Bước đầu nghiên cứu sản xuất axit axetic bằng phương pháp lên men vi sinh vật trên tinh bột khoai

Phần I

Đặt vấn đề
Từ thời thợng cổ ngời ta đà biết sản xuất dấm và chỉ khoảng hai thế kỷ
gần đây ngời ta mới biết sản xuất ra axit axetic ở dạng đậm đặc. axit axetic
(axit etanoic) có khoảng 3% trong dấm, là một loại axit quan trọng nhất trong
các loại axit hữu cơ, axit axetic có nhiều ứng dụng vì nó là loại axit rẻ tiền
nhất, đợc dùng nhiều trong công nghiệp hoá chất, công nghiệp thực phẩm, sản
xuất tinh dầu, thuỷ tinh không vỡ, dung môi để pha sơn... axit axetic đợc sản
xuất bằng các phơng pháp nh: Chng cất gỗ, tổng hợp hoá học hoặc bằng phơng pháp lên men và hiện nay bằng công nghệ sinh học thì phơng pháp sản
xuất bằng lên men đang chiếm u thế.
Theo Nguyễn Lân Dũng (1981) những vi khuẩn axetic thờng gặp là:
Acetobacter.aceti, Acetobacter.xylium, Acetobacter.schutzenbachii,
Acetobacter.orleanense, Acetobacter.xyboxydans,
Acetobacter.pasteurianum...
Nguồn tiêu thụ chủ yếu của axit axetic là: Làm dấm ăn (dấm ăn chứa
tới 4,5% axit axetic) làm đông đặc nhựa mủ cao su, làm chất dẻo tơ sợi
xenlulo acetat - làm phim ảnh không nhạy lửa, làm chất nhựa kết dính
polivinyl acetat, làm các phẩm màu, dợc phẩm, nớc hoa tổng hợp, acetat nhôm
dùng làm chất cầm mầu (mordant) trong nghề nhuộm, điều chế axeton, thuỷ
hoài sâm, axit tricloaxetic (CCl 3-COOH) làm thuốc trừ cỏ dại, este axetic
(CH3COOR) dùng làm dung môi, vinyl axetat (CH=CHCOOH-CH2) để tổng
hợp polime vinyl axetat. Đặc biệt hiện nay ngời ta sử dụng axit axetic để điều
trị bệnh ung th gan bằng cách tiêm axit axetic qua da, axit axetic có tác dụng
gây hoại tử khối u, nó ít vào máu do đó hạn chế đợc phạm vi lan tràn, gây hoại
tử các tế bào lành (http.www.vinaseek.com).
Cũng theo Nguyễn Lân Dũng (2000) hàng năm nhân loại tiêu thụ một lợng dấm tơng đơng 160.000 tấn axit axetic tinh khiÕt (hay 3,2 tØ lÝt dÊm chøa
kho¶ng 5% axit axetic) [4]. Do nhu cầu về sử dụng axit axetic ngày càng
nhiều mà cứ sản xuất theo phơng pháp hoá học thì rất tốn kém, mà sản lợng
lại thấp, giá thành lại cao. Cho nên hiện nay axit axetic đợc sản xuất bằng phơng pháp lên men trong công nghệ vi sinh vật, vì phơng pháp này có thể tận
dụng đợc các nguyên liệu rẻ tiền nh: rỉ đờng, sắn, khoai, hoặc các phế thải

nông nghiệp... Trong giới hạn của đề tài này chúng tôi sử dụng nguyên liệu
khoai lang để s¶n xuÊt axit axetic.

1


Theo Lê Ngọc Tú (2000) cây khoai lang là cây nông nghiệp quen thuộc
ở nhiều nớc Châu á và ở nớc ta, có giá trị kinh tế cao, ở nớc ta sau lúa và ngô
thì khoai lang là nguồn quan träng cung cÊp tinh bét cho ngêi vµ gia sóc [16].
Vòng đời sinh trởng ngắn, kỹ thuật canh tác đơn giản, đầu t ít.
Mục tiêu: Từ những lí do trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
Bớc đầu nghiên cứu sản xuất axit axetic bằng phơng pháp lên men vi sinh
vật trên tinh bột khoai nhằm.
- Phân lập và nuôi cấy chủng vi khuẩn axetic.
- Tìm hiểu hoạt tính của vi khuẩn axetic.
- Xác định số lợng khuẩn lạc.
- Sản xuất axit axetic từ nguyên liệu bột khoai.
- Rèn luyện cho bản thân một số kỷ năng thực hành, thí nghiệm, làm
quen với phơng pháp nghiên cứu khoa học.

Phần II

Tổng quan tài liệu
I.Khái niệm về lên men.
Lên men theo nghĩa hẹp là quá trình phân giải hydrat cacbon để thu
năng lợng, trong đó hyđrô đợc tách ra từ một cơ chất, cuối cùng đợc chuyển
đến chất nhận là hợp chất hữu cơ. Oxy phân tử không tham gia vào quá trình
lên men. Vì vậy Paxtơ (pasteur) nói: Lên men đó là sự sống không không
khí, lên men đảm bảo tồn tại của sự sống mà khí quyển trái đất còn cha có
oxy (Warburg O.1959). Rõ ràng lên men khác với quá trình hô hấp, hô hấp

hiếu khí và oxy hoá không hoàn toàn [8].
Lên men theo nghĩa rộng là quá trình trao đổi chất qua đó mà các chất
hữu cơ mà trớc tiên là đờng bị biến đổi dới t¸c dơng cđa enzim vi sinh vËt
[16].

