Nghiên cứu chuyển hóa chitin chitosan bằng phương pháp thủy phân enzyme thanh vật liệu hấp thụ trong xử lý ô nhiễm môi trường

NGHIÊN CỨU CHUYỂN HÓA CHITIN/CHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP
THỦY PHÂN ENZYME THANH VẬT LIỆU HẤP THỤ TRONG XỬ LÝ Ô
NHIỄM MÔI TRƯỜNG
Nguyễn Ngọc Lương, Nguyễn Thạc Hòa,
1
Trần Thị Quý Mai,
2
Nguyễn Thị Ninh,
3
Nguyễn Văn Thiết
Viện Chăn nuôi; ;
1
Sở Y tế Bắc Giang;
2
Sở Giáo dục và Đào tạo Hưng Yên;
3
Viện Công nghệ Sinh học
TÓM TẮT
Thủy phân chitin/chitosan b
ng phương pháp enzyme có nhi u ưu ñiểm hơn
các phương pháp hóa học. Trong nghiên cứu này, sử dụng enzyme bromelain thu
nhận từ phụ phẩm chế biến dứa ñể thủy phân chitin/chitosan thành vật liệu hấp phụ
sinh học kích thước nano rất có hiệu quả. Sau khi nghiên cứu ñộng học của phản ứng
thủy phân chitosan bằng enzyme bromelain, ñã xác ñịnh ñược các ñiều kiện tối ưu cơ
bản cho quá trình là: pH = 3,5; nhiệt ñộ = 60oC; tỉ lệ enzyme/cơ chất là 150 µl chế
phẩm enzyme cho 7,5 ml dung dịch cơ chất 0,2%. Ngoài ra còn xác ñịnh ñược ảnh
hưởng của n ng ñộ các muối NaCl và (NH4)2SO4 lên hoạt tính của bromelain. Dùng
bromelain thủy phân chitosan từ kích thước trung bình ban u là 2800 nm ñã tạo ra
ñược sản phẩm kích thước 645 nm, ñạt tiêu chuẩn kích thước nano.
1. Đặt vấn ñề
Cùng với sự phát triển nhanh về kinh tế, Việt Nam ñang phải ñối mặt với vấn ñề

ô nhiễm môi trường ngày càng trầm trọng. Riêng trong l nh vực chăn nuôi, tuy nhiều
giải pháp xử lý chất thải (biogas, compost có bổ sung chế phẩm VSV, dung dịch
anolit, EM…) ñã ñược nghiên cứu ứng dụng nhưng kết quả vẫn còn hạn chế (Nguyễn
Thạc Hòa và cs., 2009; Trịnh Quang Tuyên và cs., 2009). Thực tiễn ñang ñòi hỏi phải
tìm ra những giải pháp, vật liệu xử lý mới, có hiệu quả hơn nhằm giảm thiểu những
tác ñộng bất lợi của ô nhiễm môi trường tới ñời sống và sản xuất, trong số ñó phương
pháp hấp phụ các chất gây ô nhiễm bằng vật liệu sinh học có kích thước nano ñang tỏ
ra có ưu thế cao và ñược ứng dụng nhiều trên thế giới.
Chitin/chitosan thu nhận từ vỏ các loài giáp xác, chủ yếu từ tôm, cua,… ñã ñược
ứng dụng rộng rãi trong dược học, y học, công nghiệp, nông nghiệp, công nghệ sinh
học… Nhờ có nhiều nhóm chức –OH nên phân tử chitin/chitosan có ñộ thấm nước
cao, khả năng bắt giữ và hấp phụ tốt (Dutta P.K và cs., 2004). Ngoài ra, do chứa các
nhóm chức mà trong ñó các nguyên tử Oxygen và Nitrogen còn cặp electron chưa sử
dụng nên chúng có khả năng tạo phức, phối kết với hầu hết các kim loại nặng và kim
loại chuyển tiếp như: Hg
2+
, Cd
2+
, Zn
2+
, Cu
2+
, Ni
2+
, Co
2+
… (Vũ Công Phong., 2009).
Sản xuất chitin, chitosan làm vật liệu hấp phụ có kích thước nano dùng trong xử
lý ô nhiễm môi trường ñã ñược nhiều tác giả nghiên cứu (Zielinska K và cs., 2010;
Ramirez M A và cs., 2010; Lora M A và cs., 2008 Kim S H và cs., 2006; Schmuhl R

