Luận văn - Nghiên cứu tạo chủng vắc-xin S.choleraesuis nhược độc làm chủng vi khuẩn biến nạp

ĐẶT VẤN ĐỀ
Nền kinh tế phát triển, cùng với hội nhập kinh tế toàn cầu, mức sống của
người dân được nâng cao, vai trò của ngành chăn nuôi trở lên quan trọng, đặc biệt là
ngành chăn nuôi lợn. Ngành chăn nuôi lợn đã góp phần đáp ứng nhu cầu thực phẩm
trong nước và một phần dành cho xuất khẩu thu ngoại tệ. Theo CIRAD - Trung tâm
hợp tác quốc tế về nghiên cứu nông nghiệp vì phát triển , thịt lợn chiếm 77% tổng
lượng các loại thịt tiêu dùng hàng ngày trên thị trường Việt Nam [26].
Mục tiêu của kế hoạch phát triển chăn nuôi lợn của Việt Nam theo chiến lược
phát triển chăn nuôi đến 2020: đàn lợn từ 29,9 triệu con năm 2010, lên 32,9 triệu con
năm 2015 và lên 34,7 triệu con năm 2020. Sản lượng thịt hơi từ 3,1 triệu tấn năm 2010,
lên 3,9 triệu tấn năm 2015 và 4,8 triệu tấn năm 2020; sản lượng thịt xẻ từ 2191,3 ngàn
tấn năm 2010; 2794,7 ngàn tấn năm 2015 và 3493,1 ngàn tấn năm 2020. Trong đó đàn
lợn nuôi công nghiệp 5,8 triệu con (chiếm 19,3%) năm 2010, lên 8,9 triệu con (chiếm
27,0%) năm 2015 và lên 12,9 triệu con (chiếm 37,0%) năm 2020. Sản phẩm thịt hơi
nuôi công nghiệp từ 1135,2 ngàn tấn (chiếm 36,5%) năm 2010; 1851,5 ngàn tấn
(chiếm 47,2%) năm 2015 và 2866 ngàn tấn (chiếm 59,%) năm 2020 [7].
Để đạt được những mục tiêu có tính chiến lược đó, việc đầu tư cho công tác
giống, quan tâm đến vấn đề thức ăn, các chương trình quản lý; đặc biệt nhiệm vụ
của công tác chăn nuôi – thú y càng nặng nề hơn, tăng cường áp dụng các biện pháp
khoa học kỹ thuật cho công tác phòng, chống dịch bệnh ở vật nuôi có hiệu quả là
điều hết sức quan trọng.
Một thách thức không nhỏ đối với việc phát triển chăn nuôi lợn là dịch bệnh
vẫn thường xuyên xảy ra trên các đàn lợn ở mọi lứa tuổi, làm giảm năng suất, giảm
chất lượng con giống. Sản phẩm thịt lợn nhiễm bệnh làm tăng nguy cơ mất an toàn
vệ sinh thực phẩm. Một trong những bệnh thường gặp phải kể đến là bệnh phó
thương hàn và phù đầu do vi khuẩn Salmonella và Escherichia coli (E.coli) gây ra.
Bệnh do vi khuẩn Salmonella và E.coli xảy ra ở hầu hết các loại hình chăn
nuôi và gây ra thiệt hại rất lớn về kinh tế cho các nhà chăn nuôi. Việc sử dụng
kháng sinh tràn lan đã dẫn đến tỷ lệ rất lớn các chủng vi khuẩn kháng lại kháng
1
sinh, do vậy việc điều trị bệnh gặp rất nhiều khó khăn. Các loại vắc-xin thú y ngoài

việc bảo vệ sức khỏe cho động vật nuôi còn có tác dụng bảo vệ sức khỏe cộng đồng,
bởi vì việc sử dụng vắc-xin làm giảm đi đáng kể sử dụng các loại kháng sinh và các
loại kích thích tố trong chăn nuôi, dẫn đến giảm đi sự tồn đọng của chúng trong quá
trình sản xuất và chế biến thực phẩm cho người [59, 74]. Sử dụng vắc-xin phòng
bệnh vẫn là một lựa chọn số 1 đối với các nhà chăn nuôi.
Hiện nay trên thị trường có rất nhiều loại vắc-xin vi trùng, trong đó hai loại
vắc-xin vô hoạt và vắc-xin nhược độc được sử dụng nhiều nhất. Vắc-xin vô hoạt ít
hiệu quả hơn so với các loại vắc-xin sống nhược độc [35]. Những năm gần đây có
rất nhiều nghiên cứu và số liệu liên quan đến quy trình sản xuất các loại vắc-xin
sống nhược độc. Tuy nhiên các loại vắc-xin sống nhược độc tạo ra qua tác dụng lý
hóa hoặc bằng phương pháp tiếp truyền truyền thống chỉ giới hạn ở một số loại
mầm bệnh nhất định và nguy cơ các chủng vi khuẩn vắc-xin nhược độc quay trở lại
độc lực cao là rất lớn [52, 69]. Để khắc phục những mặt hạn chế trên, loại vắc-xin
thế hệ mới ra đời, một trong số đó là vắc-xin tái tổ hợp. Quá trình tạo vắc-xin tái tổ
hợp bắt đầu bằng việc tạo chủng vi khuẩn nhược độc. Sử dụng kỹ thuật gen để loại
bỏ những gen gây bệnh của vi khuẩn nhưng vẫn giữ nguyên các đặc tính sinh học,
sinh trưởng và phát triển như vi khuẩn ban đầu [24, 45, 63]. Sau đó tổ hợp gen biểu
hiện kháng nguyên ngoại lai cùng với hệ thống khởi động được thiết kế và ghép vào
chủng vi khuẩn nhược độc. Chủng này mang plasmid tái tổ hợp mang kháng
nguyên ngoại lai. Vì vậy trên chủng vắc-xin mang đồng thời 2 loại kháng nguyên,
kháng nguyên của vi khuẩn và kháng nguyên ngoại lai.
Hiện nay, tại Việt Nam có hai loại vắc-xin phòng bệnh phó thương hàn lợn
đó là vắc-xin vô hoạt và vắc-xin nhược độc. Đối với bệnh phù đầu trên lợn do
E.coli gây ra, hiện nay có một số cơ sở sản xuất vắc-xin phòng bệnh phù đầu ở dạng
bacterin. Đến nay, vẫn chưa có vắc-xin kép phòng hai bệnh trên. Vì vậy, để phòng
cả hai bệnh trên thì phải tiêm hai mũi vắc-xin khác nhau gây stress lớn cho lợn, ảnh
hưởng tốc độ tăng trưởng của lợn. Việc áp dụng những kỹ thuật tiên tiến của Mỹ để
nghiên cứu chế tạo vắc-xin tái tổ hợp đa giá chất lượng cao, giá thành hạ với một
2
lần tiêm có thể phòng được nhiều bệnh là việc làm cần thiết góp phần hạn chế

