmonella
Ure Broth
MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHẤT
Môi trường và hóa chất Mục đích
Lysine Decarboxylase broth
(LDC)
Thử nghiệm sinh hóa để khẳng
định Salmonella
Tryptone Water
Kligler Iron Agar (KIA)/TSI
Đĩa giấy ONPG
Dung dịch creatin Thuốc thử các phản ứng sinh
hóa
Kháng huyết thanh
Dung dịch α – naphtol
KOH 40%
Thuốc thử Kovac’s
HCL và NaOH 10% Chỉnh pH
QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Cân 25g/25ml mẫu
Ủ ở (37 ± 1 C/18 ± 2h)⁰
Thêm 225ml BPW
Bao PE vô trùng chứa 25g/25ml mẫu
10ml môi trường RVS broth
Ủ ở 41.5 ± 1 C/24 ± 3h⁰

10ml môi trường MKTTn Broth
Ủ ở 37 ± 1 C/24 ± 3h⁰
Không có khuẩn lạc điển hình hoặc
nghi ngờ từ MT phân lập
Cấy lên HE agar
Ủ ở 35 C/18-24h⁰
Cấy lên XLD agar
Ủ ở 37 ± 1C/24 ± 3h⁰
Đánh dấu 5 khuẩn lạc điển hình
hoặc nghi ngờ, cấy lên NA/TSA
Ủ ở 37 ± 1 C/24 ± 3h⁰
QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Không có khuẩn lạc điển hình hoặc
nghi ngờ từ MT phân lập
Đánh dấu 5 khuẩn lạc điển hình
hoặc nghi ngờ, cấy lên NA/TSA
Ủ ở 37 ± 1 C/24 ± 3h⁰
Thử kháng
huyết thanh
Thử 4 khuẩn lạc còn lại
đã được đánh
Thử một khuẩn lạc điển
hình hoặc nghi ngờ
Tryptone
broth
VP
ONPG
LDC
Ure
agar

TSI
Ủ ở 37 ± 1 C/24 ± 3h⁰
Báo cáo kết quả
Âm tính
Không phát hiện
Salmonella trong
25g/25ml
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
T
Ă
N
G

S
I
N
H

C
H
Ọ
N

L
Ọ
C
P
H
Â
N

L
Ậ
P
P
H
Ụ
C

H
Ồ
I
K
H
Ẳ
N
G

Đ
Ị
N
H
BƯỚC 2 BƯỚC 3 BƯỚC 4 BƯỚC 5
T
I
Ề
N

T
Ă

N
G

S
I
N
H
BƯỚC 1
BƯỚC 1: TIỀN TĂNG SINH
Cân 25g/25ml mẫu
Đồng nhất bằng máy dập mẫu
Stomacher
60s
Thêm 225ml BPW
Bao PE vô trùng chứa 25g/25ml mẫu
Stomatcher
BƯỚC 2: TĂNG SINH CHỌN LỌC
DD TIỀN TĂNG SINH
1
m
l
0
.
1
m
l
Môi trường RVS broth
Môi trường MKTTn Broth
BƯỚC 3: PHÂN LẬP


Dùng que cấy vòng cấy phân
lập từ mỗi canh tăng sinh
chọn lọc XLD và HE. Sau khi
cấy, lật ngược các đĩa sao
cho đáy hướng lên trên và ủ
ở 37 ± 1 C/24 ± 3h.⁰

Kiểm tra các đĩa: Trên MT
XLD, khuẩn lạc Salmonella
điển hình có màu hồng trong
suốt, trên MT HE có màu
xanh lam, có hoặc không có
tâm đen. Đánh dấu vị trí các
khuẩn lạc này trên đáy đĩa.
Salmonella on XLD agarSalmonella on HE Agar
BƯỚC 4: PHỤC HỒI TRÊN MÔI TRƯỜNG
DINH DƯỠNG NA/TSA

Đánh dấu 5 khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ từ mỗi
đĩa trên môi trường phân lập XLD và HE. Nếu mỗi đĩa có
ít hơn 5 KL điển hình hoặc KL nghi ngờ, thì lấy tất cả các
khuẩn lạc đó cấy ria lên NA/TSA. Ủ ở 37 ± 1 C/24 ± 3h.⁰

TH1: Từ mỗi đĩa thử 1 khuẩn lạc đặc trưng, nếu cho kết
quả thử nghiệm sinh hóa phù hợp thì kết luận phát hiện
Salmonella trong mẫu.

TH2: Nếu KL đầu cho kết quả không phù hợp thì tiến
hành thử 4 KL còn lại, nếu 1 trong 4 KL này cho kết quả
thử nghiệm sinh hóa phù hợp thì kết luận có Salmonella

trong mẫu, ngược lại kết luận không có Salmonella trong
mẫu.
Salmonella
on TSA
BƯỚC 5: KHẲNG ĐỊNH SINH HÓA VÀ KHÁNG
HUYẾT THANH

Thạch TSI

Lysine Decarboxylase broth (LDC)

Ure Broth

Môi trường phản ứng Indol

Phát hiện β-galactosidase

Voges – Prokauer

Thử phản ứng kháng huyết thanh
Từ các khuẩn lạc đã chọn cấy ria lên NA/TSA, dùng
que cấy vào các môi trường sau:
BƯỚC 5: KHẲNG ĐỊNH SINH HÓA VÀ KHÁNG
HUYẾT THANH

Thạch TSI

Nguyên tắc: Xác định khả năng sử dụng nguồn
Cacbonhydrate cụ thể kết hợp với môi trường tăng trưởng
căn bản, cớ hoặc không có sinh hơi và H2S


Cách cấy mẫu: Cấy ria trên bề mặt nghiêng của thạch và
cấy đâm sâu xuống đáy, ủ ở 37 ± 1 C/24 ± 3h.⁰

Salmonella chỉ lên men được đường glucose trong môi
trường TSI → phần nghiêng của thạch có màu đỏ, phần
sau có màu vàng.