và cs., 2001; Davila M G và cs., 1991;…). Do quá trình thủy phân ñể tạo kích thước
nano hiện nay chủ yếu là sử dụng phương pháp hóa học (acid HCl ñặc) và còn tồn tại
một số nhược ñiểm như cắt mạch không ñịnh hướng, có nhiều sản phẩm phụ, khó tinh
chế, chi phí tốn kém, hiệu suất thấp, gây ô nhiễm môi trường và sản phẩm có hoạt
tính không cao nên nghiên cứu thủy phân chitin/chitosan bằng phương pháp enzyme
là một hướng ñi có nhiều triển vọng vì ñiều kiện phản ứng mềm, dễ dàng ñiều khiển
ñược quá trình, sạch và thân thiện với môi trường. Dễ dàng thu nhận ñược từ phụ
phẩm chế biến dứa, bromelain ñược coi là một nguồn enzyme sẵn có tại Việt Nam với
giá thành rẻ hơn rất nhiều so với các enzyme ñặc hiệu thủy phân chitosan khác như
chitinase và chitosanase. Không dừng lại ở mục tiêu tạo ñược vật liệu có kích thước
nano từ chitin/chitosan, các nghiên cứu của chúng tôi sẽ góp phần sử dụng hiệu
quả/triệt ñể hơn nguồn phế phụ phẩm chế biến nông/ thủy hải sản (vỏ tôm, cua; ngọn
vỏ, bã dứa,…), giảm thiểu ô nhiễm môi trường sinh thái do các hoạt ñộng này gây ra.
Báo cáo này trình bày kết quả “Nghiên cứu chuyển hóa chitin/chitosan bằng phương
pháp thủy phân enzyme thành vật liệu hấp phụ trong xử lý ô nhiễm môi trường”.
2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1. Vật liệu
- Chitin/chitosan thành phẩm (từ vỏ tôm, cua,…)
- Enzyme Bromelain (từ vỏ dứa)
2.2. Hóa chất và thiết bị
Hóa chất
: Acid acetic, NaCl, KOH, (NH
4
)
2
SO
4

Trong tất cả các thí nghiệm mẫu chitosan ñược pha trong dung dịch acid acetic
1% hoặc trong các dung dịch ñệm acetate có pH trong vùng từ 2 ñến 6 ñược chuẩn bị

từ dung dịch acid acetic 1% này.
Thiết bị
: Nhớt kế Otwan, nhiệt kế, máy ño pH, máy khuấy từ, máy ổn nhiệt, ống
ñong, pipet các loại,…
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp tách chiết chitin từ vỏ tôm, vỏ cua và chuyển hóa chitin thành
chitosan
Chitin ñược tách chiết từ vỏ tôm hay vỏ cua bằng phương pháp enzyme và
phương pháp hóa học, sau ñó ñược chuyển hóa thành chitosan bằng phương pháp xử
lí với dung dịch kiềm ñặc có ñun sôi (Alves M. N. và cs., 2008).
2.3.2. Các phương pháp nghiên cứu ñộng học thủy phân chitin/chitosan bằng
bromelain
Động học quá trình thủy phân chitin/chitosan do bromelain xúc tác ñược nghiên
cứu chi tiết bằng phương pháp ño ñộ nhớt của dung dịch cơ chất (chitosan).
Nguyên lí
: chitosan là một biopolymer dài mạch thẳng không phân nhánh, do ñó
các dung dịch chitosan có ñộ nhớt rất cao. Ngoài các yếu tố như nhiệt ñộ, lực ion, áp
su t…, ñộ nhớt các dung dịch của chitosan nói riêng, của các polymer mạch thẳng nói
chung phụ thuộc rất lớn vào nồng ñộ của dung dịch, và ñặc biệt là vào ñộ dài của
mạch polymer. Vì vậy chỉ cần cắt một vài liên kết bên trong mạch polymer là ñộ nhớt
của dung dịch ñã giảm ñi rất nhiều, ñây chính là cơ sở ñể xác ñịnh kích thước hay
khối lượng phân tử trung bình của các polymer ña phân tán. Do ñộ nhớt của các dung
dịch polymer có thể ñánh giá thông qua ño thời gian chảy một lượng nhất ñịnh các
dung dịch này qua mao quản của nhớt kế nên việc xác ñịnh ñộ nhớt của các dung dịch
polymer ñược quy về ño thời gian chảy các dung dịch của chúng qua nhớt kế và trong
nghiên cứu này nhớt kế Otwan ñược lựa chọn sử dụng.
Động học của phản ứng thủy phân chitosan bao gồm các bước sau:
- Khảo sát thời gian chảy (t, s) hay biến ñổi thời gian chảy (∆t, s) (tức là ñộ
nhớt) của dung dịch cơ chất trong hỗn hợp phản ứng tại các thời ñiểm khác nhau dọc
theo tọa ñộ của phản ứng (T, min), tương ñương với ñộng học P – t (tích lũy sản