2


Bản chất của quá trình lên men là quá trình cung cấp năng lợng và các
hợp chất trung gian cho tÕ bµo vi sinh vËt. Nhng tÕ bµo sèng chØ sử dụng dạng
hoá năng táng trữ trong mạch cacbon và đợc giải phóng ra trong các phản ứng
enzim do sự chuyển hoá electron từ mức năng lợng này sang mức năng lợng
khác. Nh vậy lên men là quá trình oxy ho¸ - khư cã enzim xóc t¸c hay nãi
c¸ch kh¸c là quá trình
CH3CHO

hydrat hoá

CH3CH(OH)2

Aldehit dehidrogenaza
CH3COOH + 2H2

hydrat của axetaldehit

axit axetic

H2 đợc NADP nhận và qua các xitocrôm của chuỗi hô hấp đợc chuyển
cho O2 là chất nhận.
Từ trớc đến nay ngời ta xếp quá trình này thuộc lên men hiếu khí nhng

thực chất đây là quá trình chuyển hoá: vi sinh vật sử dụng cơ chất etanol và
chuyển thành axit axetic. NADP H2 xét trong quá trình này có lẽ đợc chuyển
hoá qua chuỗi hô hấp để thu năng lợng. Quá trình đó cũng đợc coi là quá trình
oxy hoá không hoàn toàn cơ chất bị phân giải không hoàn toàn, trong đó O 2 là
chất nhận H2 [13].
Ngoài oxy hoá rợu etylic, vi khuẩn axetic còn có khả năng oxy hoá
nhiều chất khác. Chẳng hạn, oxy hoá butanol thành axit butylic, oxy hoá
propanol thành axit propionic, glyxerin thành dioxyaxeton, manit thµnh
fructoza, socbit thµnh socboza, eritrit thµnh eritruloza, gluroza thµnh axit
gluconic và các dẫn xuất của nó, axit lactic thành axit pyruvic.
Ví dụ:
CH2OH

CH2OH

C

OH C H

OH

OH C H

OH C H

CH2OH

CH2OH
Eritrit

Eritruloza

Đặc biệt đáng chú ý là quá trình oxi hoá socbit thành socboga, 1 trong
nhữn giai đoạn quan trọng oxi hoá - khử sinh học [ 16].
II. Bản chất của quá trình lên men axetic.
Ngời ta gọi quá trình chuyển hoá rợu thành axit axetic là quá trình lên
men axetic hoặc quá trình lên men dấm, nhng thực ra đấy là một quá trình
oxi hoá chứ không phải là quá trình lên men vì:
3


NAD
CH3CH2OH

NADH2

(1)

CH3

_

(0)
CHO

(2)

CH3COOH

(1) alconđehyđrogenaza

(2) Oxydaza
Vi khuẩn gây ra quá trình lên men axetic (vi khn axetic) thc vỊ mét
gièng riªng - gièng Acetobacter trong họ Pseudomonadaceae. Đó là những
trực khuẩn hình que, kích thớc khoảng 0,5 x 8,0 mm, một đầu có tiên mao, có
thể di động (có loài không có tiên mao và không di động), không sinh bào tử,
hiếu khí bắt buộc (phát triển thành váng trên các môi trờng dịch thể). Vi
khuẩn axetic đôi khi có thể sinh ra những tế bào rất dài hoặc những tế bào có
hình dạng kỳ lạ (tế bào dị hình).
Năm 1862, L.Pasteur là ngời đầu tiên khám phá ra cơ chế quá trình lên
men axetic, đó là quá trình oxy hoá hiếu khí rợu etylic thành axit axetic theo
phơng trình chung sau:
CH3CH2OH +

1
O = CH3COOH + H2O
2 2

Thực chất của quá trình này gåm 2 ph¶n øng víi 2 enzim cđa vi khn
axetic xúc tác nh đà nêu ở trên.
III. Vi sinh vật lên men Axetic.
Ngày nay ngời ta biết đến hơn 20 loài vi khuẩn có khả năng lên men
axetic chúng đợc gọi bằng một tên chung là vi khuẩn axetic. Những vi khuẩn
này phân bố rộng rÃi khắp mọi nơi, có thể tìm thấy trong không khí, đất, nớc,
cùng với các hạt bụi, trên bề mặt thực vật, trên quả.... Vì vậy các dịch nớc quả,
bia, rợu thấp, dịch đờng... để hở tiếp xúc với không khí dễ bị vẫn đục nhẹ, trên
bề mặt tạo thành một lớp màng mỏng trắng xám hoặc vàng xám. Đó là do vi
khuẩn axetic phát triển.
Vi khuẩn axetic phân bố rộng rÃi khắp mọi nơi chúng có khả năng đồng
hoá nhiều nguồn thức ăn cacbon khác nhau (etanol, glyxerin, glucoza,
Fructoza, manit, lactoza, mantoza, saccaroza...), không có khả năng sử dụng

tinh bột. Đa số các loài vi khuẩn axetic đòi hỏi phải cung cấp thức ăn đạm hữu
cơ (peptit, axit amin), chỉ có vài loài có khả năng đồng hoá đạm vô cơ [6].
Trớc đây L.Pasteur cho rằng quá trình lên men dấm là do một loại vi
sinh vật gây ra và đợc gọi là Mycoderma aceti. Sau này ngời ta đà biết đó là vi
khuẩn thuéc nhãm Acetobacter cña Bacterium. Vi khuÈn axetic thuéc chi
4


