Phương pháp phân tích hoá học nước biển

Website: Email : Tel : 0918.775.368

PhÇn 1: Tỉng quan
1.1. Tổng quan về Tobramycin
1.1.1. Công thức cấu tạo

C18H37N5O9

PTL: 467.5

Tên khoa học: 4-O-(3-Amino-deoxy--D-glucopyranosyl)-2-deoxy-6-O-(2,6diamino-2,3,6-trideoxy--D-ribo-hexopyranosyl)-L-streptamine [21].
1.1.2. Tính chất lý hóa
Bột màu trắng hoặc trắng ngà. Dễ tan trong nớc, rất khó tan trong
ethanol, thực tế không tan trong cloroform và ether.
Góc quay cực riêng []D20 : +1380 đến +1480[7]
1.1.3. Nguồn gốc
Chiết xuất từ môi trờng nuôi cấy Streptomyces tenebrarius, có thể bán
tổng hợp từ kanamycin B [7].
1.1.4. Dợc động học
Tobramycin hầu nh không hấp thu qua đờng tiêu hoá nhng hấp thu tốt
qua đờng tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch. Thuốc ít liên kÕt víi protein hut t¬ng. Do

3


Website: Email : Tel : 0918.775.368

ph©n tư ph©n cực mạnh nên khó đi vào các mô kể cả nÃo. Thuốc đạt nồng độ
cao trong vỏ thận. Khi sử dơng cho phơ n÷ mang thai, thc tÝch lịy trong thai
gây độc cho cả mẹ và con. Tobramycin đào thải chủ yếu qua thận nên phải
giảm liều khi suy thận, thờng dựa vào creatinin huyết thanh để tránh độc tính.

Hiện nay, tobramycin đợc dùng với chế độ một liều cao và duy nhất trong ngày.
Cách dùng này cho thấy hiệu quả điều trị cao hơn và ít độc tính hơn so với dùng
liều nhỏ và nhiều lần trong ngày nh trớc đây. Đối với các ca nặng (nhiễm Pseu.
aeruginosa ở ngời giảm neutrophile và các ca suy thận) cần khoảng cách liều
dài hơn 24 giờ. Thời gian bán thải của tobramycin: 2 - 5 giờ [6]
1.1.5. Tác dụng và cơ chế tác dụng
Tobramycin là một kháng sinh nhóm aminoglycosid có tác dụng trên
nhiều vi khuẩn Gr (-) hiếu khí và mét sè vi khuÈn Gr (+) hiÕu khÝ. Thuèc kh«ng
cã tác dụng với Chlamydia, nấm, virus và đa số các vi khuÈn yÕm khÝ.
Tobramycin rÊt gièng gentamycin vÒ tÝnh chÊt sinh học và độc tính:
chúng có cùng nửa đời thải trừ, nồng độ đỉnh trong huyết thanh, ít liên kết với
protein, thể tích phân bố và sự bài tiết chủ yếu qua lọc ở cầu thận.
Điểm quan trọng nhất của tobramycin là có hoạt tính đối với phần lớn
các chủng Pseudomonas aeruginose, mạnh hơn cả gentamycin.
Cơ chế tác dụng: Tobramycin ức chế sự tổng hợp protein ở các vi khuẩn
nhậy cảm bằng cách gắn không thuận nghịch với các tiểu phân 30S của ribosom
[2], [11].
1.1.6. Chỉ định
Đợc chỉ định trong các bệnh nhiễm khuẩn nặng đe dọa tới tính mạng, đặc
biệt với các bệnh mà nguyên nhân cha rõ ràng hoặc bị nhiễm khuẩn huyết do vi
khuẩn Gr (-).
Trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn nặng, hoặc trong các bệnh nhiễm
khuẩn nặng toàn thân do Pseudomonas sp. gây ra, tobramycin có thể dùng phối
hợp với một kháng sinh nhóm beta-lactam.

4


Website: Email : Tel : 0918.775.368

Trong bƯnh viªm nội tâm mạc do Streptococcus faecalis hoặc alpha Streptococcus gây ra, có thể dùng tobramycin phối hợp với ampicilin hoặc
benzylpenicilin nhng phải tiêm riêng rẽ. [2]
1.1.7. Chống chỉ định
Ngời có tiền sử dị ứng với các kháng sinh loại aminoglycosid, ngời nghe
kém và ngời có bệnh thận. [2]
1.1.8. Dạng bào chế và liều lợng
Tobramycin sulphat: Dung dịch tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch 40 mg/ml (ngời
lớn), 10 mg/ml (trẻ em). Bột pha tiªm 30 - 40 mg/lä.
Lä 5 ml 0,3 % ®Ĩ nhá m¾t. Tp 3,5 g mì tra m¾t 0,3 %.
Dạng thuốc hít qua đờng miệng bằng máy khi dùng để điều trị nhiễm P.
aeruginosa đờng hô hấp ở bệnh nhân bị xơ nang hóa.

[11]

1.2. Một số phơng pháp định lợng Tobramycin
1.2.1. Định lợng tobramycin bằng phơng pháp vi sinh
1.2.1.1. Phơng pháp 1 [15]
- Chủng vi khuẩn: Bacillus subtilis CMCC(B)63501.
- Dung dịch đệm phosphat pH 7,8 0,1
Dikali hydrophosphat : 5,59 g
Kali dihydrophosphat

: 0,41 g

- Môi trờng định lợng:
Pepton

: 5,0 g

Cao thịt

: 3,0 g

Dikali hydrophosphat

: 3,0 g

Thạch

: 15,0 - 20,0 g

Níc cÊt

: 1000 ml

pH sau khi tiƯt trïng

: 7,8 ± 0,2

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử sau đó tiến hành thử và tính kết quả
theo [15]