phẩm theo thời gian);
- Nghiên cứu mối phụ thuộc tốc ñộ thủy phân (sự biến ñổi của thời gian chảy t
hay ñộ nhớt) vào nồng ñộ của cơ chất (ở ñây là chitosan), tương ñương với ñộng học
bão hòa enzyme bởi cơ chất (ñộng học P – [S]);
- Nghiên cứu mối phụ thuộc tốc ñộ quá trình thủy phân (hay thời gian chảy hoặc
sự biến ñổi ñộ nhớt) vào nồng ñộ của enzyme (ñộng học P – [E]);
- Nghiên cứu mối phụ thuộc của quá trình thủy phân vào pH (xác ñịnh giá trị pH
tối ưu), nhiệt ñộ, lực ion…
2.3.3. Phương pháp ño ñộ nhớt và xác ñịnh kích thước phân tử của các polymer
thẳng
Việc ño ñộ nhớt của một dung dịch ñược quy về ño thời gian chảy của nó trong
nhớt kế. Để ñạt ñược mục ñích này, cần chuẩn bị một seri dung dịch chitosan có nồng
ñộ nhỏ hơn 0,1% (trong vùng từ 0,005 ñến 0,1%) trong dung dịch acid acetic 1%, sau
ñó ño thời gian chảy của các dung dịch này (kí hiệu là t, s) và của dung môi (acid
acetic 1%, kí hiệu là t
0
, s). Từ các kết quả xác ñịnh thời gian chảy của các dung dịch
này sẽ tính ñược ñộ nhớt tương ñối (η
tñ
= t/t
0
), ñộ nhớt riêng (η
r
= (t – t
0
)/t
0
= η
tñ
– 1)

và ñộ nhớt rút gọn (η
rg
= η
r
/C). Sau ñó xây dựng ñồ thị biểu diễn mối phụ thuộc của
ñộ nhớt rút gọn vào nồng ñộ của dung dịch chitosan, ñồ thị này có dạng ñường thẳng
y = ax + b, cắt trục tung tại b, b chính là giá trị ñộ nhớt ñặc trưng ([η]) của mẫu
chitosan ñược nghiên cứu.
Biết ñộ nhớt ñặc trưng của mẫu chitosan sẽ xác ñịnh ñược khối lượng phân tử
(M
r
) của nó theo công thức Mark-Houwink-Sakurada:
[η] = KM
r
α

trong ñó K và α là các hằng số phụ thuộc vào bản chất của dung môi và nhiệt ñộ, α có
giá trị trong khoảng 0,5 – 0,8 (tham khảo tài liệu chúng tôi chọn α = 0,76; K = 7,4.10
-
4
).
Công thức tính chiều dài mạch polysaccharide của chitosan và các sản phẩm
thủy phân của nó:
L = 0,55n
ở ñây L: Chiều dài của mạch polymer (nm)
n: Số lượng ñơn phân (monomer) cấu tạo nên polymer
2.3.4. Tiến hành thí nghiệm
- Xác ñịnh kích thước ban ñầu của mẫu chitosan: Chuẩn bị seri dung dịch
chitosan nồng ñộ từ 0,005 ñến 0,1 %, sau ñó ño thời gian chảy của các dung dịch này
và của dung môi (acid acetic 1%) từ các số liệu này tính ñược ñộ nhớt ñặc trưng của

