đề cương kháo sát dòng lúa tẻ mới chọn tạo kháng bệnh bạc lá

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC





TIỂU LUẬN MÔN
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC
ĐỀ CƯƠNG “Khảo sát, đánh giá các dòng giống lúa tẻ mới chọn tạo có
năng suất, chất lượng cao kháng bệnh bạc lá bằng chỉ thị phân tử DNA”
GVHD PGS.TS VŨ ĐÌNH HÒA
Học viên thực hiện : NGUYỄN THỊ LƯƠNG
Lớp : CNSHC – CH23
Mã Học viên : 23030530
HÀ NỘI – 2013
PHẦN I: MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Nông nhiệp có vai trò rất quan trọng trong nền kinh tế Việt Nam và sản xuất lương
thực là ngành quan trọng nhất trong nông nghiệp , là giá đỡ của nền kinh tế Việt. Lúa là cây
trồng chủ lực có diện tích thu hoạch năm 2012 đạt 7,75 triệu ha với năng suất bình quân 5,63
tấn./ha, sản lượng 43,66 triệu tấn ( GSC,2013). Vấn đề chọn tạo giống là khâu trọng yếu, đột
phá trong chuỗi liên kết nâng cao giá trị xuất khẩu gạo. Những giống có năng suất thấp dần
được thay thế bằng những giống cho năng suất cao hơn, chất lượng tốt hơn. Và đến nay
những giống lúa cho năng suất cao, chất lượng đang dần chiếm lĩnh thị trường. Đó là mục
tiêu mà các nhà chọn giống hướng tới.
Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae ( Xoo) gây ra là một
trong những bệnh gây hại nghiêm trọng đối với nhiều vùng trồng lúa trên thế giới đặc biệt đối
với những vùng nhiệt đới có trình độ thâm canh cao ( Zhang Qi, et al 2007). Ở miền Bắc Việt
Nam bệnh phát sinh phát triển ở hầu hết các vụ trồng lúa. Tuy nhiên bệnh hại vụ mùa nặng
hơn vụ xuân. Cây lúa có thể giảm 20- 25% khi bệnh hại phát triển sớm và hại lá đòng

( Mohiuddin, et al 1997). Để phòng trừ bệnh , người ta đã sử dụng một số biện pháp như xử
lý hạt giống trước khi gieo, bón phân cân đối, sử dụng thuốc hóa học. Tuy nhiên sử dụng
giống kháng bệnh đã đem lại hiệu quả kinh tế hơn cả vì không gây ô nhiễm môi trường và tạo
ra nông sản sạch, chi phí cho công tác phòng trừ ít, không tốn kém.
Hiện nay đã xác định được 30 gen kháng bệnh khác nhau. Tương ứng với mỗi gen
kháng bệnh cũng tồn tại nhiều chủng bệnh khác nhau tùy từng vùng sinh thái trồng lúa,có gen
kháng được chủng này nhưng lại nhiễm chủng khác, hoặc mỗi gen có thể bị nhiễm hoặc
kháng nhiều chủng( Xu J L, 2007, Zhang, Qi, 2007). Hướng chọn tạo giống lúa tẻ năng suất,
chất lượng, và kháng bệnh bạc lá . Nhận thấy rằng chọn tạo giống lúa năng suất cao, chất
lượng tốt, kháng bệnh là con đường đi ngăn nhất, an toàn nhất cho nông nghiệp bền vững.
Nhằm chủ động đề xuất một số giống lúa thuần trong mạng lưới khảo nghiệm cho các tỉnh
phía Bắc phát triển sản xuất chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Khảo sát đánh giá các
dòng, giống lúa tẻ năng suất, chất lượng kháng bệnh bạc lá bằng chỉ thị phân tử DNA”
2. Mục đích và yêu cầu
2.1.Mục đích
- Tuyển chọn được 2- 3 dòng, giống lúa có năng suất cao, chất lượng tốt, kháng bệnh
bạc lá, đưa đi khảo nghiệm quốc gia.
2.2.Yêu cầu
- Đánh giá một số đặc điểm sinh trưởng, phát triển của các dòng giống tham gia thí nghiệm.
- Đánh giá mức độ nhiễm sâu bệnh hại lúa của các dòng giống tham gia thí nghiệm.
- Đánh giá các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các dòng giống tham gia thí
nghiệm.
- Đánh giá cảm quan chất lượng cơm, gạo đối với các dòng , giống tham gia thí nghiệm.
- Xác định gen kháng bệnh bạc lá thông qua chỉ thị phân tử DNA.
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về cây lúa
2.1.1. Nguồn gốc phát sinh
Người ta cho rằng tổ tiên của chi lúa Oryzae là một cây hoang dại trên siêu lục địa
Gondwana cách đây ít nhất 130 triệu năm và phát tán rộng khắp các châu lục. Hiện nay có
khoảng 21 loài cây hoang dại thuộc chi này và 2 loài lúa được thuần hóa là lúa châu Á (

