TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM – SỐ 6 (39) 2014 67
KHẢO SÁT IN SILICO, XÂY DỰNG CƠ SỞ KHOA HỌC CHO VIỆC
PHÁT HIỆN KẾT HỢP YẾU TỐ NHIỄM VÀ BẤT ỔN DI TRUYỀN
TRONG UNG THƯ VÒM HỌNG
Ngày nhận bài: 17/06/2014 Nguyễn Văn Trường, Nguyễn Thị Thúy Tài,
Ngày nhận lại: 05/07/2014 Nguyễn Thị Thanh Nhàn, Nguyễn Thị Thu Ngân,
Ngày duyệt đăng: 09/09/2014 Lý Thị Tuyết Ngọc
1
Lao Đức Thuận
2
Lê Huyền Ái Thúy
3
TÓM TẮT
Ung thư vòm họng là một dạng ung thư phổ biến ở Việt Nam với tỷ lệ tử vong khá cao lên
đến 3,3% dân số vào năm 2012. Do vậy, việc chẩn đoán và phát hiện sớm ung thư vòm họng là
một vấn đề cấp thiết nhằm nâng cao khả năng sống sót của bệnh nhân. Các nghiên cứu gần đây
khẳng định rằng sự xâm nhiễm của Epstein-Barr virus (EBV) và sự methyl hóa bất thường trên
gen DAPK là những nguyên nhân dẫn đến sự tăng sinh và phát triển khối u ở vòm họng. Với mục
đích hướng tới việc phát triển một kỹ thuật chẩn đoán dựa trên việc kiểm tra sự hiện diện của
gen EBNA-1 – một gen cần thiết cho sự xâm nhiễm và nhân lên của EBV – và sự methyl hóa bất
thường trên gen DAPK như các dấu chứng sinh học trong tiên lượng và chẩn đoán sớm ung thư
vòm họng, chúng tôi tiến hành nghiên cứu bước đầu gồm (1) Khai thác dữ liệu, thống kê tần số
methyl hóa trung bình có trọng số gen DAPK dựa trên các nghiên cứu trên thế giới; (2) Xác định
phương thức thực nghiệm nhằm tiên lượng và chẩn đoán sớm bệnh ung thư vòm họng và khảo
sát các bước in silico cần thiết.
Từ khóa: ung thư vòm họng, EBV, EBNA-1, DAPK, methyl hóa.
ABSTRACT
Nasopharyngeal carcinoma is the common cancer in Vietnam counting for 3,3% in 2012.
Therefore, there are necessary to prognosis and early diagnosis nasopharyngeal carcinoma in
order to improve the survival of patients. Current studies affirmed that the infection of EBV
(Epstein-Barr virus) and the aberrant methylation in DAPK gene were the reasons leading to the
carcinogenesis of nasopharynx. For the aims to establish the method based on the present of
EBNA-1 which was necessary to the infection and replication of EBV and the hypermethylation
in DAPK as the biomarker for prognosis and early diagnosis nasopharyngeal carcinoma, in this
study, we carried out (1) Data mining and statistically calculated the mean of methylation
frequencies of DAPK based on the studies worldwide; (2) Determination of the mode of
experiment for prognosis and early diagnosis the nasopharyngeal carcinoma.
Keywords: nasopharyngeal carcinoma, EBV, EBNA-1, DAPK, methylation.
1
Trường Đại học Mở TP.HCM.
2
ThS, Trường Đại học Mở TP.HCM.
3
PGS.TS, Trường Đại học Mở TP.HCM. Email:
68 CÔNG NGHỆ
ng là lo
bi u trong các b
Vit Nam. S liu cy t l
mc b ng và t vong ln
n 3,9% và 3,3% dân s
[17]
c ch m
b ng s ha hn cho s
phc hi và nâng cao kh ng sót ca
bnh nhân
[13]
ng
t khi u có giá tr cao trong chn
m xâm ln
gây t bnh nhân và ch c
áp dn không còn sm ca
bnh (kh
[13]
. Son
các nhà nghiên cu trên th git sc
n l tìm kim mt biomarker nhm tiên
ng và chm bnh.
