Hoàn thiện công nghệ sản xuất và ứng dụng chế phẩm vi sinh vật xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp làm vật liệu che phủ đất

BÁO CÁO MỘT SỐ KẾT QUẢ DỰ ÁN SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM
HOÀN THIỆN CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VÀ ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM VI SINH
VẬT XỬ LÝ PHẾ PHỤ PHẨM NÔNG NGHIỆP LÀM VẬT LIỆU CHE PHỦ ĐẤT
REPORT RESULTS THE TRIAL PRODUCTION PROJECT PERFECTING
ANUFACTURE TECHNOLOGIES AND APPLICATIONS MICROBIAL PRODUCTS
ROCESSING AGRICULTURAL WASTE PRODUCTS AS SOIL COVER MATERIAL
TS. Hoàng Minh Tâm. ThS. Trần Tiến Dũng
Đơn vị chủ trì: Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Duyên hải Nam Trung bộ
SUMARY
Technology used in the project is modern biotechnology and suitable for the development of
a sustainable agriculture is being government and local development priorities. The project has
selected 04 strains of microorganisms metabolize organic compounds rich in carbohydrates is
SHX01, SHX15, SHX012, SHXDL47; 03 strains of microorganisms convert insoluble phosphate
compound is SHV7, SHV10, SHV17; 05 strains of microorganisms countervailing pathogenic
rhizosphere upland crops is NA1, SHB17, SHB18, SHB19, SHB21. At the same time, has
identified the strains including 06 strains of microorganisms in accordance with the Central South
Coastal conditions as a basis for the production of microbial preparations processing agricultural
waste products as soil cover material is SHX012, SHXDL47, SHX01, SHB17, SHV7, SHY06.
Perfecting processes using of the bio-organic cover substances and inspect and evaluate the quality
of bio-organic overlay and build technological processes produce microbial products processing
agricultural waste products as soil cover material with the full range of specifications, the density of
microbial cells ≥ 10
8
CFU / g. Besides, the project has identified the conditions of storage products,
best used after 3 months of storage, test methods and established basic standards for quality
products.
I. THÔNG TIN CHUNG
Công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh vật (VSV) là kết quả nghiên cứu thuộc đề tài
khoa học công nghệ cấp Nhà nước “Nghiên cứu công nghệ sản xuất phân bón VSV chức
năng phục vụ chăm sóc cây trồng cho một số vùng sinh thái” (Mã số KC04.04) nằm trong
chương trình nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học giai đoạn 2001 - 2005 do Viện Khoa

học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam chủ trì và được Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông
thôn công nhận là tiến bộ khoa học kỹ thuật. Sản phẩm được ứng dụng xử lý nhiều loại cơ
chất hữu cơ như: phân gia súc, bã nấm, thân xác thực vật, phế phụ phẩm của sản xuất nông
nghiệp và một số ngành sản xuất công nghiệp…làm phân bón hữu cơ sinh học và làm
nguyên liệu sản xuất cơ chất hữu cơ vi sinh. Công nghệ sản xuất chế phẩm VSV đã được
hoàn thiện và ứng dụng sản xuất thành công tại tỉnh Nghệ An, Đăklăk.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Các chủng VSV chuyển hoá hợp chất hữu cơ giàu hydratcacbon
+ Phương pháp kiểm tra mật độ: Sử dụng phương pháp Kock, kiểm tra mật độ VSV tổng
số trên môi trường thạch thịt, kiểm tra mật độ xạ khuẩn trên môi trường Gause, kiểm tra mật
độ nấm men trên môi trường Hansen.
+ Phương pháp kiểm tra hoạt hoạt tính: Hoạt tính của VSV được kiểm tra bằng phương
pháp khuyếch tán trên đĩa thạch, trong đó hoạt tính sinh học được xác định bằng đường kính
vòng phân giải; đó là vòng tròn trong suốt bao quanh lỗ thạch (đối với trường hợp khoan lỗ
thạch).
+ Xác định hoạt độ enzym phân giải: Hoạt độ enzym phân giải xenluloza được xác định
thông qua hoạt độ endo- glucanse (CMCase) do VSV sinh tổng hợp.
- Các chủng VSV đối kháng
+ Đánh giá hoạt lực của vi khuẩn đối kháng: Chủng vi khuẩn đối kháng cần kiểm tra được
cấy bằng tăm vô trùng lên điểm giữa của bề mặt môi trường KB (môi trường đặc).
+ Tuyển chọn: Sử dụng phương pháp đục lỗ thạch và cấy chấm điểm
+ Nghiên cứu các đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn đối kháng: Xác định một số
1
đặc điểm sinh lý, sinh hoá của các chủng vi khuẩn đối kháng theo phương pháp của N.W.
Schaad - 2001.
- Các chủng VSV chuyển hóa hợp chất phosphat khó tan
+ Môi trường kiểm tra: Môi trường dùng để kiểm tra mật độ VSV phân giải hợp chất
photpho khó tan được sử dụng là môi trường chứa nguồn photpho duy nhất là Tricanxi
phophat [Ca3( PO4)
2

