Tải bản đầy đủ (.ppt) (20 trang)

slide Thiết kế khung bê tông cốt thép nhà dân dụng

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.16 MB, 20 trang )

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

PHẠM THỊ NHÀN
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR TRONG VIỆC
PHÁT HIỆN CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA E.COLI
GÂY TIÊU CHẢY Ở NGƯỜI
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN
Người hướng dẫn khoa học: ThS. NGUYỄN PHÚ HÙNG

THÁI NGUYÊN - 2010
NỘI DUNG BÁO CÁO
1. Mở đầu
2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
3. Kết quả và thảo luận
3. Kết quả và thảo luận
4. Kết luận và kiến nghị
4. Kết luận và kiến nghị
MỞ ĐẦU
MỞ ĐẦU
Tiêu chảy là một vấn đề sức khỏe toàn cầu. Một trong những
Tiêu chảy là một vấn đề sức khỏe toàn cầu. Một trong những
nguyên nhân phổ biến gây tiêu chảy ở trẻ em là do vi khuẩn
nguyên nhân phổ biến gây tiêu chảy ở trẻ em là do vi khuẩn
E.coli.
E.coli.
Việc xác định nhanh các nhóm
Việc xác định nhanh các nhóm
E.coli
E.coli


bằng các kỹ thuật có độ
bằng các kỹ thuật có độ
nhạy và độ đặc hiệu cao sẽ có ý nghĩa rất quan trọng trong việc
nhạy và độ đặc hiệu cao sẽ có ý nghĩa rất quan trọng trong việc
lựa chọn phương pháp điều trị thích hợp cho bệnh nhân.
lựa chọn phương pháp điều trị thích hợp cho bệnh nhân.
Có nhiều phương pháp được sử dụng để xác định
Có nhiều phương pháp được sử dụng để xác định
E.coli
E.coli
gây tiêu
gây tiêu
chảy. Trong đó, PCR là phương pháp được sử dụng hữu hiệu
chảy. Trong đó, PCR là phương pháp được sử dụng hữu hiệu
nhất.
nhất.



Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện
Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện
đề tài
đề tài


Ứng dụng kỹ thuật PCR trong việc phát hiện các
Ứng dụng kỹ thuật PCR trong việc phát hiện các
gen độc lực của
gen độc lực của
E.coli

E.coli
gây tiêu chảy ở người”.
gây tiêu chảy ở người”.



MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Sử dụng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc
hiệu nhằm phát hiện các gen độc lực của 5
nhóm E.coli gây bệnh tiêu chảy ở người, làm
tiền đề cho việc tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán
các nhóm E.coli gây tiêu chảy.
MỞ ĐẦU
MỞ ĐẦU
NỘI
DUNG
NGHIÊN
CỨU
Tách DNA tổng số từ khuẩn lạc
E.coli
Khuếch đại các gen độc lực đặc
trưng của 5 nhóm E.coli
MỞ ĐẦU
MỞ ĐẦU
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU


1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Các chủng
Các chủng
E.coli
E.coli
chuẩn Quốc tế do Phòng
chuẩn Quốc tế do Phòng
Vi khuẩn đường ruột - Viện Vệ sinh dịch tễ
Vi khuẩn đường ruột - Viện Vệ sinh dịch tễ
Trung ương cung cấp, gồm có: EPEC, EHEC1,
Trung ương cung cấp, gồm có: EPEC, EHEC1,
EHEC2, EIEC, ETEC, EAEC và EC (chủng đối
EHEC2, EIEC, ETEC, EAEC và EC (chủng đối
chứng không có gen độc lực).
chứng không có gen độc lực).
2. PH NG PHÁP NGHIÊN C UƯƠ Ứ
2. PH NG PHÁP NGHIÊN C UƯƠ Ứ
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU


Điện di
kiểm tra
sản phẩm
trên gel
agarose
Điện di
kiểm tra
sản phẩm
trên gel

agarose
Các
chủng
E.coli
chuẩn
Quốc tế
Các
chủng
E.coli
chuẩn
Quốc tế
Nuôi cấy
qua đêm
trên
môi trường
MPA đặc,
thu
khuẩn lạc
Nuôi cấy
qua đêm
trên
môi trường
MPA đặc,
thu
khuẩn lạc
Tách
DNA
trực tiếp
từ
khuẩn lạc

Tách
DNA
trực tiếp
từ
khuẩn lạc
Khuếch đại
gen
bằng
phản ứng
PCR
Khuếch đại
gen
bằng
phản ứng
PCR
Hình 2.1. Sơ đồ các bước được thực hiện trong quá trình nghiên cứu
Bảng 2.1. Các trình tự mồi được sử dụng trong các phản ứng PCR
Gen
độc lực
Cặp mồi
(primer)
Trình tự primer (5’ → 3’)
Kích thước
sản phẩm
PCR (bp)
vt2
VT2 - F
VT2 - R
ACCGTTTTTCAGATTTTGCACATA
TACACAGGAGCAGTTTCAGACAGT

298
vt1
VT1 - F
VT1 - R
GAAGAGTCCGTGGGATTACG
AGCGATGCAGCTATTAATAA
130
elt
LT - F
LT - R
TCTCTATGTGCATACGGAGC
CCATACTGATTGCCGCAAT
322
eae
eae - F
eae - R
CACACGAATAAACTGACTAAAATG
AAAAACGCTGACCCGCACCTAAAT
376
IpaH
IpaH - F
IpaH - R
GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCC
GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC
620
EAST1
EA - F
EA - R
CTGGCGAAAGACTGTATCAT
CAATGTATAGAAATCCGCTGTT

