nghiên cứu tinh sạch và xác định tiềm năng chống ung thư của piperine từ hồ tiêu đen (piper nigrum l )

 
i

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



Nguyễn Thị Thu Hƣơng



NGHI£N CøU TINH S¹CH Vµ X¸C §ÞNH TIÒM N¡NG
CHèNG UNG TH¦ CñA PIPERINE Tõ Hå TI£U §EN
(PIPER NIGRUM L.)






 2013

 
ii


TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


Nguyễn Thị Thu Hƣơng

NGHI£N CøU TINH S¹CH Vµ X¸C §ÞNH TIÒM N¡NG
CHèNG UNG TH¦ CñA PIPERINE Tõ Hå TI£U §EN
(PIPER NIGRUM L.)







- 2013

 
iii
LỜI CẢM
ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS.
Nguyễn Thị Hồng Vân, người thầy đã tận tình hướng dẫn và khích lệ tinh thần
giúp tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Phạm Thị Lương Hằng và
TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung, những nhà khoa học đã tạo điều kiện tốt nhất,giúp
tôi giải đáp những thắc mắc trong thời gian tiến hành luận văn.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Trần Thị Thùy Anh, ThS. Ngô Thị
Trang và ThS. Bùi Thị Vân Khánh, những cán bộ nghiên cứu đã giành nhiều
thời gian và tâm huyết trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình tiến hành
thí nghiệm.
Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô trong bộ môn Di

truyền, khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà
Nội đã luôn quan tâm, giúp đỡ tôi hoàn thành nghiên cứu.
Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các anh chị, các bạn, các
em trong các phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Di truyền học, Bộ môn Sinh lý thực
vật - Hóa sinh và Bộ môn Sinh học tế bào đã nhiệt tình chỉ bảo, chia sẻ kinh
nghiệm, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập và làm việc.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến những người thân trong gia đình cùng
những người bạn đã hết lòng ủng hộ, cổ vũ và giúp đỡ tôi trong học tập cũng
như cuộc sống, giúp tôi yên tâm hoàn thành công việc.
Hà Nội, ngày 24 tháng 12 năm
2013.
Nguyễn Thị Thu Hương

 
iv
DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu
Viết đầy đủ
ATCC
American Type Culture Collection
CDK
Cyclin dependent kinase
CTHH
Công thc hóa h
CTPT
Công thc phân t
DMEM
Dulbecco's Modified Eagle Medium
FBS
Fetal bovine serum  

HPLC
High performance liquid chromatography - 
IGF - 1
Insulin like Grow Factor-1 - 
IPA
Isopropyl alcohol
LCMS
Liquid chromatography mass spectrometry  
N-hex
N-hexane
MCf  7
Michigan Cancer Foundation - 7
MTT
(3(4,5-dimethylthiazol2yl) 5 (3  carbocymethoxyphenyl) 
2 (4 -sulfophenyl) 2H tetrazolium)
PBS
Phosphate buffered saline
Ppm
Parts per million
Rf
Retardation factor - 
RPMI
Roswell park memorial institute medium
TLC
Thin layer chromatography - S ký b mng
UV
Ultraviolet - Tia cc tím


 

v
DANH MỤC HÌNH
 4
 7
Hình 3. Henrietta Lacks và  11
-7 [38] 12
 13
 15
 16
 [23] 21
 22
 24
 27
 32

- 7  39

 40
 42
 : n-hexane : ethyl acetate (trái )và
n - hexane : ethyl  43
n - hexane : ethyl acetate (trái) hexane :
       
