Xác định sự đa dạng di truyền vùng D-loop trong ty thể (mtADN) của 4 giống gà nội

BÁO CÁO KHOA HỌC





Tên ñề tài
: Xác ñịnh sự ña dạng di truyền vùng D-loop
trong ty thể (mtADN) của 4 giống gà nội






Lê Thị Thúy
1
, Nguyễn Đăng Tôn
2
, Địch Thị Kim Hương
2
,
Trần Thị Kim Anh
1
Vu Hai Chi
2
, Huynh Thi Thu Hue
2
,
Nong Van Hai
2

1. Viện Chăn nuôi
2. Viện Công nghệ sinh học






SUMMARY
The mtDNA control region is highly variable and can be used reliably to
estimate the extent of divergence between subspecies. In this study, we analyzed
the mitochondrial D-loop region of four native Vietnamese chicken breeds, named
as “Ri”, “Tre”, “Choi”, “Tau Vang”. The PCR product of about 1.3 kb of the D-
loop region of the chicken breeds was amplified with specific primers (H1255 and
L16725) and digested with three restriction enzymes DraI, KpnI and TaqI. No
polymorphism was observed at the restriction site of these enzymes in the D-loop
sequence of the four chicken breeds. Three hundred nucleotides beginning from
position 131 to position 430 in the D-loop sequence of the four chicken breeds
were then sequenced and compared with those of the White Leghorn and other
chicken varieties of China, Thailand, and Japan reported in Genbank. The
phylogenetic trees for the chickens were constructed based on the D-loop
sequences. The results showed that the four Vietnamese chicken breeds had
differences from each other. The D-loop sequences of these chickens were
deposited in the GenBank databases.
Keywords: Mitochondrial DNA control region, “Ri” chicken, “Tre” chicken,
“Choi” chicken, “Tau Vang” chicken
I. Đặt vấn ñề và mục tiêu ñề tài
Ở ñộng vật, ngoài hệ gen trong nhân còn có hệ gen tế bào chất nằm trong ty

thể chiếm tỉ lệ từ 1-5% ADN của tế bào. Trong tế bào trứng của ñộng vật có
xương sống, ước tính con số này lên ñến 108. Hệ gen ty thể là phân tử ADN trần,
kép, mạch vòng gồm 2 chuỗi: chuỗi nặng (H strand) giàu guanin và chuỗi nhẹ (L
strand) giàu cytosin.
Tất cả ñộng vật có xương sống ñã ñược phân tích ñều có 37 gen trên phân
tử ADN ty thể và thường không có khoảng trống giữa các gen (không có intron).
Tuy nhiên, trật tự sắp xếp các gen trong phân tử ADN dạng vòng có thể không
giống nhau giữa các loài, ñiều này ñược thể hiện rõ khi so sánh trình tự genom ty
thể các taxon bậc bộ trở lên. Vì thế, các ñặc ñiểm về trật tự các gen trên ty thể
ñược sử dụng như một dấu hiệu phân loại ñối với các taxon bậc cao (Mindell et
al., 1998).
ADN ty thể và vai trò của vùng D-loop trong nghiên cứu ña dạng sinh học gà
Thuật ngữ D - loop ñược dùng ñể chỉ một vùng có chức năng ñiều khiển
nằm trong mtADN. Đây là vùng không mã hóa duy nhất trong ADN ty thể của lớp
chim. Các nghiên cứu của Cheng et al.,1996; Gongora, et al., 2008;Guan et al.,
2007; Moiseyeva et al., 2002; Oka et al., 2007 chỉ ra rằng:Trình tự nuleotit của
vùng D-loop là một công cụ rất hữu hiệu ñể ñánh giá tính ña dạng di truyền và sự
phân hóa bên trong loài và giữa các quần thể cùng loài. Chính vì thế mà các gen
trong genom ty thể và vùng D-loop ñóng một vai trò vô cùng quan trọng trong các
nghiên cứu thuộc lĩnh vực phân loại học phân tử, trong xác ñịnh nguồn gốc, xuất
xứ của gà nhà và mối quan hệ của chúng. Như vậy, ADN ty thể có thể ñược coi là
một công cụ không thể bỏ qua khi tìm hiểu về mối quan hệ phát sinh chủng loại
hay sự tiến hóa của các quần thể.
Trong nghiên cứu này chúng tôi phân tích sự ña hình 4 giống gà nội bằng
cách nhân vùng D-loop, sử dụng các emzym hạn chế DraI, KpnI, and TaqI ñể cắt
ña hình, sau ñó giải trình tự vùng ñặc biệt trong khu vực mtDNA D-loop của các
giống gia cầm nội và so sánh với các giống gà khác của thể giới ñã ñược ñăng ký
trên ngân hàng gen Quốc tế
.
Toàn b

genom ty thể gà (Gallus gallus ñược tổ chức như sơ ñồ trong hình -
Sơ ñồ tổ chức của ADN ty thể Gà.