Các công b g u kh nh
nguyên nhân dng là h
qu ca s ri lon v mt di truyn và mt
trong nhng kiu ri lon di truyn c
chng minh xy ra rt sm trong tin trình dn
n ung là s methyl hóa t mc xy ra
các gen c ch khi u hay các gen tham gia
vào quá trình u hòa chu trình t bào bng s
gn nhóm methyl (-CH
3
) vào C
5
ca Cytosine
thông qua liên kt cng hóa tr
[1][5][9][20]
. S
methyl hóa xy ra ti các o CpG ca các gen
c ch khi u, các gen u hòa chu trình t
bào dn n s mt chc ca các gen
này, thúc y s ng và phát sinh khi
u
[9]
. Gen DAPK (Death Associated Protein
Kinase) thuc nhóm gen u hòa chu trình t
bào, nm v trí 9q21.33, mã hóa cho protein
DAPK có chc trong vic u khin t
bào cht theo trình
[15]
. S methyl hóa
trên gen DAPK c khng nh là có liên
quan n mt s loi ung vi các tn s
methyl hóa khác nhau ln t ung
phi vi 34%
[12]
, ung gan vi 52%
[18]
, u
tuyn yên vi 34%
[2]
, ung vú vi 17%
[2]
i vi ung vòm hng, tn s methyl hóa
gen này là rt cao; c th trong công b ca
Kong et al (2006), tn s này chim 76,1%
[15]
.
Mt nghiên cu khác ca Zhang et al (2002)
cho thy s methyl hóa t mc gen
DAPK trên ung vòm hng chim t l rt
cao, t 70-80%
[20]
. Bên cnh nghiên cu
ca Wong et al (2002) cho thy s methyl
hóa t mc trên promoter ca gen DAPK
ung vòm hng là mt s kin din ra sm
trong quá trình sinh u vòm hng vi s
methyl hóa trên gen DAPK khi u cp
chim 75% và trên các dòng t bào ung
vòm hng chim 80%
[16]
.
Ngoài ra, mt nguyên nhân khác n
n bnh (ung
xâm nhim ca virus
Epstein Barr (EBV)
[3][10]
. EBV là mt loi
virus thuc h Herpesvirus. C gen
ca EBV là chu kích c
cho trên 85 gen
[10]
. Khi EBV
xâm nhp vào th i, s phát trin ca
EBV din tin theo ba ng (1) Xâm nhp
vào t bào biu mô và nhân lên; (2) Gây
nhim và xâm nhp vào t bào lympho B và
nhân lên; (3) Tim tàng và tin trin thành ung
th khi có u kin
[10][19]
. duy trì kh
tim tàng, EBV hi phi có s tr giúp ca
protein EBNA-1
c mã hóa trc tip t gen
EBNA-1
[14][19]
. Chi tit EBNA-1 th hin
vai trò bng vic duy trì EBV dng vòng
(episome EBV) trong t bào ch và thc hin
chc trong phiên mã thông qua vic
EBNA-1 bám vào oriP khi phát s nhân lên
ca DNA h gen EBV
[7][14]
. Gen EBNA-1 và
các sn phm ca nó c tìm thy trong hu
ht các khi u liên quan n EBV; s có mt
ca EBV c xác nh lên ti 98% khi u
[20]
.
Chính vì vy, có th khng nh rng: yu t
nhim EBV là nguyên phát ca bnh ung
vòm hng.
Nhm xây dng s khoa hc cho thc
nghim phát hin sm và tiên ng bnh ung
vòm hng, trong nghiên cu c u này,
chúng tôi tin hành (1) Khai thác d liu
c công b trên th gii liên quan n s
hin din ca EBNA-1 và s methyl hóa t
mc DAPK liên quan n ung vòm hng;
(2) Xác nh pháp chn sm
bnh da trên hai gen gen ENBA-1 (yu
t nhim) và DAPK (yu t th ch).