5


Website: Email : Tel : 0918.775.368

1.2.1.2. Phơng pháp 2 [3]
- Chñng vi khuÈn: Bacillus pumilus NCTC 8241.
- Dung dịch đệm phosphat pH 8,0 0,1

Dikali hydrophosphat : 16,75 g
Kali dihydrophosphat

: 0,523g

- Môi trờng định lợng:
Cao men bia

: 3,0 g

Pepton

: 6,0 g

Casein pancreatic

: 4,0 g

Glucose

: 1,0 g

Cao thÞt

: 1,5 g

Th¹ch

: 15,0 g

Níc cÊt

: 100 ml

pH sau khi tiƯt trïng

: 8,2 0,2

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử
Cân chính xác khoảng 25,0 mg tobramycin hòa tan trong dung dịch
đệm phosphat pH 8,0 để có nồng độ tobramycin chính xác khoảng 10 IU/ml; 20
IU/ml và 40 IU/ml.
- Tiến hành thử và tính toán kết quả theo phơng pháp hoạt lực kháng sinh
- DĐVN III.
1.2.1.3. Phơng pháp 3:[14], [20]
- Xác định hoạt lực kháng sinh của tobramycin bằng phơng pháp vi sinh
vËt theo BP 2000 hay JP14
- Chñng vi khuÈn : Bacillus subtilis ATCC 6633
- M«i trêng nu«i cÊy : Môi trờng đặc
- Dung dịch chuẩn
Cân chính xác một lợng tobramycin chuẩn, tơng đơng khoảng 25 mg
(hiệu lực), hoà tan trong dung dịch đệm phosphat 0,1 mol/l, pH 8 thành chÝnh

6


Website: Email : Tel : 0918.775.368

x¸c 25 ml và đó chính là dung dịch chuẩn gốc. Giữ dung dịch chuẩn gốc ở nhiệt
độ từ 5C đến 15C và sử dụng trong vòng 30 ngày. Pha loÃng dung dịch bằng

dung dịch chuẩn đệm phosphat 0,1M, pH 8 để đợc các dung dịch có nồng độ
8àg/ml và 2àg/ml (theo hiệu lực).
- Dung dich thử:
Cân chính xác một lợng tobramycin, tơng đơng khoảng 25 mg (hiệu lực),
hoà tan trong dung dịch đệm phosphat 0,1 mol/l, pH 8 thành chính xác 25ml.
Pha loÃng dung dịch bằng dung dịch chuẩn đệm phosphat 0,1M, pH 8 để đợc
các dung dịch có nồng độ 8àg/ml và 2àg/ml (theo hiệu lực).
1.2.2. Định lợng tobramycin bằng phơng pháp đo quang phổ hấp thụ UVVIS
1.2.2.1. Phơng pháp 1: [4]
Cân một lợng tobramycin sulfat tơng ứng với khoảng 0,3 g tobramycin
nguyên liệu , cho vào bình định mức có dung tÝch 100 ml, bỉ sung níc cÊt 2 lÇn
võa đủ đến vạch, trộn đều. Lấy 1 ml dung dịch này cho vào bình định mức có
dung tích 20 ml, thêm 5 ml dung dịch NaOH 0,01N, 2 ml dung dịch KMnO 4.
Dung dịch vừa pha đem đun cách thuỷ ở 400C trong 60 phút.
Song song tiến hành điều chế dung dịch chuẩn bằng cách dùng chất đối
chiếu tobramycin.
Mẫu trắng tiến hành nh mẫu thử nhng không có tobramycin.
Sau khi ®un c¸ch thủ ë 400C, thêi gian 60 phót, ®em đo mật độ quang
của các dung dịch này ở bớc sóng 425 nm, cuvet dày 1cm.
1.2.2.2. Phơng pháp 2: [19]
Dựa trên cơ sở tạo ra sản phẩm mầu xanh với 3-methyl-2
benzothiazolinon hydrazon hydrochlorid và FeCl3. Sản phẩm có độ hấp thụ lớn
nhất ở 645 nm. Định luật Lambert-Beer đợc áp dụng trong khoảng nồng độ từ
50-500 mUI/ml.
1.2.3 Định lợng tobramycin bằng phơng pháp HPLC
1.2.2.1 Phơng pháp 1 [14]

7

Website: Email : Tel : 0918.775.368

- Cét styren - divinylbenzen copolymer (4,6 x 250 mm, 8àm).
- Nhiệt độ cột: 55 0C.
- Pha động: Hỗn hợp pha trong 1l nớc đà loại CO2 gồm: 52 g natri sulfat
khan; 1,5 g natri octansulfonat; 3 ml tetrahydrofuran vµ 50 ml dung dịch kali
dihydrophosphat 0,2 M đà đợc chỉnh pH về 3,0 bằng acid phosphoric.
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
- Dung dịch thêm vào sau cột: Dung dịch natri hydroxyd 2% pha trong nớc đà loại CO2. Tốc độ 0,3 ml/phút.
- Detector: Detector ampe kế hoặc các thiết bị tơng tự.
- Thể tích tiêm: 20 àl.
- Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: 0,1 mg/ml.
1.2.2.2 Phơng pháp 2 [20], [23]
- Cột RP 18 (3,9 mm x 30 cm).
- Pha động: Hòa tan 2,0 g tris (hydroxymethyl) aminomethan trong
khoảng 800 ml nớc, thêm vào dung dịch này 20 ml dung dịch acid sulfuric 1N,
sau đó pha loÃng bằng acetonitril tới 2000 ml, lắc ®Ịu.
- Thc thư 2,4-dinitrofluorobenzen: Dung dÞch 2,4dinitrofluorobenzen
1% trong ethanol 96%.
- Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút.
- Detector UV: 365 nm.
- Thể tích tiêm: 20 àl.
- Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: Khoảng 0,22 mg/ml trong dung dịch
acid sulfuric 0,004 N.
- Các dung dịch chuẩn và thử đợc tạo dẫn xuất với các thuốc thử 2,4dinitrofluorobenzen và tris (hydroxymethyl) aminomethan trớc khi tiêm sắc ký.
1.2.2.3 Phơng pháp 3 [15]
- Cột Purospherđ STARRP-18e (4 x 55 mm, 3 àm, Merck).
- Pha động: Acetonitril - níc (50:50).