] hoặc Lexitin.
+ Xác định hoạt độ enzym phân giải: Xác định hoạt tính phân giải photphataza của các
chủng VSV lựa chọn được định thông qua hoạt tính enzym phytase (cơ chất chứa photphat
hữu cơ) bằng dung dịch màu Amonium molypdate
- Xác định bộ chủng VSV phù hợp: Sử dụng những kỹ thuật VSV thường quy phòng thí
nghiệm nhằm xác định mật độ và hoạt tính các chủng VSV đã lựa chọn trong điều kiện tổ
hợp.
- Xây dựng và hướng dẫn kiểm tra chất lượng chế phẩm: Phương pháp kiểm tra chất
lượng chế phẩm được xây dựng trên cơ sở các tiêu chuẩn Việt Nam và tiêu chuẩn ngành
TCVN 6168:1996, 6167:1996, 10TCN:714-2006, 10 TCN 867-2006 về chất lượng và
phương pháp kiểm tra chất lượng chế phẩm và phân bón VSV. Kiểm tra chất lượng chế
phẩm thông qua việc xác định mật độ VSV, tính số lượng VSV trên ml hoặc trên g mẫu từ
số khuẩn lạc phát triển trong các đĩa được chọn .
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Lựa chọn chủng giống VSV chuyển hóa hợp chất hữu cơ giàu hydratcacbon phù
hợp với điều kiện vùng DHNTB
3.1.1. Lựa chọn bộ chủng xạ khuẩn vật phân giải cellulose
- Hoạt tính sinh học của các chủng VSV:
Bảng 1: Hoạt tính sinh học của chủng VSV
TT Ký hiệu Đường kính vòng phân
giải CMC (D-d) cm
Đường kính vòng phân giải
tinh bột (D-d) cm
1 SHXDL23 + 1,8
2 SHX02 2,2 +
3 SHXDL47 5,6 2,0
4 SHX04 - 1,8
5 SHX05 - 1,8
6 SHX012 4,8 2,0
Ghi chú: (+): Vòng phân giải nhỏ (<1 cm), (-): Không có hoạt tính

Kết quả kiểm tra hoạt tính phân giải cellulose của các chủng VSV trong bảng 1 cho
thấy chủng SHXDL47 và SHX012 có hoạt tính sinh học phân giải CMC cao nhất. Chủng
SHXDL47 có đường kính vòng phân giải CMC (D-d) = 5,6 cm, Chủng SHX012 có đường
kính vòng phân giải CMC (D-d) = 4,8 cm, kết quả đánh giá c€ng cho thấy ngoài khả năng
phân giải cellulose chủng SHXDL47 và SHX012 còn có hoạt tính phân giải tinh bột (đường
kính vòng phân giải tinh bột của chủng SHXDL47 và chủng SHX012 là (D-d) = 2,0 cm),
tính chất đa hoạt tính sinh học này làm tăng thêm hiệu quả xử lý chất thải hữu cơ khi ứng
dụng trong thực tế. Dựa vào kết quả nghiên cứu thu được dự án lựa chọn chủng SHXDL47
và SHX012 làm vật liệu phục vụ cho nghiên cứu tiếp theo.
- Đặc điểm sinh lý, hình thái các chủng SHXDL47 và SHX012 :
+ Chủng SHXDL47 được tuyển chọn trên môi trường Gauze trong điều kiện nhiệt độ nuôi
cấy 37
0
C. Sau 72-96 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc tròn, có đường kính 2-2,5mm, màu trắng đục,
có mùi thơm ngái, chân khuẩn lạc bám sâu, chặt vào môi trường. Khi được nuôi cấy lắc trên
môi trường dịch thể (Gauze), sau 72 giờ chủng SHXDL47 tạo thành hạt nhỏ kích cỡ ≤ 1
mm, làm trong môi trường nuôi cấy, trên thành bình tạo vòng váng màu trắng và bám chặt
vào thành bình, kết quả kiểm tra mật độ tế bào sau 72 giờ nuôi cấy cho thấy SHXDL47 đạt
2
mật độ ≥ 8.10
8
CFU/ml. Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, sau 72-96 giờ chủng SHXDL47 phát
triển làm môi trường dịch thể chia làm 2 trạng thái, phía dưới ở trạng thái huyền phù, phía
trên trong hơn, bề mặt môi trường không đóng váng, kết quả kiểm tra mật độ tế bào sau 96
giờ nuôi cấy cho thấy SHXDL47 đạt mật độ ≥ 3.10
6
CFU/ml.
+ Chủng SHX012 được tuyển chọn trên môi trường Gauze trong điều kiện nhiệt độ nuôi cấy
370C. Sau 72-96 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc chủng SHX012 tròn, đường kính 2-2,5 mm, rìa
ngoài màu trắng đục, tâm màu xanh, có mùi hắc, chân khuẩn lạc bám sâu, chặt vào môi