Khai thác thu trình
gen EBNA-1 và DAPK
TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM – SỐ 6 (39) 2014 69
Tn s
m methyl hóa trên gen DAPK c khai
d liu Pubmed và Pubmed
central, t n s trung bình có trng s
c tính toán. Các trình t gen EBNA-1 c
thu nhn t d liu NCBI
( bng các mã s truy
cp KC207814, KC207813, NC_009334,
DQ279927, KF373730, JQ009376,
ng thi trình t gen DAPK
c thu nhn bng mã s truy cp
NC_000009.12.
-
DAPK
Vic thit k mc thc hin bng các
công c tin sinh hc bao gc
tuyn BLAST (
IDT analyzer (www.idtdna.com/analyzer/
Applications/OligoAnalyzer/), Annhyb,
CLUSTALX, BatchPrimer 3
(
Chúng tôi b u bng vic tp trung
trên tính cht methyl hóa b ng có liên
ng. Qua quá trình
khai thác d liu t các nghiên cu trên th
gi mc methyl
hóa, chúng tôi nhn thy rng gen DAPK có t
l t bc. Bng sau là tng
hp t các công b n hình v t l methyl
c hin vi các ngun
mu s dng trên gen này.
B
Nghiên
cu
Phng pháp
Loi mu
Sôi mu
ung th/bình thng
T l methyl hóa
trên mu ung th
(%)
[3]
MSP
Mô sinh thit
49/-
67,3/-
Dch pht
49/20
55,1/0
[5]
MSP
Mô c paraffin
41/-
76,0/-
[6]
MSP
Mô sinh thit
30/-
76,7/-
Dch pht
30/-
63,4/-
[7]
MSP, Real-Time
PCR
Mô c paraffin,
Mô sinh thit
46/-
76,1/-
[13]
MSP
Mô c paraffin
53/-
79,2/-
[14]
MSP
Mô sinh thit
32/-
75,0/-
Ghi chú: - trong nghiên cứu không thử nghiệm trên nguồn mẫu bình thường
Da trên kt qu th hin Bng 1 cho
thy phn ln các công b u s dng mu
sinh thi duy nht hai
nghiên cu s dng dch ph kho sát. Kt
qu thng kê ghi nhn t l methyl hóa trên
gen DAPK u rt cao và có s ng t
a các công b
không ghi nh
u
trên th giu s
dng k thu phát hin tính cht
methyl hóa trên gen DAPKu k
thuc phát trin. Bên c
b ca tác gi Zhang và cng s
70 CÔNG NGHỆ
2012, các tác gi vn la chn MSP
[3]
. Chúng
ng nht vi la chn này bi MSP
nhy, d phát trin và nht l
phân bic allele methyl (dù hin din ít)
trong hn hp t bào bình
ng ca mu bnh phm. Nhm loi b s
khác bit giu và
các loi mu, chúng tôin s trung bình
có trng s áp dng cho các s ling
c. Kt qu cho thy tn s methyl có
trng s c th hin thông qua
Hình 1.
Hình 1. Tn s methyl hóa có trng s ca gen DAPK
trên t ng và t bào bìng
Ghi chú: Tâm ca các vòng tròn th hin tn s c báo cáo trong các công trình liên
ng thng nm ngang hin th tn s methyl hóa trung bình có trng s da trên các nghiên cu
mà chúng tôi phân tích.
c bit c
các công b v tính cht methyl hóa bt
ng ca gen DAPK, các tác gi
cn yu t nguyên phát, tc là nhim EBV
ca mu bnh phm.
DAPK
trên gen DAPK
Trình t gen DAPK c thu nhn t
ngân hàng gen vi mã s truy cp
NC_0ng thi, các vùng
nh
bng các công c h tr trc tuyn Sequence
view trên NCBI (D liu không trình bày).