những thiệt hại do bệnh gây ra.
Từ yêu cầu thực tế và những tìm hiểu về tình hình nghiên cứu chế tạo vắc-xin
thế hệ mới đang được thực hiện tại nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới, việc
nghiên cứu tạo chủng vắc xin Salmonella choleraesuis (S.choleraesuis) nhược độc
mang gen crp (cAMP receptor protein), gen asd (aspartic semialdehyde
dehydrogenase) đột biến làm chủng vi khuẩn biến nạp mang plasmid ngoại lai của
E.coli để phòng hai bệnh phù đầu và phó thương hàn lợn được đặt ra có ý nghĩa về
khoa học và thực tiễn cao.
Để góp phần đi tới đích chung nêu ra ở trên trong luận văn này tôi thực hiện
các nghiên cứu ở công đoạn đầu với nội dung: ”Nghiên cứu tạo chủng vắc-xin
S.choleraesuis nhược độc làm chủng vi khuẩn biến nạp”.
Mục đích:
Tạo được chủng vắc-xin S.choleraesuis nhược độc mang hai gen crp, asd
đột biến làm chủng vi khuẩn biến nạp.
Để đạt được những mục đích trên, các nội dung nghiên cứu bao gồm:
- Tạo dòng plasmid pRE112 mang gen crp đột biến (pRE112/Δcrp). Kiểm tra
kết quả tạo dòng plasmid pRE112/Δcrp.
- Chuyển nạp plasmid pRE112/Δcrp vào chủng S.choleraesuis nhược độc gây
đột biến gen crp. Kiểm tra kết quả gây đột biến gen crp.
- Kiểm tra các đặc tính sinh vật, hóa học của chủng S.choleraesuis mang gen
crp đã bị đột biến (S.choleraesuis Δcrp).
- Tạo dòng plasmid pRE112 mang gen asd đột biến (pRE112/Δasd). Kiểm tra
kết quả tạo dòng plasmid pRE112/Δasd.
- Chuyển nạp plasmid pRE112/Δasd vào chủng S.choleraesuis Δcrp. Kiểm tra
kết quả gây đột biến gen asd.
- Kiểm tra các đặc tính sinh vật, hóa học của chủng S.choleraesuis mang hai
gen crp, asd đột biến.
Đối tượng nghiên cứu: chủng S.choleraesuis nhược độc (S.choleraesuis
Smith) do Phân viện Thú y miền Trung cung cấp.
3

Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. BỆNH PHÓ THƯƠNG HÀN VÀ PHÙ ĐẦU LỢN
1.1.1. Bệnh phó thương hàn [80]
Bệnh phó thương hàn lợn (Salmonellosis of Swine typhoid - Swine Entoritis
Swine paratyphoid) là một bệnh truyền nhiễm xảy ra trên lợn ở mọi lứa tuổi, thường
gặp ở lợn con đặc biệt là lợn sau cai sữa từ 2 - 4 tháng tuổi, ở lợn trưởng thành thì ít
thấy. Hầu như không thấy trường hợp lợn đang bú sữa mắc bệnh (do lợn con có
kháng thể truyền từ sữa mẹ). Bệnh có đặc điểm gây bại huyết, viêm dạ dày, ruột,
tiêu chảy, mụn loét ở ruột già, viêm phổi, viêm gan, viêm màng não. Các đàn lợn bị
nhiễm bệnh không những gây thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi mà còn là nguồn
tàng trữ mầm bệnh gây hại đối với con người [66, 75].
1.1.1.1. Nguyên nhân gây bệnh
Bệnh phó thương hàn lợn gây ra chủ yếu do 2 loài vi khuẩn là S.choleraesuis
chủng Kunzendorf gây thể cấp tính, S.typhisuis chủng Voldagsen gây thể mãn tính.
Ngoài ra có các chủng khác như S.enteritidis, S.typhimurium, S.dublin.
Vi khuẩn có thể tồn tại nhiều ngày, hàng tuần, thậm chí cả năm trong những
điều kiện thích hợp, nhưng dễ bị tiêu diệt bởi nhiệt độ cao và các loại hoá chất sát trùng
như Glutaraldehyde, Benzalkonium chloride, Formaldehyde. Ở lợn bệnh, vi khuẩn có ở
trong máu, phủ tạng, các chất tiết (nhiều nhất ở trong phân); ở lợn nái có nhiều trong
dịch tiết đường sinh dục, thai bị sẩy. Những lợn khoẻ mang trùng có ý nghĩa rất quan
trọng đối với lưu hành dịch bệnh và nguy cơ đối với sức khoẻ cộng đồng. Một vài yếu
tố gây stress như: cai sữa, vận chuyển, thay đổi thời tiết đột ngột làm giảm sức đề
kháng của heo, có thể là những nguyên nhân làm dịch bệnh bộc phát.
1.1.1.2. Triệu chứng – Bệnh tích
Thời kỳ nung bệnh từ 3 - 6 ngày có khi kéo dài đến 1 tuần lễ hay 1 tháng tùy
thuộc số lượng vi khuẩn xâm nhập, độc lực của vi khuẩn và sức đề kháng của cơ thể
con vật.
4
Thể cấp tính: con vật sốt cao 41,5

0
C - 42
0
C, kém ăn hoặc không ăn, không
bú. Con vật táo bón, phân có màu đen có màng giả, bí đại tiện, nôn mửa, tiêu chảy,
phân thối có màu vàng, da tụ máu thành từng nốt, đỏ ửng rồi chuyển thành màu tím
xanh ở tai, bụng, mặt trong đùi, ngực. Bệnh thường kéo dài 2 - 4 ngày, con vật gầy
còm, còi cọc, tiêu chảy nhiều rồi chết. Tỷ lệ chết có thể từ 25 - 95%, có khi bệnh
chuyển sang thể mãn tính.
Một số bệnh tích có thể thấy như: lá lách sưng to do dai như cao su, màu xanh
thẫm; hạch lâm ba sưng, mềm, đỏ; thận có những nốt hoại tử ở vỏ thận; gan tụ máu,
có nốt hoại tử; niêm mạc dạ dày và ruột viêm đỏ, có điểm xuất huyết, có khi có vết
loét nhỏ như hạt đậu, hoại tử ở dạ dày (trên đỉnh các nếp nhăn), ở ruột non và từng
đoạn dài biến thành khối vàng bột như cám; phổi tụ máu và có các ổ viêm.
Thể mãn tính: bệnh phát ra lúc đầu không rõ triệu chứng. Con vật sốt nhẹ,
gầy yếu dần, ăn uống giảm sút, chậm lớn, da xanh, trên da có những mảng đỏ hoặc
xám tím bầm. Con vật tiêu chảy, phân lỏng, có màu vàng rất thối. Bệnh tiến triển
trong vài tuần. Tỉ lệ chết từ 25 - 75%. Một số có thể khỏi bệnh nhưng tiêu hoá thức
ăn kém, chậm lớn.
Bệnh tích chủ yếu ở dạ dày và ruột. Thành ruột dày và có nhiều chỗ bị hoại tử,
có bã đậu (casein hoá), xuất huyết, vết loét liền nhau thành mảng, hạch ruột xuất
huyết, có khi có mủ, gan, lách sưng, mềm, có những đốm hoại tử, xoang bụng tích
nước viêm.
Hình 1.1: Lợn mắc bệnh gầy còm và những vết loét ở ruột già
lợn mắc bệnh
5
1.1.1.3. Chẩn đoán
Chẩn đoán lâm sàng
Ở thể cấp tính: lợn sốt cao, chết nhanh, viêm cata dạ dày, ruột, lách sưng to,
đàn hồi, dai như cao su, có màu xanh sẫm, gan sưng, có ổ hoại tử, xuất huyết ở