Acetobacter họ Acetobacteriaceae, họ này ngoài chi Acetobacter còn có chi
Gluconobacter. Hai chi này đều có thể sinh trởng ở pH = 4,5, đều có thể oxy
hoá etanol thành axetic ë pH = 4,5 nhng Acetobacter cã tiªn mao kiĨu chu
mao (peritrichons) còn Gluconobacter có tiên mao kiểu cực mao (polas).
Ngoài ra khác với Acetobacter, chi Gluconobacter không có chu trình ATC
(axit tricacboxylic) đầy đủ trong hiều khí do đó không oxy hoá đợc axetat [4].
Vi khuẩn axetic không những oxy hoá đợc rợu etylic thành axit axetic
mà còn oxy hoá đợc rợu propionic thành axit propionic, rợu butylic thành axit
butyric nhng chúng không oxy hoá đợc rợu metylic và những rợu bậc cao.
Trong môi trờng đủ rợu etylic 5,13% thì sản phẩm chủ yếu là axit
axetic, nếu nồng độ rợu thấp hơn các vi khuẩn axetic oxy hoá triệt ®Ư thµnh
CO2 vµ H2O. Vi khn axetic rÊt hiÕu khÝ, tốc độ sinh trởng rất nhanh từ một
tế bào sau 12 giờ có thể phát triển thành 17 triệu tế bào trong quá trình sinh
trởng, phát triển chúng tạo thành axit axetic và nồng độ axit thấp lại kích thích
sự sinh trởng của chúng. Vì vậy, trong sản xuất dấm có thể dùng rợu không
cần thanh trùng đợc bổ sung một ít axetic để axit hoá môi trờng [13].
Vi khuẩn axetic có dạng hình que, đôi khi tạo các thành các hình dạng
kéo dài, phân nhánh, phình to lên... chúng không hình thành bào tử, thờng xếp
thành chuỗi dài. Một số loài di động, một số loài không di động và chịu axit
cao, một số phát triển ở pH = 3,2, thùc hiƯn trao ®ỉi chÊt ë pH thÊp ®iỊu này
phân biệt chúng với các vi khuẩn khác, các vi khuẩn axetic là bọn đa hình tế
bào từ hình elip tới hình que thẳng hoặc hơi cong 0,5 - 0,8 x 0,9 - 4,2 m,

chúng là bọn hiếu khí bắt buộc, một số tạo thành sắc tố, một số tạo thành
xenluloza. Ngời đầu tiên tìm cách phân loại các vi khuẩn axetic là Hansen
(1894). Ngày nay các vi khuẩn axetic mới đợc phân loại vào hai giống chính
là: Acetobacter và Gluconobacter. Các loài Acetobacter có 5 đặc điểm: Có
mặt cactalaza, oxy hoá etanol qua axit axetic tới CO 2 và H2O, oxy hoá lactat
thành cacbonat, oxi hoá glixerol thành DHP và sản sinh axit glucomic từ
glucoza.
Các vi khuẩn trong chi Acetobacter thờng đợc chia thành 4 nhóm: Oxi
hoá mạnh, oxi hoá, oxi hoá trung bình, oxi hoá yếu [2].
Từ trớc đến nay đà có rất nhiều tác giả đề cập đến vấn đề phân loại các
vi khuẩn trong giống Acetobacter (Rothenbach - 1898, Beizeneinck - 1890,
Hoyer - 1899, Hansen - 1911)... Nhng đáng chú ý nhất là bảng phân loại của
J.Franteur (1950). Những loài Acetobacter quan trọng là:
Acetobacter aceti.

5


Acetobacter pasteurianum.
Acetobacter orleanense.
Acetobacter xylium.
Acetobacter schutzenbachii.
Acetobacter suboxydans.
Acetobacter cuvrum.
C¸c vi khuÈn axetic đợc gộp chung trong một giống là Acetobacter,
những vi khuẩn này khác về kích thớc tế bào, tính chịu đựng cồn, khả năng tạo
ra axit axetic trong môi trờng và nhiều đặc tính khác.
Ví dụ: A.aceti tích tụ trong môi trêng tíi 6% axit axetic, A.orleanense
9,5%, A.schutzenbachii 11,5%, A.xylium 4,5% khả năng chịu cồn cũng khác.
Ví dụ: A.aceti và A.schutzenbachii nuôi ở trong môi trờng có nồng độ