trường. Khi được nuôi cấy lắc trên môi trường dịch thể (Gauze), sau 72 giờ chủng SHX012
tạo thành hạt nhỏ kích cỡ ≤ 1 mm, làm trong môi trường nuôi cấy, trên thành bình tạo vòng
váng màu trắng và bám chặt vào thành bình, kết quả kiểm tra mật độ tế bào sau 72 giờ nuôi
cấy cho thấy SHX012 đạt mật độ ≥ 8.10
8
CFU/ml. Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, sau 72-96
giờ chủng SHX012 phát triển làm môi trường dịch thể chia làm 2 trạng thái, phía dưới ở
trạng thái huyền phù, phía trên trong hơn, bề mặt môi trường không đóng váng, kết quả
kiểm tra mật độ tế bào sau 96 giờ nuôi cấy cho thấy SHX012 đạt mật độ ≥ 10
6
CFU/ml.
3.1.2. Lựa chọn bộ chủng xạ khuẩn phân giải tinh bột
- Hoạt tính sinh học của các chủng VSV:
Bảng 2: Hoạt tính sinh học của chủng VSV
TT Ký hiệu
chủng
Đường kính vòng phân giải tinh
bột (D-d) cm
Đường kính vòng phân giải CMC
(D-d) cm
1 SHX01 2,8 1,8
2 SHX12 + 1,6
3 SHX13 + 1,6
4 SHX14 - 2,5
5 SHX15 4,2 2,2
6 SHX16 + 2,2
Ghi chú: (+) Vòng phân giải <1 cm, (-) Không có hoạt tính
Kết quả kiểm tra hoạt tính phân giải tinh bột của các chủng VSV trong bảng 2 cho
thấy chủng SHX01 và SHX15 có hoạt tính sinh học phân giải CMC cao nhất. Chủng
SHX01 có đường kính vòng phân giải CMC (D-d) = 2,8 cm, chủng SHX15 có đường kính