thận, tương mạc.
Ở thể mãn tính: lợn bị tiêu chảy dai dẳng, gầy còm, suy nhược, chết do kiệt
sức, viêm ruột, gan, phổi.
Chẩn đoán phân biệt
Cần chẩn đoán phân biệt với các bệnh dịch tả lợn, tụ huyết trùng, đóng dấu…
vv. Để xác định chắc chăn nguyên nhân bệnh cần thiết phải lấy mẫu để làm các xét
nghiệm tại phòng thí nghiệm.
1.1.1.4. Phòng và trị bệnh
Phòng bệnh
Mua lợn từ nơi không có dịch, cách ly theo dõi ít nhất 10 ngày trước khi nhập
đàn.
Khi có lợn bệnh phải cách ly ngay để theo dõi và điều trị, kịp thời báo cho
chung quanh biết để cùng nhau phòng chống dịch.
Không bán chạy lợn bệnh, không mổ thịt ở ao, hồ, sông; phân và nước rửa phủ
tạng phải chôn. Tiêu độc chuồng trại và dụng cụ chăn nuôi.
Dùng vắc-xin phó thương hàn keo phèn tiêm liều 2ml/con, miễn dịch 6 tháng,
4 tháng tiêm lại. Kháng huyết thanh điều chế từ ngựa, tiêm liều 30, 40ml/con.
Điều trị
Chưa có biện pháp đìều trị có hiệu quả cao. Chỉ nên điều trị những trường hợp
nhẹ, tiến triển chậm.
Chloramphenicol 10%, chlotetrasone, oxycaf, biocortyl O.P.C, T.P.C, tylo
P.C, tylo D.C liều: 1 – 1,5ml/10 kg thể trọng (20 mg/ kg); gentamycine: 250 mg,
2 lần/ngày; các loại sulfamid: sulfadiazin, sulmet, sulfaprim, septotryl 24% dùng 1
ml/5, 10 kg thể trọng.
6
1.1.2. Bệnh phù đầu (Edema Disease) [81]
Bệnh phù đầu ở lợn được Shanks mô tả lần đầu tiên vào năm 1938 và đặc
biệt phổ biến ở Châu Âu vào sau Thế chiến thứ II. Tại Việt Nam, bệnh phù đầu và
tiêu chảy ở lợn con gây thiệt hại lớn về kinh tế cho ngành chăn nuôi; từ rất sớm các
tác giả Nguyễn Thị Nội và cộng sự đã nghiên cứu về bệnh này; bệnh xảy ra ở tất cả

ba miền Nam, Trung và Bắc [5]. Tại miền Nam, bệnh xảy ra ở các tình đồng bằng
sông Cửu Long [4], các tỉnh phía Bắc [1, 3, 6] và các tỉnh miền Trung [6] với tỷ lệ
nhiễm dao động 15,72 – 58,78% . Bệnh thường xảy ra đột ngột ở lợn con cai sữa
với các dấu hiệu điển hình của bệnh sưng mí mắt, mặt phù thũng, đi lảo đảo.
1.1.2.1. Nguyên nhân gây bệnh
Bệnh phù đầu lợn do vi khuẩn E.coli mang kháng nguyên bám dính F18ab và
sản xuất độc tố shiga biến thể 2e (Stx2e) gây ra cho lợn con trước và sau cai sữa.
Các chủng vi khuẩn E.coli này có đặc điểm gây dung huyết khi cấy trên thạch máu.
Vi khuẩn E.coli dung huyết gây bệnh phù đầu thường xuyên có mặt trong đường
ruột lợn với số lượng rất ít. Khi xuất hiện các yếu tố bất lợi làm giảm sức đề kháng
cơ thể lợn như cai sữa, thay đổi thời tiết hoặc thức ăn, quần thể E.coli gây bệnh sẽ
phát triển nhanh, lây lan gây thành dịch.
Nguyễn Viết Không và cộng sự khi nghiên cứu về kháng thể kháng E.coli
phù đầu ở lợn chăn nuôi công nghiệp cho thấy chỉ có 6,25% lợn con theo mẹ có
kháng thể này [2]. Gần đây, khi phân tích kháng nguyên bám dính F4 và F18 trên
184 chủng E.coli phân lập từ lợn con bị phù đầu ở các tỉnh Nam Trung bộ và Tây
Nguyên. Võ Thành Thìn và cộng sự tìm thấy 27/184 chủng mang kháng nguyên
bám dính F18ab [9]. Cù Hữu Phú và cộng sự đã chọn một số chủng E.coli phân lập
từ lợn bị bệnh phù đầu tại Hà Tây và Bình Định để sản xuất vắc-xin dưới dạng vô
hoạt có bổ trợ keo phèn để phòng bệnh phù đầu [6]. Gần đây, bộ môn Vi Trùng
Phân viện Thú y miền Trung cũng đã nghiên cứu chế tạo vắc-xin phòng bệnh phù
đầu dưới dạng bacterin có bổ trợ keo phèn.
1.1.2.2. Triệu chứng – Bệnh tích
Thường xảy ra một cách đột ngột với các triệu chứng ban đầu là bỏ ăn và rất
7
khát nước, sau đó xuất hiện các triệu chứng thần kinh như run rẩy, nằm đạp chân
kiểu bơi chèo hoặc chạy quanh, liệt hoặc nằm úp trên 4 chân. Đa số lợn con sẽ chết
trong vòng 24 giờ sau khi xuất hiện các triệu chứng thần kinh. Kiểm tra kỹ, thấy
phù ở mí mắt, xung huyết kết mạc mắt, phù đầu.
Ngoài ra còn thấy khó thở, táo bón hoặc tiêu chảy trước khi xuất hiện triệu

chứng thần kinh. Đa số không thấy thân nhiệt tăng cao.
1.1.2.3. Chẩn đoán
Chẩn đoán dễ dàng trên cơ sở dựa vào các đặc điểm là chỉ xảy ra sau khi cai
sữa 1 – 2 tuần với các triệu chứng thần kinh, phù nề ở niêm mạc mặt và dạ dày.
1.1.2.4. Phòng và trị bệnh
Phòng bệnh
- Chuồng trại khô ráo, thoáng mát, định kỳ sát trùng tẩy uế chuồng trại.
- Khi cai sữa nên giữ heo con ở lại chuồng và chuyển heo mẹ sang chuồng
khác. Trong những ngày đầu cai sữa không cho ăn quá nhiều, giảm chất bột, đạm và
tăng chất xơ trong khẩu phần.
- Tiêm vaccin E.coli phòng bệnh, tiêm bắp hoặc dưới da, liều 2ml/con.
Điều trị
- Khi độc tố của E.coli đã nhiễm vào máu và heo đã sưng phù đầu thì việc điều
trị sẽ không hiệu quả.
- Thường điều trị dự phòng bằng cánh sử dụng 1 trong các loại kháng sinh sau:
Sodibio, Mycofloxacine 10%, Bio+B12, Clamoxyl L.A, Multibio : 1ml/10kg thể
trọng, tiêm bắp 1lần/ngày liên tục trong 3 - 5 ngày.
1.2. VẮC-XIN THÚ Y VÀ MỘT SỐ NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC-XIN
TỪ VI KHUẨN Salmonella NHƯỢC ĐỘC
1.2.1. Vắc-xin thú y
Việc phát triển vắc-xin thú y có nhiều mục đích như ngăn ngừa và kiểm soát
bệnh truyền nhiễm trên động vật, bảo vệ sức khỏe cho động vật nuôi, giảm giá
thành thức ăn cho vật nuôi [60, 74]. Mặt khác, khi tiêm phòng vắc-xin cho vật nuôi
cũng ngăn chặn được khả năng lây lan bệnh truyền nhiễm từ động vật sang người.
Ngoài ra các chương trình tiêm chủng vắc-xin đại trà cho vật nuôi, sẽ làm giảm
đáng kể sử dụng thuốc thú y, dẫn đến hạn chế tác dụng phụ của thuốc thú y đối với
8
môi trường cũng như hạn chế được sự tồn đọng thuốc thú y trong động vật nuôi
[60]. Tóm lại, các loại vắc-xin sử dụng trong thú y, ngoài việc cải thiện sức khỏe
cho động vật nuôi còn có tác dụng nâng cao sức khỏe cộng đồng.