mẫu chitosan, áp dụng công thức Mark-Houwink-Sakurada xác ñịnh kích thước phân
tử ban ñầu của mẫu chitosan cơ chất;
- Nghiên cứu mối phụ thuộc tốc ñộ thủy phân vào nồng ñộ cơ chất: Chuẩn bị các
dung dịch chitosan nồng ñộ từ 0,1 ñến 0,5 % sau ñó cho thêm một lượng enzyme như
nhau (100µl) vào 7,5ml dịch cơ chất, lắc ñều và ño ngay thời gian chảy của hỗn hợp
phản ứng, tiếp theo cứ cách 5 phút lại ño 1 lần thời gian chảy của hỗn hợp phản ứng;
- Nghiên cứu mối phụ thuộc tốc ñộ thủy phân vào nồng ñộ enzyme: Phản ứng
thủy phân ñược tiến hành với dung dịch cơ chất nồng ñộ 0,2% và các lượng enzyme
khác nhau từ 25 ñến 200 µl chế phẩm enzyme cho 7,5ml dịch cơ chất. Cách ño thời
gian chảy của hỗn hợp phản ứng như trên;
- Trong các trường hợp: a) nghiên cứu ảnh hưởng của pH ñến tốc ñộ thủy phân,
chuẩn bị seri dịch chitosan 0,2% trong ñệm acetate pH từ 2,0 ñến 6,0; b) nghiên cứu
ảnh hưởng của lực ion lên quá trình thủy phân - chuẩn bị seri dung dịch chitosan 0,2%
trong acid acetic 1% chứa NaCl nồng ñộ từ 25 ñến 150 mM hoặc (NH
4
)
2
SO
4
từ 1,25
ñến 20 mM, sau ñó phản ứng thủy phân trong tất cả các trường hợp ñược tiến hành
với một lượng enzyme như nhau cho mỗi 7,5ml dung dịch cơ chất, ño thời gian chảy
của hỗn hợp phản ứng như trên;
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến khả năng thủy phân: Tiến hành phản
ứng thủy phân ở các nhiệt ñộ 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90
o
C với lượng enzyme như
nhau ở nồng ñộ chitosan 0,2%, sau 10 phút cho dừng phản ứng, ñể vào ngăn ñá tủ
lạnh. Trước khi ño thời gian chảy lấy ra cho cân bằng với nhiệt ñộ phòng;
2.3. Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu trong báo cáo ñược xử lý bằng chương trình Microsoft Excel 2003.
ết quả nghiên cứu và thảo luận
ết quả nghiên cứu xác ñịnh kích thước phân tử của mẫu chitosan
Bảng 1. K
t qu ño thời gian ch y và tính ñộ nh t c a mẫu cơ ch t chitosan ban
u
C, % T, s
η
tñ
η
r
η
rg

0.01 13,4 1,2762 0,2762 27,619
0.02 17,4 1,6571 0,6571 32,857
0.03 21,2 2,0190 1,0190 33,968
0.04 27,6 2,6254 1,6254 40,635
0.05 32,9 3,1333 2,1333 42,667
0.1 79,4 7,5651 6,5651 65,651

y = 419.93x + 23.069
0
10
20
30
40
50
60
70

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12
C, %
ĐNRG

Hình 1. Đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc của
η
rg
của mẫu chitosan vào nồng ñộ dung
dịch của nó
Trong thí nghiệm xác ñịnh khối lượng phân tử nhớt trung bình của mẫu cơ
chất chitosan ban ñầu, từ các số liệu ño thời gian chảy của các dung dịch nồng ñộ từ
0,01 ñến 0,1%, ñã tính ñược η
tñ
, η
r
, và η
rg
của nó (bảng 1). Từ ñồ thị biểu diễn mối
phụ thuộc của η
rg
và nồng ñộ dung dịch chitosan (hình 1) ñã xác ñịnh ñược ñộ nhớt
ñặc trưng [η] của mẫu chitosan cơ chất này là 23,069 (giá trị b của phương trình hồi
quy trên hình 1), t ng ứng với M
r
nhớt khoảng 820 kDa và chiều dài trung bình
mạch polysaccharide của mẫu cơ chất này là ~2800 nm.
Theo Dutta và cs (2004), M
r
của chitosan từ một ñến vài triệu dalton. Mẫu
chitosan chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu có khối lượng phân tử nhỏ hơn giá trị

này, nhưng vẫn chưa ñạt ñược kích thước nano, do ñó cần phải có phương pháp
chuyển hóa chúng thành dạng nhỏ hơn ñể dùng làm vật liệu hấp phụ thì mới có hiệu
quả cao.
3.2. t quả nghiên cứu ñộng học quá trình thủy phân chitosan bởi enzyme
bromelain
3.2.1. Kết quả nghiên c u m i ph thu c vào n ng ñộ cơ chất tới tốc ñộ thủy phân
Cắt mạch polysaccharide của chitosan có thể thực hiện b
ng các ph ng pháp
hóa học (HCl, HNO
2
) (Allan và Peyrou, 1995), vật lý (siêu âm) (Tsaih và Cheu.,
2003), sinh học (enzyme) (Muzzarelli và cs., 1999). Nhiều tác giả ñã chứng minh
chitosan có thể ñược thủy phân bởi các enzyme không ñặc hiệu như papain (Kumar
và cs., 2005), cellulase (Wu và cs., 2004), hemicellulase (Qin và cs., 2003) Yalpani
và cs (1994); Lee và cs (2005) cho rằng dùng bromelain ñể thủy phân chitosan, một
cơ chất không ñặc hiệu với bromelain, có thể ñạt ñược kết quả tốt.
Nhằm tìm ra ñiều kiện tối ưu ñể thủy phân chitin/chitosan thành kích thước
nano bằng bromelain, chúng tôi ñã tiến hành nghiên cứu ñộng học của quá trình thủy
phân chúng. Kết quả nghiên cứu mối phụ thuộc tốc ñộ thủy phân vào nồng ñộ cơ chất
ñược thể hiện trên hình 2.


