bài báo cáo hoàn chỉnh kỹ thuật PCR

1. Lịch sử.
2. Phương pháp PCR.
3. PCR cải tiến.
4. Ứng dụng PCR.
PCR oligonucleotide Taq
polymerase
Thermus aquaticus
Primer:
mồi
DNA polymerase Nested PCR: PCR tổ Wobble position: vị trí
không bền.
RT-PCR DNA duplex: DNA
mạch đôi
recombinant Taq
polymerase:Taq
polymerase tái tổ hợp
Processivity:
AP-PCR inverse PCR: PCR
đảo
inosine primer design: thiết kế
mồi.
Sequence:
trình tự
RAPD-PCR DNA templates: DNA
mẫu.
rate of synthesis: tốc độ
tổng hợp
Amplicon:
đoạn DNA
đôi

primer length: chiều
dài của mồi.
nhiệt độ nóng chảy
(Tm)
Competitor RT-PCR
sốc nhiệt biến tính thermostable chu trình nhiệt

PCR (polymerase chain reaction) là một kỹ
thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm
khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn
ADN đặc trưng mà không cần sử dụng các sinh
vật sống như E.coli hay nấm men.

Kỹ thuật này do KARL MULLIS phát minh
vào năm 1985. Ông đạt giải nobel hóa học vào
tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này. Mullis
đã phát triển một quy trình mà DNA có thể
nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều
chu kỳ sao chép bởi enzyme DNA Polymerase.
28/12/1944

Phản ứng PCR được thực hiện trên cơ sở phản ứng
sinh tổng hợp ADN. Là phản ứng gồm nhiều chu kỳ
nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba bước:
Target Sequence
Target Sequence
T
a
r
g

e
t

S
e
q
u
e
n
c
e
T
a
r
g
e
t

S
e
q
u
e
n
c
e
P
r
i
m

e
r

1
P
r
i
m
e
r

2
5
’
3
’
5
’
5
’
3
’
5
’
3
’
3
’
T
a

r
g
e
t

S
e
q
u
e
n
c
e
T
a
r
g
e
t

S
e
q
u
e
n
c
e
P
r

i
m
e
r

1
P
r
i
m
e
r

2
5
’
3
’
5
’
5
’
3
’
5
’
3
’
3
’

T
a
q


D
N
A
P
o
l
y
m
e
r
a
s
e
T
a
r
g
e
t

S
e
q
u
e

n
c
e
T
a
r
g
e
t

S
e
q
u
e
n
c
e
No. of No. Amplicon
Cycles Copies of Target
1 2
2 4
3 8
4 16
5 32
6 64
20 1,048,576
30 1,073,741,824
1 cycle = 2 Amplicon
2 cycle = 4 Amplicon

3 cycle = 8 Amplicon
4 cycle = 16 Amplicon
5 cycle = 32 Amplicon
6 cycle = 64 Amplicon
7 cycle = 128 Amplicon

Kết thúc quá trình PCR, các đoạn DNA được nhân bản
lên nhiều lần (gọi là các đơn vị khuếch đại theo hàm
mũ)

Dùng phương pháp điện di để kiểm tra kích thước cũng
như độ tinh sạch, đồng nhất của DNA đã khuếch đại

Sản phẩm của PCR có thể dùng để tạo dòng và biểu
hiện vào trong vector

DNA polymerase: Taq polymerase

Các nucleotide môi trường: dNTPs

Primer (mồi)

Dung dịch đệm

ADN khuôn

Số chu kỳ phản ứng

Nhiệt độ và pH

Trở về

Ưu điểm:

Thời gian thực hiện nhanh.

Đơn giản và ít tốn kém.

Độ tinh sạch của mẫu không cần cao.

Nhược điểm:

Trong thực nghiệm, kích thước của các đoạn cần
khuếch đại có giới hạn.

Sự ngoại nhiễm là vấn đề đặt ra lớn nhất đối với PCR

Sự sai sót do Taq Polymerase gây ra.

Mồi: một trình tự DNA hay RNA ngắn, bắt cặp với một mạch
khuôn DNA và có mang một đầu 3’OH tự do giúp DNA
polymerase bắt đầu tổng hợp mạch mới.

Mồi là một đoạn Oligonucleotide được thiết kế theo yêu cầu
từ nhiều nguồn thương mại khác nhau.

Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất trong phương pháp PCR

Cách xác định trình tự mồi: từ 2 nguồn
•

Chuỗi amino acid.
•
Chuỗi ADN đã xác định.
Các yêu cầu của mồi:

Tính đặc hiệu, đặc trưng (Specificity)

Tính ổn định (Stability)

Tính tương thích (Compatibility)

Lưu ý khi thiết kế:

Nhiệt độ nóng chảy (Tm)

Chiều dài mồi

Quá ngắn không đặc hiệu.

Quá dài giảm hiệu quả lai

Thường từ 18-25

Hàm lượng G/C
- Nên có 45- 60% G/C
- Không nên chứa PolyG hoặc PolyC  tăng tính bắt
cặp không đặc hiệu của mồi

Trình tự đầu cuối 3’

- Vị trí kết thúc ở đầu 3' của mồi có vai trò quan trọng
trong việc kiểm soát sự bắt cặp nhầm của mồi.
- Việc có G hoặc C làm tăng việc bắt cặp chính xác
( liên kết hydrogen của gốc G/C lớn hơn).
DNA polymerase

Phải phù hợp để đạt hiệu quả cao nhất. Trước đây,
DNA polymerase: đoạn Klenow được sử dụng,
nhưng nó không chịu được nhiệt độ cao và đòi hỏi
thêm vào enzyme mới cho mỗi pha kéo dài của
chu kỳ nhiệt → kém hiệu quả và số lượng enzyme
cần nhiều

Enzyme chịu nhiệt: phản ứng PCR đặc hiệu hơn

Tùy mục đích sử dụng:

Enzyme chịu nhiệt : Thermus thermophilus (rTth), Thermus
lithoralis (Vent), Pyrococcus furiosus (Pfu)

Enzyme có hoạt tính sửa sai (proofreading): Ultima, Vent,
Deep Vent, Pfu,. Nhờ vậy mà người dùng có rất nhiều chọn lựa

Taq polymerase từ Thermus aquaticus được dùng
nhiều

RT-PCR (reverse transcription-PCR) là một phương pháp nhạy

cảm cho phép nghiên cứu các mRNA có hàm lượng thấp.

RT-PCR bao gồm hai bước chính:

Phiên mã ngược(RT), trong đó RNA được phiên mã ngược →cDNA
bằng cách sử dụng reverse transcriptase (hoạt tính polymerase
5’→3’)

Phản ứng PCR lần hai khuếch đại cDNA
T
a
r
g
e
t

S
e
q
u
e
n
c
e
P
r
i
m
e
r

5
’
3
’
5
’
3
’
T
a
r
g
e
t

R
N
A

S
e
q
u
e
n
c
e
P
r
i

m
e
r
5
’
3
’
5
’
3
’
r
T
t
h


D
N
A

P
o
l
y
m
e
r
a
s

e