 44
n-hexane : ethyl acetate
 45
 46

 48


 49

 
vi
 50

 53
Hình 
 54
Piperine 2 (P2) 55
  57
 57
-  58
 
µg/ml b) 10 µg/ml c) 1 µg/ml 59
 
µg/ml; b) 10 µg/ml; c) 1 µg/ml 59
 
100 µg/ml b) 10 µg/ml c) 1 µg/ml 60
- 
 60

- 7 61
 64

 65

 65

 66

Hìn
 67


 
vii
DANH MỤC BẢNG

 1. Danh sách 
29
 41

 47

 51
 52
 56

 7 62

50
 7 62

 67

50
 68

 
viii

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 Khái quát về ung thƣ 3
1.1.1  3
1.1.2  4
1.1.3  8
1.1.4  11
1.1.4.1 Hela 11
1.1.4.2 -7 12
1.2 Hồ tiêu (Piper nigrum L.) và Piperine 12
1.2.1  12
1.2.1.1  12
1.2.1.2  14
1.2.1.3  14
1.2.2 Piperine 15
1.2.2.1  15
1.2.2.2   17
1.2.2.3  18
1.3 Kỹ thuật tinh sạch hợp chất và thử độc tính trên tế bào 20
1.3.1  20
1.3.1.1  Thin Layer Chromatography) 20
1.3.1.2  22
1.3.1.3  22
1.3.2  25
1.3.2.1  25
1.3.2.2  25
1.3.2.3  26
1.3.3  27

 
ix
CHƢƠNG 2 – ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29
2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 29
2.2 Hóa chất, thiết bị và sinh phẩm 29
2.2.1  29
2.2.2  30
2.2.3  30
2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 30
2.3.1  30
2.3.2  32
2.3.3  33
2.3.4 
 34
2.3.4.1  34
2.3.4.2  36
2.3.5  37
2.3.5.1  37
2.3.5.2  38
2.3.6 và
MCF  7 38
2.3.6.1  7 39
2.3.6.2  40
CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41
3.1 Kết quả tinh sạch Piperine từ Hồ tiêu đen 41
3.1.1  41
3.1.2  42
3.1.3  45
3.1.4 
 47

3.1.4.1   47

 
x
3.1.4.2  52
3.2 Kết quả nghiên cứu mức độ tác động của Piperine trên một số dòng tế
bào ung thƣ 56
3.2.1  7 56
3.2.2 
MCF  7 57
3.2.3  .
64
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 70
TÀI LIỆU THAM KHẢO 71


 
1
MỞ ĐẦU










tiêu  [8, 21].

Ngay t thi c i, con ngi  bi  dng các lo cây c  nhiên 
cha m s  thông ng   ngoài da, cm máu, ho, s  y h
  phát tri kèm theo là s phát hin r nhi các các lo  c
  khám phá c hàng lo công dng c chúng và sáng t ra hàng trm
ngàn các bài thu cha a vào  ph hp các lo  dc. Tuy nhiên,
  các bài thu  truy  c  phát t kinh nghim dân gian,
   s khoa h  v tác d   thu 
, các loài  dc h   có thành ph , bao gm  thành
ph có  sinh h  không có  tính sinh h  chí là
thành ph gây    qu cha b  tho dc 
.   ph nhng nh này, các chng trình sàng l 
c  hành da trên vi phân tích thành ph th dc, t  tìm ra thành
 có  tính, các  tác d    nó  tinh s và bi chúng thành
các  thu tân c khác nhau [3,6].
Mi  có kho các loài thc v nhi i  c nghiên cu 

 
2
nc phm, do  k ìm kim c các lo hp  các loài nhi
i  ng  cho vi sàng l thu mi là r ln [32]. i  
ti ng khai thác dc  c  Nam, m trong nhng nc i có
mc   thc vrkh quan.
Piper nigrum 


 
“Nghiên cứu tinh sạch và xác định tiềm năng chống ung thƣ của
Piperine từ Hồ tiêu đen (Piper nigrum L. )”tiêu là ti
Piperine   xác


Piperine.











 
3
CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Khái quát về ung thƣ
1.1.1 Khái niệm và hiện trạng
 

               
11/0ng 110 
        
3.
    

lympho không H
                  




  
 hình thành 


 [26]
 hình thành h
lên nhau. K 

 hình thành 
(Hình 1) [2, 13, 31] khác nhau


 
4


 [29].

Hình 1. Quá trình phát sinh và di căn ung thƣ [31]
  thành 3



0. [12].
1.1.2 Cơ chế di truyền gây bệnh ung thư
 hình thành là 
4 pha: G1, S, G2
và M
    .


 
5

là 

 
ch
.
              

 
h  
 
protein  
phân bào. 

v – sis v
– sis               

 hình thành 
M


 

sang  Gen c – ras 
                   



 
6
  
  
(anti - 

 Khi các gen 

pRB và gen TP53.Gen pRB 
 
TP53 




  -     
nhau. 

 hình thành 




 


 
.