0
100
200
300
400
500
0 5 10 15 20 25 30
T, min

t, s
C = 0.5 C = 0.4
C = 0.3 C = 0.2
C = 0.1

(a)

0
100
200
300
400
500
0 5 10 15 20 25 30
T, min
∆
t, s
C = 0.5 C = 0.4 C = 0.3
C = 0.2 C = 0.1


(b)


0
100
200
300
400
500

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
[S], %
∆
t, s
1 1 2
2 3


(c)

Hình 2. Các ñồ thị biểu diễn mối phụ thuộc của thời gian chảy a và sự biến ñổi của
thời gian chảy
b vào nồng ñộ cơ chất chitosan trong quá trình thủy phân (c)

Qua hình 2 ta thấy ñộ nhớt của dung dịch giảm mạnh trong phút phản ứng ñầu
tiên, ñiều này chứng tỏ rằng bromelain có khả năng thủy phân chitosan khá tốt (hình
2a). Mức ñộ giảm trung bình của thời gian chảy ở các nồng ñộ cơ chất khoảng 2,84
lần so với khi chưa xảy ra phản ứng thủy phân tương ñương với kết quả của Lee và cs
(2005) sử dụng bromelain của hãng Sigma công bố giảm 3 lần.
Nồng ñộ cơ chất càng cao thì sự biến ñổi thời gian chảy ∆t càng lớn (hình 2b).
Đặc biệt là giá trị này hầu như tỉ lệ tuyến tính với nồng ñộ của cơ chất trong vùng
khảo sát từ 0,1 ñến 0,5% (hình 2c).
3.2.2. Kết quả nghiên c
u mối phụ thuộc biến ñổi thời gian chảy theo nồng ñộ
enzyme
Để ñánh giá khả năng thủy phân chitosan bởi bromelain, phản ứng thủy phân ñã
ñược tiến hành với các lượng (nồng ñộ) enzyme khác nhau. Kết quả các thí nghiệm
ñược trình bày trên hình 3 cho thấy sự biến ñổi (giảm) thời gian chảy của dung dịch
cơ chất trong hỗn hợp phản ứng tỉ lệ tuyến tính với nồng ñộ của enzyme trong vùng từ
25 ñến 150 µl dung dịch enzyme/7,5 ml dung dịch cơ chất nồng ñộ 0,2%. Điều này có

nghĩa là ñể thủy phân một cách hiệu quả chitosan bằng chế phẩm bromelain cần phải
sử dụng không dưới 150 µl chế phẩm enzyme này cho 7,5 ml dung chitosan 0,2%.
0
20
40
60
80
100
0 5 10 15 20 25 30 35
T, min
t, s
0,025 ml 0,050 ml 0,100 ml
0,150 ml 0,200 ml

(a)

0
20
40
60
80
0 50 100 150 200 250
[E],
µ
l
∆
t, s
1 2 3

(b)

Hình 3 Đồ thị biểu diễn ñộng thái của thời gian chảy của dung dịch cơ chất trong
quá trình thủy phân khi phản ứng ñược xúc tác bởi các lượng bromelain khác
nhau (a) và cực ñại ñường cong thể hiện mối phụ thuộc của sự biến ñổi ñộ nhớt
vào nồng ñộ của enzyme (b)