Hình 2. V trí gen DAPK nm trên nhim sc th s 9
o CpG thuc vùng promoter ca
nh bng phn mm
o CpG có chiu dài 662 bp
(-n +370) kéo dài t vùng cui promoter
n cui exon 1 (Hình 3).
TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM – SỐ 6 (39) 2014 71
Hình 3. cu trúc gen DAPK
Bên c m tra bng phn mm
TF search, nhiu v trí phiên mã quan trng
Sp1, MZF, CP2, ANML1a, p300, C/EBP,
GATA,c nhn din no
CpG ca gen DAPK (Hình 4.). Các nhân t
phiên mã này hin din trong vùng promoter,
vì vy vi a chúng s
quy n ho ng phiên mã và biu
hin c chn vùng
methyl hóa ti các v
trí CpG có th gây c ch quá trình phiên mã
d n s im lng ca các gen thông qua
c thit
k ng methyl hóa ti v trí các
o CpG s phiên mã quan
tr i vi phn ng MSP, h thng mi
bao gm mi methyl và mi unmethy phân
bi c tình trng methyl hóa hay không
methyl hóa ca các v trí CpG trong vùng kho
m khác bit duy nht gia hai mi
methyl và unmethyl là nucleotide Cytosine
trong trình t mi methyl s c thay th
bng các Thymine trong trình t mi
unmethyl. Trình t các cp mc th hin
Bng 2.
Bng 2. Trình t m khui gen DAPK
Cp mi
Trình t m
(I)
DAPK-MF
GGATAGTCGGATCGAGTTAACGTC
DAPK-MR
CATAAACGCCAACGCCGAAAA
(II)
DAPK-UF
GGAGGATAGTTGGATTGAGTTAATGTT
DAPK-UR
CCATAAACACCAACACCAAAAA
Ghi chú: Các v m và gi; Các cp mc kí
hiu là Fmi xuôi. Rmc; Mmethyl; Uunmethyl
Cp m c tin
vt lý bao gm
chiu dài, phng t do hình
thành cu trúc th cp, bng công c trc
tuy c hiu
thông qua chc tuyn BLAST hay
METHBLAST trên NCBI (Bng 3).
72 CÔNG NGHỆ
B vt lý mi methyl và unmethyl gen DAPK
Tên mi
T
m
(
o
C)
L
%GC
(1)
(2)
(3)
Sn phm (bp)
DAPK-MF
56,5
24
50,0
- 0,41
- 7,53
- 8,26
172
DAPK-MR
56,9
21
47,6
- 0,51
- 3,61
DAPK-UF
54,8
27
37,0
0,15
- 4,85
- 8,31
176
DAPK-UR
52,1
22
36,4
-0,51
-1,47
ng t
-1
) hình thành (1) hairpin loop; (2) homodimer và (3)
heterodimer; T
m
: nhi nóng chy, L: chiu dài (bp), %GC: ph
Da trên kt qu phân tích các thông s
vt lý ca mi (Bng 3.), phn ln các thông
s vu phù hp vi các yêu cu lý thuyt
t ra
[11]
. Ch duy nht %GC ca cp mi
unmethyl thp nh là 50-60%,
c nghim sau này s
trong vic t ca phn
ng MSP. Ngoài ra, khi kic hiu
b
u th hic hiu cao (D liu không
trình bày). Mt khác, v s ng các CpG
trong mi, mi xuôi và mc thit
k bao ph ít nht ba v trí CpG, c th i vi
mi xuôi methyl và unmethyl cha 4 v trí
CpG và m c cha 3 v trí CpG. Cùng
vi tính cht h thng m c thit k
cha các v trí CpG trùng vi v trí ca các
nhân t phiên mã quan tr
c hi
giá tình trng methyl hóa t
hng (Hình 4).