vòng phân giải CMC (D-d) = 4,2 cm, kết quả kiểm tra c€ng cho thấy ngoài khả năng phân
giải tinh bột chủng SHX01 và SHX15 còn có hoạt tính phân giải cellulose (đường kính
vòng phân giải CMC của chủng SHX01 (D-d) = 1,8 cm và chủng SHX 15là (D-d) = 2,2
cm).
- Đặc điểm sinh lý, hình thái các chủng SHX01 và SHX15 :
+ Chủng SHX01 được tuyển chọn trên môi trường Gauze trong điều kiện nhiệt độ nuôi cấy
37
0
C. Sau 72-96 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc tròn, có đường kính 3-4 mm, màu trắng xám, có
mùi thơm ngái, chân khuẩn lạc bám sâu, chặt vào môi trường. Khi được nuôi cấy lắc trên
môi trường dịch thể (Gauze), sau 72 giờ chủng SHX01 tạo thành hạt nhỏ kích cỡ ≤1 mm,
làm trong môi trường nuôi cấy, trên thành bình tạo vòng váng màu trắng và bám chặt vào
thành bình, kết quả kiểm tra mật độ tế bào sau 72 giờ nuôi cấy cho thấy SHX01 đạt mật độ
≥ 8.10
8
CFU/ml. Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, sau 72-96 giờ chủng SHX01 phát triển làm
môi trường dịch thể chia làm 2 trạng thái, phía dưới ở trạng thái huyền phù, phía trên trong
hơn, bề mặt môi trường không đóng váng, kết quả kiểm tra mật độ tế bào sau 96 giờ nuôi
cấy cho thấy SHX01 đạt mật độ ≥4,0
6
CFU/ml.
+ Chủng SHX 15 được tuyển chọn trên môi trường Gauze trong điều kiện nhiệt độ nuôi cấy
37
0
C. Sau 72-96 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc chủng SHX15 tròn, đường kính 2-2,2 mm, rìa
ngoài mọc thành sợi, có mùi hắc, chân khuẩn lạc bám sâu, chặt vào môi trường. Khi được
nuôi cấy lắc trên môi trường dịch thể (Gauze), sau 72 giờ chủng SHX15 tạo thành hạt nhỏ
kích cỡ ≤1 mm, làm trong môi trường nuôi cấy, trên thành bình tạo vòng váng màu trắng và
3
bám chặt vào thành bình, kết quả kiểm tra mật độ tế bào sau 72 giờ nuôi cấy cho thấy

SHX15 đạt mật độ ≥8,10
8
CFU/ml. Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, sau 72-96 giờ chủng
SHX15 phát triển làm môi trường dịch thể chia làm 2 trạng thái, phía dưới ở trạng thái
huyền phù, phía trên trong hơn, bề mặt môi trường không đóng váng, kết quả kiểm tra mật
độ tế bào sau 96 giờ nuôi cấy cho thấy SHX15 đạt mật độ ≥ 10
6
CFU/ml.
3.1.3. Nghiên cứu điều kiện ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng
VSV có khả năng chuyển hóa các hợp chất hydratcabon phù hợp với điều kiện vùng
DHNTB
Bảng 3: Các điều kiện tối ưu cho sinh trưởng và phát triển của các chủng VSV phân
giải hydratcacbon
Các yếu tố Chủng VSV
SHX01 SHX15 SHX012 SHXDL47
pH 7,5
7,0
7,5 7,0
Nhiệt độ (
o
C) 35±2
30±2
35±2 30±2
Thời gian nuôi cấy (giờ) 72 72 72 72
Nguồn C 20g/l 20g/l 20g/l 20g/l
Nguồn N 5g/l
5g/l
5g/l 5g/l
Lưu lượng không khí
(dm

3
không khí/dm
3
môi
trường/ phút)
0,75 0,75 0,75 0,75
Ảnh hưởng tốc độ cánh
khuấy (vòng/phút)
350-400 350-400 350-400 350-400
3.2. Lựa chọn chủng giống VSV chuyển hóa hợp chất phosphat khó tan phù hợp với
điều kiện vùng DHNTB
3.2.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc các chủng VSV
Việc lựa chọn các chủng VSV chuyển hóa hợp chất photphat khó tan có hoạt tính
sinh học cao và ổn định từ các mẫu đã phân lập phù hợp điều kiện vùng DHNTB cho kết
quả.
Bảng 4: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng VSV
STT Kí hiệu chủng Đặc điểm hình thái khuẩn lạc
1 SHV7 Khuẩn lạc màu vàng nhạt, mép không gọn
2 SHV10 Khuẩn lạc màu vàng, mép tròn, gọn
3 SHV17 Khuẩn lạc màu trắng đục, nhỏ, mép không gọn
Bảng 5: Hoạt tính sinh học của các chủng VSV
Kí hiệu chủng Hoạt tính sinh học
Phân giải Ca
3
(PO
4
)
2
(D-d=mm)
SHV7 24

SHV10 20
SHV17 21
Số liệu bảng 4, 5 cho thấy, đã lựa chọn được 3 mẫu VSV có khả năng chuyển hóa
các hợp chất photphat khó tan với hoạt tính cao, ổn định và chủng VSV SHV7 có hoạt tính
sinh học cao hơn chủng SHV10 và chủng SHV17.
3.2.2. Nghiên cứu điều kiện ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng
VSV có khả năng chuyển hóa các hợp chất photphat khó tan phù hợp với điều kiện vùng
DHNTB
Dự án đã tiến hành nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát
triển của các chủng VSV có khả năng chuyển hóa các hợp chất photphat khó tan.
Bảng 6: Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng VSV
phân giải photphat khó tan
4
Các yếu tố Chủng VSV
SHV7 SHV10 SHV17
pH
KCl
7,0 7,0 7,0
Nhiệt độ (
0
C) 30 30 30
Thời gian nuôi cấy (giờ) 48 48 48
Nguồn C 20g/l 20g/l 20g/l
Nguồn N 5g/l 5g/l 5g/l
Lưu lượng không khí (dm
3
không khí/dm
3
môi trường/phút)
0,70-0,75 0,70-0,75 0,70-0,75