3.2.3. Kết quả nghiên c
u ảnh hưởng của p lên phản ứng thủy phân
Để nghiên cứu mối phụ thuộc của quá trình thủy phân chitosan vào pH và xác
ñịnh giá trị pH tối ưu cho quá trình này, phản ứng thủy phân chitosan bởi bromelain
ñã ñược tiến hành trong ñệm acetate với pH từ 2,0 ñến 6,0. Các kết quả này ñược
trình bày trên hình 4.
Theo Lee và cs (2005) thì ở giá trị pH thấp s
không thuận lợi cho việc hòa tan
chitosan và pH khác nhau c ng gây biến ñổi ñộ nhớt ngay cả khi không có mặt của
enzyme. Dung dịch ñệm acetate có thể làm giảm ñộ nhớt của chitosan, khi không có
mặt enzyme; giảm 40% ở pH 3,98 và 12% ở pH 5,5 (Muzzarelli và cs (1999). Hình 4
cho ta thấy pH tối ưu trong phản ứng của chúng tôi là 3,5. Như vậy, pH tối ưu của
bromelain mà chúng tôi thu nhận ñược thấp hơn so với của Lee và cs (2005) (pH 5,0)
và hãng Sigma (pH 6,5). Ở nh
ng giá trị pH >5 thì thời gian chảy hay ñộ nhớt thay
ñổi không nhiều.

0
20
40
60
80
0 1 2 3 4 5 6 7
pH
t, s

(a)
0
10
20
30
40
0 1 2 3 4 5 6 7
pH
∆
t, s

(b)
Hình 4. Mối phụ thuộc của phản ứng thủy phân chitosan do bromelain xúc tác vào
pH

3.2.4. Kết quả nghiên c u ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến phản ứng thủy phân
Theo quy luật của các phản ứng hóa học thông thường, vận tốc phản ứng
enzyme tăng khi tăng nhiệt ñộ, nhưng vì enzyme có bản chất là protein do ñó ñối với
mỗi enzyme thường tồn tại một nhiệt ñộ tối thích nhất ñịnh. Hình 5 biểu diễn mối phụ
thuộc quá trình thủy phân chitosan do bromelain xúc tác vào nhiệt ñộ.

0
20
40
60
80
100
20 30 40 50 60 70 80 90 100
T,

o
C
t, s

(a)
60
80
100
120
140
160
20 30 40 50 60 70 80 90 100
T,
o
C
∆
t, s

(b)
Hình 5. Mối phụ thuộc của phản ứng thủy phân chitosan do bromelain xúc tác vào nhiệt
ñộ
Các ñồ thị trên hình 5 cho thấy dung dịch cơ chất trong hỗn hợp phản ứng thủy
phân chitosan chảy nhanh nhất khi phản ứng ñược tiến hành ở 60
o
C (hình 5a), tương
ứng với nhiệt ñộ tối ưu của phản ứng do bromelain xúc tác là 60
o
C (hình 5b). Nhiệt
ñộ tối ưu của phản ứng do chế phẩm bromelain của chúng tôi xúc tác cao hơn so với
kết quả của Lee và cs (2005) (50

o
C) và hãng Sigma (55
o
C).
3.2.5. Kết quả nghiên c
u ảnh hưởng của lực ion ñến phản ứng thủy phân
Ngoài những yếu tố quan trọng kể trên ảnh hưởng tới hoạt ñộng của enzyme, thì
lực ion (nồng ñộ muối) cũng ảnh hưởng tới hoạt tính xúc tác của enzyme. Vì vậy
chúng tôi ñã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ muối NaCl và (NH
4
)
2
SO
4
ñến phản
ứng thủy phân chitosan do bromelain xúc tác. Kết quả các nghiên cứu này ñược trình
bày trên hình 6 ñã cho thấy lực ion không chỉ làm giảm ñộ nhớt của dung dịch
chitosan, mà còn ảnh hưởng mạnh lên quá trình thủy phân của nó do bromelain xúc
tác: Các ñồ thị ∆t – T khi không có mặt các muối NaCl (ở nồng ñộ 25 – 150 mM) và
(NH
4
)
2
SO
4
(ở nồng ñộ 1,25 – 20 mM) nằm cao hơn rất nhiều so với khi có mặt muối
này trong hỗn hợp phản ứng (hình 6 a
c). Các ñồ thị trên hình 6b và 6d cũng cho
thấy thời gian chảy của dung dịch cơ chất trong hỗn hợp phản ứng (tương ứng với ts
thủy phân) giảm rất mạnh ngay cả ở các nồng ñộ muối rất thấp (1,25 mM ñối với

ammonium sulfate và 25 mM ñối với NaCl). Điều này có nghĩa là các muối này ức
chế quá trình thủy phân chitosan do bromelain xúc tác, và tác ñộng ức chế của
(NH
4
)
2
SO
4
mạnh hơn nhiều so với NaCl.
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10 12
T, min
∆
t, s
0 mM 25 mM 50 mM
75 mM 100 mM 150 mM

