THIẾT KẾ MỘT QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM CHO CÁ TRA CÓ CHỨC NĂNG HỖ TRỢ TIÊU HÓA, ĐỐI KHÁNG SINH HỌC Edwardsiella ictaluri

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Đề tài:
THIẾT KẾ MỘT QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT CHẾ
PHẨM CHO CÁ TRA CÓ CHỨC NĂNG HỖ TRỢ TIÊU HÓA, ĐỐI
KHÁNG SINH HỌC Edwardsiella ictaluri
5/12/15
VI SINH ỨNG DỤNG
1
IV. Quy trình sản xuất
III. Phương pháp nghiên cứu
II. Khái quát về đối tượng nghiên cứu
Chủng vi khuẩn Bacillus spp
Bệnh gan thận mủ trên cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus)
I. Đặt vấn đề
•
Trong những năm gần đây nghề nuôi cá tra (P. hypophthalmus) ở đồng bằng sông Cửu Long phát triển rất mạnh đã đưa năng suất nuôi tăng
lên đáng kể. Tuy nhiên, không thể tránh khỏi những rũi ro xảy ra dịch bệnh trong môi trường nuôi.
•
Do đó, để đạt được sản lượng và lợi nhuận cao nhất, người nuôi không ngừng sử dụng hoá chất và kháng sinh trong nuôi trồng thuỷ sản để
phòng và điều trị bệnh gây tổn hại đến môi trường và làm tăng sức đề kháng của các vi sinh vật gây bệnh
•
Chính vì vậy, việc sử dụng các chế phẩm sinh học hoặc vi khuẩn có lợi để kiểm soát mầm bệnh, tăng sức đề kháng và giải quyết vấn đề ô
nhiễm môi trường ao nuôi ngày càng được xem là một giải pháp thay thế cho điều trị kháng sinh.
•
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, vi khuẩn Bacillus có tiềm năng làm probiotic và là tác nhân kiểm soát sinh học trong nuôi trồng thuỷ sản.
•
Trong bài nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng những chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ ao nuôi cá tra để sản xuất chế phẩm cho cá
tra có chức năng hỗ trợ tiêu hóa, làm tác nhân đối kháng sinh học Edwardsiella ictalluri,là tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra
(Pangasianodon hypophthalmus).

5/12/15
VI SINH ỨNG DỤNG
3
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
1. Bệnh gan thận mủ trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)
- Edwardsiella ictaluri là một vi khuẩn gram âm, hình que, oxidase âm tính, có tiên mao, có thể lên men.
5/12/15
VI SINH ỨNG DỤNG
4
Hình 1.1: Cá tra
Hình 1.2: Biểu hiện bệnh lý
II. KHÁI QUÁT VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2. Chủng vi khuẩn Bacillus spp.
:
•
Nguồn phân lập: Các chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính probiotic được phân lập từ mẫu nước,
bùn đáy ao và ruột cá tra.
•
Đặc điểm hình thái: Bacillus là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, G+, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi
ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 - 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục.
•
Đặc điểm nuôi cấy và điều kiện phát triển:
–
Hiếu khí, nhiệt độ tối ưu là 37C.
–
Nhu cầu O2: Bacillus là vi khuẩn hiếu khí nhưng lại có khả năng phát triển yếu trong môi
trường thiếu oxy.
–
Độ pH: Bacillus thích hợp nhất với pH = 7,0 - 7,4.
5/12/15