Ảnh hưởng tốc độ cánh khuấy (vòng/phút) 400 400 400
3.3. Lựa chọn chủng giống VSV đối kháng VSV gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn phù
hợp với điều kiện vùng DHNTB
3.3.1. Đặc điểm hình thái các chủng VSV đối kháng với VSV gây bệnh vùng rễ cây trồng
cạn
Dự án đã tiến hành tuyển chọn được 5 chủng VSV đối kháng vi sinh gây bệnh vùng
rễ cây trồng cạn phù hợp với vùng DHNTB.
Bảng 7: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng VSV
STT Ký hiệu
chủng
Đặc điểm hình thái khuẩn lạctrên môi trường King B
Hình dạng Kích cỡ Màu sắc
1 NA
1
Tròn, mép gấp nép Trung bình Trắng đục
2 SHB17 Bề mặt sần sùi, mép ko gọn Trung bình Trắng vàng
3 SHB18 Phẳng, nhẵn Trung bình Vàng
4 SHB19 Chảy Trung bình Vàng nhạt
5
SHB21
Tròn, dạng đa đặc
Nhỏ
Vàng
Bảng 8. Hoạt lực đối kháng của các chủng vi khuẩn với đại diện các chủng vi khuẩn
gây bệnh héo xanh R. solanacearum
STT Vi khuẩn gây
bệnh héo xanh
Đường kính vòng ức chế tạo ra bởi các chủng vi khuẩn đối
kháng trên thảm vi khuẩn gây bệnh chỉ thị (cm)
NA1 SHB17 SHB18 SHB19 SHB21

1 BHT1 1,4 2,3 2,2 1,4 1,4
2 TT1 1,4 2,5 2,4 1,6 1,6
3 TH1 1,4 2,3 2,4 1,6 1,8
4 HTV2 1,6 2,6 2,2 1,6 1,4
5 SV2 1,4 2,2 2,4 1,4 1,6
3.3.2. Nghiên cứu điều kiện ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng
VSV có khả năng đối kháng với VSV gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn
Tiến hành nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của
các chủng VSV có khả năng đối kháng với VSV gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn cho kết
quả.
Bảng 9: Điều kiện ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng VSV có
khả năng chuyển hóa
Các yếu tố Chủng VSV
NA1 SHB17 SHB18 SHB19 SHB21
pH 7,5 7,0 7,0 7,0 7,0
Nhiệt độ (
0
C) 30±2 30±2 30±2 30±2 30±2
Thời gian nuôi cấy (giờ) 48 48 48 48 48
Nguồn C 20g/l 20g/l 20g/l 20g/l 20g/l
Nguồn N 5g/l 5g/l 5g/l 5g/l 5g/l
5
Lưu lượng không khí (dm
3
không
khí/dm
3
môi trường/phút)
0,75 0,75 0,75 0,75 0,75
Ảnh hưởng tốc độ cánh khuấy

(vòng/phút)
350-400 350-400 350-400 350-400 350-400
3.4. Lựa chọn bộ chủng giống VSV phù hợp với điều kiện vùng DHNTB
3.4.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc các chủng VSV được tuyển chọn
Tiến hành tổ hợp các cặp đôi, cặp ba, cặp bốn, cặp năm, cặp sáu và chủng SHY06 đã
lựa chọn ra được tổ hợp gồm 6 chủng VSV.
Bảng 10: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng VSV
STT Ký hiệu
chủng
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc
Hình dạng Kích cỡ Màu sắc
1 SHX012 Tròn, bề mặt khô, nhăn, chân khuẩn
lạc bám sâu vào môi trường thạch
2 - 2,5mm Trắng xám
2 SHXDL47 Tròn, bề mặt khô, nhăn, chân bám sâu
vào môi trường
2,5 - 3mm Vàng đen
3 SHX01 Khuẩn lạc tròn, có mùi thơm ngái,
chân bám sâu vào môi trường
2 - 2,5mm Trắng đục
4 SHB17 Khuẩn lạc không tròn đều, có mùi hôi. 1,5 - 2mm Vàng nhạt
5
SHV7
Khuẩn lạc tròn, nhăn, bề mặt khô
2,5 - 3mm
Trắng vàng
6 SHY06 Tròn, lồi, trơn, có mùi thơm 1,5 - 2mm Trắng ngà
Bảng 11: Hoạt tính sinh học của chủng VSV ((D-d) cm)
TT Ký hiệu Đường kính
vòng phân