Oryza sativa) và lúa châu Phi ( Oryzae glaberrima)
2.1.2. Phân loại thực vật
Cây lúa ( Oryza spp.) là một trong năm cây lương thục hàng đầu thế giới cùng với
Ngô ( Zae mays L), lúa mì ( Triticum sp.), sắn ( Manihot esculenta Crants) và khoai tây
( Solanum tuberosum )
Về phân loại thực vật, cây lúa thuộc:
- Giới( kingdom/regnum): Thực vật ( Plantae)
- Ngành (phyla): Thực vật có hoa ( Angiospermae)
- Lớp( class): thực vật một lá mầm ( Monocots)
- Bộ(ordo) : Hòa thảo ( Poales)
- Họ ( familia): Hòa thảo ( Poaceae)
- Chi ( genus): Lúa( Oryza)
- Loài ( Species): Lúa châu Á : Oryzae sativa
Lúa châu Phi : Oryzae glaberima
- Phân loài/ thứ ( subspecies): Lúa nhiệt đới: Oryza sativa var indica
Lúa ôn đối: Oryza sativa var japonica
Lúa rẩy: Oryza sativa var javanica
2.2.3. Tình hình nghiên cứu và phát triển lúa gạo
a) Tình hình nghiên cứu và phát triển lúa gạo trên thế giới
b) Tình hình nghiên cứu và phát triển lúa gạo ở Việt Nam
2.2. Tổng quan về bệnh bạc lá lúa
2.2.1. Nguyên nhân gây bệnh bạc lá lúa
Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae viết tắt Xoo (Zhang Qi,
2007. Bệnh đượcphát hiện đầu tiên ở Nhật bản vào năm 1884-1966. Hiện nay phổ biến hầu
hết các nước trồng lúa như: Nhật bản, Trung Quốc, Ấn độ, Philipin Ở Việt Nam bệnh
được phát hiện từ lâu trên những giống lúa mùa cũ, đặt biệt từ những năm 1965- 966 trở lại
đây. Bệnh thường xuyên phá hại nặng ở các vùng trồng lúa miền Bắc, nơi gieo trồng các
giống nhập nội có năng suất cao hơn cả vụ xuân lẫn vụ mùa nhưng đặc biệt hại nghiêm trọng
ở vụ mùa ( Vũ Triệu Mân và cs, 1998; Lê Lương Tề và cs, 2007)
2.2.2. Tác hại của bệnh