Mặc dù các loại vắc-xin dùng trong thú y chỉ chiếm khoảng 23% trên tổng số
các loại sinh phẩm bảo vệ động vật nuôi trên thị trường toàn cầu, nhưng những
nghiên cứu về các loại vắc-xin ngày một tăng do việc áp dụng những tiến bộ khoa
học để nghiên cứu và phát triển vắc-xin, do số lượng rất lớn các loại vi khuẩn kháng
lại kháng sinh, và do sự xuất hiện các loại dịch bệnh mới. Các loại vắc-xin thú y
ngoài việc bảo vệ sức khỏe cho động vật nuôi còn có tác dụng bảo vệ sức khỏe cộng
đồng, bởi vì việc sử dụng vắc-xin làm giảm đi đáng kể sử dụng các loại kháng sinh
và các loại kích thích tố trong chăn nuôi, dẫn đến giảm đi sự tồn đọng của chúng
trong quá trình sản xuất và chế biến thực phẩm cho người. Điều này sẽ thúc đẩy làm
tăng các hoạt động của cơ quan soạn thảo luật nhằm bảo vệ quyền lợi của người tiêu
dùng thực phẩm tại thị trường lớn như Mỹ và liên minh Châu Âu [68].
Các loại vắc-xin thú y được cấp phép sử dụng bao gồm các loại vắc-xin vô
hoạt và vắc-xin sống nhược độc. Mặc dù các loại vắc-xin này đã và đang được sử
dụng rộng rãi và góp phần đáng kể bảo vệ sức khỏe cho vật nuôi cũng như cộng
đồng trên toàn cầu, nhưng vẫn còn một số hạn chế nhất định. Các loại vắc-xin
truyền thống thường giá thành sản xuất cao, đòi hỏi phải có chất bổ trợ và phải tiêm
chủng nhiều lần mới tạo được miễn dịch tốt, hơn nữa các loại vắc-xin này có thể
ảnh hưởng đến việc tạo kháng thể trên gia súc mẹ dẫn tới khả năng bảo hộ thấp
hoặc không có khả năng bảo hộ đối với gia súc non [20, 60]. Các loại vắc-xin độc tố
có thể tạo miễn dịch dịch thể tốt, tuy nhiên không có tác dụng hoặc tác dụng ít trong
việc tạo miễn dịch trung gian tế bào. Các loại vắc-xin vô hoạt toàn khuẩn thường
chứa cơ chất kháng nguyên và không kháng nguyên, các đáp ứng miễn dịch chống
lại cơ chất không kháng nguyên hoàn toàn trái ngược với sự ngăn chặn nhiễm trùng
và có thể làm ảnh hưởng hoặc làm giảm đáp ứng miễn dịch đối với cơ chất kháng
nguyên. Chúng có thể tạo ra phản ứng phụ có hại do các cơ chất ngoài mong muốn
như các loại nội độc tố [75]. Các loại vắc-xin sống nhược độc có khả năng tạo ra hai
9
loại miễn dịch, miễn dịch dịch thể và miễn dịch trung gian tế bào. Những năm gần
đây có rất nhiều nghiên cứu và số liệu liên quan đến quy trình sản xuất các loại vắc-
xin sống nhược độc. Tuy nhiên các loại vắc-xin sống nhược độc chỉ giới hạn ở một

số loại mầm bệnh nhất định và nguy cơ các chủng vi khuẩn vắc-xin nhược độc quay
trở lại độc lực cao là rất lớn [53, 70]. Để khắc phục những nhược điểm của các loại
vắc-xin trên, vắc-xin thế hệ mới ra đời dựa trên kỹ thuật gen, một trong số đó là
vắc-xin tái tổ hợp. Có nhiều đối tượng vi sinh vật có thể sử dụng làm chủng vi
khuẩn biến nạp trong vắc-xin tái tổ hợp như vi khuẩn Salmonella, vi khuẩn Lao,
E.coli, hoặc một số loại virus như virus đậu, virus adeno,
Ưu thế của vắc-xin tái tổ hợp sử dụng vi khuẩn Salmonella là dễ dàng thao
tác, dễ sử dụng, dễ nhân lên và dễ phân phối kháng nguyên cho cơ thể. Việc nuôi
cấy chủng vi khuẩn tái tổ hợp không phức tạp do đó đảm bảo việc tiếp giống, nhân
giống và sản xuất vắc-xin để ứng dụng. Salmonella hiện đang được sử dụng làm
chủng vi khuẩn biến nạp mang các loại gen kháng nguyên của virus cúm, HBV,
virus sốt xuất huyết, vi khuẩn gây bệnh đường ruột, vi khuẩn tả, liên cầu khuẩn, ký
sinh trùng sốt rét,
1.2.2. Một số nghiên cứu sản xuất vắc-xin từ vi khuẩn Salmonella nhược độc
Các chủng vi khuẩn Salmonella nhược độc đầu tiên được sử dụng làm
vắc-xin phòng các bệnh do vi khuẩn Salmonella gây trên người và động vật [33,
34]. Hiện nay, việc sử dụng các chủng Salmonella nhược độc mang một số gen
đột biến làm chủng vi khuẩn biến nạp mang các plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa
các kháng nguyên ngoại lai để tạo thành các chủng sản xuất vắc-xin phòng nhiều
bệnh đang là hướng nghiên cứu thu hút nhiều sự tham gia của các nhà khoa học
[24, 45, 55]. Những vắc-xin tái tổ hợp này tạo miễn dịch do các kháng nguyên
ngoại lai đồng thời tạo miễn dịch do các kháng nguyên của vi khuẩn Salmonella.
Các chủng vắc-xin Salmonella đã được loại bỏ gen asd nhưng mang plasmid
asd+ tái tổ hợp đã chủng hóa các gen kháng nguyên ngoại lai nên mang trên
mình đồng thời hai hoại kháng nguyên đó là kháng nguyên của Salmonella và
kháng nguyên ngoại lai [31, 53].
10
Gần đây, có rất nhiều nghiên cứu sử dụng các chủng vắc-xin Salmonella
nhược độc làm vi khuẩn biến nạp mang các plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa các
kháng nguyên ngoại lai phòng các bệnh do Salmonella cũng như các bệnh do các

kháng nguyên ngoại lai gây ra cho người và động vật. Bucley và cộng sự sử dụng
chủng Salmonella typhimurium DeltaaroA nhược độc làm tế bào chủ mang plasmid
tái tổ hợp đã dòng hóa các kháng nguyên của Campylobacter làm vắc-xin phòng
bệnh do Campylobacter jejuni gây ra trên gia cầm [13]. Zekarias và cộng sự đã
dùng chủng Salmonella typhimurium nhược độc làm vi khuẩn biến nạp mang
plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa gen Alpha tốc xin của Clostridium perfingens làm
vắc-xin phòng bệnh viêm ruột hoại tử trên gà. Gà tiêm vắc-xin được bảo hộ tốt khi
công cường độc với chủng Clostridium perfringens cường độc [76]. Tương tự, Xin
và cộng sự cũng sử dụng Salmonella typhimurium làm vi khuẩn biến nạp mang
plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa gen của kháng nguyên protein bề mặt A của
Streptococcus pneumoniae gây bệnh viêm phổi, viêm màng não trên người; khi thử
nghiệm trên chuột, vắc-xin có tác dụng tạo miễn dịch tốt [70]. Branger và cộng sự
khi nghiên cứu vắc-xin tái tổ hợp phòng bệnh do Yersinia gây ra trên người, chủng
vi khuẩn vắc-xin nhược độc Salmonella typhimurium được sử dụng làm tế bào chủ
mang plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa các gen kháng nguyên Lcrv và Lcrv196 [16].
Zhao và cộng sự khi nghiên cứu thử nghiệm vắc-xin phòng bệnh sảy thai truyền
nhiễm, các tác giả này đã dòng hóa các gen kháng nguyên protein L7/L12 của vi
khuẩn Brucella trên plasmid plasmid và biến nạp vào chủng vắc-xin nhược độc
Salmonella typhirmurium; vắc-xin có hiệu lực cao khi thử nghiệm trên chuột [78].
Các chủng vắc-xin Salmonella nhược độc không những là tế bào chủ mang các
plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa các kháng nguyên vi khuẩn mà còn là vật mang cho
các plasmid tái tổ hợp dòng hóa các kháng nguyên vi rút và ký sinh trùng. Benitez
và cộng sự đã sử dụng chủng vắc-xin Salmonella typhimurium nhược độc SL3261
làm vi khuẩn biến nạp mang plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa các kháng nguyên của
Cryptosporidium parvum [11]. Ning và cộng sự nghiên cứu vắc-xin tái tổ hợp
phòng bệnh đốm trắng trên tôm trong đó kháng nguyên protein vỏ V28 được dòng
11
hóa trên plasmid pcADN3,1-VP28 và biến nạp vào chủng Salmonella nhược độc
SV4089; vắc-xin có tác dụng bảo hộ cao trên tôm [54].
Plasmid tái tổ hợp mang gen ngoại lai đã được chứng minh là ổn định trong tế