giải CMC
Đường kính
vòng phân
giải tinh bột
Đường kính
vòng phân giải
phosphat
Đường kính
vòng kháng
VSV gây bệnh
1 SHX012 4,8 2,0 - -
2 SHXDL47 5,6 2,0 - -
3 SHX01 1,8 4,2 - -
4 SHB17 + + - 2,4
5 SHV7 - - 1,8 -
6 SHY06 2,7 3,6 - -
Ghi chú: (+): có hoạt tính, (-): Không có hoạt tính
3.4.2. Các điều kiện ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của bộ chủng VSV phù
hợp với điều kiện Vùng DHNTB
Bảng 12: Điều kiện ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng VSV có
khả năng chuyển hóa
Các yếu tố
Chủng VSV
SHX012 SHXDL47 SHX01 SHB17 SHV7 SHY06
pH 7,5 7,5 7,0 7,0 7,0 7,0
Nhiệt độ (
o
C) 35±2 30±2 35±2 30±2 30±2 30±2
Thời gian nuôi cấy (giờ) 72 72 72 48 48 48
Nguồn C 20g/l 20g/l 20g/l 20g/l 20g/l 20g/l

Nguồn N 5g/l 5g/l 5g/l 5g/l 5g/l 5g/l
Lưu lượng không khí
(dm
3
không khí/dm
3
môi
trường/phút)
0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75
Ảnh hưởng tốc độ cánh
khuấy (vòng/phút)
350-400 350-400 350-400 350-400 350-400 350-400
6
Trên cơ sở kết quả nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men sinh khối
của các chủng VSV và kế thừa các kết quả nghiên cứu đã được thực hiện trước đây, dự án
đã xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm VSV xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp
làm vật liệu che phủ đất.
3.5.Qui trình sản xuất chế phẩm VSV
3.5.1. Sơ đồ qui trình
Các chủng giống gốc ở dạng ống thạch nghiêng bảo quản trong điều kiện lạnh hoặc
chế phẩm gốc. Có thể cấy truyền giống gốc sang ống thạch nghiêng thứ cấp, song phải bảo
đảm tuyệt đối mức độ thuần của chủng giống.
3.5.2. Nội dung quy trình
3.5.2.1. Chuẩn bị
- Dụng cụ, thiết bị:
Bên cạnh các thiết bị dụng cụ sử dụng cho phòng thí nghiệm VSV (thiết bị, dụng cụ
khử trùng, thiết bị dụng cụ nuôi, cấy VSV và thiết bị dụng cụ phục vụ đánh giá kiểm tra
VSV), để sản xuất sinh khối VSV cần hệ thống lên men (nồi lên men, thiết bị lên men xốp),
thiết bị đóng gói và bảo quản chế phẩm VSV.
- Hoá chất, vật tư:

+ Môi trường nhân sinh khối các VSV
+ Môi trường kiểm tra hoạt tính các vi sinh
+ Cơ chất sử dụng cho sản xuất chế phẩm VSV có thành phần chủ yếu là cám gạo đã nghiền
mịn, khô (độ ẩm <12%) được sản xuất từ thóc mới và than bùn không bị nhiễm nấm mốc,
tốt nhất đã được khử trùng
+ Dinh dưỡng là các nguồn cung cấp năng lượng (đường, mật rỉ…), cung cấp N (hợp chất
nitơ vô cơ và hữu cơ) và một số hoạt chất kích thích sự sinh trưởng, phát triển của VSV.
+ Thành phần nguyên liệu của cơ chất xốp được phối trộn với nhau theo tỷ lệ 90% than bùn,
9% cám gạo và 1% rỉ mật
- Khử trùng
+ Các thiết bị, dụng cụ sử dụng trong sản xuất phải tiệt trùng bằng một trong các phương
pháp: Trong tủ sấy ở nhiệt độ từ 170
o
C đến 180
o
C, không ít hơn 1 giờ; Trong nồi hấp áp
lực 1 at (121
0
C), không ít hơn 15 phút.
7
Vi khuẩn PG Xenlulose
Vi khuẩn PG Lân
Nấm men phân giải protein
Kiểm tra hoạt tính các chủng VSV
Giống gốc
chủng 1
Giống gốc
chủng 2
Giống gốc
chủng 3