Mức độ hại phụ thuộc vào giống, thời ký nhiễm bệnh sớm hay muộn và mức độ bệnh
nặng hay nhẹ. Tác hại chủ yếu của bệnh làm cho lá bị cháy khô làm chết ảnh hưởng đén khả
năng quang hợp của cây, tăng tỷ lệ hạt lép, dẫn đến giảm năng suất. Theo nghiên cứu của
Sharma et al ( 1984) về thời gian nhễm bệnh cho thấy năng suất lúa có thể giảm 54- 57% nếu
bệnh phát triển sớm vào thời gian đẻ nhánh tối đa, giảm 30- 48% khi bệnh phát triển thời kỳ
đòng va giảm 29- 38 khi bệnh phát triển vào thời kỳ nở hoa.
2.2.3. Triệu chứng
Bệnh bạc lá lúa xuất hiện và phá hoại suốt thời kỳ mạ đến đẻ nhánh.
- Trên mạ: vết bệnh dài ngắn khác nhau. , có màu xanh vàng, nâu bạc rôi khô xác.
- Trên cây lúa : Vết bệnh xuất hiện mép lá , mút lá sau đó lan dần và trong phiến
lá, kéo dài theo gân chính, cũng có khi xuất hiện ở phiến lá rồi lan rộng ra, mô bệnh chuyển
xanh tái, vàng lục, nâu, bạc khô và chết.
Kết quả nghiên cứu của Bộ môn bệnh cây- Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội cho
thấy có hai loại hình triệu chứng của bệnh bạc lá lúa: bạc lá gợn vàng và bạc lá tái xnh, loại
hình bạc lá gợn vàng là phổ biến trên hầu hết các giống ở vụ mùa, còn loại hình bạc lá tái
xanh thường chỉ xuất hiện trên một số giống lúa mẫn cảm, ngắn ngày, chịu phân, phiến lá to,
thế lá đứng, ví dụ như T1, X1, NN27.( Vũ Triệu Mân và cs 1998)
2.2.4. Cơ sở khoa học của chọn giống lúa kháng bệnh bạc lá
Vào những năm 80, viện nghiên cứu IRRI đã xác định bản chất di truyền tính kháng
là do gen quy định.Cho tới tháng 5 năm 2005 đã có khoảng 30gen được đăng ký báo cáo
trong đó có 21gen trội và 9 gen lặn. Các gen như Xa5, Xa7, Xa 13, Xa 24, Xa 26, Xa
28 Tính kháng bệnh của một cá thể được kiểm tra bởi một cá thể được kiểm tra bởi một
gen trội đơn hoặc gen lặn đơn, hoặc bởi hai gen. Nhiều gen được nghiên cứu trong ứng dung
chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá. Một số gen đã xác định bằng chỉ thị phân tử như gen Xa4
liên kết với RFLP ở locus Nbp1881 va Npb 78 trên nhiễm sắc thể 11 ( Yoshida et al, 1992)
với khoảng cách 1,7cM. Gen Xa 7 liên kết với RFLP ở locus P3 trên nhiễm sắc thể 6 ( Taure,
et al, 2003) với khoảng cách liên kết 2,5cM.
2.2.5. Phương pháp PCR trong chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá lúa
Trong các phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử khác nhau thì PCR là phương pháp
phổ biến và được áp dụng nhiều hơn trong công tác chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá

lúa. Phan Hữu Tôn và cs đã ứng dụng kỹ thuật PCR để phát hiện gen kháng bệnh bạc lá lúa
của 500 giống lúa địa phương thu thập ở miền Bắc- Việt Nam qua đó xác định được 56 giống
chứa gen Xa4, 36 giống chứa gen Xa5, 16 giống chứa gen Xa7, Không có giống nào hứa gen
Xa21.
PHẦN III:
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu
- Gồm 30 giống lúa tẻ mới chọn tạo và giống đối chứng là Khang dân 18.
3.2 Nội dung nghiên cứu
- Đánh giá một số đặc điểm nông sinh học trong tập đoàn mẫu giống nghiên cứu.
- Đánh giá chất lượng gạo cảm quan.
- Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá bằng lây nhiễm nhân tạo.
- Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA phát hiện gen kháng bệnh bạc lá hữu hiệu Xa4, Xa 7
3.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm : Khu ruộng thí nghiệm Trung tâm bảo tồn và phát triển nguồn gen
Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học phân tử, Khoa Công nghệ sinh học,
Học viện Nông nghiệp Việt Nam
- Thời gian nghiên cứu: từ 2015 đến 2016
3.4 Phương pháp nghiên cứu
Nội dung 1: Đánh giá đặc điểm nông sinh học theo phương pháp tiêu chuẩn IRRI.
- Chỉ tiêu đánh giá:
 Thời gian sinh trưởng: ngày gieo mạ đến khi 85% số hạt/tất cả các bông
chuyển màu vàng.
 Chiều cao cây cuối cùng: đo từ gốc đến mút đầu bông cao nhất
 Chiều dài rộng lá đòng
 Năng suất và các yêu tố cấu thành năng suất gồm có:
+ Số bông hữu hiệu/ khóm
+ Số hạt/bông
+ Số hạt chắc/ bông
+ Trọng lượng 1000 hạt