Hình 4. V trí bt cp mi methyl và unmethyl,
các nhân t phiên mã quan trng trên gen DAPK
--
--UR).
TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM – SỐ 6 (39) 2014 73
vic thit k cp m
ng methyl hóa trên gen DAPK
c s dng trong các
nghiên cu thc nghim sau này.
cp trên, s có mt ca
c chng minh v
rt cao (trên 98%) các khi u vòm hng
[20]
.
M duy trì hình thc xâm nhim tim
tàng vi DNA dng vòng, gen EBNA-1 cn th
hin chc kho sát in silico
k tip, chúng tôi tp trung trên gen EBNA-1,
nhnh xem gen này có th làm trình t
xác nhn tính nhim và hình thc
xâm nhim tim tàng ca EBV.
gen EBNA-1
các mã s truy c
lit kê trong phn Vt li
da trên ngun gc công b có tính phân bit
v chng hay type nhim. Các trình t này
c tin hành sp gióng ct b
trình CLUSTALX (Hình 5).
Hình 5. Kt qu sp gióng ct các trình t gen EBNA-1
Kt qu sp gióng ct các trình t
EBNA-1 (Hình 5) cho thy t l bo tn ca
gen này khá cao (th hin thông qua du *
trong hình). Ngoài ra, các trình t bo tn ca
u ro
sát bng BLAST (d liu không trình bày). Do
kt lun rng, vùng bo tn thuc
gen EBNA-1 làm trình t
m phát hin EBV. Vic thit k mi
cho các phn ng RT-c tin hành và
kt qu c th hin trong Bng 4.
Bng 4. Trình t mi cho phn ng PCR khui mt phn gen EBNA-1
Cp mi
Trình t m
EBNA1_F
GCCGGTGTGTTCGTATATGG
EBNA1_R
AGGGGAGACGACTCAATGGT
Ghi chú: F mi xuôi; R mc
Các thông s vt lý ca cp mc kim tra b
IDT analyzer và th hin Bng 5.
Bng 5. Kt qu thông s vt lý ca cp mi EBNA1_F và EBNA1_R
Trình t mi -
L
%GC
Tm (
o
C)
(1)
(2)
(3)
Sn phm (bp)
EBNA1_F6
20
55,0
55,8
1,18
-9,75
-6,53
109
EBNA1_R6
20
55,0
57,9
-1,65
-3,61
ng t
-1
) hình thành (1) hairpin loop; (2) homodimer và (3)
heterodimer; T
m
: nhi nóng chy, L: chiu dài (bp), %GC: ph
74 CÔNG NGHỆ
Da trên kt qu phân tích, các thông s
v u phù hp vi yêu cu ca thit k
mi, ngoi tr ng t do hình thành
cu trúc homodimer là -9,75 < -9 Kcal.mole
-1
.
Tuy nhiên, khi tin hành kim tra bng phn
mm trc tuyn IDT, cu trúc t bt cp xy ra
ng t do này không
chênh lch quá nhiu so vi yêu cu (-9
Kcal.mole
-1
p mi này vc s
d kic hiu. Khi tin hành
kic hiu bc
tuyn BLAST, kt qu cho thy mi khuch
c gen EBNA-1 ca virus human hepes
(Mã s truy c
t 100% và giá tr E-value
gn bng 0 (Ident=100%, E-value=0,089).
y, v mt lý thuyt
k thành công cp mi khui gen EBNA-
1 tha mãn vi các yêu cu v thông s, tính
c hiu ca m
ng thc thc nghim
nh ng và ch s
vòm hng s dEBNA-
1 (yu t nhim) và DAPK (yu t th ch)
bng các phn ng kt hp RT-PCR và MSP.
T nhng kt qu nghiên cu,
chúng tôi ghi nhn tn s methyl hóa trung
bình có trng s ca gen DAPK t
72,02%. Cùng vi tính cht methyl hóa cao
này, s biu hin ca gen EBNA-1 c ghi
nhm bo tính nhim dng tim tàng,
DNA dng vòng c ch.