Lên men cấp 1, 2.
Sinh khối
cấp 2 chủng 1
Sinh khối
cấp 2 chủng 2
Sinh khối
cấp 2 chủng 3
Lên men bề mặt với cơ chất xốp khử trùng hoặc không khử trùng
Chế phẩm VSV
+ Các loại môi trường được pha chế theo thứ tự các hoá chất trong thành phần đã cho. Sau
đó phân phối vào các dụng cụ thuỷ tinh hoặc nồi lên men đã chuẩn bị trước và đưa đi khử
trùng dưới áp lực 1 at (121
0
C) không ít hơn 30 phút.
+ Cơ chất xốp dùng cho sản xuất chế phẩm là than bùn được khử trùng bằng hơi nước bão
hoà trong thời gian 1 giờ.
5.5.2.2. Các bước tiến hành
BƯỚC 1. Kiểm tra đánh giá hoạt tính VSV
Để đảm bảo chất lượng chế phẩm, trước mỗi đợt sản xuất, hoạt tính sinh học của các
chủng VSV cần được kiểm tra đánh giá.
BƯỚC2. Nhân sinh khối cấp I
- Môi trường lên men cấp 1 được pha chế theo đúng thành phần đã hướng dẫn cho từng loại
chủng giống. Hoà tan thành phần môi trường trong nước ấm, điều chỉnh pH cho phù hợp
với yêu cầu từng loại. Phân chia môi trường vào các bình tam giác. Làm nút bông, bọc giấy
sạch và khử trùng bằng hơi nước bão hoà (nồi hấp khử trùng) trong thời gian 20 phút (chú ý
với môi trường có hàm lượng đường cao thời gian khử trùng không quá 15 phút).
- Có thể cấy giống trực tiếp từ ống giống gốc vào các bình tam giác môi trường đã chuẩn bị
sẵn, mỗi bình tam giác 1 vòng que cấy đầy. Tuy nhiên với cách cấy này cần thiết phải lên
men cấp 1 trong thời gian dài hơn. Cách tốt nhất là chuẩn bị giống thứ cấp trước 48-36 giờ
và sau đó cấy trực tiếp từ ống giống thứ cấp. Mỗi bình tam giác cần sử dụng 1 ống giống.

Khử trùng miệng ống giống và miệng bình môi trường. Từ bình tam giác lấy một ít môi
trường cho vào ống giống, sao cho lượng dịch lỏng phủ hết bề mặt lớp thạch nghiềng. Dùng
que gạt gạt hết sinh khối VSV trên bề mặt thạch. Lắc đều và đổ trở lại vào bình tam giác
(các thao tác phải bảo đảm vô trùng tuyệt đối). C€ng có thể nuôi cấy vi sinh trong các ống
nghiệm chứa môi trường lỏng trước 48-36 giờ sau đó sử dụng sinh khối này làm giống gốc.
- Sau khi cấy giống các bình tam giác được đưa lên giàn máy lắc, tốc độ lắc 150-200
vòng/phút. Trong điều kiện 30-40
0
sinh khối VSV đảm bảo yêu cầu sau 48-96 giờ tùy yêu
cầu của từng chủng VSV.
BƯỚC 3. Nhân giống cấp II
- Chuẩn bị môi trường lên men: tương tự như chuẩn bị môi trường cho quá trình lên men
cấp I, tuy nhiên lượng môi trường lên men có số lượng lớn sau đó cho vào các thùng lên
men và đặt chế độ khử trùng tự động trong thời gian 30 phút. Làm nguội môi trường đến
45
0
C÷50
0
C.
- Cấy truyền từ giống cấp 1 sang nồi lên men, lượng dịch cấp 1 cần thiết cho quá trình lên
men cấp 2 là 5,0-10,0% so với lượng môi trường. Dùng đuốc, đền cồn cháy to hoặc đèn gas
khử trùng miệng bình tam giác và nồi lên men. Chuyển sinh khối trong bình tam giác vào
nồi lên men. Chú ý thao tác nhanh dưới đèn khử trùng. Khử trùng bề mặt các điểm nối dây
dẫn khí và lắp đặt hệ thống cấp khí. Chú ý kiểm tra độ an toàn của dây dẫn và nồi lên men
trước khi khởi động máy nén (hệ thống dây dẫn, bộ lọc khí và các nắp đậy nồi lên men phải
được khử trùng và kiểm tra độ vô trùng trước khi sử dụng).
- Nhân sinh khối cấp 2 ở điều kiện phù hợp với nhu cầu sinh trưởng phát triển của từng
chủng VSV thông qua việc điều chỉnh các thông số kỹ thuật của hệ thống lên men. Thời
gian lên men là 24-36 giờ. Trong suốt quá trình nhân sinh khối cần tiến hành kiểm tra độ
thuần và mật độ các VSV theo phương pháp được trình bày chi tiết trong chuyên đề kiểm