bào chủ trong điều kiện invitro. Garmory và cộng sự khi nghiên cứu về các chủng
vắc-xin Salmonella typhimurium mang plasmid tái tổ hợp đã được dòng hóa kháng
nguyên F1 của vi khuẩn Yersinia pestis, đã kiểm tra sự ổn định của plasmid tái tổ
hợp bằng phương pháp cấy truyền [32]. Các tác giả này nhận thấy sau khi cấy
truyền 60 lần plasmid tái tổ hợp vẩn ổn định trong tế bào chủ. Zekarias và cộng sự
sau khi cấy truyền 50 lần thì plasmid tái tổ hợp mang kháng nguyên độc tố Alpha
toxin (PLcC) trong chủng vắc-xin Salmonella typhimurium vẫn ổn định [76]. Tương
tự hai nghiên cứu trên, Branger và cộng sự đã chứng minh được sự ổn định của
plasmid tái tổ hợp trong tế bào chủ sau 70 lần cấy truyền [16].
1.2.3. Vắc-xin phòng bệnh phó thương hàn và phù đầu ở lợn
Hiện nay, tại Việt nam có hai loại vắc-xin phòng bệnh phó thương hàn lợn đó
là vắc-xin vô hoạt và vắc-xin nhược độc. Vắc-xin Phó thương hàn vô hoạt được sản
xuất dưới dạng nước có bổ sung các chất bổ trợ làm tăng cường và kéo dài khả năng
miễn dịch. Vắc-xin nhược độc được sản xuất dạng đông khô kết hợp với
Pasteurella Mutocida nhược độc phòng 2 bệnh Phó thương hàn và Tụ huyết trùng
lợn. Ưu điểm của vắc-xin kép nhược độc dạng đông khô là an toàn, hiệu lực cao,
giá thành hạ.
Đối với bệnh phù đầu trên lợn do E.coli gây ra, hiện nay có một số cơ sở sản
xuất vắc-xin phòng bệnh phù đầu ở dạng bacterin. Đến nay, vẫn chưa có vắc-xin tái
tổ hợp phòng hai bệnh trên, để phòng hai bệnh trên thì phải tiêm hai mũi vắc-xin
khác nhau, gây stress lớn cho lợn ảnh hưởng tốc độ tăng trưởng của lơn.
Việc áp dụng những kỹ thuật tiên tiến của khoa học để nghiên cứu chế tạo
vắc-xin tái tổ hợp đa giá chất lượng cao, an toàn, giá thành hạ với một lần tiêm có
phòng được nhiều bệnh là việc làm cần thiết góp phần hạn chế những thiệt hại do
bệnh gây ra.
12
1.3. VI KHUẨN Salmonella choleraesuis (S.choleraesuis)
S.choleraesuis là một trong những vi khuẩn gây bệnh phó thương hàn lợn. Lợn
bị nhiễm S.choleraesuis không chỉ bị viêm dạ dày, ruột mà gây chết biểu hiện bao
gồm viêm phổi, viêm gan, viêm màng não [66].

Vi khuẩn S.choleraesuis được phân lập lần đầu tiên ở lợn con vào năm 1885
do Salmon và Smith [8].
Phân loại khoa học của S.choleraesuis :
Giới (regnum) : Bacteria
Ngành (phynum) : Proteobacteria
Lớp (class) : Gamaproteobacteria
Bộ (ordo) : Enterobacteriales
Họ (familia) : Enterobacteriaceae
Chi (genus) : Salmonella
Loài (species) : S.choleraesuis
1.3.1. Đặc điểm hình thái
S.choleraesuis là loại trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, kích thước 0,4
– 0,6 × 1 – 3 µm, không hình thành giáp mô và nha bào, gram âm.
S.choleraesuis có khả năng di động mạnh do có từ 7 – 12 lông quanh thân
[8].
Hình 1.2: Đặc điểm hình thái của vi khuẩn S.choleraesuis [84]
13
1.3.2. Đặc tính về nuôi cấy
Trên thạch: khi nuôi cấy ở nhiệt độ 37
0
C sau 24 – 48 giờ, vi khuẩn mọc thành
các khuẩn lạc tròn, trắng hoặc xám, hơi lồi lên ở giữa, hình thành một bờ chất dính
lầy nhầy ở xung quanh. Trên mặt thạch thỉnh thoảng xuất hiện khuẩn lạc R nhám,
mặt không bóng, không đều, mờ [8].
1.3.3. Đặc tính sinh hóa
Khả năng chuyển hóa đường: S.choleraesuis lên men có sinh hơi glucose,
levulose, galactose, mannitol, xyclose, rhamnose, maltose, dextrin; không lên men
sucrose, lactose, arabinose [8].
Các phản ứng sinh hóa khác:
Indol : -

H
2
S : +
VP (voges prosskauer) : -
MR (methyl rouge) : -
Khử nitrat thành nitrit.
1.3.4. Sức đề kháng
S.choleraesuis có thể tồn tại một tuần trong nước thường. Trong nước đá,
trong xác động vật chết chôn ở bùn, cát chúng có thể sống 2 – 3 tháng.
Khả năng chịu nhiệt: vi khuẩn có khả năng chịu nhiệt kém, bị diệt ở 50
0
C sau
1 giờ, 70
0
C trong 20 phút, đun sôi trong 5 phút, thanh trùng theo phương pháp
Pasteur. Ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp diệt vi khuẩn sau 5 giờ ở nước trong và 9
giờ ở nước đục.
Salmonella có thể sống trong thịt ướp muối (nồng độ muối 29%) được 4 – 8
tháng ở nhiệt độ từ 6 – 12
0
C. Xử lý miếng thịt nhiễm trùng bằng hơ lửa hay nướng
ít có tác dụng diệt Salmonella ở bên trong.
Các chất sát trùng thông thường cũng dễ phá hủy vi khuẩn hoàn toàn: phenol
5%, HgCl
2
1/500, formol 1/500 diệt vi khuẩn trong 15 – 20 phút. Nhưng đối với một số
hóa chất như cristal violet, lục malachite, natri hyposunfit, dixitrat, muối mật với những
14
nồng độ vừa đủ gây độc cho E.coli thì không ảnh hưởng tới sự phát triển của
Salmonella. Dựa vào tính chất này, người ta chế tạo ra những môi trường chọn lọc để