VI SINH ỨNG DỤNG
5
Bacillus subtilis
5/12/15
VI SINH ỨNG DỤNG
6
•
Đặc tính cần có của vi khuẩn Bacillus dùng làm chế phẩm cho cá tra có chức năng đối kháng
sinh học Edwardsiela ictaluri ???
–
Chúng có khả năng đối kháng với E.ictaluri;
–
Thích nghi rộng ở các điều kiện môi trường như nhiệt độ, pH và nồng độ muối;
–
Có khả năng chịu đựng trong môi trường có pH thấp và muối mật.
–
Không có khả năng dung huyết (tiêu huyết)
–
Có khả năng sinh ra enzyme ngoại bào.
–
Không mang gen đề kháng kháng sinh có thể truyền được.
=> Tiềm năng dùng làm probiotic và cần được nghiên cứu khả năng bảo vệ cá tra kháng bệnh gan
thận mủ nhằm kiểm soát bệnh này.
5/12/15
VI SINH ỨNG DỤNG
7
Phân lập vi khuẩn Bacillus
Thử nghiệm đối kháng với E.ictaluri
Thử nghiệm khả năng sinh enzyme ngoại bào
Thử nghiệm khả năng chịu muối và chịu pH trong môi trường nuôi

Thử nghiệm khả năng chịu đựng pH acid dạ dày và khả năng chịu muối mật
Thử nghiệm khả năng sinh enzyme hemolysin
Thử nghiệm khả năng nhạy/ kháng với kháng sinh (MIC)
5/12/15
VI SINH ỨNG DỤNG
8
III. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phân lập vi khuẩn Bacillus
•
Các mẫu phân lập được pha loãng tới độ pha loãng cần thiết rồi được xử lý nhiệt ở 80
0
C trong 15 phút, sau đó được cấy gạt lên môi trường thạch
dinh dưỡng(môi trường Nutrient Agar (NA). Nuôi ở nhiệt độ 28 – 30
0
C trong 24 giờ. Các khuẩn lạc mọc lên được kiểm tra dưới kính hiển vi và
kiểm tra các đặc điểm khác, nếu phù hợp cới các đặc điểm của Bacillus thì cấy truyền sang thạch nghiêng để bảo quản.
•
Các chủng thu được định danh sơ bộ bằng phương pháp thường quy, bắt màu Gram (+), sinh bào tử, oxydase (+) và catalase (+)
5/12/15
VI SINH ỨNG DỤNG
9
Thử nghiệm khả năng đối kháng với E. ictaluri
Phương pháp kiểm tra sơ bộ (phương pháp Kolmen và Boerner)
5/12/15
VI SINH ỨNG DỤNG
10
Thử nghiệm khả năng sinh enzyme ngoại bào
5/12/15
VI SINH ỨNG DỤNG
11

5/12/15
VI SINH ỨNG DỤNG
12
Sơ đồ: Thử nghiệm khả năng phân giải tinh bột
5/12/15
VI SINH ỨNG DỤNG
13
Sơ đồ: Thử nghiệm khả năng phân giải lipid
Thử nghiệm khả năng chịu pH
•
Khoảng pH được khảo sát từ 4-10.
•
Điều chỉnh độ pH của môi trường người ta dùng HCl 10 % hay
NaCl 10 %. Ngoài ra có thể dùng một số hoá chất khác như: H3PO4, H2SO4, KOH, NaHCO3, Na2CO3
•
Muốn kiểm tra độ pH của môi trường ta nên dùng máy đo pH
=> Phương pháp này nhanh nhạy và cho độ chính xác cao.
•
Trong phòng thí nghiệm có thể dùng chỉ thị màu xanh bromotomol hay giấy quỳ để đo pH.
=> Phương pháp này tiện lợi, nhanh nhưng không cho độ chính xác cao.
=> Vi khuẩn được xem là có khả năng chịu pH khi có khả năng tăng trưởng và làm đục môi trường nuôi cấy.
5/12/15
VI SINH ỨNG DỤNG
14
Thử nghiệm khả năng chịu
đựng
pH acid dạ dày
=> Nếu vi khuẩn đều có khả năng sống sót
và tăng trưởng sau 2h thì vi khuẩn Bacillus có
khả năng chịu được pH acid dạ dày