8

Website: Email : Tel : 0918.775.368

- Tèc ®é dòng: 1,3 ml/phút.
- Detector UV: 230 nm.
- Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: Khoảng 5 àg/ml trong nớc.
- Dung dịch chuẩn và dung dịch thử đợc tạo dẫn xuất víi dung dÞch thc
thư 1-naphthyl isothiocyanat trong pyridin ë 700C.
1.2.2.4 Phơng pháp 4 [16]
- Cột Xterrađ RP - 18 (2,1 x 250 mm, 5 àm).
- Nhiệt độ cột: 30 0C.
- Pha động A: Thêm 0,7 ml dung dịch amoni hydroxyd 28 - 30 % vào 1
lít nớc Milli - Qđ. Sử dụng dung dịch natri hydroxyd 2,5 N để chỉnh pH pha
®éng A ®Õn 11,0.
- Pha ®éng B: Acetonitril.
- TiÕn hành sắc ký theo chơng trình gradient dung môi nh sau:
Thời gian
(phút)
0
10

Pha động A

Pha động B

(%)
100
0

(%)
0
100

- Tốc độ dòng: 0,2 ml/phút.
- Detector: Khối phổ.
- Thể tích tiêm: 4àl.
- Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: Khoảng 0,35 mg/ml trong dung dịch
NaCl 0,9 %.
1.2.2.5 Phơng pháp 5 [15]
- Cột Ultrasphera RP 8 (4,6 x 250 mm, 5àm).
- Pha động: Acetonitril - ®Ưm phosphat 0,05 M pH 3,5 [62:38]
- Tèc ®é dßng: 2,5 ml/phót.
- Thc thư t¹o dÉn chÊt: Acid 2,4,6-trinitrobenzen sulfomic.

9


Website: Email : Tel : 0918.775.368

- Detector UV: 340 nm.
- Thể tích tiêm: 20 àl.
- Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: Khoảng 0,02 mg/ml trong đệm
phosphat pH 7,4.
- Dung dịch chuẩn và thử đợc tạo dẫn xuất với thuốc thử acid
2,4,6-trinitrobenzen sulfomic ở 70 0C.
1.2.2.6. Phơng pháp 6 [5]
- Cét : RP -18 brava ODS (150 x 4,6 mm,5µm)
- Detector huúnh quang : Ex/Em= 338 nm/ 455 nm
- Tốc độ dòng: 1ml/phút

- Tốc độ thuốc thử: 0,7ml/phút
- Thể tích tiêm: 20 àm
- Pha động: Hoà tan 17,75 g natri sulfat khan ; 3,05g natri pentansulfonat
vµ 1ml acid acetic băng trong 1000 ml nớc, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45àm.
- Thuốc thử tạo dẫn xuất sau cột: Hoà tan 0,5g o-phthalaldehyd trong 100
ml methanol, thêm 1,0 ml 2-mercaptoethanol, lắc 3 phút. Thêm 1,5 ml dung
dịch polyoxyethylen lauryl ether 12% và 350 ml dung dịch đệm borat pH 10,4
lắc đều.
- Dung dịch đệm borat pH 10,4: Hoà tan 24,64 g acid boric trong 900 ml
níc. §iỊu chØnh pH đến 10,4 bằng dung dịch NaOH 40%, thêm nớc tới vừa đủ
1000 ml, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 àm (pha theo BP 2005).
1.2.2.7. Phơng pháp 7 [9]
ã Dung dịch thử
Cân chính xác khoảng 20,0 mg tobramycin nguyên liệu cho vào bình
định mức 20,0 ml. Hòa tan và pha loÃng bằng nớc vừa đủ đến vạch. Lấy chính
xác 5,0 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 20,0 ml. Thªm 0,5 ml thuèc

10


Website: Email : Tel : 0918.775.368

thư X, ®em đun cách thủy ở 80 0C trong 60 phút. Thêm dung môi vừa đủ đến
vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 àm.
ã Dung dịch chuẩn (đối chiếu)
Tiến hành tơng tự nh dung dịch thử nhng thay tobramycin nguyên liệu
bằng tobramycin chuẩn (đối chiếu).
- Cột sắc ký Nucleosil C18 (250 x 4 mm, 5µm).
- Detector UV : λ = 215 nm.
- Pha động: Methanol : Đệm phosphat 0,01 M pH 3 = 20 : 80

- Thể tích tiêm: 10 àl.
- Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút.
- Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng thí nghiệm.
* Nhận xét: Qua các phơng pháp định lợng nêu trên, chúng tôi nhận thấy:
- Định lợng bằng phơng pháp vi sinh: Rẻ, đơn giản, không cần trang thiết
bị phức tạp nhng có nhợc điểm lớn là mất nhiều thời gian và kém dặc hiệu do sự
có mặt của các chất kháng vi sinh vật khác, tính chính xác không cao.
- Định lợng bằng phơng pháp đo độ hấp thụ UV-VIS: Có độ chính xác cao,
tiến hành đơn giản, không yêu cầu máy móc quá phức tạp, hoá chất thông dụng
và có thể áp dụng định lợng ở các cơ sở kiểm nghiệm trong cả nớc. Tuy nhiên,
nhợc điểm của phơng pháp là: Tính đặc hiệu cha cao (sự có mặt của chất khác
có khả năng hấp thụ tử ngoại khả kiến nh benzalkonium clorid, một chất bảo
quản hay dùng, sẽ ảnh hởng kết quả định lợng), hoặc phải dùng thuốc thử nhập
ngoại để tạo dẫn chất.
- Định lợng bằng phơng pháp HPLC :
u điểm: Nói chung có tính đặc hiệu cao, tách riêng đợc hoạt chất.
Nhợc điểm: Tiến hành phức tạp, đòi hỏi có trang thiết bị và thuốc thử đắt
tiền vì detector UV thờng không dùng đợc mà thờng phải tạo dẫn chất.