+ Năng suất cá thể ( NSCT)
NSCT =( số bông hữu hiệu/ khóm X số hạt chắc/ bông X TL1000 hạt) X 10
-3
 Tỷ lệ gạo lật
 Tỷ lệ gạo nguyên
 Tỷ lệ gạo xát
 Chiều dài, rộng hạt gạo
 Hàm lượng amylose
Nội dung 2: Đánh giá chất lượng gạo cảm quan
Theo tiêu chuẩn 10TCN 590- 2004
Nội dung 3: Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá bằng lây nhiễm nhân tạo
Sử dụng 10 chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá đang tồn tại ở miền Bắc Việt Nam, 10 chủng
này được bảo quản tại phòng thí nghiệm thuộc bộ môn Sinh học phân tử và CNSH ứng dụng-
Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Bảng 1 : Chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá
STT Chủng Ký hiệu Phân lập
từ giống
Địa điểm thu thập
1 Race 1 HUA 1014 Khang dân Trung Rã- Sóc Sơn - Hà Nội
2 Race 2 HUA 1014 Tẻ thoem Xuân Canh- Đông Anh- Hà Nội
3 Race 3 HUA 2014 Tẻ thơm Tiên Dược- Sóc Sơn- Hà Nội
4 Race 4 HUA 02 Tẻ thơm Cộng Hòa- Chí Linh- Hải Dương
5 Race 5 HUA 5 Khang dân Kim Sơn- Đông Triều- Quảng Ninh
6 Race 6 HUA 2015 Khang dân Kim Sơn- Đông Triều- Quảng Ninh
7 Race 7 HUA 2013-3 Bắc thơm Anh Dũng- Kiến Thụy- Hải Phòng
8 Race 8 HUA 2013-1 Nếp 87 Xuân Thượng- Xuân Trường- Nam
Định
9 Race 9 HUA 2013 Nếp 87 Nam Hồng- Trực Ninh- Nam Định
10 Race 10 HUA 01 Nhị ưu 838 Nam Xá- trực Nonh- Nam Định
- Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường Wakimoto

+ Thành phần môi trường Wakimoto trong 1000 ml gồm: Khoai tây (300g),
Ca(NO
3
)
2
.H
2
O ( 05g), NaHPO
4
. 4 H
2
O( 2,0g), Peton( 0,5g), Saccarose (15g), Agar:17g, PH
6,8-7,0
+ Chuẩn bị môi trường: Khoai tây gọt vỏ, rửa sahj bằng nước cất, thái mỏng, đổ 50ml
nước cất đun sôi 30 phút, lọc lấy dịch chiết, lên thể tích 1000ml. Cân các hóa chất còn lại lần
lượt cho vào dung dịch, khuấy đến đến khi tan hết. Đổ môi trường vào ống nghiệm, đặt
nghiêng, đem hấp khử trùng. Sau 4- 8 h môi trường đông lại, tiến hành cấy vi khuẩn.
Dung dịch vi khuẩn lây nhiễm có nồng độ vi khuẩn từ 10
8
- 10
9
vi khuẩn /ml.
Tiến hành lây nhiễm: cắt đầu lá khi lúa bắt đầu có đòng. Cắt đầu lá sâu 3-5 cm, cắt 10 lá. Lây
nhiễm 10 cây/ giống/ đeo thẻ. Sau 18- 20 Ngày lây nhiễm kiểm tra và đánh giá.
+ <8cm : Kháng bệnh (R)
+ 8-12cm : Kháng vừa (M)
+ >12cm: Nhiễm ( S)
Nội dung 4: Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA phát hiện gen kháng bệnh bạc lá hữu
hiệu Xa4, Xa 7.
- Quy trình tách chiết DNA

- Thành phần của dung dịch chiết tách DNA
Thành phần Nồng độ
dung dịch mẹ
Nồng độ
dung dịch làm việc
Hỗn hợp 50ml
tách chiết
TrisHCl, ph= 8,0 1M 5mM 2,5
EDTA, ph= 8,0 0,5M 0,25mM 2,5
NaCL 5M 300mM 3,0
SDS 10% 1% 5
Nước cất 37
- Quy trình tách chiết
+ Thu lá non vào thời điểm sáng sớm cho vào ống nghiệm và ghi tên.
+ Cắt lá thành mẩu nhỏ bằng kéo vô trùng, nghiễm mẫu bằng cối chày sứ trên đá lạnh.
+ Cho 400µl dung dịch tách chiết DNA, nghiền tới khi dung dịch chuyển màu xanh.
+ Thêm 400 µl dịch chiết tách vào cồi rồi chuyển toàn bộ dung dịch vào ống eppendorf ,
đánh dấu, ghi tên.
+ Thêm 700µl dung dịch Chloroform: phenol: isoalcohol ( 25:24:1), ly tâm 5 phút, 13000
vòng/phút ở 4
0
C
+ Hút chuyển phần dung dịch phía trên vào ống mới, thêm 600 µl hỗn hợp phenol: isoalcohol
( 24:1) ly tâm 13000 vòng/ phút trong 5 phút ở 4
0
C.
+ Chuyển phần dung dịch phí trên sang ống mới , thêm cồn tủa 100 % lạnh , ly tâ thu kết tủa
+ Rửa tủa DNA bằng cồn 70% để khô tự nhiên.
+ Hòa tan tủa DNA bằng dung dịch TE 50µl, bảo quẩn ở - 20
0

