Chủ đề 6 Thiết kế quy trình nghiên cứu và sản xuất phân vi sinh vật đa chức năng dùng cho cây đậu nành(cố định đạm, phân giải lân, kích thích tăng trưởng, đối kháng nấm bệnh).

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH
Khoa Cơng Nghệ Sinh Học
Lớp SH11

GVHD: ThS. Nguyễn Văn Minh

Chủ đề 6
Thiết kế quy trình nghiên cứu và sản xuất phân vi sinh vật đa chức năng dùng cho cây đậu
nành(cố định đạm, phân giải lân, kích thích tăng trưởng, đối kháng nấm bệnh).

Danh sách nhóm:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

Nguyễn Hồng Huy Khơi
Hồ Giang Trúc Loan
Đào Thị Ngân
Phạm Thị Kim Ngân
Nguyễn Như Ngọc
Võ Thị Ngọt
Dương Thị Thu Thảo
Nguyễn Thị Quang
Đinh Thái Hòa

1153010365
1153010423
1153010512
1153010515
1153010528
1153010536
1153010745
1053010612
1153010268

MỤC LỤC
PHẦN I: MỞ ĐẦU
I./ Đặt vấn đề............................................................................................................................................................. 2
II./ Tổng quan về tình hình sản xuất và sử dụng phân vi sinh...............................................................2
PHẦN II: NỘI DUNG
I./ Sơ lược về cây đậu tương............................................................................................................................... 3
II./ Phân vi sinh vật đa chức năng..................................................................................................................... 4
1./ Vi sinh vật cố định đạm........................................................................................................................... 5
2./ Vi sinh vật phân giải lân......................................................................................................................... 7
3./ Vi sinh vật kích thích tăng trưởng................................................................................................... 11
4./ Vi sinh vật đối kháng nấm bệnh........................................................................................................ 13
5./ Quy trình sản xuất phân....................................................................................................................... 15
1


PHẦN I: MỞ ĐẦU
I./ Đặt vấn đề
Trong sản xuất nông nghiệp, phân bón đóng vai trị quan trọng quyết định cả về chất
lượng và sản lượng thu hoạch. Hiện nay có rất nhiều dạng phân bón khác nhau đã được sản
xuất sử dụng trong nơng nghiệp như: Phân hố học đa lượng hoặc vi lượng: Phân hữu cơ,

phân sinh học, phân vi sinh.
Ngành nông nghiệp nước ta hiện nay chủ yếu sử dụng phân bón hóa học trong canh
tác và sản xuất. Tuy nhiên do sử dụng không đúng cách, lạm dụng các loại phân bón và
thuốc trừ sâu hóa học làm tăng dư lượng các chất hóa học gây ô nhiễm môi trường đất, môi
trường nước và ảnh hưởng đến sinh vật cũng như con người đồng thời làm đất canh tác bị
bạc màu nhanh chóng.
Dưới tác động của việc đẩy mạnh cơng nghiệp hóa hiện đại hóa đất nước góp phần
làm diện tích đất nơng nghiệp ngày một giảm đi. Chính vì vậy để tăng năng suất, sản lượng
cây trồng đồng thời phải đảm bảo môi trường phát triển bền vững là một vấn đề cấp thiết
hiện nay.
Cùng với chất hữu cơ, vi sinh vật sống trong đất, nước và vùng rễ cây có ý nghĩa
quan trọng trong các mối quan hệ giữa cây trồng, đất và phân bón. Hầu như mọi q trình
xảy ra trong đất đều có sự tham gia trực tiếp hoặc gián tiếp của vi sinh vật (mùn hoá,
khoáng hoá chất hữu cơ, phân giải, giải phóng chất dinh dưỡng vơ cơ từ hợp chất khó tan
hoặc tổng hợp chất dinh dưỡng từ mơi trường...).
Phân bón vi sinh do Noble Hiltner sản xuất đầu tiên tại Đức (1896) và được đặt tên
là Nitragin. Sau đó phát triển sang một số nước khác như ở Mỹ (1896), Canada (1905), Nga
(1907), Anh (1910) và Thụy Điển (1914).
Phân đạm vi sinh, phân vi sinh hỗn hợp, phân vi sinh vật phân giải phosphate khó
tan có khả năng chuyển hố các hợp chất phospho khó tan thành dễ tiêu cho cây trồng sử
dụng, góp phần nâng cao năng suất và chất lượng nông phẩm, không gây hại đến sức khoẻ
của người, động thực vật và không ảnh hưởng xấu đến môi trường sinh thái.