kìm hãm sự phát triển của E.coli và giúp cho Salmonella phát triển dễ dàng [8].
1.3.5. Cấu trúc kháng nguyên
Hiện nay có hơn 2500 kiểu huyết thanh của Salmonella được phát hiện, các
kiểu huyết thanh của Salmonella được phân biệt dựa trên phản ứng miễn dịch của
hai kháng nguyên bề mặt chính: kháng nguyên O và kháng nguyên H.
Kháng nguyên O có bản chất cacbohydrate (hay polysaccharide) và là thành
phần nằm ngoài cùng của màng lipopolysaccharide. Kháng nguyên O là polymer
của các tiểu phần O, mỗi tiểu phần O sẽ gồm 4 – 6 nhóm đường tùy từng nhóm
nguyên O. Các kháng nguyên O khác nhau do chứa các nhóm đường khác nhau,
hay khác nhau do bản chất liên kết cộng hóa trị giữa các nhóm đường trong cùng
một tiểu phần hoặc khác nhau về liên kết cộng hóa trị giữa các tiểu phần. Kháng
nguyên O được kí hiệu bằng số và được chia thành từng nhóm khác nhau, một số
nhóm còn được kí hiệu bằng chữ cái latin.
Kháng nguyên H là protein tiểu phần cấu tạo nên phần sợi của lông roi, đây là
phần cấu trúc chính của lông roi, do đó kháng nguyên H còn được gọi là kháng
nguyên lông roi (hay protein kháng nguyên flagellin). Flagellin chia làm 8 vùng:
vùng I, II và VIII là các vùng bảo tồn cho chỉ Salmonella và họ vi khuẩn đường
ruột, có vai trò g liên kết các flagellin tiểu phần. Vùng IV, V, VI là vùng biến đổi,
nằm trên bề mặt sợi roi có tính miễn dịch kháng nguyên cao, kích thích tạo kháng
thể chuyên biệt với các kiêu huyết thanh của Salmonella.
Theo bảng phân loại Salmonella của Kauffman S.choleraesuis có công thức
kháng nguyên O67 và H1,5 [8].
1.3.6. Tính gây bệnh
Trong tự nhiên: vi khuẩn có thể theo thức ăn, nước uống vào đường tiêu hóa.
Bình thường chúng có thể sống trong ống tiêu hóa mà không gây bệnh. Khi sức đề
kháng của con vật giảm sút, vi khuẩn xâm nhập vào máu, nội tạng và gây bệnh. Sự
giảm sút sức đề kháng có thể do thời tiết, do chăm sóc nuôi dưỡng, lợn con sau cai
15
sữa, tách đàn vận chuyển xa hoặc do con vật mắc các bệnh truyền nhiễm khác,
thường là các bệnh: tụ huyết trùng, đóng dấu lợn và đặc biệt là phó thương hàn.

Vi khuẩn gây ra bệnh phó thương hàn cho lợn con từ 2 – 4 tháng tuổi với tỷ
lệ tử vong trên 50% có khi lên đến 95%, bệnh có thể ở lợn lớn với thể mãn tính và ít
gây chết.
Trong phòng thí nghiệm: chuột bạch dễ cảm nhiễm nhất. Sau khi tiêm canh
khuẩn Salmonella nuôi 24 giờ vào dưới da thì 8 – 12 ngày con vật bị bại huyết và
chết. Chuột lang, thỏ cũng cảm nhiễm, tiêm tĩnh mạch giết chết con vật từ 5 – 9
ngày với các bệnh tích viêm ruột, gan sưng hoại tử.
1.4. GEN CRP (cAMP RECEPTOR) VÀ ASD (β-ASPARTIC SEMIALDEHYDE
DEHYDROGENASE)
Quá trình tạo vắc-xin tái tổ hợp bắt đầu bằng việc tạo chủng Salmonella
nhược độc. Bằng kỹ thuật gen đã cắt bỏ hoặc xoá hoạt tính những gen gây bệnh của
vi khuẩn Salmonella nhưng vẫn giữ nguyên các đặc tính sinh học, sinh trưởng và
phát triển như vi khuẩn ban đầu. Sau đó tổ hợp gen kháng nguyên cùng với hệ
thống khởi động được thiết kế kèm theo được ghép vào chủng Salmonella nhược
độc. Chủng này tiếp nhận gen kháng nguyên tạo thành chủng vi khuẩn tái tổ hợp.
Chủng vi khuẩn tái tổ hợp được nuôi cấy và tạo vắc-xin.
Trong những thập kỷ qua, một loạt chủng S.choleraesuis sống giảm độc lực
đột biến đã được phát triển để sản xuất vắc-xin. Chúng bao gồm các chủng có đột
biến trong các gen tham gia vào tổng hợp purine (pur), tổng hợp thymidine (thy),
the cAMP-reception (crp), adenylate cyclase (cya), type III secretion system
(T3SS), Gifsy-1 prophage protein (gifsy-1), và D-galactonate transport protein
(dgoT)…[24, 43, 71]. Trong số này, các chủng S.choleraesuis với đột biến gen crp
một mình hoặc kết hợp với các gen khác cho thấy có rất nhiều suy yếu trong tính
độc hại và phục vụ làm chủng sản xuất vắc-xin có hiệu quả chống lại bệnh truyền
nhiễm ở lợn [24, 44].
1.4.1. Gen crp (cAMP receptor)
Gen crp quy định khả năng lên men carbohydrate và peptid nhỏ của vi sinh
16
vật. Ngoài ra gen này còn mã hoá sinh tổng hợp cAMP receptor protein, protein
hoạt hóa dị hóa CAP (catabolite activatorprotein), kiểm soát sự biểu hiện của các

gen liên quan đến quá trình trao đổi năng lượng. Trong Escherichia coli, các protein
thụ thể cAMP (crp) kích hoạt phiên mã của hơn 100 gen [46]. Sau khi ghép đôi với
AMP allosteric tác động theo chu kỳ, gen crp khởi tạo sao chép bằng cách liên kết
đến các đoạn ADN cụ thể và tăng cường sự gắn kết của ARN polymerase
holoenzyme để kích hoạt phiên mã [15]. Theo cách này, các gen liên quan đến sự
hấp thu và sử dụng nguồn cacbon, tổng hợp roi, sự hấp thu sắt, tổng hợp glycogen,
protein màng tế bào bên ngoài được quy định trong E.coli và Salmonella
Typhimurium [12]. Hơn nữa, đột biến gen crp và cya đã được báo cáo ảnh hưởng
đến sản xuất của các protein tạo bởi Ysc (Yersinia secretion), Ysa (Yersinia
secretion apparatus), và T3SS (type III secretion system) trong Yersinia
enterocolitica [61]. Tuy nhiên, ít được biết đến về vai trò của gen crp trong độc lực
vi khuẩn Salmonella cho đến khi một nghiên cứu gần đây đã báo cáo rằng gen crp /
cya là cần thiết cho biểu hiện của gen sirA quyết định khả năng gây bệnh của một
cụm gen ở Salmonella là SPI-1 T3SS (Salmonella pathogenicity island 1 encoded
type III secretion system) [21, 68].
SPI-1 T3SS là một trong những yếu tố quyết định độc lực của vi khuẩn
Salmonella, bằng cách cung cấp hơn 10 loại protein khác nhau tác dụng lên các
thành phần hoặc cấu trúc của thành tế bào niêm mạc ruột làm giảm tính thấm của
muối mật giúp Salmonella xâm nhập vào tế bào biểu mô khởi đầu cho quá trình gây
nhiễm trùng và gây ra viêm ruột trong các vật chủ [21, 65]. Hơn nữa, các SPI-1
T3SS SipB protein cũng tương tác làm hoạt hóa quá trình tự hủy (caspase-1
apoptosis) các đại thực bào, đóng một vai trò thiết yếu trong sinh bệnh của
Salmonella. Nhiều nghiên cứu cho thấy, chủng S.choleraesuis mang gen crp đột
biến không thể tiết ra SPI-1 T3SS - yếu tố quyết định độc lực của Salmonella và sự
gây độc tế bào đại thực bào cũng giảm đáng kể khi tiến hành gây nhiễm với
S.choleraesuis crp [39, 50].
17
1.4.2. Gen asd (β-aspartic semialdehyde dehydrogenase)
Gen asd mã hóa cho enzyme aspartic β-semialdehyde deshydrogenase (ASD,
EC 1.2.1.11). ASD là một loại enzyme rất quan trọng trong sinh tổng hợp các axit