630
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 Nước khử ion 12,5
2 PCR Buffer (10X) 2,5
3 dNTPs (25mM) 2
4
MgCl
2

(25mM)
2,5
5 Mồi xuôi (10pM/mồi) 1
6 Mồi ngược (10pM/mồi) 1
7 DNA khuôn 3
8 Taq DNA polymerase (5 unit/µl) 0,5
Tổng thể tích 25
Các
bước
Nhiệt
độ
Thời
gian
Số chu
kỳ
Tác
dụng
1 94
0
C 3 phút 1 Biến tính

2
94
0
C
52
0
C
72
0
C
1 phút
1 phút
1 phút
30
Biến tính
Gắn mồi
Tổng hợp chuỗi
3 72
0
C 10 phút 1 Tổng hợp chuỗi
4 4
0
C ∞ Ổn định mẫu
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. KẾT QUẢ TÁCH DNA TRỰC TIẾP TỪ KHUẨN LẠC
DNA được tách chiết trực tiếp từ khuẩn lạc E.coli bằng
phương pháp của Cebula và cộng sự (1995) có cải tiến
cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm.
Ưu điểm: - Tổng thời gian tách DNA là 25 phút.

- Không phải tiêu tốn nhiều hóa chất.
- Lượng DNA thu được là rất nhỏ, nên có thể
sử dụng trực tiếp để làm khuôn cho các phản ứng PCR (3
µl/1 phản ứng) mà không cần tiến hành pha loãng.
2. KHUẾCH ĐẠI CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA CÁC NHÓM E.COLI
2.1. Gen độc lực eae
603 bp
270 bp
M 1 2 3 4 5 6 7
376 bp
872 bp
Hình 3.1. Kết quả khuếch đại gen eae
M. Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1. EPEC; 2. ETEC; 3. EHEC1;
M. Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1. EPEC; 2. ETEC; 3. EHEC1;
4. EAEC; 5. EHEC2; 6. EIEC; 7. EC
4. EAEC; 5. EHEC2; 6. EIEC; 7. EC
2.2. Gen độc lực vt1
M 1 2 3 4 5 6 7
130 bp
Hình 3.2. Kết quả khuếch đại gen vt1
M. Marker ФX 174 cắt bằng Hae III
M. Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1. EHEC1; 2. EC; 3.
EAEC;
4. EPEC; 5. EHEC2; 6. EIEC; 7. ETEC
2.3. Gen độc lực vt2
Hình 3.3. Kết quả khuếch đại gen vt2
M. Marker ФX 174 cắt bằng Hae III
M. Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1. EHEC1; 2. EHEC2; 3.
EPEC;
4. ETEC; 5. EIEC; 6. EAEC; 7. EC

298 bp
M 1 2 3 4 5 6 7
2.4. Gen độc lực elt
Hình 3.4. Kết quả khuếch đại gen elt
M. Marker ФX 174 cắt bằng Hae III
M. Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1. EPEC; 2. EHEC1;
3. EHEC2; 4. ETEC; 5. EAEA; 6. EIEC; 7. EC
322 bp
M 1 2 3 4 5 6 7
2.5. Gen độc lực IpaH
Hình 3.5. Kết quả khuếch đại gen IpaH
M. Marker ФX 174 cắt bằng Hae III
M. Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1. EPEC; 2.
EIEC;
3. EHEC1; 4. EHEC2; 5. ETEC; 6. EAEC; 7. EC
620 bp
M 1 2 3 4 5 6 7
2.6. Gen độc lực EAST1
Hình 3.6. Kết quả khuếch đại gen EAST1
M. Marker ФX 174 cắt bằng Hae III
M. Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1. EPEC; 2. EHEC1;
3. EHEC2;4. EIEC; 5. ETEC, 6. EAEC; 7. EC
630 bp
M 1 2 3 4 5 6 7
Bảng 3.1. Kết quả khuếch đại các gen độc lực của 5 nhóm E.coli
EPEC EHEC1 EHEC2 EAEC EIEC ETEC EC
eae + + + - - - -
vt1 - + - - - - -
vt2 - - + - - - -
IpaH - - - - + - -

EAST1 - - - + - - -
elt - - - - - + -
Ghi chú: EHEC1 và EHEC2 là hai phân nhóm của nhóm EHEC
+ : Dương tính - : Âm tính
Tóm tắt kết quả khuếch đại các gen độc lực của 5 nhóm E.coli
Gen
Nhóm
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
2. KIẾN NGHỊ
Tiếp tục phát triển nghiên cứu và phát triển thành kĩ thuật mutiplex PCR
để có thể chẩn đoán nhanh tác nhân gây tiêu chảy là E.coli ở người.
1. KẾT LUẬN
Đã tách chiết được DNA tổng số của các nhóm vi khuẩn E.coli bằng
phương pháp tách DNA trực tiếp từ khuẩn lạc, tiết kiệm được nhiều thời
gian và hoá chất nghiên cứu.
Khuếch đại thành công các gen độc lực đặc trưng của 5 nhóm E.coli là:
eae, vt1, vt2, IpaH, elt, EAST1.
Kết quả nghiên cứu này là tiền đề cho nghiên cứu tiếp theo của chúng
tôi để tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán tác nhân gây bệnh là E.coli.

×