cồn tới 9 - 11%, nhng A.xylium chØ cã 5 - 7%. NhiÖt độ tối thích hợp cho sự
sinh trởng của các loài vi khuÈn axetic n»m trong kho¶ng 20 -35 0C. Mét số
loài có khả năng sinh tổng hợp vitamin B1, B2, B12 nhng nhiều loài cần có
vitamin làm chất sinh trởng có trong môi trờng trớc hết là cần axit pantotenic
[12].
Các vi khuẩn axetic thờng gặp có hình sợi dài và kết thành màng trên bề
mặt cơ chất, do khả năng tạo nhầy của tế bào nh: A.pasteurianum tạo thành
màng có bề mặt khô, nhăn nheo. A.xylium có hình hạt, thô dày còn một số
loài vi khuẩn axetic lại không tạo màng dày đặc mà chỉ tạo thành các mảnh
nhỏ trên bề mặt dịch hoặc tạo thành các vòng ở thành thùng nuôi cấy.
Những vi khuẩn axetic có đặc điểm là đẽ thay đổi hình dạng tế bào.
Trong những điều kiện sinh trởng không thuận lợi các tế bào của chúng có
hình dạng không bình thờng nh: Dạng sợi to và dài, phồng trơng lên, hoặc có
những hình thù quái gỡ khác nhau.
Theo Nguyễn Thành Đạt vi khuẩn axetic thông qua con đờng oxi hoá
không hoàn toàn để phân giải đờng và rợu, tạo ra các loại axit và đợc sinh vật
thải ra ngoài. Phần lớn các vi khuẩn axetic cần các môi trờng phức tạp để sinh
sống, chúng oxi hoá rợu sơ cấp thành axit béo tơng đơng.
CH3CH2OH

CH3COOH

IV. Lên men axetic trong sản xuất dấm ăn.
Thuật ngữ dấm để chỉ các dung dịch chua thu đợc từ quá trình lên
men axetic, khi để ra ngoài không khí và nhiệt độ ổn định thông thờng không
vợt quá từ 20 - 30 0C của tất cả các loại dung dịch có cồn hc mét sè dung

6

dịch có đờng, có tinh bột sau khi đà qua quá trình lên men rợu, tác nhân của
quá trình axit hoá là Mycoderma aceti hoặc Acetobacter.
Dấm ăn từ xa đến nay đợc dùng làm chất điều vị, theo truyền thuyết thì
đó là phát minh của một chuyên gia sản xuất rợu ngời Trung Quốc tên là Đỗ
Khang [11].
Tuỳ theo nguồn gốc của dấm ngời ta phân biệt các loại dấm nh: Dấm
làm từ rợu vang, dấm làm từ bia và mạch nha, dấm làm từ cồn và dấm làm từ
các hạt, mật, khoai tây đà thuỷ phân, lactoserum.
Quá trình biến rợu thành dấm đà đợc con ngời sử dụng từ rất lâu trong
kỹ thuật lên men oxi hoá rất phổ biến trong gia đình. Dấm là một dung dịch
chứa khoảng 3 - 6% axit axetic. Để hở một cốc rợu nhạt (rợu trắng, rợu
vang...) pha loÃng bằng nớc sôi để nguội để độ rợu chỉ còn khoảng 6%. Nếu
dùng bia thì không cần pha loÃng, cho thêm ít chuối để bổ sung thêm gluxit và
vitamin cho axit axetic, phủ miệng bình rộng bằng vải màn khoảng mơi ngày
là ta có dấm ăn.
Trong lên men axetic cơ chất dinh dỡng chủ yếu là etanol với nồng độ
trên dới 10% trong môi trờng. Ngoài ra còn có thêm một ít đờng, nguồn nitơ
vô cơ và hữu cơ, cũng nh các chất khoáng khác.
Trong công nghiệp sản xuất hiện nay ngời ta dùng hai phơng pháp lên
men là: Phơng pháp lên men nhanh và phơng pháp lên men chậm. Ngoài hai
phơng pháp này ngời ta còn chú ý đến phơng pháp lên men chìm kiểu hiện
đại, phơng pháp này ngày càng có ý nghĩa lớn.
Lên men dấm là quá trình axetyl hoá etanol thành axit axetic trong điều
kiện hiếu khí dới tác dụng của enzim oxi hoá của vi khuẩn. Để chuyển hoá
thành axit axetic rợu phải thâm nhập vào bên trong tế bào vi khuẩn và cả oxi
cũng phải đi vào để oxi hoá axit axetic tạo thành thoát ra khỏi tế bào môi trờng.
Sự oxi hoá rợu thành dấm là một quá trình khử dần hyđro của rợu mà
phản ứng cuối cùng đợc viết nh sau:
CH3COOH + H2O + 0,48.106J

CH3CH2OH + O2

Vi khuẩn axetic bị ức chế hoạt động khi nồng độ axit axetic quá cao
cũng nh nồng độ rợu quá lớn. Sự thông khí tốt và nhiệt độ 30 - 40 0C là điều
kiện thích hợp cho chúng. Ngoài sự oxi hoá rợu thành dấm, một số loài vi
khuẩn axetic còn có khả năng tổng hợp vitamin B1, B2... các loài
A.suboxydans, A.xylium có khả năng oxi hoá rợu sobit thành ®êng socboza,

7


từ socboza ta thu đợc vitamin C. Vitamin này có vai trò chống bệnh hoại
huyết. Hàng ngày trung bình mỗi ngời cần dùng đến 100 mg vitaminC.
V. Bột khoai lang, nguyªn liƯu dïng cho lªn men axetic.
Theo Lª Ngäc Tó (2000) thành phần hoá học ở khoai lang nh sau:
Loại củ

Khoai
lang tơi
Khoai
lang khô

Nớc (%)

Gluxit
(%)

Protein
(%)

Chất béo Xenluloja
(%)
(%)

