SỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Rhizoctonia solani PHÂN LẬP TỪ NHIỀU CÂY KÝ CHỦ KHÁC NHAU (Tóm tắt, mục lục)

LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành cảm ơn:
- Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều
kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.
- Các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học cùng các thầy cô trực tiếp
giảng dạy luôn tận tình hướng dẫn, giảng dạy, giúp đỡ và động viên tôi trong
suốt bốn năm qua.
- ThS. Từ Thị Mỹ Thuận đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong thời
gian thực hiện đề tài tốt nghiệp.
- TS. Bùi Minh Trí và các anh chị phụ trách phòng CNSH thuộc Trung tâm
Phân Tích Thí Nghiệm Đại học Nông Lâm Tp. HCM đã tận tình giúp đỡ tôi
trong thời gian làm đề tài.
- Các thầy cô Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật thuộc khoa Nông Học đã tạo mọi điều
kiện để tôi thực hiện tốt đề tài.
- Bạn Lê Tuấn Kiệt cùng toàn thể lớp CNSH 27 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động
viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài và 4 năm qua.
Thành kính ghi ơn bà, cha mẹ đã nuôi nấng, dạy bảo con được như ngày hôm nay,
cùng những người thân trong gia đình luôn tạo mọi điều kiện và động viên con
trong suốt quá trình học tập tại trường.
Chân thành cảm ơn.
Tp. HCM, tháng 09 năm 2005
Sinh viên
Nguyễn Thị Tiến Sỹ
iii
TÓM TẮT
NGUYỄN THỊ TIẾN SỸ, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 9/2005.
“SỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA
NẤM Rhizoctonia solani PHÂN LẬP TỪ NHIỀU CÂY KÝ CHỦ KHÁC NHAU”.
Giáo viên hướng dẫn:
ThS. TỪ THỊ MỸ THUẬN
Đề tài được thực hiện trên đối tượng là nấm Rhizoctonia solani. Đây là nấm

có khả năng gây bệnh trên nhiều cây trồng khác nhau, ảnh hưởng rất lớn đến năng
suất của cây trồng. Chúng tôi sử dụng kỹ thuật RFLP nhằm mục tiêu khảo sát sự đa
dạng di truyền của các dòng nấm này, để dễ dàng cho việc đưa ra các biện pháp
phòng trừ bệnh do nấm này gây ra. Đề tài được thực hiện tại phòng thực tập Bệnh
cây khoa Nông Học và Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm trường Đại học Nông
Lâm, Tp. Hồ Chí Minh, từ 01/03/05 đến 30/08/05.
Nội dung nghiên cứu:
1. Nhân sinh khối các dòng nấm R. solani.
2. Ly trích DNA của các dòng nấm R. solani.
3. Khuếch đại vùng rDNA-ITS của nấm R. solani bằng phương pháp PCR.
4. Thực hiện phản ứng cắt vùng rDNA-ITS đã được khuếch đại bằng các
enzyme cắt hạn chế.
5. Phân tích sự đa dạng di truyền của các dòng nấm R. solani dựa trên kết quả
cắt của các enzyme.
Kết quả đạt được:
1. Thu sinh khối và ly trích DNA của 45 dòng nấm R. solani.
2. Cải tiến quy trình PCR để khuếch đại vùng rDNA-ITS của nấm R. solani với
cặp primer ITS 4 và ITS 5.
3. Khuếch đại được vùng rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani.
4. Với 9 dòng nấm RM-61, BV-61-02, CX-8-02, CTĐ-77, BV-62-03, KT-63-
01, XL-4, L-73 và ĐHL-63, khi cắt với các enzyme hạn chế Alu I, Hae III,
và Taq I cho ra các đoạn cắt giới hạn có kích thước khác nhau. Phân tích
ITS-RFLP cho thấy, 7 dòng nấm R. solani nói trên (trừ 2 dòng L-73, và
ĐHL-63) thuộc 6 nhóm khác nhau.
iv
MỤC LỤC
PHẦN TRANG
Trang bìa
Trang tựa
Lời cảm ơn .....................................................................................................................iii

