HPLC - MS TRONG AN TOÀN THỰC PHẨM

1
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA CÔNG NGHỆ
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC
SEMINAR PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HIỆN ĐẠI
Đề tài:
HPLC - MS
TRONG AN TOÀN THỰC PHẨM
CBHD: NGUYỄN THỊ DIỆP CHI
Lớp: Công Nghệ Hoá Học K31
Nhóm: 2
Sinh Viên:
Bùi Thy Anh 2051778
Nguyễn Thị Thanh Loan 2051820
Đặng Minh Nhựt 2051838
Phạm Hoàng Ánh Phương 2051846
CHƯƠNG 1:TỔNG QUAN
I. GIỚI THIỆU:
Hiện nay vấn đề an toàn thực phẩm đang là mối quan tâm của xã hôi. Thực
phẩm rất dễ bị ô nhiễm bởi các tác nhân sinh học, các chất độc hại hóa học, độc hại
vật lý có thể gây ngộ độc nguy hiểm và ảnh hưởng tới sức khỏe người tiêu
dùng. Do đó, việc phát hiện và phòng tránh những bệnh tật tiềm ẩn do thực phẩm
có ý nghĩa quan trọng, có nhiều phương pháp phân tích các độc tố trong thực phẩm
như GC, LC, HPLC kết hợp với các detector phù hợp. Trong đó, việc các định
chính xác thành phần các độc tố bằng HPLC với detector khối phổ MS nhằm phân
tích chính xác thành phần và hàm lượng ngày càng được sử dụng phổ biến.
1. Các tác nhân sinh học chính gây ô nhiễm bao gồm: vi khuẩn, nấm mốc, vi rút
và ký sinh vật
· Vi khuẩn có ở mọi nơi xung quanh chúng ta. Phân nước thải, rác bụi, thực
phẩm tươi sống là ổ chứa của nhiều loại vi khuẩn gây bệnh. Trong không khí và
ngay ở trên cơ thể người cũng có hàng trăm loại vi khuẩn, cư trú ở da (đặc biệt là ở

bàn tay), ở miệng, ở đường hô hấp, đường tiêu hóa, bộ phận sinh dục, tiết niệu.
Thức ăn chín để ở nhiệt độ bình thường là môi trường tốt cho vi khuẩn trong không
khí xâm nhập và phát triển rất nhanh, đặc biệt các thức ăn còn thừa sau các bữa ăn
chỉ cần một vài giờ là số lượng vi khuẩn có thể sinh sản đạt đến mức gây ngộ độc
thực phẩm.
· Nấm mốc thường gặp trong môi trường sống, nhất là ở trong các lợi ngũ cốc,
quả hạt có dầu dự trữ trong điều kiện khí hậu nóng ẩm như ở nước ta. Nấm mốc
gây hư hỏng thực phẩm, một số loại còn sản sinh ra các độc tố nguy hiểm.
Aflatoxin là độc tố vi nấm được biết rõ nhất do nấm Aspergillus Flavus và
Aspergillus Parasiticus sản sinh ra trong ngô, đậu và lạc ẩm mốc có thể gây ung
thư gan.
2
· Vi rút gây ngộ độc thực phẩm thường có trong ruột người. Các nhuyễn thể
sống ở vùng nước ô nhiễm, rau quả tưới nước có phân tươi hoặc các món rau sống
chuẩn bị trong điều kiện thiếu vệ sinh thường hay bị nhiễm vi rút bại liệt, vi rút
viêm gan.
- Virút có thể lây truyền từ phân qua tay người tiếp xúc hoặc từ nước bị ô nhiễm
phân vào thực phẩm, với một lượng rất ít virút đã gây nhiễm bệnh cho người. Virút
nhiễm ở người có thể lây sang người khác trước khi phát bệnh.
· Ký sinh vật thường gặp trong thực phẩm là giun sán. Người ăn phải thịt có
ấu trùng sán dây trong thịt bò (sán dây bò), trong thịt lợn (thịt lợn gạo) chưa nấu
chín, khi vào cơ thể thì ấu trùng sẽ phát triển thành sán trưởng thành ký sinh ở
đường tiêu hóa và gây rối loạn tiêu hóa.
- Khi ăn cá nước ngọt như cá diếc, cá rô, cá chép, cá trôi… có nang trùng sán lá
gan nhỏ chưa nấu chín thì nang trùng chuyển tới ống mật, lên gan và phát triển ở
gan thành sán trưởng thành gây tổn thương gan mật
- Nếu ăn phải tôm, cua có nang trùng sán lá phổi chưa nấu chín hoặc uống nước có
nang trùng thì chúng sẽ xuyên qua thành ruột và qua cơ hoành lên phổi, phát triển
thành sán trưởng thành gây viêm phế quản, đau ngực, ho khạc ra máu nguy hiểm.
Bệnh do giun xoắn cũng bởi tập quán ăn thịt tái, nem bằng thịt sống, ăn tiết canh

có ấu trùng gây nhiễm độc, dị ứng, sốt cao, liệt cơ hô hấp có thể dẫn đến tử vong.
2. Những độc hại hóa học thường gây ô nhiễm trong thực phẩm như:
· Các chất ô nhiễm trong công nghiệp và môi trường như: các dioxin, các chất
phóng xạ, các kim loại nặng (chì, thuỷ ngân, asen, cadimi…)
· Các chất hoá học sử dụng trong nông nghiệp: thuốc bảo vệ thực vật, động
vật, thuốc thú y, chất tăng trưởng, phân bón, thuốc trừ giun sán và chất hun khói.
· Các chất phụ gia sử dụng không đúng qui định: các chất tạo màu, tạo mùi,
tạo ngọt, tăng độ kết dính, ổn định, chất bảo quản, chất chống ôxy hóa, chất tẩy
rửa… và các hợp chất không mong muốn trong vật liệu bao gói, chứa đựng thực
phẩm.
3
· Các chất độc hại tạo ra trong quá trình chế biến thịt hun khói, dầu mỡ bị
cháy khét, các hợp chất tạo ra do phản ứng hóa học trong thực phẩm, sự sản sinh
độc tố trong quá trình bảo quản, dự trữ bị nhiễm nấm mốc (độc tố vi nấm) hay biến
chất ôi hỏng.
- Các độc tố tự nhiên có sẵn trong thực phẩm như mầm khoai tây, sắn, đậu mèo,
măng, nấm độc, cá nóc, cá cóc…
- Các chất gây dị ứng trong một số hải sản, nhộng tôm… các độc hại nguồn gốc vật
lý như các mảnh thuỷ tinh, gỗ, kim loại, đá sạn, xương, móng, lông, tóc và các vật
lạ khác lẫn vào thực phẩm cũng gây nguy hại đáng kể như gãy răng, hóc xương,
tổn thương niêm mạc dạ dày, miệng…
II. MÁY SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC – KHỐI PHỔ MS:
Hiện nay, HPLC là dạng sắc ký lỏng với áp suất cao được cải tiến từ LC.
HPLC được dùng phổ biến vì có thể phân tích các chất khó bay hơi, và là dang sắc
ký điều chế. Do đó, HPLC được dùng để phân tích an tòan thực phẩm, môi trường
và dược phẩm.
Trong thực phẩm HPLC được dung để phân tích thành thành phần, các chất
phụ gia, chất bảo quản, các độc tố trong thịt, cá, trứng, sữa, …
4
CHƯƠNG 2