Tro (%)

68,1

27,9

1,6

0,5

0,9

1

13,1

80,5

2

0,8

0,2

0,5

Qua bảng trên cho thấy ở khoai lang khô có hàm lợng gluxit cao
(80,5%) đó là nguồn nguyên liệu quan trọng cho lên men axetic.
ở Việt Nam khoai lang là một cây nông nghiệp đợc trồng rộng rÃi, phổ
biến ở nhiều vùng cho năng suất cao cung cấp lơng thực cho ngời và gia súc.
Hiện nay đang đợc sử dụng để ăn (luộc, lấy bột làm bánh, làm thức ăn cho gia
súc), dùng làm nguyên liệu để sản xuất sinh khối nhng dùng bột khoai để sản
xuất axit axetic thì cha ở đâu làm. Do đó ở đây chọn bột khoai làm nguyên
liệu để lên men axetic, với mục đích tận dụng loại nguyên liệu dễ kiếm, rẻ tiền
để tạo ra axit axetic có giá trị đang đợc dùng nhiều trong kinh tế.

8


Phần III.

Đối tợng - Địa điểm - Thời gian
và phơng pháp nghiên cứu.
I. Đối tợng nghiên cứu.
Vi khuẩn lên men axetic.
II. Địa điểm nghiên cứu.
Phòng thí nghiệm Di truyền - Vi sinh Trờng Đại học Vinh.
III. Thời gian nghiên cứu.
Từ 22/9/2005 - 3/2006.
IV. Phơng pháp nghiên cứu.
1. Thu nhận vi khuẩn axetic.
- Cho vào bình tam giác 100 ml (khử trùng) gồm: 50 ml bia + 0,5 ml rợu làm chất giàu năng lợng và axit hoá môi trờng bằng axit axetic 1N từ 0,1 0,2 ml.
- Đậy nút bông và nuôi trong tủ ấm ở 300C.
- Sau 5 - 7 ngày trên bề mặt của bình sẽ xuất hiện váng màu trắng nhạt
do vi khuẩn axetic tạo thành.
- Lấy váng dấm làm tiêu bản, quan sát.

1.1 Nuôi và phân lập.
Thành phần môi trờng cho vi khuẩn axetic gồm:
Sữa bột: 10g
Pepton: 10g
Agar: 20g
Níc: 1000 ml
V« trïng ë 1 atm trong vòng 30 phút.
- Dùng que trang thuỷ tinh phân phối đều dịch pha loÃng trên mặt
thạch. Sau đó đặt vào tủ ấm nuôi ở nhiệt độ 25 - 300C.
1.2 Xác định số lợng vi sinh vật.
Dùng môi trờng đặc trng cho vi khuẩn axetic với các thành phần nh ở
trên. Khử trùng ở 1 atm, trong 30 phút.
Tất cả các ống nghiệm và đĩa petri đều đợc khử trùng. Các thao tác đợc
tiến hành trong buồng cấy đà đợc vô trùng bằng tia tử ngoại [10]. Vi sinh vật
đợc nuôi cấy trên môi trờng thạch đĩa và đợc định lợng theo phơng pháp CFU.
9


Xác định số lợng vi khuẩn axetic bằng phơng pháp pha lo·ng ë 10-5, cÊy
0,1 ml dung dÞch hun phï lên đĩa thạch. Nuôi 2 - 5 ngày ở 25 - 30 0C. Đếm
số lợng khuẩn lạc hình thành trên đĩa thạch theo công thức sau:
N

X(CFU/ml) =

.R

n1vf1 + .... nivfi

Trong đó:

N: Tổng số khuẩn lạc đếm đợc.
ni: Số đĩa khuẩn lạc đếm ở mỗi độ pha loÃng.
v: Thể tích mẫu lấy vào đĩa.
fi: Độ pha loÃng có số khuẩn lạc đợc chọn.
R: Tỷ lệ khẳng định.
2. Xác định hoạt tính của vi khuẩn axetic
Dung dịch khoai đợc pha ở các nồng độ 5%, 10%, 15%, 20%, sau đó
cho vào các bình tam giác. Đậy nút bông, gói báo, khử trùng ở 1atm trong 30
phút. Lấy ra để nguội và cho vào mỗi bình tam giác 5g men đà đợc nghiền
nhỏ, lắc đều. Cho 1- 2 giọt axit axetic (để kích thích sự sinh trởng ) + váng
dấm. Nuôi ở các nhiệt độ 20 0c, 300c từ 3- 5 ngày thì cho thêm nớc để lên men
tiếp. Hàng ngày theo dõi sù thÝch l axit axetic b»ng sù thay ®ỉi pH của dịch
lên men, đến khi pH không đổi thì tiến hành định lợng.
3. Phơng pháp định tính (lặp lại 3 lần)
- Phản ứng tạo sắt axetat:
Cho vào ống nghiệm (khử trùng): 3ml dung dịch lên men + 1ml
NH4OH hoặc NaOH 20% + vài giọt FeCl3 5% (2 giọt). Lắc đều và đun nóng
trên đèn cồn. Nếu dịch lên men có axit axetic thì sẽ tạo thành sắt axetat màu
đỏ thẫm.