Salmonella có khả năng sinh H2S → Xuất hiện các vệt
màu đen trong môi trường TSI.

Có thể thấy hiện tượng sinh khí qua hiện tượng làm vỡ
thạch môi trường hoặc môi trường bị đẩy lên tạo ra một
khoảng không bên dưới ống nghiệm
BƯỚC 5: KHẲNG ĐỊNH SINH HÓA VÀ
KHÁNG HUYẾT THANH

Lysine Decarboxylase broth (LDC)

Nguyên tắc: Phát hiện vi
khuẩn sinh các enzyme
decarboxylase

Cách cấy mẫu: Cấy ngay
phía dưới của bề mặt môi
trường lỏng, phủ một lớp
paraffin hay dầu khoáng
lên bề mặt môi trường. Ủ ở
37 ± 1 C/24 ± 3h. ⁰


Dương tính: Môi trường
giữ nguyên màu tím.

Âm tính: Môi trường có
màu vàng
Salmonella on (LDC)
BƯỚC 5: KHẲNG ĐỊNH SINH HÓA VÀ
KHÁNG HUYẾT THANH

Ure Broth

Nguyên tắc: Phát hiện khả
năng phân cắt Ure thành
ammoniac.

Cách cấy mẫu: Cấy ria trên
bề mặt nghiêng của thạch. Ủ
ở 37 ± 1 C/24 ± 3h. ⁰

Dương tính: Môi trường từ
màu đỏ chuyển sang màu
hồng, sau đó chuyển thành
màu đỏ hồng.

Âm tính: Môi trường không
đổi màu (vàng cam).
Salmonella on Ure Broth
BƯỚC 5: KHẲNG ĐỊNH SINH HÓA VÀ
KHÁNG HUYẾT THANH


Môi trường phản ứng Indol

Nguyên tắc: Phát hiện khả
năng oxi hóa tryptophan thành
các dạng của Indol: Indol,
Skatol (methyl indol) và indol-
acetate.

Cách cấy mẫu: Cấy khuẩn lạc
nghi ngờ vào ống chứa 5ml
môi trường tryptone water. Ủ
ở 37 ± 1 C/24 ± 3h. Sau khi ủ, ⁰
thêm 1ml thuốc thử Kovac’s.

Dương tính: Bề mặt môi
trường xuất hiện màu đỏ.

Âm tính: Xuất hiện màu khác.
BƯỚC 5: KHẲNG ĐỊNH SINH HÓA VÀ
KHÁNG HUYẾT THANH

Phát hiện β-galactosidase

Nguyên tắc: Xác định khả năng lên men
Lactose của vi sinh vật.

Cách cấy mẫu: Cho một vòng đầy các khuẩn
lạc nghi ngờ vào ống vô trùng có chứa 0.25ml
dung dịch muối sinh lý. Thêm 1 giọt Toluen và
lắc ống. Đặt ống này vào nồi cách thủy ở

37 C/vài phút. Thêm 0.25ml thuốc thử để phát ⁰
hiện β-galactosidase và lắc đều. Đặt lại ống
vào nồi cách thủy để ở 37 C/24 ± 3h.⁰

Dương tính: Màu vàng (xuất hiện sau 20 phút)
BƯỚC 5: KHẲNG ĐỊNH SINH HÓA VÀ KHÁNG
HUYẾT THANH

Voges – Prokauer

Nguyên tắc: Xác định khả năng sinh acetylmethylcarbinol
(acetoin) trong quá trình lên men glucose của một số vi
sinh vật.

Cách cấy mẫu: Cấy VSV vào môi trường glucose
phosphate (MR –VP Broth). Ủ ở 37 ± 1 C/24 ± 3h. Sau ⁰
đó thêm 2 giọt Creatin, 3 giọt α-naphthol và sau đó thêm
2 giọt dung dịch Kali hydroxide, lắc đều sau mỗi lần thêm
thuốc thử.

Dương tính: Xuất hiện màu hồng đến mà đỏ sang trong
15 phút.

Âm tính: Dịch vi khuẩn không đổi màu
BƯỚC 5: KHẲNG ĐỊNH SINH HÓA VÀ
KHÁNG HUYẾT THANH

Thử phản ứng kháng huyết thanh

Loại trừ chủng tự ngưng kết: Nhỏ một giọt nước muối

sinh lí lên phiến kính thủy tinh đã được làm sạch một
cách cẩn thận, dùng que cấy vòng trộn đều dung dịch
với khuẩn lạc cần thử, để thu được huyền phù đục và
đồng nhất. Lắc nhẹ phiến kính. Quan sát kết quả trên
nền tối, tốt nhất là dùng kính lúp. Nếu có sự vón cục
thì chủng xem như ngưng kết, không cần thử phản
ứng huyết thanh tiếp theo. Ngược lại cần phải tiếp tục
phản ứng thử huyết thanh.

Kiểm tra O, H,…