PHÂN TÍCH NITROFURAN BẰNG
HPLC MS/MS
I.GIỚI THIỆU :
Nitrofuran và 5-Nitroimidazoles là hai chất kháng sinh được sử dụng rộng rãi
trong chăn nuôi, thủy sản. Hiện nay, chúng bị cấm do dư lượng của chúng trong thực
phẩm có thể gây ung thư Nitrofuran có 4 chất chính : Furazolidone,Furaltadone,
nitrofurazone,nitrofurantoin.
5
1 Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng của các chất chuyển hoá
thuộc nhóm nitrofuran gồm furazolidon, furaltadon, nitrofurantoin và nitrofurazon
trong thủy sản và sản phẩm thủy sản. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 1 mg/kg.
2 Phương pháp tham chiếu
Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp của Viện Kiểm soát Chất lượng
sản phẩm nông nghiệp Hà lan (RIKILT).
3 Giải thích thuật ngữ và các từ viết tắt
3.1 Giải thích thuật ngữ Trong Tiêu chuẩn này, các thuật ngữ dưới đây được hiểu
như sau:
3.1.1 Dư lượng liên kết với mô là các chất tồn dư do có các liên kết đồng hoá trị với
các đại phân tử trong cơ thể động vật.
3.1.2 Ion sơ cấp (precursor ion) là ion được tạo ra và chọn lọc sau giai đoạn MS thứ
nhất, thông thường, nhưng không nhất thiết nó là một ion phân tử mang điện dương.
3.1.3 Ion thứ cấp (product ion) là ion được tạo ra và chọn lọc trong giai đoạn MS thứ
hai, ion này được sinh ra từ ion sơ cấp trong quá trình phân ly do va chạm.
3.2 Các từ viết tắt
3.2.1 LC/MS/MS: Sắc kí lỏng/khối phổ/khối phổ.
3.2.2 CID (Collision induced dissociation): phân ly do va chạm.
3.2.3 ESI (Electron spray ionization): ion hoá bằng phun điện tử.
3.2.4 HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao.
4 Nguyên tắc

Dư lượng liên kết với mô của các chất chuyển hoá nhóm nitrofuran trong sản
phẩm thuỷ sản được thuỷ phân bằng axit clohyđric loãng để thu được mạch nhánh của
các chất nhóm nitrofuran. Các mạch nhánh này được dẫn xuất hoá bằng 2-
nitrobenzalđehyt. Ðịnh tính và định lượng các chất dẫn xuất bằng LC/MS/MS bằng
cách sử dụng các đồng vị đơtơri như chất chuẩn nội.
5 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, dung dịch
5.1 Thiết bị, dụng cụ
5.1.1 Cân phân tích, độ chính xác 0,01 mg.
5.1.2 Cân phân tích, độ chính xác 0,01 g.
5.1.3 Máy nghiền
5.1.4 Máy ly tâm
5.1.5 Tủ ấm (có thể điều chỉnh được ở khoảng nhiệt độ 37
o
C 2
o
C)
5.1.6 Hệ thống cô bằng khí Nitơ
5.1.7 Máy lắc Vortex.
5.1.8 Màng lọc PTFE, 13mm, 0,45mm.
6
5.1.9 Giấy thử pH
5.1.10 Pipet 100ml
5.1.11 Hệ thống LC/MS/MS:
- Hệ thống sắc kí lỏng: Water Alliance 2690 hoặc tương đương gồm bơm và hệ thống
tiêm mẫu; - Cột bảo vệ pha đảo C18 (Symmetry Sentry Guard hoặc tương đương),
kích thước 20 x 3,9mm; - Cột C18 (Symmetry hoặc tương đương) kích thước150 x
3,0 mm, 5mm, - Ðầu dò khối phổ dạng bốn cực với giao diện ESI (Triple quadrupole
Micromass Quattro Ultima hoặc tương đương).
5.1.12 ống ly tâm 14ml, polypropylen hoặc thuỷ tinh, có nắp đậy
5.1.13 Máy lắc ống nghiệm

5.1.14 Lọ đựng mẫu cho HPLC
5.1.15 Bình định mức 10ml, 20ml, 100ml
5.1.16 Dụng cụ thủy tinh thông thường.
5.1.17 Máy lắc đảo đầu (Heidolf REAX2) hoặc tương đương
5.2 Hóa chất
Hoá chất phải là loại tinh khiết được sử dụng để phân tích gồm:
5.2.1 Metanol
5.2.2 Axit clohydric (HCl) 32%.
5.2.3 2-nitrobenzalđehyt (C
7
H
5
NO
3
) viết tắt làNBA.
5.2.4 Natri phosphat ngậm nước Na
3
PO
4
.12H
2
O.
5.2.5 Natri hyđroxyt khan (NaOH).
5.2.6 Etyl axetat (CH
3
COOC
2
H
5
).

5.2.7 Axit axetic (CH
3
COOH).
5.2.8 Axetonitril (CH
3
CN).
5.2.9 Metanol -d, 99,5% D. 5.2.10 Nước
5. 3 Chất chuẩn
5.3.1 3-amino-2-oxazolidinon (AOZ).
5.3.2 5-metylmorfolino-3-amino-2-oxazolidinon (AMOZ).
5.3.3 1-amino-hyđantoin hyđroclorit (AHD).
5.3.4 Semicarbazit (SEM) hyđroclorit.
5.3.5 3-amino-2- oxazolidinon-d
4
hyđroclorit (AOZ-d
4
).
5.3.6 5-metylmorfolino-3-amino-2-oxazolidinon-d
5
(AMOZ-d
5
).
5.3.7 1-amino-hyđantoin hyđroclorit-d
2
(AHD-d
2
).
5.3.8 3-((2-nitrophenyl)metylen)-amino-2-oxazolidinon (NPAOZ).
5.3.9 5-metylmorfolino-3-((2-nitrophenyl)metylen)-3-amino-2-oxazolidinon
(NPAMOZ).