amin trong prokaryote, nấm và một số thực vật [41]. Nó tham gia vào con đường
chuyển hóa aspartate tạo thành lysine, methionine, leucine, isoleucine. Con đường
này cũng sản xuất axit diaminopimelic (DAP), một thành phần cần thiết cho sự tổng
hợp peptidoglycan của vi khuẩn Gram âm và thành tế bào vi khuẩn Gram dương
[58, 60, 64, 72]. Ở động vật có vú không tổng hợp cũng không sử dụng DAP như là
một chất nền trong bất kỳ con đường chuyển hóa và lysine không được tổng hợp vì
nó là một acid amin thiết yếu được lấy từ nguồn thực phẩm [14], [18], [38]. Ngoài
ra lysine, threonine, methionine, isoleucine là axit amin thiết yếu trong chế độ ăn
uống của cá [28], [36], [37], [47], [48], [56].
Kể từ khi enzyme aspartic β-semialdehyde deshydrogenase được biết không
có mặt trong các mô động vật có vú, xóa gen asd đã được khai thác làm vô hiệu hóa
enzyme này để gây tử vong cho các sinh vật. Bên cạnh đó, một số nghiên cứu cho
thấy gen asd đột biến có một yêu cầu bắt buộc phải có DAP. Điều này đã được
chứng minh bởi các nghiên cứu gen asd trên Legionella pneumophila [38],
Salmonella Typhimurium [31] và Streptococcus mutans [17]. Do đó, sử dụng đột
biến gen asd như một điểm lựa chọn vị trí đánh dấu kháng kháng sinh [31].
Như vậy, có thể nói S.choleraesuis đột biến ở gen crp và asd có nhiều suy giảm
trong tính độc hại. Vì vậy, chúng tôi nghiên cứu tạo ra chủng vắc-xin S.choleraesuis
nhược độc mang hai gen crp, asd đột biến làm chủng vi khuẩn biến nạp.
1.5. PLASMID SỬ DỤNG TRONG KỸ THUẬT TẠO DÒNG
Các plasmid sử dụng trong kỹ thuật tạo dòng hay gọi là các thể mang gen
cần phải có các đặc điểm tiêu chuẩn sau:
• Có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ, sao chép không phụ thuộc tế
bào chủ.
• Có đặc tính giúp dễ xác định tế bào có chúng.
• Mang những vị trí nhận biết duy nhất của các enzyme cắt giới hạn.
• Có kích thước càng nhỏ càng tốt, dễ xâm nhập, sao chép nhanh hiệu quả.
• Số lượng bản sao trong tế bào cao.
18
Các plasmid đã được cải tiến rất nhiều trở thành các plasmid đa năng và

chuyên dụng. Hiện nay, plasmid được sử dụng với ba nhóm chính là: nhóm PUC,
nhóm pGEM, nhóm pBluescrip. Nhóm PUC có kích thước 2,6 kb mang gen kháng
kháng sinh ampicillin, chứa một phần gen lacZ’, có chứa polylinker cho phép chèn
vào gần như bất kỳ ADN lạ nào. Nhóm pGME có kích thước 3 kb, mang đầy đủ các
trình tự của PUC và mang promotor đặc trưng cho ARN polymerase (SP6.T7).
Nhóm pBluescrip có kích thước 3kb và có ưu thế nhất, kết hợp được tất cả các ưu
điểm của hai nhóm trên. Chính vì thế, chúng tôi chọn plasmid pBuescrip II SK+
làm plasmid mang gen trong nghiên cứu này.
1.5.1. Plasmid pBluescript II SK+ (pBSIIK+)
Plasmid pBSIIK+ có kích thước khoảng 3 kb, plasmid này mang gen kháng
kháng sinh ampicillin và vùng tạo dòng MSC chứa các điểm cắt của các enzyme
giới hạn XhoI, BamHI, KpnI, XbaI.

Hình 1.3. Plasmid pBSIIK+ [83]
19
Plasmid pBSIIK+ được sử dụng để tạo dòng pBSIIK+ mang đoạn gen crp, asd
của chủng S.choleraesuis Smith nhằm tạo ra và nhân gen crp, asd đột biến.
1.5.2. Plasmid pRE112
Để Δcrp, Δasd sau khi đưa vào S.choleraesuis có thể thực hiện quá trình thay
thế gen crp của hệ gen trong tế bào thì nó cần phải được đưa vào một plasmid tự
hủy (sucide plasmid). Đây là plasmid chỉ có thể nhân lên trong các tế bào E.coli
mang gen pir sinh tổng hợp protein π có vai trò khởi động cho quá trình sao chép
plasmid, do đó không thể tồn tại trong các tế bào vi khuẩn S.cholerasuis [62]. Vì
vậy trước khi bị loại bỏ, plasmid này sẽ gắn đoạn gen của chúng mang vào hệ gen
của vật chủ thông qua cơ chế trao đổi chéo, nhờ đó mà việc trao đổi gen được thực
hiện thành công. Plasmid pRE112 là một trong các sucide plasmid có kích thước
khoảng 5 kb, mang gen kháng chloramphenicol (Cm
r
) và sacBI cho phép có thể
nhận biết được sự tiếp nhận và loại bỏ của tế bào đối với plasmid này, nên đã được

chúng tôi lựa chọn.
Hình 1.4. Plasmid pRE112
1.6. TẾ BÀO CHỦ ĐỂ KHUẾCH ĐẠI GEN
Có rất nhiều tế bào chủ dùng trong tạo dòng như E.coli, Bacillus subtilis,
Saccharomyces cerevisia, virut động vật,… E.coli là tế bào chủ phổ biến nhât, dễ
20
nuôi, sinh sản nhanh, không tiết enzyme. E.coli dùng để tạo dòng đã được cải tiến
rất nhiều như loại bỏ các hệ thống sửa đổi hạn chế bằng cách gây đột biến hệ
thống sửa đổi hạn chế nội sinh, hệ thống tái tổ hợp ADN được sửa đổi để ngăn
chặn sự tái tổ hợp, thay đổi hoạt tính endonuclease nhằm tăng lượng plasmid tích
lũy trong tế bào.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn chủng E.coli JM109 khả biến
(endA1, recA1, gyrA96, thi, hsdR17 (r
k
-
, m
k
+
), relA1, supE44, Δ (lac-proAB), [F’,
traD36, proAB, laqI
q
ZΔM15], Amp
s
) trong việc tạo dòng pBSIIK+/Δcrp,
pBSIIK+/Δasd.
Chủng E.coli χ7213 (thi-1, thr-1, leuB6, fhuA21, lacY1, glnV44, ΔasdA4,
recA1, RP4 2-Tc:Mu[λpir], Km
r
, Amp
s

, DAP
r
) sử dụng trong việc tạo dòng plasmid
pRE112/Δcrp, pRE112/Δasd. Plasmid pRE112 - plasmid chỉ nhân lên trong tế bào
E.coli có gen pir sinh tổng hợp protein π có vai trò khởi động cho quá trình sao chép
plasmid và E.coli χ7213 đáp ứng được yêu cầu.
21
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Đối tượng: chủng S.choleraesuis nhược độc (S.choleraesuis Smith) đang
được dùng để sản xuất vắc-xin phòng bệnh phó thương hàn ở lợn tại Phân viện Thú
y miền Trung.
Địa điểm: Phân viện Thú y miền Trung – Nha Trang – Khánh Hòa.
Thời gian nghiên cứu: từ tháng 01/2011 – tháng 01/2012.
2.2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ DÙNG CHO NGHIÊN CỨU
2.2.1. Chủng vi sinh vật
+ Chủng S.choleraesuis Smith là chủng nhược độc đang được sử dụng để sản
xuất vắc-xin phòng bệnh phó thương hàn ở lợn tại Phân viện Thú y miền Trung.
+ Tế bào khả biến E.coli JM109, E.coli χ7213 được cung cấp bởi công ty Promega.
+ Plasmid pRE112 được lấy từ đại học Bang Arizona – Mỹ.
+ Plasmid pBluescript II SK+ (pBSIIK+) của viện công nghệ sinh học.
2.2.2. Hóa chất và môi trường
+ Bộ kít chiết tách ADN tổng số, bộ kít QIA Quick Gel Extraction kit, bộ kít
chiết tách plasmid QIAprep Spin Miniprep Kit and a microcentrifuge của hãng
Promega và Qiagen.
+ Môi trường:
LB (Luria – Bertani) broth, LB agar.
NA: casein (10g/l), yeast extract (5g/l), agar (18g/l).
NB: casein (10g/l), yeast extract (5g/l).