11


Website: Email : Tel : 0918.775.368

Phơng pháp HPLC pha đảo với detector UV rất hay sử dụng để phân tích
các hợp chất phân cực và hấp thụ UV. Nhng với các hợp chất hấp thụ UV yếu
nh tobramycin thì thờng phải tạo dẫn chất, hoặc phải sử dụng detector loại đặc
biệt đắt tiền.
Vì vậy, với các trang thiết bị sẵn có ở phòng thí nghiệm, chúng tôi đặt
vấn đề nghiên cứu xây dựng một quy trình định lợng tobramycin bằng phơng

pháp HPLC đơn giản, dễ thực hiện và kinh phí thấp hơn, không sử dụng thuốc
thử tạo dẫn xuất nh các phơng pháp hiện nay với hi vọng có thể đa vào sử dụng
trong công tác kiểm nghiệm - góp phần quản lý chất lợng các sản phẩm chứa
tobramycin.
1.3. Tổng quan về phơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng
cao (HPLC)
1.3.1. Nguyên tắc
Phơng pháp HPLC là 1 phơng pháp phân tích hóa lý, dùng để tách và
định lợng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất
với 2 pha luôn tiếp xúc nhng không hòa lẫn vào nhau: Pha tĩnh (trong cột hiệu
năng cao) và pha động (dung môi rửa giải). Khi dung dịch của hỗn hợp các chất
cần phân tích đa vào cột, chúng sẽ đợc hấp phụ hoặc phân bố vào pha tĩnh tùy
thuộc vào bản chất của cột và của chất cần phân tích. Khi ta bơm dung môi pha
động vào cột thì tùy thuộc vào ái lực của các chÊt víi hai pha, chóng sÏ di
chun qua cét víi vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách.
Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ đợc phát hiện bởi bộ phận phát hiện gọi là
detector và đợc chuyển qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng đợc hiển thị
trên màn hình hoặc đa ra máy in [8].
1.3.2. Cơ sở lý thuyết
Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và
phân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau. Khi pha ®éng di chun víi mét
tèc ®é nhÊt ®Þnh qua cét sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lu gi÷ ra khái cét.

12


Website: Email : Tel : 0918.775.368

Tïy theo b¶n chất pha tĩnh, chất tan và pha động mà quá trình rửa giải tách đợc
các chất khi ra khỏi cột sắc ký. Nếu ghi quá trình tách sắc ký, chúng ta có sắc

đồ [8], [11].
1.3.3. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC
Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm viÖc theo kü thuËt HPLC bao gåm
6 bé phËn chÝnh sau:
1.3.3.1. Hệ thống bơm
Để bơm pha động vào cột tách. Bơm này phải điều chỉnh đợc áp suất (0 400 bar)
1.3.3.2. Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi
Bình chứa dung môi thờng bằng thủy tinh hoặc thép không gỉ. Dung môi
chạy sắc ký đợc lọc qua màng lọc (thờng màng lọc cỡ lỗ 0,45 àm ) và đuổi khí
hòa tan.
1.3.3.3. Hệ tiêm mẫu
Để đa mẫu phân tích vào cột.
Có nhiều phơng pháp tiêm mẫu khác nhau, đơn giản nhất là sử dụng một
van tiêm. Trong các hệ thống sắc ký hiện đại là hệ tiêm mẫu tự động.
Mẫu thử (dạng lỏng hay dạng rắn) đều phải hoà tan trong dung môi thích hợp
rồi lọc qua màng lọc 0,45àm trớc khi tiêm.
1.3.3.4. Cột sắc ký lỏng HPLC
Cột đợc chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hóa chất, chịu đợc với áp suất
cao đến vài trăm bar.
- Chiều dài cột: 10, 15, hoặc 25 cm; thích hợp với các tiểu phân pha tĩnh có đờng kính rất nhỏ (3, 5, 10 àm).
- Đờng kính cột: 4 hoặc 4,6 mm.
Nói chung, cột HPLC có tuổi thọ khá dài nếu ta sử dụng đúng cách. Nếu
sử dụng không đúng cách tuổi thọ của cột sẽ giảm. Ví dụ dung môi có tính chất
acid mạnh hoặc base mạnh hoặc tiêm liên tiếp các mẫu sinh học hay nguyên
liệu bẩn thì tuổi thọ của cột sẽ bị giảm.

13


Website: Email : Tel : 0918.775.368

1.3.3.5. Detector trong HPLC
Là bộ phận phát hiện chất phân tích, tùy theo bản chất của chất cần phân
tích mà sử dụng detector thích hợp. Detector hay sử dụng là detector hấp thụ
UV - VIS.
Nguyên lý hoạt động của detector UV - VIS dựa trên nguyên lý hoạt
động của phơng pháp đo quang phổ hấp thụ. Ngoài ra còn có detector khúc xạ,
huỳnh quang, điện hóa.
1.3.3.6. Thiết bị hiển thị kết quả
Có nhiều loại, nhng đơn giản và phổ biến nhất là máy tự ghi các tín hiệu
dới dạng pic [8], [14].
Sơ đồ khối hệ thống HPLC đợc tổng quát ở hình 1.1
Van tiêm
mẫu

Binh
chứa
pha
động

Cột

Detector

Bơm

Bộ phận tự ghi

Hình 1.1: Sơ đồ khối tổng quát hệ thống HPLC
1.3.4. Các thông số đặc trng của quá trình sắc ký

14


Website: Email : Tel : 0918.775.368

t R2
t R1

to
W 0.5-1

t' R1

W 0.5-2

W b1

W b2

t' R2

Hình 1.2: Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trng
Kết quả của quá trình tách các chất đợc detector phát hiện, phóng đại và
ghi thành sắc ký đồ với các thông sè:
* tR (Thêi gian lu): thêi gian kÓ tõ khi chất phân tích đợc bơm vào cột cho đến
khi đợc phát hiện ở nồng độ cựu đại của nó.
* t0 (Thời gian chết): thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống sắc ký.
* tR (Thời gian lu thùc): tR’ = tR - t0
* W0.5 : §é réng cđa pic ë nưa chiỊu cao.