5.3.10 1-((2-nitrophenyl)metylen)-amino-hyđantoin (NPAHD).
5.3.11 (2-nitrophenyl) metylen-semicarbazit (NPSEM).
5.4 Chuẩn bị các dung dịch
5.4.1 Axit clohyđric 0,2M: hoà tan 20 ml HCl (5.2.2) trong 1000ml nước (5.2.10).
5.4.2 Natri hyđroxit 2M: hoà tan 80g NaOH khan (5.2.5) vào 1000ml nước (5.2.10).
7
5.4.3 2-nitrobenzalđehyt (NBA) 100mM trong metanol nồng độ 0,1M: hoà tan 1,51g
NBA (5.2.3) vào 100ml metanol (5.2.1).
5.4.4 Natri phosphat 0,3M: hoà tan 11,4 g Na
3
PO
4
.12H
2
O (5.2.4) vào 100ml nước
(5.2.10).
5.4.5 Dung môi hoà tan mẫu: trộn 50ml axetonitril (5.2.8), 450 ml nước (5.2.10) và
0,5 ml axit axetic (5.2.7).
5.4.6 Pha động A: trộn 1ml axit axetic (5.2.7) với 1000ml nước (5.2.10), lọc qua
màng lọc 0,45mm (5.1.8).
5.4.7 Pha động B: trộn 900ml axetonitril (5.2.8) với 100ml nước (5.2.10) và 1ml axit
axetic (5.2.7), lọc qua màng lọc 0,45mm (5.1.8).
5.5 Các dung dịch chuẩn
5.5.1 Các dung dịch chuẩn gốc
5.5.1.1 Dung dịch chuẩn gốc AOZ, AMOZ, AHD, SEM, AOZ-d
4
, AMOZ-d
5
,
NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD, NPSEM (50mg/l trong metanol) Cân chính xác từ

khoảng 1 đến 5 mg 0,02mg các chất chuẩn nói trên. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn
gốc bằng cách hoà tan trong metanol (5.2.1), lưu ý đến độ tinh khiết của chất chuẩn.
5.5.1.2 Dung dịch chuẩn gốc AHD-d
2
(50mg/l trong metanol-d) Cân chính xác từ
khoảng 1 đến 5 mg 0.02mg các chất chuẩn nói trên. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn
gốc bằng cách hoà tan trong metanol-d (5.2.9), lưu ý đến độ tinh khiết của chất chuẩn.
5.5.2 Hỗn hợp các dung dịch chuẩn
5.5.2.1 Hỗn hợp MM1 (1mg/l trong metanol) gồm AOZ, AMOZ, AHD, SEM Lấy
200 ml từ mỗi dung dịch gốc AOZ, AMOZ, AHD, SEM (5.5.1.1) cho vào bình định
mức 10ml, định mức đến vạch với metanol (5.2.1).
5.5.2.2 Hỗn hợp IS1 (1 mg/l trong metanol-d) gồm AOZ-d
4
, AMOZ-d
5
,AHD-d
2
Lấy
200 ml từ mỗi dung dịch gốc AOZ-d
4
, AMOZ-d
5
(5.5.1.1) và AHD-d
2
(5.5.1.2) cho
vào bình định mức 10ml, định mức đến vạch với metanol-d (5.2.9).
5.5.2.3 Hỗn hợp NP1 (1mg/l trong metanol) gồm NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD,
NPSEM Lấy 460 ml dung dịch gốc NPAOZ (5.5.1.1), 332 ml dung dịch gốc
NPAMOZ (5.5.1.1), 432 ml dung dịch gốc NPAHD (5.5.1.1) và 554 ml dung dịch
gốc NPSEM (5.5.1.1) cho vào bình định mức 10 ml. Ðịnh mức đến vạch với metanol

(5.2.1).
5.5.3 Pha loãng các hỗn hợp dung dịch chuẩn
5.5.3.1 Hỗn hợp chuẩn MM2 (50 mg/l trong metanol) gồm AOZ, AMOZ, AHD, SEM
Lấy 1,00 ml hỗn hợp chuẩn MM1 (5.5.2.1) cho vào bình định mức 20ml, định mức
đến vạch với metanol (5.2.1).
5.5.3.2 Hỗn hợp chuẩn nội IS2 (50 mg/l trong metanol-d) gồm AOZ-d
4
, AMOZ-
d
5
,AHD-d
2
Lấy 1,00 ml hỗn hợp chuẩn IS1 (5.5.2.2) cho vào bình định mức 20ml,
định mức đến vạch với metanol-d (5.2.9).
5.5.3.3 Hỗn hợp chuẩn NP2 (100 mg/l trong metanol) gồm NPAOZ, NPAMOZ,
NPAHD, NPSEM Lấy 2,00 ml hỗn hợp chuẩn NP1 (5.5.2.3) cho vào bình định mức
20ml, định mức đến vạch với metanol (5.2.1).
5.5.4 Dung dịch chuẩn làm việc của các dẫn xuất nitrophenyl - WS1 (1mg/l) Lấy 1,00
ml hỗn hợp chuẩn NP2 (5.5.3.3) cho vào bình định mức 1000ml, định mức đến vạch
8
với dung môi hoà tan mẫu (5.4.5). Tất cả các dung dịch chuẩn phải được bảo quản
trong bóng tối ở nhiệt độ 4
o
C. Các dung dịch chuẩn gốc có thể sử dụng trong 1 năm.
Các hỗn hợp chuẩn có thể sử dụng trong 1 tháng. Dung dịch chuẩn làm việc (5.5.4) có
thể sử dụng trong 1 tuần.
6 Phương pháp tiến hành
6.1 Chuẩn bị mẫu
6.1.1 Mẫu thử nghiệm Cân chính xác 1,0 0,05 g mẫu cần kiểm nghiệm đã được đồng
nhất bằng máy nghiền (5.1.3) cho vào ống ly tâm 14ml (5.1.12). Bổ sung 40ml hỗn