2


Phân bón vi sinh dựa vào các chủng vi sinh vật sẽ phân giải các chất hữu cơ trong
bùn, phế thải, rác thải, phế phẩm công nông nghiệp,…. tạo ra sinh khối, sinh khối này rất tốt
cho cây cũng như cho đất, giúp cải tạo làm đất tơi xốp.
II./ Tổng quan về tình hình sản xuất và sử dụng phân vi sinh

Hiện nay có rất nhiều dạng phân bón khác nhau đã được sử dụng trong nơng nghiệp
như: Phân hố học dưới dạng đa lượng hoặc vi lượng, phân hữu cơ, phân sinh học, phân vi
sinh.Trong những năm gần đây, ở nhiều nước trên thế giới, người ta đã tổ chức sản xuất
công nghiệp một số loại phân vi sinh vật và đem bán ở thị trường trong nước. Một số loại
phân vi sinh vật được bán rộng rãi trên thị trường thế giới. Tuy nhiên, các loại phân vi sinh
vật cịn rất ít và chỉ là bộ phận nhỏ so với phân hố học trên thị trường phân bón.
Ở Việt Nam, phân VSV cố định đạm cây họ đậu và phân VSV phân giải lân đã được
nghiên cứu từ năm 1960 và đến năm 1987 phân Nitragin trên nền chất mang than bùn mới
được hoàn thiện và đến năm 1991 đã có hơn 10 đơn vị trong cả nước tập trung nghiên cứu
phân vi sinh vật. Các nhà khoa học đã phân lập được nhiều chủng vi sinh vật cố định đạm và
một số VSV phân giải lân.
Phân bón vi sinh vật được sản xuất bằng cách nhân sinh khối VSV trong mơi trường và
điều kiện thích hợp để đạt được một mật độ nhất định sau đó xử lý bảo quản và đưa đi sử
dụng trực tiếp hoặc phối trộn với cơ chất hữu cơ tạo sản phẩm phân hữu cơ vi sinh vật.
Trong khuôn khổ các đề tài nghiên cứu thuộc chương trình cơng nghệ sinh học giai đoạn
1991-2000 Viện Khoa học kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam đã phối kết hợp cùng gần 20 cơ
quan nghiên cứu, giảng dạy và công ty chuyên ngành đã xây dựng và triển khai thành cơng
các qui trình sản xuất phân vi sinh vật cố định nitơ, phân vi sinh vật phân giải lân, phân vi
sinh vật hỗn hợp cố định nitơ và phân giải lân. Sản phẩm phân bón VSV được các hội đồng
khoa học nghiệm thu, đánh giá và công nhận là tiến bộ kỹ thuật.
Để sản xuất phân vi sinh đa chức năng ta cần tuyển chọn các chủng vi sinh vật có đủ 4
khả năng: cố định đạm, phân giải lân, kích thích tăng trưởng, đối kháng nấm bệnh và có ảnh
hưởng tốt đến cây trồng. Vì ngồi hoạt tính tốt nhiều chủng vi sinh vật cịn có các hoạt tính
sinh học khác gây ảnh hưởng xấu đến sự sinh trưởng, phát triển và năng suất cây trồng.
Chính vì vậy sau khi đánh giá khả năng của các chủng vi sinh vật dùng để sản xuất phân ta
cần phải đánh giá được ảnh hưởng của chúng đến đối tượng cây trồng sử dụng. Chỉ sử
dụng chủng vi sinh vật vừa có hoạt tính tốt vừa khơng gây ảnh hưởng xấu đến cây trồng và
môi trường sinh thái.
3

Ngồi những chỉ tiêu quan trọng như trên ta cịn phải đánh giá đặc tính sinh học như:
thời gian mọc; kích thước tế bào, khuẩn lạc; khả năng thích ứng ở pH; khả năng cạnh
tranh... Để có thể tạo ra loại phân vi sinh mang những đặc tính tốt nhất.