Nghiên c
u ADN ty thể gà trên th gi i
Zhang và CS (2002)
ã giải trình tự 539 nuleotit ñầu tiên trong vùng D-
loop của 6 chủng gà nhà (Gallus gallus domesticus) Trung Quốc và so sánh dữ
liệu này với trình tự ADN của 4 loài khác: Gallus gallus, Gallus sonneratii, Gallus
varius, Gallus lafayettei ñã ñược công bố trong Ngân hàng Gen Quốc tế. Ông ñã
thiết lập ñược mối quan hệ nguồn gốc của chúng dựa trên trình tự vùng D-loop.
Kết quả cho thấy 4 loài thuộc giống Gallus có rất nhiều ñiểm khác nhau. G. g.
domesticus có mối quan hệ thân thuộc nhất với G. gallus của Thái Lan và các
vùng lân cận. Nhóm nghiên cứu ñã giả thiết rằng, gà nhà Trung Quốc có thể có
nguồn gốc từ loài G. gallus ở các nơi này và hai loài phụ G. g. Gallus, G. g.
spadiceus có thể thuộc một loài phụ do tính tương ñồng cao giữa chúng (Niu et al.,
2002).
Năm 2002, Shi Okamoto ñã giải trình tự ADN trong ty thể ở khu vực D-
loop ñể xác ñinh tổ tiên của các giống gà nuôi.
Han Jianline (2006) và công sự ñã thành công trong phân tích trong mt
DNA xác ñịnh sự ña dạng, nguồn gốc các giống gà trên thế giới
Nghiên c u ADN ty thể gà tại Việt Nam
Tại Việt Nam, các nghiên cứu ở mức ñộ tế bào, phân tử trên ñối tượng chim
nói chung và gia cầm nói riêng còn rất ít ỏi. Đã có một số nghiên cứu về sự khác
biệt di truyền ở ba loài thuộc giống Gà lôi: Gà lôi lam ñuôi trắng Hà tĩnh (Lophura
hatinhensis), Trĩ bạc (L. nycthemera) và gà lôi hông tía (L. diardi) của Kim Thị
Phương Oanh (1999). Tác giả ñã chỉ ra sự thay ñổi nuleotit trên vùng D - loop ty

thể của chúng dựa trên vị trí nhận biết của các enzym giới hạn SmaI và EcoRI
(Kim Thị Phương Oanh, 1999).
II. Vật liệu và phương pháp thí nghiệm
Mẫu máu của 4 giống gà nội: Ri, Tre, Chọi và Tàu vàng ñược thu thập từ
Thanh Hóa, Bến Tre, Hà Tây, Thái bình, Bình Định, Long An. AND ñược tách
chiết từ các mẫu máu, sử dụng kít tách AND của hãng Fermentas. Sử dụng cặp
mồi: L16750 (5’-AGAACTACGGCTTGAAAAGC-3’) và H1255 (5’-
CATCTAGGCATCTTCAGT- GCC -3’), ñể nhân gen vùng D-loop. Phản ứng
PCR ñược tiến hành với thể tích 50 ml [500 mM Tris-HCl (pH 8.3), 0.1% Triton
X-100, 2 mM KCl, 75 mM MgCl2, 5 mM dNTP, 10 pM mồi, and 1.5 units of Taq
DNA polymerase (Fermentas), chu trình nhiệt 35 chu kỳ trong: 1 phút 94oC, 1
phút ở 54oC, và 1 phút ở 72oC. Sản phẩm PCR ñược tinh sạch sau ñó ñược ñưa
vào ñọc trình tự trực tiếp sử dụng kít BigDye® Terminator cycle sequencing của
hãng Applied Biosystems. Số liệu giải trình tự ñược phân tích bằng phần mềm
SeqScape® 2.6 (Applied Biosystems) và sử dụng cây phân loài neighbor-joining
(NJ) cho tất cả các Haplotypes với cấu trúc phầm mềm MEGA software (Kumar
et al., 2007).
III. K
t quả và thảo luận
Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhân và tinh sạch sản phẩm PCR với kích
thước 1.3 kb vùng D-loop của 4 giống gà nội sau ñó cắt bằng 4 enzyme hạn chế
DraI, KpnI, and TaqI.
Kết quả cho thấy, không có ña hình tại vị trí căt bằng các enzyme này ở
vung D-loop của 4 giống gà nôi Việt nam. Điều này có thể là phương pháp PCR-
RFLP với các emzyme trên chưa thích hợp cho các giống gà nội Việt Nam .
Hình 1: K
t qu ñiện di ADN tổng số tách ñược từ mẫu gà