hợp chuẩn nội IS2 (5.5.3.2), đồng nhất và để yên trong 15 phút.
6.1.2 Mẫu kiểm soát chất lượng
6.1.2.1 Mẫu kiểm soát âm tính: mẫu trắng không chứa AOZ, AMOZ, AHD và SEM
Cân chính xác 1,0 0,05 g mẫu trắng (đã được chứng nhận), bỏ vào ống ly tâm 14ml
(5.1.12). Bổ sung 40 ml hỗn hợp chuẩn nội IS2 (5.5.3.2) và để yên trong 15 phút. Sau
đó, tiến hành thuỷ phân và dẫn xuất hoá theo qui định tại Ðiều 6.2.1.
6.1.2.2 Mẫu kiểm soát dương tính: mẫu trắng được bổ sung AOZ, AMOZ, AHD và
SEM Cân chính xác 4 phần có khối lượng 1,0 0,05 g mẫu trắng (đã được chứng
nhận), bỏ vào 4 ống ly tâm 14ml (5.1.12). Bổ sung các dung dịch chuẩn theo cách ghi
trong Bảng 1 rồi để yên trong 15 phút. Sau đó, tiếp tục thuỷ phân và dẫn xuất hoá theo
qui định tại Ðiều 6.2.1.
Bảng 1 - Chuẩn bị mẫu kiểm soát dương tính
Nồng độ trong mẫu (mg/kg) Hỗn hợp chuẩn MM2
(5.5.3.1) (ml)
Hỗn hợp chuẩn nội IS2
(5.5.3.2) (ml)
0,5 10 40
1 20 40
2 40 40
5 100 40

6.1.2.3 Mẫu kiểm soát độ thu hồi: mẫu trắng bổ sung các chất dẫn xuất nitrophenyl
của AOZ, AMOZ, AHD và SEM chuẩn. Cân chính xác 2 phần có khối lượng 1,0 0,05
g mẫu trắng (đã được chứng nhận), bỏ vào 2 ống ly tâm 14ml (5.1.12). Bổ sung 40ml
dung dịch chuẩn nội IS2 (5.5.3.2) rồi để yên trong 15 phút. Sau đó, tiếp tục thuỷ phân
và dẫn xuất hoá theo qui định tại Ðiều 6.2.1. Sau khi làm bay hơi etyl axetat (6.2.3),
thêm vào một mẫu 20ml hỗn hợp chuẩn NP2 (5.5.3.3) và 480ml dung môi hoà tan
mẫu (5.4.5). Thêm vào một mẫu khác 50ml hỗn hợp chuẩn NP2 (5.5.3.3) và 450ml
dung môi hoà tan mẫu (5.4.5). Sau đó, tiến hành chuẩn bị mẫu phân tích (6.2.4) với
công đoạn lọc.

6.2 Xử lý mẫu
Chú thích: Vì các chất dẫn xuất nitrophenyl rất nhậy với ánh sáng nên toàn bộ
qui trình xử lý mẫu phải được tiến hành dưới ánh sáng yếu (ánh sáng vàng).
6.2.1 Thuỷ phân và dẫn xuất hoá Thêm 5 ml axit clohyđric 0,2M (5.4.1) và 50ml
dung dịch 2-NBA trong metanol (5.4.3)vào các ống nghiệm chứa mẫu (6.1.1; 6.1.2.1;
6.1.2.2; 6.1.2.3). Ðậy nắp ống và lắc bằng tay để phân tán mẫu. Ðặt lên máy lắc ống
9
nghiệm (5.1.13) rồi đặt cả hệ thống vào trong tủ ấm. ủ mẫu qua đêm ở nhiệt độ 37
2
o
C.
6.2.2 Trung hoà Sau khi làm nguội, thêm 500 ml dung dịch Na
3
PO
4
0,3M (5.4.4) vào
mẫu. Lắc mẫu bằng tay. Ðiều chỉnh pH về 70,5 bằng dung dịch NaOH 2M (5.4.2),
kiểm tra pH bằng giấy thử pH (5.1.9). Lắc bằng tay và để yên trong 5 phút. Kiểm tra
lại pH và điều chỉnh thêm nếu cần thiết.
6.2.3 Chiết Thêm 4ml etyl axetat (5.2.6) vào mẫu đã điều chỉnh pH. Chiết mẫu bằng
cách đặt trên máy lắc đảo đầu (5.1.17) trong 20 phút. Ly tâm mẫu trong 10 phút ở tốc
độ 2000 vòng/phút. Chuyển lớp hữu cơ ở phía trên sang một ống ly tâm 14ml (5.1.12)
sạch. Lặp lại bước chiết bằng cách thêm 4ml etyl axetat (5.2.6) vào phần mẫu còn lại,
đóng nắp ống ly tâm rồi đặt trên máy lắc đảo đầu (5.1.17) trong 20 phút. Ly tâm mẫu
trong 10 phút ở tốc độ 3500 vòng/phút. Lấy lớp hữu cơ và kết hợp với phần hữu cơ đã
lấy ở lần đầu rồi làm bay hơi cho đến khô ở nhiệt độ 45
o
C với hệ thống cô bằng khí
nitơ (5.1.6) với tốc độ dòng khí chậm. Chú thích: tổng thể tích phần hữu cơ phải lớn
hơn 6 ml, nếu không phải chiết thêm một lần nữa.

6.2.4 Chuẩn bị mẫu phân tích Hoà tan cặn khô bằng 500ml dung môi hoà tan mẫu
(5.4.5), lắc trên máy lắc Vortex (5.1.7) trong 20 giây. Lọc dịch đục qua màng lọc
13mm, 0,45mm (5.1.8) và thu dịch lọc vào lọ vial cho HPLC (5.1.14).
6.2.5 Phân tích trên LC/MS/MS
6.2.5.1 Ðiều kiện máy LC a. Tốc độ: 0,4 ml/phút; b. Thể tích mẫu tiêm: 50 ml; c.
Nhiệt độ cột: 40
o
C; d. Toàn bộ thời gian phân tích: 22 phút; đ. Pha động: chế độ
gradien theo Bảng 2
Bảng 2 - Ðiều kiện gradien dung môi của máy LC
Thời gian (phút) Pha động A (5.4.6) (%) Pha động B (5.4.7) (%)
0 90 10
1 90 10
14 55 45
16 10 90
18 10 90
19 90 10