PHẦN II: NỘI DUNG
I./ Sơ lược về cây đậu tương
1. Phân loại
Cây đậu tương hay đỗ tương, đậu nành (tên khoa học Glycine max) là loại cây họ Ðậu
(Fabaceae), đặc điểm của hạt đậu tương giàu hàm lượng protein, chính vì vậy là cây thực
phẩm quan trọng cho người và gia súc. Trên thế giới có trên 1,000 loại đậu tương với nhiều
đặc điểm khác nhau, hạt đậu tương có kích thước nhỏ nhất như hạt đậu Hà lan (pea) cho
tới lớn nhất giống trái anh đào (cherry), hạt đậu có nhiều màu sắc như đỏ, vàng, xanh, nâu
và màu đen. Trong ngũ cốc, đậu tương được đánh giá cao nhất.
2. Điều kiện sống
- Đất: Cây đậu tương không yêu cầu nghiêm khắc về đất trồng, đất thích hợp nhất đối với
cây đậu tương là loại đất có tầng canh tác sâu, giàu chất hữu cơ, canxi, kali và pH (độ chua)
trung tính, mực nước ngầm sâu, giữ ẩm tốt, dễ thoát nước. Đậu tương chịu mặn và chua
kém hơn nhiều cây trồng khác, độ pH thích hợp nhất là 6,0-7,0.
- Nước: Ở giai đoạn nảy mầm và cây con, tỷ lệ sử dụng nước thấp. Nhu cầu nước của cây
đậu tương tăng dần khi cây ở giai đoạn từ 3-5 lá kép, tăng nhanh và cao nhất ở giai đoạn
từ khi cây ra hoa đến khi quả vào chắc.
- Nhiệt độ: Nhiệt độ thích hợp cho sự nở hoa và đậu quả là 25-28oC, ẩm độ khơng khí 7580%, ẩm độ đất 70-80%.
3. Nhu cầu dinh dưỡng
Có 16 nguyên tố cần thiết cho sinh trưởng và phát triển triển của cây đậu tương. Trong đó, 3
nguyên tố Carbon (C), Hydro (H) và Oxy (O) là thành phần chủ yếu trong chất khô và được
hấp thụ dưới dạng CO2, H2O và O2 tự do trong khơng khí. Những ngun tố cần thiết khác là
N, P, K, Ca, Mg, S, Fe, Mn Mo, Cu, B, Zn và Cl. Bên cạnh đó Coban (Co) là nguyên tố cần thiết
cho việc cố định đạm (N) và cũng được coi là nguyên tố cần thiết (Ngô Thế Dân và cs, 1999).
4

Cây đậu tương phản ứng ít đối với phân đạm, tuy nhiên bón phân đạm vẫn làm tăng năng
suất, tỷ lệ đạm trong hạt và hàm lượng protein chứng tỏ cố định N2 khơng đủ để cung
cấp cho cây.
Lân đóng vai trị quan trọng hình thành và phát triển nốt sần ở đậu tương. Kali (K) tích lũy
trong lá, đỉnh sinh trưởng và hạt tăng lên khi bón kali tăng, kali (K) rất cần cho sự phát
triển của nốt sần.
Theo Giáo sư Đỗ Ánh (1965) đối với đậu tương tỷ lệ Ca: P: K tối thích là 2: l: 1,5. Đậu tương
có thể hấp thụ lân của các photphat khó tan như AlPO4, FePO4. Đậu tương có nhu cầu cao
với S, vì vậy bón thêm S sẽ tăng năng suất đậu.
Trên nền đất chua, bón vơi là cần thiết. Bón vơi có tác dụng giảm nồng độ các chất độc hại
như: sắt (Fe), nhôm (Al), mangan (Mn) đồng thời cung cấp dinh dưỡng caxi cho cây.
Vai trò của các nguyên tố vi lượng thường thể hiện rõ hay không tùy thuộc vào đặc tính đất.
Trên đất giàu caxi (Ca) có hiện tượng thiếu sắt (Fe), phun phân bón lá có chứa các chất vi
lượng hịa tan ở dạng chellat có thể bổ sung sự thiếu hụt này, mangan cũng rất cần cho cây
đậu tương nhưng nếu trong đất dư thừa hoặc bón quá nhiều sẽ có hiện tượng ngộ độc mà
cụ thể là lá biến dạng, màu vàng và có những mô bị chết.
Khi pH đất ở phạm vi 5,8 - 6,7; xử lý hạt với muối mo làm tăng năng suất đậu. Đậu tương có
nhu cầu cao với vi lượng bo (B), đồng (Cu) và kẽm (Zn).
II. Phân vi sinh vật đa chức năng
Trên cơ sở tính năng tác dụng của các chủng loại VSV sử dụng, phân bón VSV còn được
gọi dưới các tên:
- Phân VSV cố định nitơ (phân đạm vi sinh) chứa các VSV sống cộng sinh với cây bộ
đậu, hội sinh trong vùng rễ cây trồng cạn hay tự do trong đất, nước có khả năng sử dụng N
từ khơng khí tổng hợp thành đạm cung cấp cho đất và cây trồng.
- Phân VSV phân giải hợp chất phosphate khó tan (phân lân vi sinh) sản xuất từ các
VSV có khả năng chuyển hố các hợp chất phosphate khó tan thành dễ tiêu cho cây trồng sử
dụng.
- Phân VSV kích thích, điều hồ sinh trưởng thực vật chứa các VSV có khả năng sản

sinh các hoạt chất sinh học có tác dụng điều hồ, kích thích q trình trao đổi chất của cây.