 

 
7


 hình thành 
máu 
 hình
thành 
  hình
thành 
 (Hình 2) [2, 12, 20].

Hình 2. Các giai đoạn cơ bản của quá trình phát sinh ung thƣ [2, 20]

 







Kích âm 



Hình thành các





 
8
1.1.3 Các phương pháp điều trị
,
tuy n      
                
         
.


  kích th 
.

 tiêu            
chúng. Tuy nhiên
. 


 quá trình tiêu 


 

 h
tiêu 
 
  




 
9
 

 [8, 25].
Va
 

ông y.
 tiêm các 
    
 interferon.        (2006)  ,   
ung th
]. 
 [30].

ch 
 

 


       u   


Hedyotis
diffusa 

30 - 40 cm. 
 - 

 
10
S trong chu trì [53].
               
Ganoderma lucidum, lim.  Hongbo 
(2002)
  
 - 7 [28, 49].
  
V  


p
h

 chính là Piperine 
 
 Piperine 
]
dò-18 [42]
      




c 
nhau trchú 

 
11
1.1.4 Một số dòng tế bào ung thư dùng trong nghiên cứu
1.1.4.1 Dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hela


 -  - 
  - 10% còn 

virus Hepes type II (HVII) và Papiloma virus 16 - 18 và 3 - 33. 
18 - 30, ].

Hình 3. Henrietta Lacks và dòng tế bào Hela [4]

 (Hình 3)



 


000


 
12
 
 


thanh [14].
1.1.4.2 Dòng tế bào ung thư vú MCF-7


  1 (Insulinlike Grow Factor-
 s ].
Dòng MCF  
  
 , 53]. 
  (Hình 4).

Hình 4. Dòng tế bào ung thƣ vú MCF-7 [38]
1.2 Hồ tiêu (Piper nigrum L.) và Piperine
1.2.1 Hồ tiêu (Piper nigrum L.)
1.2.1.1 Đặc điểm sinh học
  , , 
Piper nigrum L.,  cây leo có hoa   (Piperaceae

 
13
   (Hình 5).
 có thâkhông mang lông, bám vào các cây khác
 


Hình 

 , 




3.5 - 5
mm. 





, . 








  , 



  . 

,
p










 .   ,






 .  , 







 a
, [3, 21].
 .
 . 








 , ,


, , 







 



.
 :  , 

, , ,
 ,  . 
  . 









, 

. , 2 - 3 


, ; , 










 . 


, 



.

Hình 5. Cây và quả Hồ tiêu

 
14
K 




 , 










, 





 , 



19 - 66 µm, 
. 










 , 



20 - 30 µm, n
ông,  .   , ,
 .  

, ,




51 - 75 µm. , 

ng  .
   


               
 (hay                

               
   


  [1, 3].
1.2.1.2 Thành phần hóa học
 methylene 

 [15]. 
       Piper nigrum L. là piperine, sesquisabinene,
piperylin, cubebin, pipertine, piperoleins A và B [48].
1.2.1.3 Ứng dụng
Tiêu thm, cay nng thng c  ng làm gia v có kh ng kích thích
tiêu hóa, kích thích và tng chc ng ho ng  d dày do ng d v và dch
. 

 
15
ông y,  
tiêu tiêu tiêu  có tác d kh
trùng, ch viêm nhim, gim  ch nôn, long m, h  gim xung
huy da, lu thông máu, gi m cho  th, tn gim cm giác s hãi, b
chn, lo lg Nhng nghiên cu mi  còn ch     en có tác
dng trong vi phòng chng ung t và các b v tim m [1, 3, 40].
1.2.2 Piperine
1.2.2.1 Nguồn gốc, cấu trúc và tính chất hóa học
Hans Christian Orsted 
  Piper nigrum L.   
Piper longum L.; Piper retrofractum Vahl.; Piper clusii C.D.C. 
cây Piper geniculatum. Piperaceae (Hình 6).

Hình 6. Cấu trúc hóa học của Piperine [31]
CTPT: C17H19 NO3
Tên IUPAC: 1[5(1,3-Benzodioxol-5- yl)-1-oxo-2,4-pentadienyl] piperidine

Piperine 
khét. Piperine 
 
0
 

2
SO
4
 [23, 40].
 7. 