CH3COOH + Na = CH3COONa + H2O
3CH3COONa + FeCl3 = Fe(CH3COO)3 + 3NaCl
Màu đỏ
4. Định lợng axit axetic (lặp lại 3 lần)
10ml dung dịch lên men + 1- 2 giọt phenolphtalein 0,1% rồi chuẩn độ
bằng dung dịch NaOH 0,1N, cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt và bền.
Tính ra số mg axit axetic ë tõng c«ng thøc.
X=

A . 0,006 . V

V0

10


X: Hàm lợng axit axetic (mg).
A: Số ml chuẩn độ lấy trung bình.
V0: 10 ml dung dịch lên men.
0,006 g: Lợng axetic tơng ứng 1ml NaOH 0,1N.
V= 100 ml dung dịch lên men.
5. Các chỉ tiêu thống kê theo Rumxki (1968) xử lý số liệu.
5.1. Xác định số trung bình cộng.
n

x

X i 1
n

Trong đó:

i

: Trị số trung bình cộng.
xi: Giá trị thứ i của dÃy biến số.
n: Số lần xuất hiện dÃy biến số.
5.2 Xác định độ lệch chuẩn.
X

n

(x


i 1

i

x) 2

n

Phần IV

Kết quả nghiên cứu
Chơng I.
Vi khuẩn lên men Axetic
I.

Đặc điểm.
Theo Misuchin và Emxel (1970), vi khuẩn lên men axetic là một nhóm
gồm: Acetobacter aceti, A.pasteurianum, A.orleanense, A.xylinum,
A.chutzenbachii, là những vi khuẩn hình que, không chuyển động. Những
giống này có những đặc điểm khác nhau và khả năng lên men tạo axit axetic
cũng nh tích luỹ axit axetic trong dịch lên men cũng khác nhau. Tuy nhiên
trong khuôn khổ một luận văn không có điều kiện nghiên cứu riêng từng
chủng mà nghiên cứu hoạt tính chung của các chủng trong giống Acetobacter.
Cơ chất lên men axetic của Acetobacter là etylic, chúng oxi hoá etylic
để cho axetic và phơng trình tổng quát là:

CH3CH2OH + O2

CH3COOH + H2O + xKeal

Trong nghiên cứu này, chúng tôi bỏ qua giai đoạn lên men etylic mà
cho lên men trực tiếp từ tinh bột tạo axetic. Và đó mới là khả năng lín trong

11


công nghệ sản xuất axetic từ các ngũ cốc và phế thải của sản xuất nông
nghiệp, vừa tận thu nguyên liệu, vừa giảm nhiều công sức và giảm năng lợng
tiêu tốn.
II. Quy trình phân lập và nuôi cấy.
Để thu nhận đợc vi khuẩn axetic, chúng tôi phân lập theo quy trình sau:
- Lấy váng dấm bằng một vòng que cấy.
- Pha loÃng thập phân.
- Cây 0,1ml dịch huyền phù lên đĩa petri chứa môi trờng thạch.
- Trang đều bằng que trang.
- Nuôi ở 300C trong 2 - 3 ngày (cho ®Õn khi xt hiƯn khn l¹c)
- Thu nhËn vi khn axetic.
- Nghiên cứu hoạt tính lên men axetic.
Từ một đĩa petri có 6 khuẩn lạc chúng tôi tiến hành nhuộm màu bằng
lugol thì thấy có 5 khuẩn lạc bắt màu và có một khuẩn lạc không bắt màu.
III. Kết quả.
Với phơng pháp nghiên cứu trên chúng tôi thu đợc kết quả ở bảng 1.
Bảng 1: Đặc điểm của các chủng lên men axetic
Đặc điểm của khuẩn lạc

Hình thái

Đờng kính ( mm)
Bề mặt
Màu sắc
Nhuộm I-ốt
Mặt cắt ngang

AH1

Tròn
5,525
Bóng, nhẵn
Trắng nâu
Vàng nhạt
Lồi

AH2

Tròn
1,2
Bóng, nhẵn
Trắng tinh
Không bắt màu
Lồi

Từ kết quả bảng 1 cho ta thấy.
- Về hình thái khuẩn lạc:
+ Khuẩn lạc hình tròn.
+ Khuẩn lạc nhẵn bóng.
+ Đờng kính trung bình khuẩn lạc 1,2 mm (AH2), 5,525 mm
(AH1).

- Về màu sắc khuẩn lạc:
+ AH1: có màu trắng nâu khi nhuộm bằng thuộc nhuộm Iốt (5 10 phút). Khuẩn lạc bắt màu vàng nhạt, đó chính là loài Acetobacter
aceti, có thể tích luỹ ®Õn 6% axit axetic trong m«i trêng.

12


+ AH2: Có màu trắng tinh không bắt màu với thuốc nhuộm Iốt,
đó chính là loài A.Schutzenbachii có khả năng tích luỹ trong môi trờng
đến 11,5% axit axetic do đó thờng đợc dùng chuyển hoá rợu thành dấm.
Nh vậy: Là chúng tôi đà tiến hành phân lập đợc 2 chủng là: A.aceti và
A.Schutzenbachii là 2 chủng có khả năng tích luü axit axetic cao tõ 6 - 12%.

Ch¬ng II.