5


- Phân VSV chức năng là sản phẩm có chứa khơng chỉ các VSV làm phân bón như cố
định nitơ, phân giải lân, kích thích sinh trưởng thực vật mà cịn có các loại VSV có khả năng
ức chế, tiêu diệt VSV gây bệnh cây trồng.
1.

Vi sinh vật cố định đạm
Đạm là nguyên tố khoáng quan trọng nhất trong dinh dưỡng của cây trồng. Năng suất
cây trồng phụ thuộc rất lớn vào lượng đạm cung cấp cho cây.
Cố dịnh nitơ là q trình khử nitơ khơng khí(N2) thành dạng đạm ammoni(NH3).

Năm 1886, Hellriegel và Wilfath phát hiện cây họ đậu có khả năng cố định đạm từ khơng
khí. Năm 1889, vi khuẩn cộng sinh trong nốt sần cây họ đậu được xếp vào chi Rhizobium.
Đa phần các nòi thuộc Rhizobium phát triển ở pH thích hợp từ 6,5-7, dưới pH 5 và trên 8, sự
sinh trưởng của chúng bị cản trở. Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn nằm trong khoảng từ 2426oC. Trên 37oC, sinh trưởng của chúng bị đình chỉ.

2.Vi sinh vật phân giải lân và đối kháng nấm bệnh
2.1Phân giải lân
2.1.1. Các dạng lân và sự chuyển hóa lân
Các dạng lân.
Lân hay phospho là một trong những yếu tố rất cần thiết cho cây trồng. Lượng lân
dễ tiêu trong đất thường không đáp ứng được nhu cầu của cây nhất là những cây trồng có
năng suất cao. Bón phân lân và tăng cường độ hồ tan các dạng lân khó tiêu trong đất là
biện pháp quan trọng trong sản xuất nơng nghiệp. Bón phân hữu cơ, xác động vật vào đất ở
mức độ nhất định là biện pháp tăng hàm lượng lân cho đất.
Lân trong đất gồm 2 dạng chính:

Lân hữu cơ.
Lân hữu cơ có trong cơ thể động vật, thực vật, vi sinh vật thường gặp ở các hợp
chất chủ yếu như phytin (phytin và các chất họ hàng: inositol, inositolmonophosphate,
inositoltriphosphate), phospholipit, axit nucleic. Trong không bào người ta cịn thấy
lân vơ cơ ở dạng octhophosphate làm nhiệm vụ đệm và chất dự trữ. Cây trồng, vi sinh
vật khơng thể trực tiếp đồng hố lân hữu cơ. Muốn đồng hoá chúng phải được
chuyển hoá thành dạng muối H3PO4.
Lân vô cơ.
6


Lân vơ cơ thường ở trong các dạng khống như apatit, phosphoric,
phosphate sắt, phosphate nhôm... Muốn cây trồng sử dụng được phải qua chế biến,
để trở thành dạng dễ tan.
Nhờ vi sinh vật lân hữu cơ được vơ cơ hố biến thành muối của axit
phosphoric. Các dạng lân này một phần được sử dụng, biến thành lân hữu cơ, một phần bị
cố định dưới dạng lân khó tan như Ca3(PO2)2, FePO4, AlPO4. Những dạng khó tan này trong
mơi trường có pH thích hợp, với sự tham gia của vi sinh vật sẽ chuyển hố thành dạng dễ
tan.
2.1.2. Sự chuyển hóa lân.
Trong đất thường tồn tại các vi sinh vật có khả năng hoà tan lân. Các vi sinh vật này
được các nhà khoa học đặt tên cho chúng là: HTL (hoà tan lân, tên tiếng anh PSM –
phosphate solubilizing microorganisms).
2.2Vi sinh vật đối kháng nấm bệnh
2.2.1. Các loại nấm, bệnh thường gặp ở đậu tương
2.2.1. Bệnh thối thân
Thối thân (Brown Stem Rot) gây nên bởi nấm phialophoria. Đây là loại nấm sản
xuất ra tới 3 độc tố có tên là gregation A, C và D. Đầu tiên, xuất hiện các nốt nhỏ, sau đó dày
hơn và lan rộng trên thân cây và vùng gốc bắt đầu biến màu nâu đen, lá vàng rụng và ở thể
nặng có thể làm cho đậu tương bị chết.