6.2.5.2 Ðiều kiện của đầu dò MS a. Tỉ số chia: xấp xỉ 1 : 2 b. Kiểu ion hoá: ESI,
dương c. Ðiện thế mao quản: 2,7 kv d. Ðiện thế khối nón: 30 v đ. Nhiệt độ nguồn:
120
o
C e. Nhiệt độ khử dung môi: 300
o
C g. Tốc độ dòng khí khử dung môi: 500 l/h h.
Tốc độ khí qua khối nón: 200 l/h i. Khí gây phân ly bằng va chạm: Argon, p = 3,2.10
-3
bar.
6.2.5.3 Ðiều kiện phân ly MS/MS NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD và NPSEM bị phân
ly thành các ion thứ cấp liên quan đến cấu trúc. Các chất đồng vị đánh dấu được sử

dụng làm chất chuẩn nội cũng có cách phân ly tương tự (Bảng 3).
Bảng 3 - Các điều kiện phân ly MS/MS
Thành phần Ion sơ cấpIon thứ cấpThời gianNăng lượng vaCửa sổ (phút)
10
(m/z) (m/z) lưu (s) chạm (eV)
NPAMOZ 335 0,5 262 0,5 291
0,5
0,3 0,3 15 15 0,0 - 8,5 0,0 -
8,5
NPAMOZ-d
5
340 0,5 296 0,5 0,3 15 0,0 - 8,5
NPAHD 249 0,5 134 0,5 178
0,5
0,2 0,2 15 15 8,5 - 13,0 8,5
- 13,0
NPAHD-d
2
251 0,5 134 0,5 0,2 15 8,5 - 13,0
NPSEM 209 0,5 166 0,5 192
0,5
0,2 0,2 10 10 8,5 - 13,0 8,5
- 13,0
NPAOZ 236 0,5 104 0,5 134
0,5
0,3 0,3 17 17 13,0 -18,0
13,0 -18,0
NPAOZ-d
4
240 0,5 134 0,5 0,3 17 13,0 -18,0

Chú thích: các ion thứ cấp có cường độ cao nhất được gạch chân.
6.2.6 Kiểm tra hiệu năng của hệ thống LC/MS/MS Tiêm dung dịch chuẩn làm việc
1mg/l (5.5.4). Xác định tỷ lệ tín hiệu/nhiễu (S/N) đối với bước chuyển có cường độ
thấp nhất. Tỷ lệ S/N phải lớn hơn 6. Lặp lại bước tiêm để kiểm tra sự lặp lại của thời
gian lưu, diện tích pic và tỉ lệ các ion.
6.2.7 Trình tự tiêm mẫu Các mẫu sẽ được phân tích theo trình tự sau: a. Dung môi
trắng; b. Mẫu kiểm soát âm tính (6.1.2.1); c. Mẫu kiểm soát dương tính (6.1.2.2); d.
Mẫu kiểm soát độ thu hồi (6.1.2.3); đ. Dung môi trắng; e. Mẫu cần kiểm nghiệm
(6.2.4); g. Dung môi trắng; h. Mẫu kiểm soát âm tính (6.1.2.1); i. Mẫu kiểm soát
dương tính (6.1.2.2).
7 Tính kết quả
7.1 Tính tỉ số ion theo công thức sau:
100 x A
1
R (%) = (1)
A
2
Trong đó: - R là tỉ số ion (%).
- A
1
là diện tích của pic ion thứ cấp có cường độ thấp nhất.
- A
2
là diện tích của pic ion thứ cấp có cường độ cao nhất.
11
7.2 Tính độ lệch tương đối của tỉ số ion theo công thức sau:

Trong đó:
- DR là độ lệch tương đối giữa tỉ số ion của chất cần phân tích trong mẫu kiểm với tỉ
số ion trung bình của chất đó trong mẫu kiểm soát dương tính có nồng độ 1 mg/kg và

cao hơn (%).
- R
s
là tỉ số ion của chất cần phân tích trong mẫu kiểm (1).
- R
m
là tỉ số ion trung bình của chất cần phân tích trong mẫu kiểm soát dương tính có
nồng độ 1 mg/kg và cao hơn (%) (1).
R
s
- R
m
DR (%) = x 100 (2)
R
m
Rt
Rrt = (3)
Rt
IS
7.3 Tính thời gian lưu tương đối theo theo công thức sau:

Trong đó: - Rrt là thời gian lưu tương đối.
- Rt là thời gian lưu của chất cần phân tích.
- Rt
IS
là thời gian lưu của chất chuẩn nội (đối với NPSEM thì NPAHD-d
2
là chất
chuẩn nội).
7.4 Tính độ lệch chuẩn của thời gian lưu tương đối theo công thức sau:

Rrt
s
- Rrt
m
12
DRrt (%) = x 100 (4)
Rrt
m


Trong đó: - DRrt là độ lệch tương đối giữa Rrt của chất cần phân tích trong mẫu kiểm
so với Rrt của chất đó trong mẫu kiểm soát dương tính (%).
- Rrt
s
là thời gian lưu tương đối của chất cần phân tích trong mẫu kiểm.
- Rrt
m
là thời gian lưu tương đối trung bình của chất cần phân tích trong mẫu kiểm
soát dương tính.
7.5 Chất cần phân tích được khẳng định là có mặt khi các yêu cầu sau được thoả
mãn:
a. Tỷ lệ tín hiệu/nhiễu cho mỗi ion phải không nhỏ hơn 3:1.
b. Mức dung sai tối đa cho phép của các cường độ ion tương đối, sử dụng nhiều loại
kỹ thuật khối phổ theo qui định trong Bảng 4.
Bảng 4 - Mức dung sai tối đa cho phép của các cường độ ion tương đối
Cường độ tương đối
(% của pic cơ sở)
LC-MS, LC-MSn
(tương đối)
Lớn hơn 50 % 20 %

Từ lớn hơn 20 đến 50 % 25 %
Từ lớn hơn 10 đến 20 % 30 %
Không lớn hơn 10 % 50 %
13

Sp
RF = (5)
Sp
IS

7.6 Tính hệ số tín hiệu cho từng chất cần phân tích theo công thức sau:

Trong đó: - RF là hệ số tín hiệu.
- Sp là tổng diện tích pic của các ion thứ cấp của chất cần phân tích.
- Sp
IS
làdiện tích pic của ion thứ cấp của chất chuẩn nội (đối với NPSEM, NPAHD-d
2
được sử dụng làm chất chuẩn nội).
7.7 Tính lượng chất cần phân tích có mặt trong mẫu kiểm theo công thức sau:
RF - b
X =
a

Trong đó: - X là lượng chất cần phân tích có trong mẫu kiểm (mg/kg).
(*)
- RF là hệ số tín hiệu (công thức 5).
- b là độ dựng của đường chuẩn tính theo phương pháp hồi qui tuyến tính.
- a là độ dốc của đường chuẩn tính theo phương pháp hồi qui tuyến tính.
(**)