* Wb : §é réng ở đáy pic.
Thời gian lu là thông tin về mặt định tính của sắc đồ, nó là một hằng số
đối với một chất nhất định khi tiến hành sắc ký trong điều kiện không đổi.
1.3.4.1. Hệ số dung lợng k

k' =

t'
t

R

=

t R t0

0

t

0

=

t
t

[8],[14]

R

0

1

Nếu k' nhỏ thì
tR cũng nhỏ và sự

tách kém. Trong thực tế k' nằm trong khoảng 2 - 5 là tốt nhất. Hai chất chỉ đợc
tách ra khỏi nhau nếu chúng có giá trị khác nhau. Trong phân tích thờng chọn
cột, pha động và các điều kiện phân tích sao cho: 1 < k' < 8
1.3.4.2. Độ chän läc α (selectivity - factor)

15


Website: Email : Tel : 0918.775.368

k' = t
α=
k' t

− t0

2

R2

1

−

R1 t 0

(k2' > k1' )

[8], [14]

α kh¸c 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng, tối u từ 1,5 đến 2.
1.3.4.3. Độ phân giải (resolution)
Đặc trng cho mức độ tách hai chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc
ký. Độ phân giải của 2 pic ở cạnh nhau đợc tính theo công thức:
R=

(

2 t R ,B − t R ,A

w +w
B

A

) = 1,18( t − t ) =
R ,B

w

1/ 2B

R ,A

+ w1 / 2 A

N  α − 1   k'B 




4  α 1+ k'B


[8], [14]

Độ phân giải cơ bản đạt đợc khi R = 1,5
1.3.4.4. Hệ số bất đối AF
Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, nó đợc tính theo công thức:

AF =

w

1 / 20

2a

[8], [14]

Trong đó:
W1/20: là chiều rộng của pic đợc đo ở 1/20 chiều cao của pic
a: khoảng cách từ đờng vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đờng
cong phía trớc tại vị trí 1/20 chiều cao của pic.

Trong phép định lợng, yêu cầu: 0,9 AF 2 [1], [18], [22].
1.3.4.5. Số đĩa lý thuyết N
Đặc trng cho hiệu lực cột.
N = 16

 tR 
 
 wB

2

hay N=5,54

 tR 


 w 1 / 2B 

2

[8], [12], [22]

NÕu gäi L lµ chiỊu cao cột sắc ký, thì chiều cao của đĩa lý thuyết H đợc
tính bằng công thức:

H=

L
N

16


Website: Email : Tel : 0918.775.368

1.3.5. C¬ së lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký
1.3.5.1. Lùa chän cét (pha tÜnh) [12], [18]
Pha tÜnh trong HPLC là chất nhồi cột có nhiệm vụ tách một hỗn hợp có
nhiều thành phần. Nó là một chất rắn xốp có kích thớc hạt rất nhỏ, đờng kính cỡ
hạt từ 3 - 10 àm, diện tích bề mặt riêng từ 50 - 500 m2/g.
Yêu cầu pha tĩnh trong HPLC:
ã Phải trơ và bền vững trong môi trờng HPLC.
ã Có khả năng tách một hỗn hợp chất tan nhất định.
ã Tính chất bề mặt ổn định.
ã Cân bằng động học của sự tách diễn ra nhanh và lặp lại tốt.
ã Cỡ hạt phải đồng nhất.
Pha tĩnh thờng đợc chế tạo trên nền silica (SiO2), nền oxyd nhôm
(Al2O3), nền hợp chất cao phân tử (cellulose) hay trên nền mạch carbon. Trong
sắc ký hÊp phơ, pha tÜnh trªn nỊn silica cã nhiỊu u điểm và sử dụng nhiều nhất.
Có thể phân loại chất nhåi cét theo gèc siloxan:
|
0

CH3

|

|

 Si  0  Si R

|

|

0

CH3

|

* R là nhóm phân cực (a nớc): nhóm hydroxyl (-0H) hoặc các alkylamin
(-CH2NH2), alkylnitril (-CH2CN). Loại này sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký
pha thuận để phân tích các chất ít hoặc không phân cực.
* R là các nhóm ít phân cực: các nhóm octyl, octadecyl, phenyl đợc chế
bằng cách alkyl hóa các nhóm OH trên bề mặt silica trung tính bằng các gốc
alkyl - R của mạch carbon (C2, C8, C18) hay các gốc carbon vòng (phenyl). Do