Tóm tắt ............................................................................................................................iv
Mục lục............................................................................................................................ v
Danh sách các hình ......................................................................................................viii
Danh sách các bảng .......................................................................................................ix
Danh sách chữ viết tắt.....................................................................................................x
Phần I. MỞ ĐẦU........................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề.................................................................................................................1
1.2. Mục tiêu.....................................................................................................................1
1.3. Yêu cầu của đề tài.....................................................................................................2
1.4. Giới hạn của đề tài....................................................................................................2
Phần II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU...........................................................................3
2.1. Giới thiệu về nấm Rhizoctonia solani.....................................................................3
2.1.1. Đặc điểm hình thái ..........................................................................................3
2.1.2. Đặc điểm sinh lý.............................................................................................4
2.1.3. Đặc điểm nuôi cấy ..........................................................................................4
2.2. Điều kiện phát sinh bệnh ........................................................................................4
2.3. Phạm vi ký chủ của nấm R. solani..........................................................................5
2.4. Sự phân nhóm của nấm R. solani...........................................................................6
2.5. Các phương pháp phân tử thường dùng để nghiên cứu sự đa dạng di truyền
của nấm R. solani......................................................................................................8
2.5.1. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction).........................................8
2.5.1.1. Nguyên tắc của phương pháp PCR......................................................8
2.5.1.2. Các thành phần cần thiết để thực hiện phản ứng PCR.......................8
v
2.5.1.3. Tiến hành phản ứng PCR......................................................................9
2.5.1.4. Các nhân tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR.......................................10
2.5.1.5. Lợi ích của phản ứng PCR..................................................................10
2.5.2. Phương pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism).........11
2.5.2.1. Restriction endonuclease....................................................................11
2.5.2.2. Nguyên tắc của phương pháp.............................................................11

2.5.2.2. Quy trình của phương pháp................................................................11
2.6. Cơ sở khoa học của việc sử dụng đoạn rDNA-ITS trong nghiên cứu sự
đa dạng di truyền của nấm R. solani....................................................................12
2.6.1. Giới thiệu về vùng rDNA...................................................................................12
2.6.2. Sử dụng vùng rDNA để nghiên cứu sự đa dạng di truyền ..............................14
2.7. Một số nghiên cứu trong nước và ngoài nước về sự đa dạng của nấm
R. solani..................................................................................................................15
2.7.1. Nghiên cứu ngoài nước.......................................................................................15
2.7.2. Nghiên cứu trong nước.......................................................................................17
Phần III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH.................................18
3.1. Thời gian và địa điểm............................................................................................18
3.2. Nội dung nghiên cứu..............................................................................................18
3.3. Nguồn nấm Rhizoctonia solani..............................................................................18
3.4. Phương pháp tiến hành ..........................................................................................18
3.4.1. Phục hồi và nhân sinh khối nấm R. solani...................................................18
3.4.2. Ly trích DNA tổng số (isolation of DNA) của nấm R. solani....................19
3.4.3. Khuếch đại vùng rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani .........................21
3.4.4. Điện di và đọc kết quả PCR trên gel agarose .............................................22
3.4.5. Phân tích RFLP vùng rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani..................23
Phần IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................24
4.1. Ly trích DNA tổng số của nấm R. solani.............................................................24
4.2. Khuếch đại vùng rDNA-ITS thông qua phản ứng PCR......................................25
4.2.1. Lượng DNA khuôn........................................................................................25
4.2.2. Khảo sát chu trình nhiệt ...............................................................................26
vi
4.2.3. Khảo sát nồng độ primer...............................................................................27
4.2.4. Kết quả khuếch đại vùng rDNA-ITS của nấm R. solani ...........................28
4.3. Phân tích RFLP vùng rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani...........................29
Phần V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................33
5.1 Kết luận.............................................................................................................33

5.2. Đề nghị....................................................................................................................33
Phần VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................34
Phần VII. PHỤ LỤC............................................................................................... 37
vii