Sinh trëng và phát triển của
vi khuẩn Axetic
I. Đặc điểm.
Theo Blachman, Grozinxki (1981) sinh trởng là sự tăng số lợng, kích thớc, thể tích cùng với sự phân hoá và hình thành cơ quan mới. ở đây chúng tôi

13


đánh giá sự sinh trởng bằng sự tăng số lợng khuẩn lạc sau một thời gian nuôi
cấy (sinh trởng tơng đối).
Nghĩa là:
P(%)

Wt W0
.100%

W0

Trong đó:

W0: Số đo lần đầu.
Wt: Số đo lần cuối.
t: Khoảng cách giữa hai lần đo
Và tốc độ sinh trởng:
v

Wt W0
.100%
W0 .t

II. Phơng pháp tiến hành.
- Lấy váng dấm ở bình nuôi vi khuẩn axetic.
- Pha loÃng 10-5.
- Cấy 0,1 ml dịch thể lên 3 đĩa môi trờng có thạch.
- Dùng que trang thuỷ tinh trang đều khắp mặt thạch.
- ủ trong tủ ấm ở 300C. Sau 48 giờ thấy khuẩn lạc xuất hiện.
- Xác định số khuẩn lạc (phơng pháp CFU).

III. Kết quả.
Với phơng pháp tiến hành nh trên chúng tôi thu đợc kết qu¶ ë b¶ng 2
B¶ng 2: Sinh trëng cđa vi khn.
MÉu pha
loÃng

Thời gian
(giờ)

10-5

48

Số khuẩn
lạc các đĩa
69
105
75

Tổng
khuẩn lạc

X

249

Từ kết quả ở bảng 2 ta thấy:
Số khuẩn lạc là:
N (CFU / ml ) 

Trong ®ã:

X .V
v

V: ThĨ tÝch pha lo·ng.
v: ThĨ tÝch ®Ĩ nuôi cấy.

14

(khuẩn
lạc)

CFU/ml

P (%)

v
(%/ngày)

83

8,3 x 10-3

436,40

22,96


ë b¶ng 2: Cho ta thÊy víi mÉu pha lo·ng 10 -5 sau 48 giờ thu đợc số
khuẩn lạc khá lín 8,3 x 10-3 CFU/ml. Nh vËy sù sinh trëng của vi khuẩn đạt đợc P(%) = 436,40% sau 48 giờ. Tốc độ sinh trởng tơng đối nhanh phù hợp với
kết quả nghiên cứu của Lơng Đức Phẩm và một số tác giả khác.

Chơng III.

ảnh hởng của nồng độ cơ chất.
I. Đặc điểm.
Nếu nồng độ cơ chất cao tức là lợng đờng trong dịch men cao dẫn đến

tăng áp suất thẩm thấu và làm mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men.
Vì vậy nếu nồng độ dịch men quá ít dẫn đến lợng đờng không đủ cho quá
trình lên men, còn nếu nồng độ dịch men cao dẫn đến lợng đờng d nhiều làm
ức chế quá trình lên men.
II. Phơng pháp tiến hành.
Dung dịch khoai đợc pha ở các nồng độ 5%, 10%, 15% và 20%, cho
vào các bình tam giác và khử trùng ở 1 atm trong 30 phút. Để nguội và cho 5g
men vào, lắc đều. Thí nghiệm trong điều kiện 30 0C. Hàng ngày theo dâi sù
tÝch l axit axetic qua sù thay ®ỉi pH của dung dịch lên men.
III. Kết quả.
Với phơng pháp nghiên cứu nh trên chúng tôi thu đợc kết quả ở b¶ng
nh sau:

15


Bảng 3: ảnh hởng của nồng độ cơ chất.

Cơ chất
5%

10%

15%

20%

Các tham số
0T
Lợng axit axetic

(mg/100ml)

VNaOH 0,1N
10,00
15,00
10,00
10,00
20,00
15,00
40,00
30,00
25,00
55,00
50,00
40,00

11,66

699,60

15,00

900,00

31,66

1899,60

48,33

2899,80

Nhận xét: Nhìn vào bảng 3 ta thấy.
Lợng axit tăng khi nồng độ cơ chất tăng vì nồng độ cơ chất tăng dẫn
đến nồng độ đờng tăng, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình lên men nên lợng
axit axetic tạo ra nhiều:
Kết quả thu đợc là:
* Về độ chua:
- ở 5% đạt 11,66 0T
- ở 10% đạt 15,00 0T
- ở 15% đạt 31,66 0T
- ở 20% đạt 48,33 0T
* Về hàm lợng axetic:
- ở 5% thu đợc 699,60 (mg/100 ml) .
- ở 10% thu đợc 900,00 (mg/100 ml).
- ở 15% thu đợc 1899,60 (mg/100 ml).
16


- ở 20% thu đợc 2899,80 (mg/100 ml).
Nh vậy là với nồng độ cơ chất là 20 % thì lợng axit axetic thu đợc là
nhiều nhất: 2899,80 (mg/100 ml).
Qua đồ thị ta thấy rõ hơn điều này (hình 1).
Axit axetic (mg/100ml)
3500

2899,80

3000
2500

1899,60

2000
1500
1000

699,60

900,00

500
0
5

10

15

20

C%

Hình 1. ảnh hởng của nồng độ cơ chất
Nhìn hình 1 ta thấy ở nồng độ cơ chất 20% thu đợc kết quả tốt hơn các
nồng độ cơ chất khác. Nghĩa là:
+ Hơn nồng độ cơ chất 5% là: 2200,20 (mg/100 ml).
+ Hơn nồng độ cơ chất 10% là: 1999,80 (mg/100 ml).
+ Hơn nồng độ cơ chất 15% là: 1000,20 (mg/100ml).