Một số môi trường có bổ sung thêm sucrose 5%, chloramphenicol (Cm)
30µg/ml, DL-α,
ε
-Diaminopimelic acid (DAP) 50µg/ml, ampicillin 100 μg/mL,
kanamycin (Km) 50 μg/mL, ethidium bromide.
+ Dung dịch đệm:
Phosphate buffer saline (PBS): NaCl (8g), KCl (0,2g), Na2HPO4
(1,44g), KH2PO4 (0,24g). Nước cất hai lần vừa đủ đến 1000ml, chuẩn pH 7,4.
22
Tris-Borate-EDTA (TBE) trong điện di (10X): Tris base (108g), Boric
acid (55g), EDTA (8,3g), nước cất vừa đủ 1000ml, pH 8,3.
Môi trường SOC: Tryption (20g), Yeast extract (5g), NaCl 5M (2ml),
KCl 1M (2,5ml), MgCl
2
1M (10ml), MgSO
4
1M (10ml), glucose 1M (20ml), nước
vừa đủ 1000ml.
+ Các loại đường: glucose, sucrose, maltose, mannitol, lactose, arabinose,
rhamnose, xylose,
+ Các enzyme: enzyme cắt giới hạn XbaI, BamHI, KpnI, XhoI, enzyme Taq,
PFU – Pwo Polymerase, enzyme T4 ADN ligase.
+ Cặp mồi: Pi1 – Pi2, Pr1F – Pr2R, Pr3F – Pr4R, Pr5F – Pr6R, Pr7F – Pr6R,
Pa1F – Pa2R, Pa3F – Pa4R, Pa5F – Pa6R, Pa7F – Pa6R [21, 24, 25, 71, 79].
Bảng 2.1: Các cặp mồi dùng cho phản ứng PCR
Khuôn gen Tên mồi Trình tự mồi (5’ – 3’) Kích thước Ghi chú
invA (Salmonella)
Pi1 CAGGATACCTATAGTGCTGC
580
Pi2 CCCACCGTCAAAGGAACCGT

Đoạn đầu crp
(Pr12)
Pr1F TTTTCTAGAGCTGGATGAGGATTTTGTGG
1048
XbaI
Pr2R TTTGGATCCCCATTCAAGAGTCGGGCTCT BamHI
Đoạn cuối crp
(Pr34)
Pr3F TTTCTCGAGGCTCGTCGCTTACAAGTCAC
1743
XhoI
Pr4R TTTGGTACCCAGTAACTGGATGGTGTATA KpnI
Crp/crp
Pr5F TACGCGCATACAACAAAACTCGC
918/599
Pr6R GCCATTCTGACGGAATTAACGGG
Crp/crp
Pr7F TCGCGTACCCATACAACTT
1731/1412
Pr6R GCCATTCTGACGGAATTAACGGG
Đoạn đầu asd
(Pa12)
Pa1F TTTCTAGACGCTTTGAGCACGACTAA
2112
XbaI
Pa2R TTGGATCCTCCGTTAGGAACGGAATC BamHI
Đoạn cuối asd
(Pa34)
Pa3F TTGGATCCAGGGTAGCTTAATCCCAC
2069

BamHI
Pa4R TTGGTACCACCGAGCGTTCATTGTCA KpnI
Asd/asd
Pa5F TTGCTTTCCAACTGCTGAGC
1803/315
Pa6R TCCTATCTGCGTCGTCCTAC
Asd/asd
Pa7F TTGGACAATGTTACCGATAA
3717/2229
Pa6R TCCTATCTGCGTCGTCCTAC
2.2.3. Dụng cụ, thiết bị
Dụng cụ: micropipet, đầu típ các loại, pipet thủy tinh các loại, dao, cục
23
khuấy từ, đũa thủy tinh, paraffin, panh, kéo, cốc thủy tinh, đĩa petri, bình tam giác,
chai schott, ống eppendorf, đầu lọc, màng lai 0,45µm…
Thiết bị:
− Máy ly tâm
− Máy ly tâm lạnh
− Máy voltex
− Máy luân nhiệt
− Hệ thống điện di ngang
− Bộ đọc điện di
− Tủ ấm
− Tủ ấm lắc
− Tủ lạnh, tủ lạnh âm sâu
− Lò vi sóng
− Tủ cấy vô trùng
− Bể ổn nhiệt
− Cân phân tích
− Máy đo pH

− Máy quang phổ đo OD
− Tủ sấy
− Nồi hấp tiệt trùng
− Máy khuấy từ…
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số
Tách chiết ADN tổng số theo protocol tách chiết ADN tổng số của vi khuẩn
gram (-) của nhà cung cấp.
Cấy 1 khuẩn lạc vào môi trường dịch, nuôi lắc qua đêm ở 37
0
C. Dịch nuôi
cấy được ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút, bỏ phần dịch nổi và thu cặn tế bào
vi khuẩn. Sau đó tế bào vi khuẩn được hoàn nguyên trong 180 µl ATL.
Tiếp theo bổ sung thêm 20 µl proteinase K, trộn đều bằng vortex và ủ 56
0
C
24
trong 1 giờ. Sau khi ủ, vortex 15 giây. Thêm 200 µl dung dịch AL vào mẫu và trộn
đều bằng vortex. Sau đó thêm 200 µl ethanol (96 – 100%) và lại trộn đều bằng
vortex.
Dùng pipet hút dịch mẫu trên cho vào cột DNeasy Mini spin trong tube 2 ml,
ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút. Bỏ dịch và tube, chuyển cột DNeasy Mini spin
vào tube 2 ml mới, thêm 500 µl dung dịch AW1 và ly tâm 8000 vòng/phút trong 1
phút. Bỏ dịch và tube.
Tiếp tục chuyển cột ADNesy Mini spin vào tube 2 ml mới, thêm 500 µl dung
dịch AW2 và ly tâm 14000 vòng/phút trong 3 phút. Bỏ dịch và tube.
Cuối cùng, chuyển cột DNeasy Mini spin vào ống eppendorf 1.5 ml sạch,
thêm 200 µl dung dịch AE vào giữa cột, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút và sau đó
ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút để rửa giải ADN. Bỏ cột, thu được ADN tổng
số. Đo nồng độ ADN thu được qua đo OD. Bảo quản -20

0
C.
2.3.2. Phương pháp tách chiết ADN plasmid
Tách chiết ADN plasmid theo protocol tách chiết ADN plasmid sử dụng
QIAprep Spin Miniprep kit and a Microcentrifuge.
Dịch nuôi cấy tế bào vi khuẩn, sau khi nuôi qua đêm, ly tâm 5000 vòng/phút
trong 10 phút, thu lấy cặn tế bào và bỏ phần dịch nổi.
Hoàn nguyên cặn tế bào vi khuẩn trong 250 µl dung dịch P1 và chuyển sang
ống eppendorf 1,5 ml. Thêm 250 µl dung dịch P2 và trộn đều bằng cách đảo ngược
ống 4 – 6 lần. Thêm 350 µl dung dịch N3 trộn đều dung dịch cũng bằng cách đảo
ngược 4 – 6 lần. Sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
Dùng pipet hút dịch sau ly tâm chuyển vào cột QIAprep spin, ly tâm 1300
vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch. Tiếp theo rửa cột QIAprep spin bằng cách thêm
750 µl dung dịch PE và ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Bỏ dịch và ly tâm
thêm 1 phút để loại bỏ hoàn toàn dung dịch rửa.
Cuối cùng chuyển cột QIAprep vào ống eppendorf 1,5 ml sạch, rửa giải
ADN, thêm 50 µl EB vào giữa cột QIAprep spin, để yên trong 1 phút và sau đó ly
tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Bỏ cột, thu được ADN plasmid. Bảo quản
25