2.2.2. Bệnh tàn lụi vi khuẩn
Bệnh tàn lụi (Bacterial Blight) gây nên bởi khuẩn Pseudomonas PV syringae. Ban
đầu khuẩn xuất hiện trong khơng khí, trong đất sau đó thâm nhập vào lá và vào các mơ của
thân. Cây lây nhiễm khuẩn thường còi cọc, chậm lớn và có thể chết nếu thể nặng, lá xuất
hiện các đốm nhỏ, sau chuyển sang màu vàng đen và làm cho lá rụng, cuống và thân cây bị
tổn thương dẫn đến tình trạng cây chết hoặc giảm năng suất của đậu tương.
2.2.3. Bệnh đốm lá do nấm Secrostora
Đây là căn bệnh gây hại cho tất cả các bộ phận trên mặt đất của đậu tương. Ngoài
gây bệnh đốm lá, nấm Secrostora còn gây ra nhiều căn bệnh khác như bệnh thối thân, bệnh
trắng thân và gặp nhiều ở các loại hoa màu khác như bắp cải, súp lơ, cà chua và nhất là khi

7


cây đã vào giai đoạn hình thành nụ cho đến khi thu hoạch. Nếu khống chế được căn bệnh
này thì năng suất đậu tương có thể tăng 50-60%.
2.2.4. Bệnh rỉ
Do nấm Phakopsora pachyrhizi Sydow; Phakopsora sojae Sawada.
Vết bệnh nhô lên ở hai mặt lá, làm cho lá bị khô cháy, cây mất dần khả năng quang
hợp.
2.2.5. Bệnh đốm phấn
Do nấm Peronospora manshurica (Naumov) Sydow
Bệnh tấn công chủ yếu trên lá, trái và hạt, làm lá khô và rụng sớm, trái và hạt không
phát triển.
2.2.6. Bệnh chấm đỏ lá
Do vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. phaseoli ( Smith ) Dowson
Bệnh xảy ra trên lá, thân, cành và trái, chủ yếu là trên lá làm cây rụng hết lá.
2.2.7. Bệnh cháy nhũn lá
Do nấm Rhizoctonia solani Kuhn, giai đọan sinh sản hữu tính là Thanatephorus
cucumeris thuộc lớp nấm Đãm.

Bệnh làm lá, cành, trái rụng sớm, cây sinh trưởng kém.
2.2.8. Bệnh héo cây con, héo khơ
Bệnh do nấm Rhizoctonia solani Kuhn
Bệnh có thể tấn công suốt giai đoạn sinh trưởng của cây, thường gây thiệt hại nặng
cho cây con.

8


Khảo sát trên Bacillus Subtilis:

Hình 1.Bacillus subtilis

Khái quát chung về Bacillus Subtilis:

Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên trong phân ngựa (1941) bởi Tổ chức y
học Nazi của Đức
Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc ở đường ruột, chúng được
phân bố hầu hết trong tự nhiên như: cỏ khô, bụi, đất nước….

Đặc điểm phân bố
Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc ở đường ruột, chúng được
phân bố hầu hết trong tự nhiên như: cỏ khô, bụi, đất nước….
Phần lớn chúng tồn tại ở trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 100 triệu CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở sa mạc, đất hoang thì Bacillus subtilis rất hiếm.
Đặc điểm hình thái
9


Bacillus subtilis là vi khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, G+, kích thước 0,5 - 0,8 μm x 1,8 – 3
μm, đứng thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, di động, 8 - 12 lông.

Sinh bào tử nhỏ hơn vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước từ 0,8 - 1,8 μm.
Phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt bào tử, khơng kháng acid, có khả năng chịu
nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ…(Tơ Minh Châu, 2000).
B. subtilis có khả năng tổng hợp hơn 20 loại kháng sinh khác nhau: subtilin,
subtilosin A, TasA, sublancin,chlorotetain, mycobacillin, rhizocticins, bacillanene, difficidin,…
với những đặc tính kháng khuẩn và kháng nấm hữu ích.
Subtilin
Subtilin có khả năng chịu nhiệt rất cao, khơng mất hoạt tính khi hấp autoclave ở pH
2, tác động ức chế sự phát triển của vi sinh
Subtilosin
Subtolosin là bacteriocin có tính kháng khuẩn mạnh đối với Listeria monocytogenes
và Bacillus cereus
Sublancin
Sublancin không tác động với vi khuẩn gram âm nhưng có khả năng đối kháng
mạnh với vi khuẩn gram. Sublancin là bacteriocin rất bền, bảo quản ở nhiệt độ thường
trong thời gian 2 năm khơng mất hoạt tính.
TasA
TasA có phổ kháng khuẩn rộng được tổng hợp và tiết vào môi trường 30 phút sau
khi quá trình tạo bào tử được bắt đầu, đồng thời TasA cũng được chuyển vào giữa lớp
màng kép của tiền bào tử sau đó định vị trong lớp petidoglycan vách của lõi bào tử, TasA
giúp cho Bacillus subtilis chiếm ưu thế trong quá trình tạo bào tử và nảy mầm.
Surfactin
Surfactin có tính đối kháng mạnh với vi khuẩn , virut . Tác động của surfactin làm ức
chế các kênh chuyển ion trên lớp màng lipid kép đồng thời ức chế hoạt tính của 1 số enzyme.
Bacilysocin
Bacilysocin là kháng sinh có bản chất phospholipid có tính kháng khuẩn mạnh với
nấm được phát hiện đầu tiên trên Bacillus subtilis.
10