17


Website: Email : Tel : 0918.775.368

c¸c nhãm OH thân nớc đợc thay bằng các gốc R kỵ nớc nên bề mặt trở nên ít
phân cực. Silica đà alkyl hóa đợc sử dụng trong sắc ký pha đảo để phân tích các
chất phân cực, ít phân cực hay sắc ký cặp ion.
1.3.5.2. Lựa chọn pha động cho HPLC [12], [18]
Pha động là dung môi để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký, là yếu
tố thứ hai quyết định hiệu suất tách của một hỗn hợp. Pha động có thể là nớc,
dung môi hữu cơ hay hỗn hợp dung môi theo tỷ lệ nhất định.
Pha động trong HPLC ảnh hởng tới rất nhiều thông số của quá trình sắc

ký nh độ chọn lọc , thời gian lu tR, hiệu lực tách của cột, độ phân giải RS , độ
rộng của pic sắc ký ... Chính vì vậy việc lựa chọn pha động thích hợp là rất quan
trọng.
Yêu cầu của pha động:
ã Phải trơ với pha tĩnh.
ã Hòa tan đợc chất cần phân tích.
ã Bền vững theo thời gian.
ã Có độ tinh khiết cao.
ã Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.
ã Phù hợp với detector.
ã Có tính kinh tế và đảm bảo môi trờng.
Trong sắc ký pha thuận, pha động thờng là các dung môi hữu cơ ít phân
cực (kỵ nớc) nh: n-hexan, n-heptan, benzen, cloroform... Các pha động này thờng đợc bÃo hoà.
Trong sắc ký pha đảo, pha động là hệ dung môi hữu cơ phân cực nh: nớc,
methanol, acetonitril... hay hỗn hợp của chúng. Các dung môi này có thể hòa
tan thêm một lợng nhỏ acid hay base hữu cơ.
Bốn yếu tố chính cần chú ý khi lựa chọn pha động:
ã Bản chất của dung môi để chạy pha động.
ã Thành phần của các chất trong pha động.
ã pH của pha động.
ã Tốc độ dòng của pha động.

18


Website: Email : Tel : 0918.775.368

1.3.5.3. Chän ®Ưm pH
Trong sắc ký tạo cặp ion, sắc ký trao đổi ion, sắc ký hấp phụ mà chất tan
có tính acid hay base thờng phải thêm đệm vào pha động để ổn định pH cho quá

trình sắc ký.
Giá trị pH thích hợp sẽ làm tăng hiệu lực tách của sắc ký [12], [18].
1.3.5.4. Tốc độ dòng
Sau khi có pha tĩnh, pha động, pH thích hợp thì một yếu tố cần lựa chọn
để quá trình tách tốt hơn là tốc độ dòng [12], [18].
1.3.6. Cách đánh giá pic
* Đánh giá diện tích pic: DiƯn tÝch cđa mét chÊt t¬ng øng víi tỉng lợng
chất đó. Để tính diện tích pic, hiện nay ngời ta thờng dùng máy tích phân điện
tử gắn với máy vi tính (sai số khoảng 0,5 %) hoặc máy phân tích cơ học (sai số
1,3 %). Phơng pháp này có thể dùng cho các pic không bị trôi đờng nền và cả
pic có đờng nền bị trôi. Phơng pháp này chỉ cần điểm đầu điểm cuối của pic đợc
nhận ra chính xác và cho và cho kết quả tốt với nồng độ vừa, trung bình và cao.
* Đánh giá chiều cao pic: Khi pic có dạng không đổi thì chiều cao pic
(khoảng cách giữa đờng nền và đỉnh pic) là một đại lợng tỷ lệ với diện tích pic
và nó cũng có thể dùng để đánh giá phổ. Phơng pháp chỉ áp dụng khi các chỉ số
k' là hằng định.
1.3.7. ứng dụng của HPLC
Sắc ký nói chung và HPLC nói riêng có ba ứng dụng chính:
1.3.7.1. Định tính và thử độ tinh khiết:
Thời gian lu của chất thử trên sắc đồ phải tơng ứng với thời gian lu của
chất chuẩn đối chiếu trên sắc ký đồ.
1.3.7.2. Sắc ký điều chế:
Qua qúa trình sắc ký các chất đợc tách ra và dịch rửa giải đợc hứng riêng
rồi cho bốc hơi dung môi thu lấy chất.
1.3.7.1. Định lợng:

19


Website: Email : Tel : 0918.775.368

S¾c ký láng hiệu năng cao có ứng rất lớn trong định lợng chất trong hỗn
hợp và xác định giới hạn tạp chất.
Các phơng pháp định lợng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ
của một chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó. Một số phơng pháp
định lợng hay áp dụng trong HPLC:


Phơng pháp chuẩn ngoại (external standard method)
Đây là phơng pháp định lợng cơ bản trong đó cả hai mẫu chuẩn và
mẫu thử đều đợc tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Sau đó đem so
sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic thu đợc tõ mÉu thư víi pic cđa mÉu
chn ®· biÕt nång độ.



Phơng pháp chuẩn nội (internal standard method)
Là phơng pháp cho thêm những lợng giống nhau của chất chuẩn thứ hai
có thời gian lu và đáp ứng gần giống mẫu thử vào cả mẫu chuẩn và
mẫu thử rồi tiến hành sắc ký. Chất chuẩn thứ hai gọi là chất chuẩn nội.



Phơng pháp chuẩn hóa diện tích pic (area normalisation)
+ Nguyên tắc: Hàm lợng phần trăm của một chất trong hỗn hợp
nhiều thành phần đợc tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tÝch pic cđa nã so
víi tỉng diƯn tÝch cđa tÊt cả các pic thành phần trên sắc đồ.
Phơng pháp này yêu cầu tất cả các thành phần đều đợc rửa giải và
đợc phát hiện, và tất cả các thành phần ®Ịu cã ®¸p øng detector nh nhau.
+ Áp dơng: Ýt dùng để định lợng, chỉ dùng trong xác định hàm lợng tạp chất khi coi đáp ứng của các chất lµ nh nhau. [12], [18].