Chơng IV.

ảnh hởng của nhiệt độ.
I. Đặc điểm.
Nhiệt độ có ảnh hởng sâu sắc đến phản ứng enzim. Thông thờng ở điều
kiện tiêu chuẩn, khi tăng nhiệt độ lên thêm 10 0C thì phản ứng tăng gấp 2 lần.
Trong điều kiện thí nghiệm, ở đây chúng tôi cũng tìm hiểu ảnh hởng của nhiệt
độ đến lên men axetic.
II. Phơng pháp tiÕn hµnh.

17


Từ kết quả ở bảng 3 chúng tôi thấy dung dịch có nồng độ cơ chất 20%
đạt kết quả cao nhất. Từ đó sử dụng nồng độ này để tìm hiểu ảnh hởng của
nhiệt độ, thí nghiệm đợc tiến hành ở điều kiện nhiệt độ 200C và 300C.
III. Kết quả.
Với phơng pháp tiến hành nh trên chúng tôi thu đợc kÕt qu¶ ë b¶ng sau:
B¶ng 4. ¶nh hëng cđa nhiƯt độ.
Thời gian
(Ngày)

Nồng độ cơ
chất (%)

Nhiệt độ
(0C)

Lần phân
tích

VNaOH 0,1N

Lần 1
Lần 2
Lần 3
Lần 1
Lần 2
Lần 3

15,00
20,00
15,00
55,00
50,00
40,00

20
9

20
30

Các tham số
0T
Lợng
axit
axetic
(mg/100ml)

16,66

999,60

48,33

2899,80

Nhận xét: Qua bảng 4 ta thấy:
ở cùng nồng độ cơ chất 20% phản ứng tạo axit axetic ở 20 0C và 300C
có thay đổi sau 9 ngày.
* Về độ chua.
- ở 200C đạt 16,66 0T
- ở 300C đạt 48,33 0T
* Về hàm lợng axetic
- ở 200C thu đợc hàm lợng axetic: 999,60 mg/100ml.
- ở 300C thu đợc hàm lợng axetic: 2899,80 mg/100ml.
Kết quả này ta sẽ thấy rõ hơn ở đồ thị sau (hình 2)
3500

Axit axetic
(mg/100ml)

2899,80

3000
2500
2000
1500
1000

999,60

500
0
20

30

Hình 2. ảnh hởng của nhiệt độ

18

C

0


Qua hình 2 ta thấy, rõ ràng ở 300C hàm lợng axetic thu đợc nhiều hơn ở
200C, nghĩa là cao hơn 1900,20 (mg/100ml) axetic.

Chơng V.

ảnh hởng của thời gian
Để biết đợc khả năng lên men tạo axit axetic, chúng tôi tìm hiểu sự tích
luỹ axit axetic trong thời gian lên men bằng theo sự biến đổi pH trong dịch lên
men.
Với điều kiện nhiệt độ môi trờng không đổi (300C) và nồng độ cơ chất
là 20% chúng tôi thu đợc kết quả nh sau (bảng 5)
Bảng 5. Biến đổi pH trong thời gian lên men.

Thời gian
Số ngày
pH dich lên men
18/2
1
7
21/2
3
4
24/2
6
4
27/2
9
3
2/3
12
3
5/3
15
3
8/3
18
4,5
11/3
21
4,5
14/3
24
5

17/3
27
5
Nhận xét: Từ bảng 5 cho thấy:
- Ban đầu pH = 7
- Sau 3 ngày pH giảm xuống còn: 4
- Sau 6 ngày pH giữ nguyên: 4
Sau 9 ngày pH giảm xuống bằng 3 và duy trì tiếp trong những ngày sau.
- Sau 18 ngày pH lại tăng lên và tăng lên ở các ngày sau đó.
19


Nh vậy: Sau 9 ngày pH giảm mạnh (pH = 3) vµ sau 6 ngµy pH cịng
b»ng 3. Chøng tá sau 9 ngày axit axetic đợc tích luỹ nhiều nhất và lợng đó đợc
duy trì trong 6 ngày, sau đó thì tăng lên dần.
Điều đó cho thấy với điều kiện thí nghiệm ở trên thì sau 9 - 15 ngày có
axit axetic là nhiều nhất. Nếu tiếp tục cho lên men thì axit axetic cso thể bị oxi
hoá dẫn đến hàm lợng giảm.
Kết quả có thấy rõ hơn ở đồ thị sau (Hình 3)
8 pH
7

7

6
5

4

4

4

3

3

3

3

9

12

15

4,5

4,5

18

21

5

5

24

27

2
1
0
1

3

6

t(ngày)

Hình 3: Biến đổi pH trong thời gian lên men
Qua hình 3 ta thấy rõ:
Sự đi xuống của đồ thị, tức là sự giảm pH, có nghĩa là sự tích luỹ axit
axetic tăng dần nhng đến một thời điểm cân bằng và đó là thời điểm phải thu
nhận axit axetic (9 - 15 ngày).

Chơng VI.

ảnh hởng của mật độ vi sinh vật
I.

Đặc điểm.

20