Tính đối kháng của Bacillus subtilis
Với vi sinh vật gây bệnh
Hình thức đối kháng chủ yếu của Bacillus subtilis đối với vi sinh vật gây bệnh là cạnh
tranh dinh dưỡng và tiết kháng sinh.
Thực tế khi nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis với một số lượng
lớn sẽ xảy ra cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh không gian sinh sống giữa vi khuẩn và
nấm. Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn chất dinh dưỡng
trong môi trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm bị
ức chế
Với đồng loại
Trong môi trường dinh dưỡng bị cạn kiệt, Bacillus subtilis đã tạo ra chất kháng sinh
giết chết những tế bào vi khuẩn bên cạnh chưa bắt đầu quá trình này nhằm tiêu thụ chất
dinh dưỡng giải phóng từ các tế bào này với mục đích kéo dài thời kỳ trước khi tạo bào tử
Tác dụng phân giải lân của Bacillus subtilis
Năm 1992, Mikio Shimizu và cộng sự đã tiến hành tinh chế và mô tả enzyme phytase từ
Bacillus subtilis (natto) N-77, enzyme phân giải phytin là thành phần của lân hữu cơ.
Bacillus subtilis có khả năng phân giải lân.
Đặc điểm nuôi cấy
Điều kiện phát triển: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu 37oC.
Nhu cầu O2: Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng có khả năng phát triển trong môi
trường thiếu oxy.
Độ pH: Bacillus subtilis thích hợp nhất với pH = 7,0 – 7,4.
Mơi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc có dạng hình trịn, rìa răng cưa khơng đều, có tâm sẩm
màu, phát triển chậm, màu vàng xám, đường kính 3 - 5mm. Sau 1- 4 ngày bề mặt nhăn nheo
màu hơi sẩm.
Môi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, tạo thành màu xám, rìa gợn sóng.
Mơi trường canh TSB: Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng
cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, khó tan đều khi lắc lên.
Dinh dưỡng: cần các nguyên tố C, H, O, N và các nguyên tố khác.
11

3. Vi khuẩn kích thích tăng trưởng bằng phương pháp sinh tổng hợp
IAA và khả năng cố định đạm,hòa tan lân.

Khảo sát trên vi khuẩn Azospirillum lipoferum

3.1. Sơ lược
Vi khuẩn Azospirillum sp. (hình 2) thuộc chi Rhodosprillales.là lồi vi khuẩn cố định đạm
hiện diện ở trong rễ, vùng đất xung quanh rễ, thân và lá của cây trồng. Chúng sống tự
do trong đất hay cộng sinh với rễ của các loại ngũ cốc, cỏ và cây có củ.

Hình 2. Chủng vi khuẩn Azospirillumsp

12


Azospirillum lipoferum (Hình 3) là một loại vi khuẩn gram âm, hình que cong hoặc hình chữ
S, chiều rộng 1 - 1,5 mm và chiều dài 2,0 - 3,0 mm. Chiên mao của chúng có vành lơng rung
với những bước sóng ngắn được dùng để tạo thành tập đồn khi di chuyển và một chiên
mao dùng để bơi lội trong mơi trường lỏng.

Hình 3. Azospirillum lipoferum

3.2.Khảo sát đặc tính tốt của vi khuẩn Azospirillum lipoferum đã được áp dụng
trên cây lúa.
Mười hai chủng vi khuẩn Azospirillum lipoferum đã được xác định bằng kĩ thuật PCR là đối
tượng dc khảo sát khả năng cố định đạm sinh học,hịa tan lân khó tan và sinh tổng hợp IAA.
3.2.1.Khả năng cố định đạm của vi khuẩn bằng phương pháp ARA
Các chủng vi khuẩn Azospirillum lipoferum được ni trong mơi trường Nfb khơng có