(a)
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200

[NaCl], mM
∆
t, s

(b)
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10
T, min
∆
t, s
0 1.25 2.5
5 10 15
20

(c)
0
20
40
60
80
100
0 3 6 9 12 15 18 21
[(NH
4
)

2
SO
4
], m
Μ
∆
t, s

(d)
Hình 6. Các ñồ thị biểu diễn ảnh hưởng của lực ion lên quá trình thủy
phân chitosan do bromelain xúc tác
3.3. Kết quả nghiên c
u thủy phân ñể tạo vật liệu hấp phụ kích thước nano
Từ các kết quả nghiên cứu ñộng học trình bày trên, chúng tôi tìm ñược các
thông số tối ưu cơ bản cho phản ứng thủy phân chitosan ñể tạo ra vật liệu hấp phụ
nano chitosan như sau: Nồng ñộ cơ chất 0,2%; lượng enzyme 150 µl/7,5 ml cơ chất
(1,36%); nhiệt ñộ phản ứng 60
o
C, pH 3,5. Kết quả xác ñịnh kích thước phân tử trung
bình của sản phẩm thủy phân chitosan trong các ñiều kiện này ñược tóm tắt trong
bảng 2.
Bảng 2. Kết quả ño thời gian chảy và tính ñộ nhớt của mẫu sản phẩm thủy phân cơ
chất chitosan ban ñầu trong các ñi
u kiện tối ưu do bromelain xúc tác
C, % T, s
η
tñ
η
r
η

rg

0.01 12,733 1,213 0,213 21,270
0.02 17,233 1,641 0,641 32,063
0.03 23,733 2,260 1,260 42,011
0.04 33,867 3,225 2,225 55,635
0.05 47,667 4,540 3,540 70,794

y = 1227.9x + 7.6073
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
[S], %

η
rg

Hình 7. Đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc của
η
rg
của mẫu sản phẩm thủy phân
chitosan vào nồng ñộ dung dịch của nó
Mẫu sản phẩm thủy phân chitosan này có ñộ nhớt ñặc trưng [η] = 7,6073, tương

ứng với khối lượng phân tử nhớt trung bình là ~190 kDa và chiều dài mạch
polysaccharide là ~645 nm, ñạt tiêu chuẩn kích thước nano.
Trên ñây là các kết quả thủy phân chitosan do bromelain xúc tác. Các kết quả
tương tự cũng nhận ñược khi thủy phân chitin ñã ñược gel hóa bởi enzyme này.
t luận và ñề nghị
ết luận
- Đã xác ñịnh ñược chi tiết ñộng học phản ứng thủy phân chitin/chitosan, xúc tác
bằng bromelain thu nhận từ phụ phẩm dứa, làm cơ sở ñể tiến hành xác lập ñiều kiện
thủy phân tối ưu.
- Điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân chitin/chitosan bằng bromelain là: pH
= 3,5; T = 60
o
C; tỉ lệ enzyme/cơ chất là 150 µl chế phẩm enzyme cho 7,5 ml dung
dịch cơ chất 0,2%. Ảnh hưởng của nồng ñộ các muối NaCl và (NH
4
)
2
SO
4
lên hoạt
tính của bromelain cũng ñã ñược xác ñịnh.
- Đã tạo ñược vật liệu hấp phụ kích thước nano từ chitin/chitosan bằng phương
pháp thủy phân enzyme ñể ứng dụng trong xử lý ô nhiễm môi trường.
4.2. Đề nghị
Cho tiến hành làm vật liệu hấp phụ thử nghiệm với một số chất gây ô nhiễm môi
trường như kim loại nặng, dư lượng các chất ñộc sau biogas.
Được tiếp tục triển khai nghiên cứu ở mức ñộ cao hơn ñể thử nghiệm khả năng
hấp phụ của sản phẩm trên một số ñối tượng vật nuôi ñể xem khả năng miễn dịch của
chúng.
Tài liệu tham khảo