Chú thích: (*) : tính theo khối lượng chất chuyển hoá chưa bị dẫn xuất hoá.
14
(**): dựng đồ thị tín hiệu của mẫu kiểm soát dương tính với nồng độ chất chuẩn bổ
sung và áp dụng hồi qui tuyến tính.
CHƯƠNG 3:
PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
AFLATOXIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG
HIỆU NĂNG CAO
1. Đặt vấn đề
Trong lịch sử đã từng xảy ra nhiều vụ ngộ
độc thức ăn do độc tố của một số chủng vi
nấm mà chúng ta gọi là nấm mốc, gây tử vong
cho hàng loạt người và gia súc. Tuy những
nghiên cứu về nấm mốc mới chỉ phát triển
trong mấy chục năm gần đây (nhất là sau khi
phát hiện ra các chất kháng sinh) - Nhưng nhờ
đó đã làm cho sự hiểu biết về độc tố của
chúng ngày càng sang rõ
Aflatoxin là những chất chuyển hóa có độc tính cao của nấm Aspergillus
flavus và Aspergillus paraciticus. Các loài nấm này rất dễ sinh sản trên các nguyên
liệu giàu tinh bột hay những hạt có dầu nên Aflatoxin có thể tìm thấy trên rất nhiều
loại thực phẩm như : Đậu phộng, càfe, sữa, tương , chao bắp và các loại ngũ cốc
khác…Đến nay đã có ít nhất 16 cấu trúc hóa học gần nhau của các Aflatoxin được xác
định song song với độc tính của chúng. Dựa trên đặc tính lý hóa và tính độc khác
15
nhau các Aflatoxin được chia thành nhiều nhóm : B ( B1 , B2); G (G1, G2); M (M1,
M2); P1 và Q1. Aflatoxin được xem như là một trong các tác nhân gây ung thư gan ở
người và gây ra dị tật thai ở phụ nữ mang thai Vì vậy, việc kiểm tra Aflatoxin trong
lương thực và thực phẩm là việc làm tối cần thiết nhằm đảm bảo giá trị kinh tế torng
sản xuất và bảo vệ sức khỏe cộng đồng, nhất là ở nước ta là nước có khí hậu nhiệt đới

rất thích hợp cho sự phát triển các loài vi nấm. Phương pháp phân tích Aflatoxin
chính thức được chấp nhận trên toàn thế giới là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao (HPLC)

Giới hạn độc tố vi nấm (Mycotoxin) trong thực phẩm mcg/Kg (ppb).


2. Nguyên tắc
Aflatoxin có trong mẫu thực phẩm bao gồm các nhóm B1, B2, G1 và G2 được chiết
tách ra bằng clorofom. Dịch chiết đựơc làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn
(SPE) trên silicagel. Hàm lượng aflatoxin có trong dịch chiết được xác định trên hệ
thống HPLC với đầu dò huỳnh quang theo phương pháp ngoại chuẩn. Giới hạn phát
hiện của phương pháp là 1,5 µg/kg.
T
T
Tên độc tố vi nấm Sản phẩm Giới hạn nhiễm tối
đa cho phép (ppb)
1 Aflatoxin tổng số hoặc
B
1
Thức ăn 10
2 Aflatoxin M
1
Sữa 0,5
3 Các độc tố vi nấm
khác
Thức ăn 35
16
3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, chất chuẩn và dung dịch thử
3.1 Thiết bị, dụng cụ

- Hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang.
- Cột sắc ký pha đảo LC18 kích thước L x ID là 25 cm x 4,6 mm, đường kính
hạt từ 5-10 µm
- Máy nghiền đồng thể tốc độ 10 000 vòng/ phút.
- Cân phân tích có độ chính xác 0,0001 g.
- Máy ly tâm tốc độ 5 000 vòng/phút.
- Bể siêu âm.
- Hệ thống cô quay chân không.
- Cột thủy tinh có khóa teflon, kích thước L x ID là 500 x 20 mm và 500 x 8
mm.
- ống ly tâm thủy tinh dung tích 250 ml.
- Bình cầu thủy tinh dung tích 100 ml và 250 ml.
- Bình định mức dung tích 5 ml và 10 ml.

3.2 Hóa chất
- Nước cất, Metanol, Clorofom, Axetonitril loại dùng cho HPLC.
- n-hexan Ete etylic tinh khiết loại dùng cho phân tích.
- Sulfat natri khan.
- Silicagel đã được hoạt hóa: cân 50,0 g silicagel tinh khiết để vào tủ sấy trong
2 giờ ở nhiệt độ 110
o
C. Sau đó để nguội về nhiệt độ của phòng trong bình hút ẩm
và ngâm trong clorofom 15 phút trước khi nhồi cột.
3.3 Dung dịch chuẩn và dung dịch thử
17
- Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp gồm: B1 (nồng độ 100,0 µg/l), B2 (nồng độ 20,0
µg/l), G1 (nồng độ 100 µg/l) và G2 (nồng độ 20 µg/l).
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp aflatoxin trong metanol từ các ống chuẩn.
Tùy theo nồng độ các aflatoxin có trong ống chuẩn, dùng bình định mức và
lượng metanol thích hợp.