Hình 2: Nhân bản ñoạn D-LOOP bằng kỹ thuật PCR



M: marker; 1: m u gà Ri; 2: mẫu gà Tre; 3: Chọi; 4: mẫu gà Tàu Vàng

Hình 3: Kết qủa không có
iểm cắt Ezymes trên ñoạn sản phẩm PCR (~1300bp)


Kết quả thể hiện trên ñiện di ñồ cho thấy tất cả các mẫu gà nghiên cứu này
ñều không chứa ñiểm cắt bằng các enzym DraI, KpnI, và TaqI tại vùng D-loop

S 1: So sánh trình t oạn D-LOOP ở m u các giống gà
ng k thu t giải trình tự và phân tích kết quả: 300 nucleotides của khu vự c từ v
trí nucleotit 131
n 430 ã ược n i th ng hàng t i sơ

131
WL TATGTACTAAACCCATTATATGTATACGGGCATTAATCTATATTCCACATTTCTCCCAATGTCCATTCTATGCATGATCC
210
RI1 C
RI10
RI2 C C
RI3
RI4
RI5

RI6 C
RI7
RI8
RI9
Tre1 C
TRE2 C
CHOI1
CHOI2
CHOI3
tvang1 C
tvang2
tvang3
tvang4
tvang5 C

WL AGGACACACTCATTCACCCTCCCCATAGACAGTTCCAAACCACTACCAAGTCACCTAACTATGAATGGTTACAGGACATA
290
RI1 C
RI10 .A T T T C
RI2 C
RI3 .A T T T C
RI4 .A T T T C
RI5 .A T T T C
RI6 .A T T T C
RI7 .A T T T C
RI8 .A T T T C
RI9 C C
Tre1 T T T C
TRE2 T T T C
CHOI1 .A T T T C

CHOI2 .A T T T C
CHOI3 T T C
tvang1 T T T C
tvang2 T AC C G
tvang3 .A T C G
tvang4 T AC C G
tvang5 T T T C

WL AATCTCACTCTCATGTTCTTCCCCCAACAAGTCACCTAACTATGAATGGTTACAGGACATACATTTAACTACCATGTTCT
370
RI1
RI10 C T
RI2 C T
RI3 C T
RI4 C T
RI5 C T
RI6 C T
RI7 T C T
RI8 C T
RI9 T
Tre1 C
TRE2 C
CHOI1 C T
CHOI2 C T
CHOI3 C T
tvang1 C
tvang2 G G T C
tvang3 C G T C
tvang4 G G T C
tvang5 C

Kết quả:
- Sự nối thẳng hàng của các trình tự mt-D-loop ở các giống gà nội Việt Nam (trình
tự D-loop của gà Leghorn trắng ñược chọn làm so sánh tương ñồng). Các chấm thể
hiện nhận dạng với trình tự ở hàng thứ nhất. Các chữ thể hiện các vị trí ñột biến
trong trình tự. Các giống: WL: gà Leghorn trắng; RI: gà Ri; TRE: gà Tre; CHOI:
gà Chọi; Tauvang: gà Tàu Vàng.
- Có 21 vị trí, ñặc trưng bởi sự ñột biến với 4,45%, ñược phát hiện trong 20 trình
tự ADN. Điều này chỉ ra rằng có sự khác nhau giữa các giống gà ñịa phương
nhưng không nhiêu.
-Có có chín kiểu ñơn bội (haplotypes) trong các giống nội ñịa ñược nghiên cứu.
Sơ ñồ 2: Cây phân bố loài bốn giống gà

Cây phân loài chỉ ra rằng bốn giống gà thuộc về hai dòng mẹ khác nhau,
một dòng gồm có gà Ri và gà Leghorn trắng, dòng còn lại gồm có Tre, Tàu Vàng
và gà Chọi. Trong dòng mẹ thứ hai, gà Chọi có quan hệ gần với gà Ri hơn gà Tàu
Vàng và gà Tre.
Trong những giống ñịa phương ñược nghiên cứu, có một số cá thể ñặc biệt
khác lạ so với các cá thể cùng giống (ví dụ như RI1, RI2, RI9, tauvang1 và
tauvang 5). Có thể nói rằng trong quá trình tiến hóa và phát triển ñã có một tổ tiên
dòng mẹ khác lẫn vào (Sơ ñồ 2).
IV. Kết luận và ñề nghị
Kết quả ban ñầu của chúng tôi cho thấy:
-Từ trình tự genome ty thể của giống gà nhà Gallus gallus domesticus ñã công
bố trên ngân hàng gen quốc tế GENBANK, ñã thiết kế ñược nhân ñoạn DLOOP
L16725, H1255 .
- Đã nhân thành công ñược ñoạn DLOOP ở các mẫu nghiên cứu có kích thước
1,3 kb.
- Tiến hành phân tích sự ña hình và xác ñịnh trình tự vùng DLOOP từ các mẫu
gà cho thấy:

+ Không có sự ña hình trong các vị trí cắt của các enzyme hạn chế DraI, KpnI,
and TaqI của khu vực mt D-loop trong bốn giống gà nội Việt Nam, Ri, Tre,
Chọi và Tàu Vàng nhưng có sự ñột biến tại các vị trí khác nhau của các giống
gà nội.
+ Gà Chọi khả năng rất cao có nguồn gốc dòng mẹ từ gà Ri. Toàn bộ chiều dài
của trình tự D-loop của các mẫu gà ñang ñược tiếp tục nghiên cứu và phân tích.

Tài li
u tham khảo
Akishinonomiya F., Miyake T., Sumi S., Takada M., Ohno S., Kondo, N. (1994) One
subspecies of the red junglefowl (Gallus gallus gallus) suffices as the matriarchic
ancestor of all domestic breeds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91:12505.
Cheng G. C., Liu K. F., Zhang Q., Wang L., Duan Z. X., Li X. Y., Liu R. S., and Yu, Q.
(1996). Studies on genetic relationship between red jungle fowl (Gallus gallus) and
domestic fowl (Gallus domesticus). Acta Genet. Sin., 23:96.
Fumihito A., Miyake T., Sumi S., Takada M., Ohno S., Kondo N. (1994) One subspecies
of the red junglefowl (Gallus gallus gallus) suffices as the matriarchic ancestor of all
domestic breeds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,
:
Fumihito A., Miyake T., Takada M., Shingu R., Endo T., Gojobori T., Kondo N., Ohno
S. (1996) Monophyletic origin and unique dispersal patterns of domestic fowls. Proc.
atl. Acad. Sci. U.S.A., : 6795.
Guan X., Geng T., Silva P., Smith E. J. (2007) Mitochondrial DNA sequence and
haplotype variation analysis in the chicken (Gallus gallu . J. Hered. : (7):
.
Mannen H., Morimoto M.L., Oyamat K., Mukai F., Tsuji S. (2003) Identification of
mitochondrial DNA substitutions related to meat quality in Japanese Black cattle.
Anim. Sci., 81(1):68-73
Mindell D. P., Sorenson M. D., Dimcheff D. E. (1998) Multiple independent origins of
mitochondrial gene order in birds. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,

( 10693 10697.
Gongora J., Rawlence N. J., Mobegi V. A., Alcalde J. A., Mtus J. T., Hanotte O., Moran
C., Austin J. J., Ulm S., Andersson A. J., Larson G., Cooper A. (2008) Indo-European
and Asian origins for Chilean and Pacific chickens revealed by mtDNA. Proc.
atl.
Acad. Sci. U.S.A.,105(30):
.
Moiseyeva I. G., Romanov M. N., Nikiforov A. A., Sevastyanove A. A., Semyenova S.
K. (2002) Evolutionary relationships of Red jungle fowl and chicken breeds. Genet.
Sel. Evol.,
( ): 403 .
Niu D., Fu Y., Luo J., Ruan H., Yu X., Chen G., Zhang Y. (2001) The origin and genetic
diversity of Chinese native chicken breeds. iochem. Genet., 40( /6): 163 174.
Oka T., Ino Y., Nomura K., Kawashima S., Kuwayama T., Hanada H., Amano T.,
Takada M., Takahata N., Hayashi Y., Akishinonomiya F. (2007) Analysis of mtDNA
sequences shows Japanese native chickens have multiple origins. Anim. Genet., 38:
287-293.
Pfeiffer I., Burger J., Brenig B. (2004) Diagnostic polymorphisms in the mitochondrial
cytochrome b gene allow discrimination between cattle, sheep, goat, roe buck and deer
by PCR-RFLP. BMC Genet., 5: 30 doi:10.1186/1471-2156-5-30.
Tamura K., Dudley J., Nei M., Kumar S. (2007) MEGA4: Molecular Evolutionary
Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol. Biol. Evol., 24:1596-1599.