bổ sug ammonium trong 4 ngày trên máy lắc xoay vòng ở 150 vòng/phút. Các hột lúa Nàng
Thơm Chợ Đào được lột vỏ trấu bằng tay và khử trùng với cồn 70% trong 3 phút và nước
oxi già 6% trong 3 phút,rửa lại nước cắt vơ trùng,sau đó gieo trên mơi trường agar (1%)
trong 3 ngày cho đến khi có rễ non xuất hiện vài mm,dùng kẹp chuyển các hột lúa vào trong
ổng nghiệm 18 Ml chứa 3 ml môi trường bán đặc, chủng 0,1 ml dung dịch vi khuẩn ( >109 tế
bào/ ml),đậy nút gòn,đặt trong giá và để dàn đèn 5 Klux chế độ 16 giờ sáng/8 giờ tối trong
1 tuần. Sau đó dùng nút cao su đăc chủng đậy kín miệng ống nghiệm,dùng kim bơm 1ml khí
acetylen tinh khiết, sau 24h rút lấy 1ml khí trong ống nghiệm để phân tích lượng
13


Ethylen bằng máy LC-MS.

3.2.2.Khả năng tổng hợp Indole-3-acetic acid (IAA)
Vi khuẩn được nuôi trong 25ml môi trường Nfb (>109 tế bào/ ml) bổ sung 100mg
tryptophan/lít trong bình tam giác 100ml, lấy 1ml dịch vi khuẩn vào thời điểm 2, 5 và 10
ngày sau khi ni, ly tâm 13.000 vịng/ phút, lấy dịch trong để đo lượng IAA tổng hợp được
bằng phương pháp so màu Salkowsky và phương pháp Sắc ký lỏng cao áp (HPLC) (chỉ đo
vào thời điểm 10 ngày sau khi ni).
Số liệu thí nghiệm được phân tích bằng phần mềm Excel 2003 và trị số trung bình của các
nghiệm thức được đánh giá sự khác biệt bằng LSD.01.

3.2.2.Khả năng hịa tan lân khó tan
Vi khuẩn Azospirillum lipoferum được ni trong 100ml mơi trường Pikovskaya với 5g
apatit/lít trong bình tam giác 250ml trong 20 ngày để khảo sát khả năng hịa tan lân khó
tan của các chủng vi khuẩn này bằng cách đo lượng lân hòa tan (P2O5) với phương pháp so
màu (Oniani).

- Kết luận: Thông qua kết quả đã khảo sát những đăc tính tốt của vi khuẩn
Azospirillum lipoferum được áp dụng trên cây lúa, từ đó có thể chọn lọc những đặc tính tốt

trên để cố định đạm hữu hiệu cao,hịa tan lân khó tan nhiều và tổng hợp được một lượng
IAA khá đủ cung cấp cho cây đậu nành.
_ Vấn đề: A.lipoferum cộng sinh rễ cây lúa ở môi trường ngập nước, trong khi cây đậu tương
là thực vật ở cạn.
_ Ý tưởng: Azospirillum lipoferum 4B là biến thể của A.lipoferum có khả năng sống ở mơi
trường đất (phát sinh roi bên). Hiện tại vẫn cịn đang khảo sát.

3.3. Tối ưu hóa mơi trường cho vi khuẩn Azospirillum lipoferum
-

-

Sinh trưởng tốt ở 30oC
Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển khoảng 35 - 37oC
pH từ 6,0 - 7,0.
Sự sinh trưởng và phát triển của chúng xảy ra dưới cả hai điều kiện hiếu khí và yếm
khí (khử nitơ) nhưng thích hợp trong điều kiện vi hiếu khí với sự có hoặc khơng có
đạm trong mơi trường (Dobereiner và Pedrosa, 1987).
Khuẩn lạc của chúng trong môi trường agar khoai tây, có màu hồng nhạt hay đậm.
Vi khuẩnAzospirillum lipoferum phát triển tốt trên mơi trường có muối hữu cơ như
malate, succinate, lactate hay pyruvate.
14


Vi khuẩn này không sử dụng đường đơn mà sử dụng đường fructose và các đường
đa khác làm nguồn carbon của chúng.
4. Thử đối kháng:
Sau khi đã sàng lọc được 3 chủng vi khuẩn:
- Rhizobium Japonicum (cố định đạm, nốt sần)
- Bacillus subtilis N-77

- Azospirillum lipoferum 4B
Phương pháp:
- Cấy trang thạch đĩa, đục lỗ 2 giếng để thử nghiệm cùng lúc 3 chủng vi sinh vật.
- Dấu hiệu kháng: xuất hiện vịng trịn xung quanh giếng.
-