- Dung dịch chuẩn trung gian có nồng độ là B1 (10,0 µg/l), B2 (2,0 µg/l), G1 (10,0
µg/l) và G2 (2,0 µg/l): hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp vào
bình định mức 10 ml rồi định mức tới vạch bằng metanol
- Dung dịch chuẩn: hút chính xác lần lượt 0,0 ml, 1,0 ml, 2,0 ml, 4,0 ml, 8,0 ml và
10,0 ml dung dịch chuẩn trung gian vào các bình định mức 10 ml rồi định mức
tới vạch bằng metanol. Các dung dịch chuẩn thu được có nồng độ aflatoxin lần
lượt như sau:
a. Chuẩn 1 : B1 (0,0 µg/l), B2 (0,0 µg/l), G1 (0,0 µg/l), G2 (0,0 µg/l).
b. Chuẩn 2 : B1 (1,0 µg/l), B2 (0,2 µg/l), G1 (1,0 µg/l), G2 (0,2 µg/l).
c. Chuẩn 3 : B1 (2,0 µg/l), B2 (0,4 µg/l), G1 (2,0 µg/l), G2 (0,4 µg/l).
d. Chuẩn 4 : B1 (4,0 µg/l), B2 (0,8 µg/l), G1 (4,0 µg/l), G2 (0,8 µg/l).
đ. Chuẩn 5 : B1 (8,0 µg/l), B2 (1,6 µg/l), G1 (8,0 µg/l), G2 (1,6 µg/l).
e. Chuẩn 6 : B1 (10,0 µg/l), B2 (2,0 µg/l), G1 (10,0 µg/l), G2 (2,0 µg/l).
- Dung dịch pha động: pha hỗn hợp các dung môi axetonitril, metanol và nước cất
loại dùng cho HPLC theo tỉ lệ về thể tích là 2 : 2 : 6.
4. Phương pháp tiến hành
4.1 Chuẩn bị mẫu thử
- Dùng cân phân tích cân chính xác 50,0 g mẫu (m) đã được băm nhuyễn cho vào
ống ly tâm thuỷ tinh dung tích 250 ml
- Thêm 100,0 ml clorofom vào ống rồi trộn đều trong khoảng 2 phút bằng máy
nghiền đồng thể Sau đó, ly tâm ống bằng máy ly tâm trong khoảng 5 phút ở tốc
độ 5 000 vòng/phút. Tiến hành lọc dịch chiết và rửa phần bã bằng clorofom rồi
cho tất cả dịch thu được vào bình cầu thuỷ tinh dung tích 250 ml
18
4.2 Chuẩn bị mẫu trắng
- Mẫu trắng được định nghĩa là mẫu thủy sản đã được xác định không có aflatoxin.
Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như chuẩn bị với mẫu thử theo qui định tại
4.3 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi
- Thêm 2,0 ml dung dịch chuẩn 3 vào 10,0 g mẫu trắng. Ðồng nhất mẫu bằng máy
nghiền đồng thể). Tiến hành chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị với mẫu thử theo

qui định tại Ðiều 5.1. Phải chuẩn bị mẫu xác định độ thu hồi đồng thời với
chuẩn bị mẫu thử và mẫu trắng.
4.4 Làm sạch dịch chiết
- Chuẩn bị cột :Ðặt 1 lớp bông thủy tinh vào đáy cột thủy tinh có khóa teflon Ðóng
khóa và cho clorofom tới khoảng 2/3 cột rồi thêm lần lượt 5,0 g sulfat natri
khan, 20,0g silicagel đã hoạt hóa, 15 g sulfat natri khan.
Chú thích: để tránh khô cột luôn giữ mực clorofom cao hơn lớp sulfat natri
khan trên cùng khoảng 1,5 cm.
- Làm sạch dịch chiết :Cô dịch chiết thu được trên hệ thống cô quay chân không còn
khoảng 5,0 ml ở nhiệt độ 40
o
C. Dùng pipet chuyển dung dịch từ bình cầu vào
cột làm sạch đã chuẩn bị và tráng rửa bình cầu bằng clorofom. Ðiều chỉnh khoá
để tốc độ chảy của dung dịch ra khỏi cột khoảng từ 1,0 đến 1,5 ml/phút. Trong
giai đoạn này, aflatoxin sẽ hấp phụ lên các hạt silicagel.
Thêm vào cột lần lượt 50,0 ml n-hexan 50,0 ml ete etylic. Ðiều chỉnh tốc độ dung
môi chảy qua cột ở 1,0 ml/phút. Sau đó loại bỏ dịch chảy ra khỏi cột.
Giải hấp các aflatoxin khỏi cột làm sạch bằng 50,0 ml hỗn hợp clorofom và
metanol theo tỉ lệ về thể tích là 97: 3 với tốc dộ 1,0 ml/phút. Hứng dung dịch chảy ra
khỏi cột vào bình cầu dung tích 100 ml). Cô dịch thu được trên hệ thống cô quay chân
không ở nhiệt độ 40
o
C cho đến khô hoàn toàn. Hoà tan cặn bằng 5,0 ml (V) dung dịch
pha động trong bình định mức 5 ml Tiến hành phân tích hàm lượng các aflatoxin trên
HPLC theo qui định tại Ðiều 5.5.
Tiến hành làm sạch mẫu trắng (5.2) và mẫu để xác định độ thu hồi (5.3) giống như
với mẫu thử (5.1) theo qui định
4.5 Tiến hành phân tích trên HPLC
Ðiều kiện phân tích
19

a. Cột sắc ký : RP-LC 18, kích thước L x ID là 25 cm x 4,6 mm, đường kính hạt
5-10 µm
b. Nhiệt độ cột : 35
o
C.
c. Pha động : Hỗn hợp gồm: axetonitril, metanol và nước cất (4.3.5.
d. Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.
đ. Bước sóng cài đặt cho đầu dò huỳnh quang là: (kích hoạt) E x 365 nm, (phát xạ)
Em 455 nm.
e. Thể tích tiêm : 20 µl.
Tiêm các dung dịch chuẩn (4.3.4) vào máy HPLC theo thứ tự nồng độ từ thấp
đến cao. Mỗi dung dịch tiêm 2 lần, tính diện tích pic trung bình. Dựng đường chuẩn
biểu thị mối quan hệ giữa các diện tích pic thu được và nồng độ từng loại aflatoxin
theo quan hệ tuyến tính bậc 1 (phương trình y = ax + b).
Tiêm dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng và dung dịch xác định độ thu
hồi vào hệ thống HPLC. Mỗi dung dịch mẫu tiêm 2 lần. Tính giá trị trung bình.
4.6 Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích
Ðộ lặp lại của 2 lần tiêm
Ðộ lệch chuẩn (CV
s
) tính theo diện tích pic sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung
dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %.
Ðộ thu hồi (R)
Ðộ thu hồi được xác định bằng cách sử dụng 10 mẫu trắng đã cho vào một lượng
dung dịch aflatoxin chuẩn đã biết hàm lượng chính xác (5.3). Ðộ thu hồi tính được
phải nằm trong khoảng từ 85 % đến 115 %, độ thu hồi trung bình phải lớn hơn 90 %.
Ðường chuẩn phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan quy hồi tuyến tính
(R
2
) phải lớn hơn hoặc bằng 0,99.