20


Website: Email : Tel : 0918.775.368

PhÇn 2: thùc nghiệm và kết quả
2.1. Nguyên vật liệu và phơng pháp thực nghiệm
2.1.1. nguyên vật liệu :
2.1.1.1. nguyên liệu và hoá chất:
- Nguyên liệu: Tobramycin của công ty CPDP Hà Tây.
- Chất đối chiếu: Tobramycin của viện kiểm nghiệm trung ơng, hàm lợng
94,96%.
- KH2PO4 (PA)
- H3PO4 (PA)
- Methanol dùng cho HPLC (Meck)
- Nớc cất tinh khiết 2 lần
- Một vài hoá chất khác
2.1.1.2. Dụng cụ:
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao: DIONEX - detector UV Diode array PDA 100
- M¸y quang phổ UV- VIS Lambda EZ210
- Máy siêu âm SONOREX
- Cân phân tích Mettler AB 204 có độ chính xác 0,1mg
- Máy lọc chân không Satorius
- Bình định mức các loại
- Cốc có mỏ
- Pipet chính xác, pipet thờng
- Lọ đựng mẫu, màng lọc 0,45 àm
2.1.2. Nội dung và phơng pháp nghiên cứu
2.1.2.1. Phơng pháp nghiên cứu

- Tham khảo các phơng pháp định lợng tobramycin đà công bố.

21


Website: Email : Tel : 0918.775.368

- Tham kh¶o các phơng pháp định lợng tobramycin bằng HPLC.
- Dựa vào cấu tạo phân tử, tính chất hoá lý của tobramycin cịng nh ®iỊu
kiƯn thùc nghiƯm cđa níc ta hiƯn nay để xây dựng quy trình kỹ thuật
định lợng tobramycin bằng HPLC.
2.1.2.2. Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu các điều kiện tiến hành để xây dựng phơng pháp: Chọn
cột, pha động, bớc sóng phát hiện và tốc độ dòng, thể tích tiêm thích hợp
để định lợng.
Xây dựng, đánh giá phơng pháp định lợng tobramycin nguyên liệu.
- Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký
- Đánh giá sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ tobramycin và diện
tích pic trên sắc ký đồ
- Đánh giá tính chính xác của phơng pháp
- Đánh giá tính đúng của phơng pháp
- Đánh giá tính đặc hiệu của phơng pháp
Một số công thức tính toán trong xử lý thống kê kết quả
x=

- Giá trị trung bình:

1 n

n i =1 x i

(x x)
n

S=

- Độ lệch chuẩn:

- Sai số chuẩn:

s

x

=

n 1
x

=

(2.2)

S
ì100
x

(2.3)

S

n

(2.4)

( %) =

- Sai số tơng đối:
- Khoảng tin cậy

x

22

2

i

i =1

s

- Độ lệch chuẩn tơng đối (RSD):

(2.1)

t

( n 1)

tSx

ì sx × 100
x

(2.5)
(2.6)


Website: Email : Tel : 0918.775.368

2.2. thùc nghiÖm và kết quả
2.2.1. Xây dựng quy trình kỹ thuật để định lợng tobramycin bằng phơng
pháp HPLC
2.2.1.1. Nguyên tắc lựa chọn điều kiện sắc ký
Chọn phơng pháp sắc ký: Tobramycin sulfat là chất hữu cơ phân cực, tan
nhiều trong nớc. Vì vậy, để phân tích và định lợng tốt, chúng tôi chọn phơng
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo.
Chọn cột sắc ký: Trong phơng pháp định lợng HPLC pha đảo, cột sắc ký
thông dụng là Nucleosil C8, C18, ... Với điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm
chúng tôi sư dơng cét Nucleosil C18 (250 x 4 mm, 5 àm).
Chọn pha động: Trong phơng pháp HPLC pha đảo, pha động thông dụng
nhất là acetonitril, methanol, nớc hay hỗn hợp cđa methanol, acetonitril víi níc.
Do tobramycin sulfat tan nhiỊu trong nớc, để rút ngắn thời gian lu thích hợp của
chất cần phân tích, pha động cần phải có nớc, để chuyển tobramycin sang hết
dạng ion cần sử dụng đệm pH acid.
Chọn

bớc

sóng:

cấu

trúc

tobramycin

có

5

nhóm

amin

(-NH2), tuy nhiên khả năng hấp thụ UV của tobramycin không cao vì vậy bớc
sóng nghiên cứu dự kiến là bớc sóng thấp.
2.2.1.2. Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc kí:
a. Khảo sát chọn bớc sóng thích hợp
Để xác định bớc sóng thích hợp phát hiện ra tobramycin, chúng tôi tiến
hành quét phổ UV dung dịch tobramycin 0,2 mg/ml trên máy quang phổ UVVIS Lambda EZ210.
Tiến hành: Cân chính xác khoảng 20 mg tobramycin nguyên liệu cho vào
bình định mức 100,0 ml, thêm nớc vừa đủ đến vạch lắc đều.
Quét phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch này. Kết quả ghi ở hình 1.

23


Website: Email : Tel : 0918.775.368

Tobra 0,02%

A
b
s

0
.
5

0
.
0
200

250

300

nm

H×nh 1: Phỉ hÊp thơ cđa dung dÞch tobramycin 0,02%
NhËn xÐt:
Tõ phỉ hấp thụ của dung dịch tobramycin chúng tôi thấy: Cực đại hấp
thụ của dung dịch chất này khoảng 194 nm. Để giảm ảnh hởng của dung môi và
tạp chất nhng vẫn đảm bảo định lợng đợc tobramycin chúng tôi chọn bớc sóng
đo là 195 nm.
b. Lựa chọn cột:
Sử dụng cột Nucleosil C18 (250x4 mm), cỡ hạt 5 àm sẵn có ở bộ môn
Hoá dợc, trờng đại học Dợc Hà Nội.

c. Lựa chọn đệm:
Chúng tôi tiến hành khảo sát pha động là dung dịch đệm phosphat 0,01M ở
các pH khác nhau, kết quả cho thấy:
Với pH=3,5 thì hệ số bất đối của pic tobramycin là 2,95
Với pH=3,0 thì hệ số bất đối của pic tobramycin là 1,53
Với pH=2,5 thì hệ số bất đối của pic tobramycin là 1,49
Nhận xét:
Khi pH giảm, hệ số bất đối giảm, pic tobramycin tách tốt cân xứng hơn.
Tuy nhiên, dễ thấy là hệ số bất đối của pic tobramycin tại pH 3,0 và pH 2,5