5/12/15
VI SINH ỨNG DỤNG
15
Thử nghiệm khả năng
chịu muối mật
=> Nếu vi khuẩn Bacillus vẫn tăng
trưởng tốt ở nồng độ muối mật như trên
thì tủ lệ sống sót khi đi qua ruột non và
ruột già cao.
5/12/15
VI SINH ỨNG DỤNG
16
Thử nghiệm khả năng sinh enzyme hemolysin
•
Kết quả cho thấy vi khuẩn Bacillus không có khả năng
dung huyết thì có thể ứng dụng và an toàn cho người khi bị
lây nhiễm qua chuỗi thức ăn. Nếu bị dung huyết thì không
được sử dụng
.
5/12/15
VI SINH ỨNG DỤNG
17
Môi trường thạch máu Blood Agar (BA), có bổ sung
5% máu cừu
Ủ ở 30
o
C trong 24 giờ
Dùng que cấy vòng lấy VK cấy lên môi trường
Đọc kết quả

Thử nghiệm khả năng nhạy/ kháng
với kháng sinh (MIC)
•
Phương pháp kháng sinh đồ:
Nguyên tắc: Khi đặt đĩa kháng sinh trên môi trường đã trải
khuẩn, kháng sinh từ đĩa giấy khuếch tán ra môi trường và
ức chế sự phát triển của vi khuẩn tạo thành vòng vô khuẩn.
Dựa vào đường kính vòng vô khuẩn xung quanh đĩa kháng
sinh để biện luận vi khuẩn đề kháng, trung gian hoặc nhạy
cảm theo tiêu chuẩn.
5/12/15
VI SINH ỨNG DỤNG
18
5/12/15
VI SINH ỨNG DỤNG
19
Sơ đồ: Phương pháp
kháng sinh đồ bằng đĩa
kháng sinh
5/12/15
VI SINH ỨNG DỤNG
20
5/12/15
VI SINH ỨNG DỤNG
21
Biện luận kháng sinh đồ (S, I, R) dựa vào
đường kính vòng vô khuẩn
=> Nếu vi khuẩn kháng lại kháng sinh thì vi khuẩn đó phải không mang gen đề kháng có thể truyền được.
Định danh chủng vi khuẩn
•

Các chủng vi khuẩn tuyển chọn được định
danh bằng các thử nghiệm sinh hoá theo khóa
phân loại Bergey (1994) [10] và định danh
bằng phương pháp giải trình tự gene mã hoá
16S rRNA.
5/12/15
VI SINH ỨNG DỤNG
22
IV. QUY TRÌNH
SẢN XUẤT
TÀI LIỆU THAM KHẢO
•
Nguyễn Hoàng Tuấn Duy và cs, 2013. Phân lập và sàng lọc vi khuẩn Bacillus spp. có hoạt tính probiotic dùng cho cá tra nuôi. Hội nghị CNSH
toàn quốc tại khu vực phía Nam.
•
Nguyễn Văn Minh và cs, 2013. Khả năng kiểm soát sinh học Edwardsiella ictaluri gây bệnh của một số chủng Bacillus spp. phân lập từ ao
nuôi cá tra. Hội nghị khoa học công nghệ quốc tế ISCE2013.
•
Lê Xuân Phương, Thí nghiệm vi sinh vật học, trang 77.
•
Nguyễn Văn Minh, Thực tập vi sinh cơ sở, trang 47 – 58.
•
Dương Nhật Linh, Kiểm soát sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật (PDF), trang 19 – 21.
•
Hồ Thị Trường Thy, Khào sát một số đặc tính chủng bacillus subtilis b20.1 làm cơ sở cho việc sản xuất probiotic phòng bệnh gan thận mũ do
edwardseilla ictaluti trên cá tra (pangasius hypophthalmus) nuôi thâm canh, Bộ môn bệnh học thủy sản, khoa thủy sản trường Đại học nông lâm
TPHCM
•
Ngô Gia Tự, Bùi Thị Việt Hà, Nghiên cứu enzyme ngoại bào của một số chủng Bacillus mới phân lập và khả năng ứng dụng của chúng trong

xử lý nước thải, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 25 (2009) 101 -106.
•
/>•
/>vhtm
•
/>•
/>5/12/15
VI SINH ỨNG DỤNG
25