1. Nguy
n Thạc Hòa, Nguyễn Ngọc Lương, Bùi Huy Hi n và cs (2009). Kết quả ñánh
giá khả năng sử dụng chế phẩm vi sinh vật trong xử lý nhanh phế thải rắn và nước
thải sau biogas tại cơ sở chăn nuôi lợn, gà quy mô tập trung. (Báo cáo nghiệm thu
ñề tài trọng ñiểm cấp Bộ: Nghiên cứu chế phẩm vi sinh vật xử lý nhanh phế thải
chăn nuôi – 2010);
2. Vũ Công Phong (2009). Những ñặc ñiểm của chitin, chitosan và dẫn xuất.
www.hoahocvietnam.com;
3. Trịnh Quang Tuyên, Nguyễn Quế Côi và cs (2009). Kết quả sử dụng dung dịch
anolit ñể giảm thiểu mùi hôi và cải thiện môi trường chuồng nuôi tại Trạm nghiên
cứu nuôi giữ giống lợn hạt nhân Tam Điệp. Báo cáo khoa học năm 2008 - Viện
Chăn nuôi 2009.
4. Allan G G, Peyron M (1995). Molecular weight manipulation of chitosan. I:
Kinetics of depolymerization by nitrous acid. Carbohydr. Res., Vol 277 No 2, pp.
257-272;
5. Alves M N, Mano J F (2008). Chitosan derivatives obtained by chemical
modification for bio medical and environmental applications. International Journal
of biological macromolecules. Vol 43, pp. 401-414;
6. avila M G, Pena J P, Casiano J M (1991). Lindane adsorption-desorption on
chitin in seawater. Intern J Enviro Anal Chem. Vol 46, pp. 175-186;
7. Dutta P K, Dutta J and Tripathi V S (2004). Chitin and chitosan: chemistry,
properties and applications. Journal of scientific
industrial research. Vol. 63, pp.
20-31;
8. Kim S H, Song H, Nisola M G, Ahn J, Galera M M, Lee C H, ChungW J (2006).
Adsorption of lead(II) ions using surface-modified chitins. J. Ind. Eng. Chem.,
Vol 12 No3, pp. 469-475;
9. Kumar A B V, Varadaraj M C, Gowda L R, Tharanathan R N (2005).
Characterization of chito-oligosaccharides prepared by chitosanolysis with the aid
papain and pronase, and their bactericidal action against Baccillus cereus and

Escherichia coli. Biochem. J. Vol 391, pp. 167-175;
10. Lee L F, Lee W K, Maskat M Y, Illias R M, Aziz K, Kamarulzaman K, Osman H
(2005). Partial depolymerization of chitosan with the aid of bromelain. Pakistan
Journal of biological science. Vol 8 No1, pp. 73-77;
11. Lora M A, Brennan R A (2008). The use of crab shell chitin for biological
denitrification: Batch and culumn test. Bioresource technology. Vol 100, pp. 534-
541;
12. Muzzarelli R A A (1997). Some modified chitosans their niche applications. Chitin
hanbook. Edited by R A A Muzzarelli and M G Peter;
13. Muzzarelli R A A, Stanic V, Ramos V (1999). Enzymatic depolymerization of
chitins and chitosans. Carbohydrate biotechnology protocols. C. Bucke, Ed.
Humana Press;
14. Qin C, Du Y, Zong L, Zeng F, Liu Y, Zhou B (2003). Effect of hemicellulase in the
molecular weight and structure of chitosan. Polymer degradation and stability. Vol
80, pp. 435-441;
15. Ramirez M A, Rodriguez A T, Alfonso L, Peniche C (2010). Chitin and its
derivatives as biopolymer with potential agricultural applications. Biological
applications. Vol 27 No4, pp. 270-276;
16. Schmuhl R, Krieg H M and Kaizer K (2001). Adsorption of Cu(II) ions by
chitosan: Kinetics and equilibrium studies. ISSN 0378-4738=water SA Vol 27
No1, pp. 1-7;
17. Tsaih M L, Chen R H (2003). Effect of degree of deacetylation of chitosan on the
kinetics of ultrasonic degradation of chitosan. J. Appl. Polym. Sci. Vol 90, pp.
3526-3531;
18. Wu G J, Tsaih G J (2004). Cellulase degradation of shrimp chitosan for the
preparation of a water-solube hydrolysate with immunoactivity. Fisheries Science.
Vol 76 No 6, pp. 1113-1120;
19. Yalpani M, Pantaleone D (1994). An examination of the unusual susceptibilities
of aminoglycan to enzymatic hydrolysis. Carbohydr. Res. Vol 256, pp. 159-175;
20. Zielinska K, Alexandre G. C, Stanislaw T (2010). Adsorption of cadimium ions on

chitosan membranes kinetics and equilibrium studies. Progress on chemistry and
application of chitin and its. Vol 15, pp. 73-78.