24


Website: Email : Tel : 0918.775.368

khác biệt không đáng kể. Trong khi đó, nếu sử dụng tại pH 2,5 sẽ làm giảm tuổi
thọ của cột do đó chúng tôi đà lựa chọn đệm phosphat 0,01 M, pH 3,0 để khảo
sát tiếp.
d. Lựa chọn pha động:
Để chọn đợc hệ pha động phù hợp chúng tôi đà tiến hành khảo sát trong
cùng điều kiện sắc kí: Tốc độ dòng 1,0 ml/phút, nồng độ chất chuẩn tobramycin
là 3,0 mg/ml, thể tích tiêm 20àl trên các hệ pha động với thành phần gồm
acetonitril và đệm phosphat pH 3,0 với các tỉ lệ khác nhau. Theo dõi sự thay đổi
hệ số bất đối của các pic tobramycin, kết quả thu đợc ghi ở bảng 1:
Bảng 1: Giá trị hệ số bất đối của các pic tobramycin khi khảo sát lựa chọn
pha động
Acetonitril
20
10
5

0

Đệm pH 3,0
80
90
95
100

Hệ số bất đối
2,43
2,02
1,75
1,52

Nhận xét:
Với pha động là 100% đệm phosphat 0,01 M pH 3,0 cho pic gọn, khá cân
xứng, hệ số bất đối thấp nhất.
Kết luận:
Pha động đợc chọn để nghiên cứu định lợng tobramycin là 100% đệm
phosphat 0,01 M pH 3,0.
e. Lựa chọn tốc độ dòng
Tiến hành sắc kí với điều kiện đà chọn trên nhng với tốc ®é dßng thay
®ỉi 1,0 ml/phót; 0,8 ml/phót: 0,6 ml/phót. KÕt quả nh sau:
Với tốc độ dòng 0,6 ml/phút thời gian lu của tobramycin là 2,95 phút
Với tốc độ dòng 0,8 ml/phút thời gian lu của tobramycin là 2,32 phút
Với tốc độ dòng 1,0 ml/phút thời gian lu cđa tobramycin lµ 1,86 phót

25

Website: Email : Tel : 0918.775.368

NhËn xÐt:
Víi tèc độ dòng 1,0 ml/phút thời gian lu quá ngắn nên chất cần tách bị
rửa giải ở thời gian gần với thời gian chết, tách không tốt.
Với tốc độ dòng 0,8 ml/phút pic của tobramycin và pic tạp bị chồng phủ
nhau một phần, hiệu lực tách kém.
Với tốc độ dòng 0,6 ml/phút kết quả tách tốt, pic cân đối, thời gian phân
tích tR= 2,95 phút là thời gian chạy sắc ký phù hợp.
Kết luận: Chọn tốc độ dòng là 0,6 ml/phút để nghiên cứu định lợng
tobramycin.
đ. Điều kiện sắc ký lựa chọn
Từ các kết quả khảo sát, chúng tôi đà xây dựng một quy trình sắc kí có
khả năng phân tích tèt tobramycin trong nguyªn liƯu nh sau:
-

Cét Nucleosil C18 (250x4,6 mm, 5àm).

-

Pha động: Đệm phosphat 0,01M pH 3

-

Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút.

-

Thể tích tiêm: 30 àl.

-

Detector UV: Bớc sóng đo 195 nm.

-

Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng.

2.2.2. Qui trình định lợng
2.2.2.1. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống
Cân chính xác khoảng 30,0 mg tobramycin đối chiếu cho vào bình định
mức 10,0ml. Hoà tan và pha loÃng bằng nớc vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua
màng lọc 0,45 àm, dùng dịch lọc tiêm sắc ký.
Tiêm 5 lần mẫu đối chiếu vào hệ thống HPLC, tiến hành sắc ký theo điều
kiện đà chọn ở trên. Ghi kết quả: thời gian lu, diện tích và hệ số bất đối của pic
tobramycin.
Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký đợc trình bày nh
bảng 2.

26


Website: Email : Tel : 0918.775.368

B¶ng 2: KÕt quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống
STT
1
2
3
4

5
RSD(%)
Nhận xét:

Thời gian lu (phót)
2,94
2,95
2,96
2,96
2,96
0,30

Pic cđa tobramycin
DiƯn tÝch pic (mAU)
12,2985
12,3001
12,2805
12,2230
12,1916
0,40

HƯ sè bÊt đối (AF)
1,52
1,53
1,51
1,52
1,52

Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống HPLC cho thấy:
Độ lệch chuẩn tơng đối (RSD %) của thời gian lu và diện tích pic

trong các phép thử là 0,30 và 0,40 đều nhỏ hơn 2%.
Các giá trị của hệ số bất đối giao động từ 1,51 đến 1,53
Kết luận:
Hệ thống HPLC mà chúng tôi sử dụng là thích hợp để định lợng
tobramycin trong nguyên liệu.
2.2.2.2. Xây dựng phơng pháp định lợng
a. Dung dịch thử
Cân chính xác khoảng 30,0 mg tobramycin nguyên liệu cho vào bình
định mức 10,0 ml. Hoà tan và pha loÃng bằng nớc vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc
qua màng lọc 0,45 àm
b. Dung dịch chuẩn (đối chiếu)
Cân chính xác khoảng 30,0 mg tobramycin đối chiếu, cho vào bình định
mức 10,0 ml. Hoà tan và pha loÃng bằng nớc vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua
màng lọc 0,45 àm.
c. Mẫu trắng:
Nớc cất 2 lần, lọc qua màng lọc 0,45 àm, siêu âm đuổi khí 15 phút
d. Pha động:
Dung dịch đệm phosphat 0,01 M, pH 3,0.

27