5. Tính kết quả
Hàm lượng các aflatoxin có trong mẫu được tính trên cơ sở đường chuẩn thu
được. Với đường chuẩn ở dạng y = ax +b, hàm lượng các aflatoxin có trong mẫu được
tính theo công thức sau:

20
(Y - b)
C (µg/kg) = x F
a
Trong đó:
- C là nồng độ aflatoxin có trong mẫu, tính theo µg/kg
- Y là hiệu số giữa diện tích pic của dịch chiết và diện tích pic có trong mẫu trắng
tiêm vào HPLC, tính theo đơn vị diện tích
- a, b là các thông số của đường chuẩn y = ax + b- F là hệ số pha loãng mẫu và có giá
trị bằng tỉ số giữa thể tích dịch chiết thu được sau khi làm sạch V và khối lượng mẫu
m sử dụng.
CHƯƠNG 4:
PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
CHLORAMPHENICOL TRONG SỮA
BẰNG SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP – PHỔ
KHỐI LƯỢNG ( HPLC/MS-MS)
I. GIỚI THIỆU :
Chloramphenicol (CAP) là một loại kháng sinh rất có hiệu quả, được sử dụng
rộng rãi từ thập niên 50, sử dụng thường xuyên cho quá trình chế biến thực phẩm có
nguồn gốc động vật nhờ có các đặc tính kháng khuẩn và dược động học tuyệt vời của
nó.
Cấu trúc của Chloramphenicol :
21
Tuy nhiên, trong cơ thể người nó gây ra các độc tính huyết học và các đặc tính
gây ung thư. Điều đó dẫn đến việc sử dụng nó trong sản xuất thuốc cho người và động

vật bị giới hạn. Đến năm 1994, Châu Âu đã hoàn toàn ngăn cấm việc sử dụng CAP
trong sản xuất thực phẩm có nguồn gốc động vật. Từ đó cho thấy sự cần thiết phải có
một phương pháp xác định CAP với độ nhạy và độ tin cậy cao.
Trước đây, một vài phương pháp phân tích đã được phát triển như : HPLC với
đầu dò diode, GC với đầu dò bẫy ion. Tuy nhiên, việc xác định những mẫu khả nghi
phải được thực hiện với đầu dò khối phổ kép để đạt được sự tách sắc ký chính xác.
Với mục đích này, phương pháp GC/MS sử dụng sự va đập ion hoặc sự ion hóa hóa
học đều đòi hỏi phải thực hiện nhiều bước trước khi phân tích. Phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao với đầu dò khối phổ kép (HPLC/MS-MS) là một kỹ thật tinh tế và
đã được dùng để phân tích các loại thực phẩm như thịt, hải sản, trứng, mật ong và đặc
biệt là trong phân tích dư lượng kháng sinh.
Sau đây, kỹ thuật HPLC/MS-MS dùng xác định lượng CAP trong sữa sẽ được
giới thiệu :
 CHUẨN BỊ THÍ NGHIỆM :
 Thiết bị :
− LC Waters Alliance 2695 separations module (Waters, Milford,MA,USA)
− Electrospray Interface (ESI)
− Quattro Ultima Pt Micromass mass Spectrometer (Wythenshawe,UK)
− Multiple reaction monitoring (MRM) mode
− C18 SymmetryShield column ( 10cm x 2.1mm I.D, 3.5
m
µ
)
− SymmetryShield precolumn (1cm x 2.1mm I.D, 3.5
m
µ
)
− Column temp : 30
0
C

− Mobile phase : Water- Acetonitrile gradient (CH
3
CN tăng từ 20%- 40% trong
4 phút)
− Flow rate : 0.2 ml/phút
− Sample volume : 20
l
µ
 Hóa chất :
− Purified water
− Acetonitrile
− Diethyl ether
− Ethyl acetate
− Hexane
− Carbon tetrachloride
− CAP standard (độ tinh khiết >99%)
− d
5
-CAP (độ tinh khiết >98%)
− Dung dịch CAP và d
5
-CAP trong methanol được tồn trữ ở 4
0
C, nồng độ
0.1mg/ml, tránh ánh sáng. Khi sử dụng ta pha loãng để được nồng độ thích hợp.
 MS-MS Detection :
CAP và d
5
-CAP đầu tiên được phân tích bằng ESI-MS.
22

Phổ khối lượng của CAP Phổ khối lượng của d
5
-CAP
Theo Commission Decision 2002/657/EC, để phát hiện những chất cấm thì cần
phải có 1 ion gốc và 2 quá trình chuyển tiếp với 2 loại sản phẩm ion khác nhau.
Cả CAP và d
5
-CAP sau đó được phân tích bằng HPLC-ESI-MS-MS với quá
trình anion hóa bằng cách chọn 2 khối lượng m/z 321 và m/z 326 là những ion
báo trước.
Phổ khối lượng của các ion được tách do sự va chạm
a : CAP
b : d
5
-CAP
CHUẨN BỊ MẪU :
Trích ly :
Sử dụng 2 chất phân cực : diethyl ether và ethyl acetate để trích CAP từ mẫu. Độ thu
hồi được xác định bằng cách so sánh điểm cực đại của vùng quan sát được từ mẫu với
những điểm cực đại quan sát đươc từ dung dịch chuẩn. Kết quả quan sát cho thấy
ethyl acetate cho độ thu hồi CAP cao hơn (>60%).
23
 Làm sạch :
Nhiều quy trình trích ly pha rắn (SPE) sử dụng silica, cột trao đổi cation hoặc cột
octadecyl để làm sạch CAP sau khi trích đã được đề xuất. Một điểm bất lợi của quy
trình SPE là nó đòi hỏi quá nhiều bước (chuẩn bị cột, nạp mẫu, rửa giải) và do đó nó
kéo dài thời gian phân tích. Để rút ngắn thời gian làm sạch mẫu, người ta sử dụng
trích lu lỏng-lỏng. Carbon tetrachloride, hexane và hỗn hợp carbon
tetrachloride/hexane (tỉ lệ thể tích 1:1).
Quy trình hoàn chỉnh về trích ly và làm sạch dư lượng CAP trong sữa :

10ml Nước sạch + 10g mẫu sữa
Ly tâm trong 20 phút
3ml
6ml ethyl acetate + 1ml d
5
-CAP (0.6ng/ml)
Lắc trong 45 phút, tách pha
Lấy 4ml của lớp trên (ethyl acetate), cô cho đến khô ở
50
0
C bằng dòng khí nitơ
Hòa tan vào 0.5ml nước, sau đó trích với 0.5ml hỗn hợp
Tetrachloride/hexane (1:1) trong 5 phút
Ly tâm trong 5 phút với vận tốc 25000 vòng/phút
Tách lớp nước, lấy 20
l
µ
mẫu cho vào cột phân tích
24
 KẾT QUẢ :
25