5. Quy trình sản xuất phân
Một trong những yếu tố quan trọng trong sản phẩm phân vi sinh đa chức năng là việc
nghiên cứu chọn lựa chất mang. Đối với yếu tố này, các nhà khoa học đã dùng chất mang
gồm hỗn hợp than bùn và mùn hữu cơ có đủ dinh dưỡng cho vi sinh vật phát triển và tồn tại,
không gây độc đối với vi sinh vật và cây trồng cũng như môi trường sinh thái. Chất mang
được xử lý chặt chẽ, bảo đảm đạt các chỉ tiêu kỹ thuật như độ ẩm, pH, được bao gói trong
túi PE và khử trùng bằng bức xạ nhiệt.
Nguồn nguyên liệu sản xuất chất mang:
- Than bùn đã được hoạt hố
- Rác phế thải có nguồn gốc từ thực vật.
- Quặng apatit hay phosphorit nghiền nhỏ
- Phân chuồng đã được ủ diệt các trứng ký sinh trùng

15


- Giai đoạn 1: Nghiền nhỏ quặng, hoạt hoá than bùn để đảm bảo được pH thích hợp và xử lý
phân chuồng, rác phế thải với vôi để diệt các trứng của ký sinh trùng.
- Giai đoạn 2: Bao gồm từ chủng giống đến khi thành phẩm và tiến hành qua các bước sau:
* Bước1: Bảo quản các chủng giống bằng cách đông khô. Đây là phương pháp bảo quản
tương đối ưu việt vì giữ chủng được lâu dài mà các hoạt tính của chủng vẫn được bảo đảm,
khi sản xuất giống sẽ được nhân qua các môi trường đặc hiệu.
* Bước 2: Tạo nguồn nguyên liệu nền và nhân giống.
- Tạo nguồn nguyên liệu nền

- Nhân giống: Giống được nhân lên qua mơi trường rỉ đường có bổ sung một số các ngun
tố thích hợp và được ni cấy trên máy lắc, sau đó nhân tiếp qua hệ thống sục khí ở nhiệt độ
37 - 45oC/72 giờ (giống C2).
* Bước 3: Lên men.

Trong quá trình sản suất phân vi sinh hiên nay người ta sử dụng chủng giống vi sinh được
lựa chọn (chủng gốc) tiến hành nhân sinh khối, xử lý sinh khối và tạo sản phẩm phân vi sinh.

16


Quy trình chung cho sản xuất phân vi sinh vật từ vi khuẩn theo phương pháp lên men chìm
6. Yêu cầu chất lượng và công tác kiểm tra chất lượng.


Yêu cầu chất lượng đối với phân VSV là có đầy đủ các hoạt tính: cố định đạm, phân
giải lân, kích thích tăng trưởng, kháng nấm bệnh cao và có ảnh hưởng tốt đối với
cây trồng với mật độ 108-109 tế bào VSV/g hay ml phân bón đối với loại phân bón
trên nền chất mang khử trùng và 106 tế bào VSV/gam hay ml đối với phân bón trên
nền chất mang khơng khử trùng.



Để phân bón vi sinh vật đạt chất lượng cao thì sau mỗi cơng đoạn sản xuất cần tiến
hành kiểm tra chất lượng sản phẩm tạo ra.

Tài liệu tham khảo:
Đỗ Kim Nhung, Vũ Thành Công. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp IAA và cố định đạm
của vi khuẩn Gluconacetobacter sp. và Azospirillum sp. được phân lập từ cây mía. Tạp
17

chí khoa học 2011: 18a 161-167.

Mikio Shimizu. Purification and Characterization of Phytase from Bacillus subtilis
(natto) N-77. Zen-noh Institute of Animal Health, Sakura, Chiba 285, Japan.

Lãng Ngọc Dậu, Nguyễn Thị Xuân Mỵ, Cao Ngọc Diệp. Khả năng cố định đạm, hoà tan lân
và sinh tổng hợp IAA của vi khuẩn Azospirillum lipoferum. Trung tâm Giống Nộng
nghiệp, Thành phố Cần Thơ. Viện công nghệ sinh học, Đại học Cần Thơ.

Trần Tú Thuỷ, Vũ Thuý Nga, Phạm Văn Toản, Nguyễn Ngọc Quyên, Lê Văn Nhương,
Nguyễn Lan Hương. Sử dụng vi sinh vật cố định nitơ, phân giải lân để sản xuất phân hữu
cơ. Viện Khoa học Kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam, Viện cơng nghệ sinh học-CNTP, Đại
học Bách khoa Hà Nội.

Mónica Fulchieri, Carlos Lucangeli, Rubén Bottini. Inoculation with Azospirillum
lipoferum Affects Growth and Gibberellin Status of Corn Seedling Roots. Plant & Cell
Physiology. Oxfordjournals.org.

HẾT

18