Kt hp c hai yu t nh
c thc nghim nhng và
chng s da trên
EBNA-1 (yu t nhim) và
DAPK (yu t th ch) bng các phn ng kt
hp RT-PCR và MSP vi các b m c
c thit k t trên lý
thuyt. Kt qu kho sát in silico
khoa h chúng tôi tin hành thc
nghim trong thi gian sm nht.
TÀI LIU THAM KHO
1.
hypermethylated tumor suppressor genes as tumor markers in mouth and throat rinsing
Int
J Cancer 105, p.851 855.
2.
of the death-associated protein kinase/p14/HDM2/p53/Apaf-1 apoptosis pathway in
J Clin Pathol, 60 p.664-669.
3. Eugene AC., Julie MW., David ET., Stacey LI
Role of the Epstein-Medscape J Med., 10(7), p.165.
4. Kong WJ., Zhang S., Guo CK., Wang YJ., Chen X., Zhang SL., Zhang D., Liu Z., Kong
W tion-associated silencing of the death-associated protein
Anticancer Drugs 17(3), p.251-259.
5. Kwong J., Lo KW., To KF., Teo PM.
Clin Cancer Res, 8,
p.131-137.
6. Leah CP., Marcie JG., Leah AD., Daniel EJ., Kieu D., Carmen ST., Steven AB. (2009).
death-associated protein kinase gene leads to differentially
Carcinogenesis, 30(12), p. 20232030.
7. Leight ER., Sugden B. -1: a protein pivotal to latent infection by Epstein-
Rev Med Virol, 10, p.83-100.
TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM – SỐ 6 (39) 2014 75
8.
World J
Gastroenterol., 17(44), p.4917-4921.
9. Springer, ISBN-10 1-
4020-3641-8.
10. Matthew PT., Razelle K. -Clin Cancer Res, 10,
p.803-821.
11. © Humana Press, 132,
p.365-386.
12. Niklinska W., Naumnik W., Sulewska A., Kozlowski M., Pankiewicz., Milewski R.
Non-Folia histochem cytobiol., 47, p.275-280.
13. Saeid G., Ali MA-Invasive Detection of Esophageal Cancer using Genetic
Changes in Circulating Cell-Avicenna J Med Biotechnol., 4(1), p.3-13.
14. Sivachandran N., Wang X., Frappier L s of the Epstein-Barr virus
J Virol., 86(11), p.6146-6158.
15. Susanna HH., Sagung RI., Luh PLI., Ahma H., Sylvia D., Sofia MH., Renske DMS.,
Molecular Cancer, 10, p.48.
16. Wong TS, Chang HW, Tang KC, Wei WI, Kwong DL, Sham JS, Yuen AP, Kwong YL.
ethylation of the death-associated protein-
kinase gene in nasopharyngeal carcinoma and its detection in the peripheral blood of
Clin Cancer Res., 8(2), p.433-437.
17. World Health Oragnization (2012). Estimated cancer incidence, Mortality and prevalence
International agency for research on cancer.
18. Wu LM., Zhang F., Zhou L., Yang Z., Xie HY., Zheng SS. (2010).
CpG island methylator phenotype for tumor recurrence in hepatitis B virus-associated
BMC Cancer, 10, p.1471-2407.
19. Young LS., Dawson CW., Clark D., Rupani H., Busson P., Tursz T., Johnson A.,
Rickinson AB-Barr virus gene ex
J Gen Virol., 69(5), p.1051-1065.
20. Zhang Z., Sun D., Hutajulu SH., Nawaz I., Nguyen Van D., Huang G., Haryana SM.,
Middeldorp JM., Ernberg I., Hu LF -Invasive Method,
Multiplex Methylation Specific PCR (MMSP), for Early Diagnosis of Nasopharyngeal
PLoS ONE, 7(11), p.1-6.