C hoặc 4
0
C
Chỉ thị sử dụng phát hiện gen kháng bạc lá Xa4, Xa7
- Tên chỉ thị
Tên
chỉ thị
NST Trình tự mồi Gen
liên kết
Khoảng
cách cM
Tài liệu tham
khảo
Npb18
1
11 F5’- ATCGATCGATCTTCACGAGG-3’
R5’- GTGCTATAAAGGCATTAGGG-3’
Xa4 1,7 Yoshimura,et
al 1991
P3 6 F5’- CAGCAATTCACTGGAGTAGTGGTT-3’
R5’- CATCACGGTCACCGCCATATCGGA-3’
Xa7 2,5 Taure et al
2004
Thiết lập chu kỳ phản ứng với các gen
Chu kỳ hoạt đọng của gen Xa4, Xa7
Bước Nhiệt độ(
0
C) Thời gian( phút)
1 94 4
2 94 1

3 56 1
4 72 2
5 Lặp lại từ bước 2 đến bước 4 34 lần
6 72 8
7 4
8 Kết thúc
Điện di
Trên nền agarose 1,5 %. Hiệu điện thế 5vol/cm
PHẦN IV:
DỰ KIẾN KẾT QUẢ VÀ KẾ HOẠCH LÀM VIỆC
4.1 Dự kiến kết quả đạt được
- Đánh giá đặc điểm nông sinh học của các mẫu giống
- Đánh giá cảm quan chất lượn lúa gạo của các mẫu giống
- Phát hiện mẫu giống chứa gen kháng bệnh bạc lá Xa4, Xa7
- Kết quả đánh giá khả năng kháng bệnh của các mẫu giống qua lây nhiễm nhân tạo
các chủng bệnh.
4.2 Kế hoạch thực hiện
STT Thời gian Công việc dự kiến Ghi chú
1
2
3
4
5
PHẦN V: TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Vũ Triệu Mân, Lê Lương Tề (1998) Bệnh cây Nông nghiệp, NXB Nông Nghiệp Hà
Nội, trang 183- 187
2. Phan Hữu Tôn ( 2001), Ứng dụng phương pháp DNA bằng PCR trên cơ sở RFLP
trong công tác chọn tạo giống lúa chống bệnh, trang 107- 110
3. Phan Hữu Tôn (2005), Công nghệ sinh học trong chọn tạo giống cây trồng, NXB
Nông nghiệp,200 trang

4. Phan Hữu Tôn và cs (2005), Nghiên cứu ứng dụng chỉ thijphaan tử PCr chọn lọc gen
kháng bệnh, Báo cáo khoa học, trang 148
5. Muhiudin MS, verma JP, Rao YP (1997) Loss due o bacterial blight of rice, Indian
[J], Agric, Sci 47(5), pp 221-223
6. Taura S, Sugita Y. Kawahara D, et al (2004), Gene distrbution resistance to bacterial
blight in Nothern Vietnam rice varieties , Abstracts of the 1
st
international Conference
on Bacterial Blight or rice, March 17- 19, 2004, Tsukuba, Janpan.42
7. Zang Qi, Que Gengsheng (2007), Breeding for Resistance to bacterial Blight in Rice,
Genetic DNA iprovement of Resistance to bacterial Blight in Rice ,pp 199-136
8. Yoshida K, Mukoo H( 1961), A method of avaluating resistance or rice to bacterial
leaf blight by multi- needle prik inoculation, Shokubutsu Boeki (Plan prot), 15, pp
343- 346
9. Yoshimura, S Yoshimura, A KoshimotoN, Kawwase , YanoM, Nakagahra M, Ogawa
T, Iwata N (1991) RFLP analysis ott introgressed chromosomal segments in three
near isogenic lines of rice bacterial blight resistance gen, Xa-1, Xa- 3 and Xa-4. 1.
Jpn.gene.67.pp, 29-37