tra đánh giá chất lượng chế phẩm VSV. Mật độ VSV đảm bảo khi đạt >10
8
VSV/ml dịch lên
men .
BƯỚC4. Sản xuất chế phẩm VSV
- Hỗn hợp cơ chất xốp và chất dinh dưỡng sau khi khử trùng được phối trộn với sinh khối
VSV từ các quá trình nhân sinh khối cấp 2 và đưa vào các khay lên men (có thể sử dụng túi
bóng đen). Thành phần chính của cơ chất xốp được sử dụng trong sản xuất chế phẩm là cám
8
gạo, than bùn với tỷ lệ 9:1 được phơi khô nghiền mịn (kích thước hạt < 0,5mm), xử lý loại
bỏ tạp nhiễm VSV và trung hoà bằng bột nhẹ sao cho pH đạt 6,8-7,0. Độ ẩm cơ chất xốp
không vượt quá 15%. Để đảm bảo điều kiện dinh dưỡng và môi trường sống tối ưu cho
VSV.
- Bổ sung sinh khối VSV sau quá trình lên men với tỷ lệ các chủng VSV là 1:1:1, liều lượng
hỗn hợp VSV bổ sung vào so với cơ chất xốp là 10-20%. Sau 3 ngày lên men tiến hành đảo
trộn và tiếp tục để VSV phát triển trong khoảng 3 ngày tiếp theo.
- Sản phẩm được coi là đảm bảo chất lượng khi VSV phát triển đều khắp, tạo màu trắng cho
cả khối cơ chất. Hỗn hợp sau khi lên men được sấy ở nhiệt độ không quá 40
o
C để đảm bảo
độ ẩm cuối cùng đạt 15-20%. Trong trường hợp sản xuất chế phẩm trên nền chất mang khử
trùng, tất cả các công đoạn phải được tiến hành trong điều kiện vô trùng. Trước khi đóng
bao gói, hỗn hợp cần được được kiểm tra mật độ các chủng VSV. Sản phẩm đảm bảo chất
lượng khi mật độ mỗi nhóm VSV chứa trong chế phẩm đạt >10
8
VSV/g.
BƯỚC 5. Kiểm tra chất lượng chế phẩm
Chất lượng chế phẩm VSV được kiểm tra theo các tiêu chuẩn TCVN 6167:1996 về
VSV phân giải lân, TCVN 6168:2002 về VSV phân giải xenlulo, TCVN 9300:2012 về VSV
đối kháng VSV gây bệnh

3.6. Điều kiện bảo quản chế phẩm và tiêu chuẩn cơ sở về chất lượng chế phẩm
Chế phẩm vi sinh sau khi sản xuất được đóng gói và bảo quản ở các điều kiện nhiệt
độ thường, tiến hành kiểm tra thường xuyên mật độ để đánh giá chất lượng của chế phẩm.
Bảng 13: Mật độ của chế phẩm tại các thời điểm bảo quản khác nhau
Chủng
VSV
Mật độ tế bào (CFU/ml)
0h 1 tháng 2 tháng 3 tháng 4 tháng 5 tháng 6 tháng
SHB17
3,44x10
5
2,34x10
9
3,06x10
8
3,74x10
8
4,12x10
7
4,2x10
7
3,32x10
6
SHV7
4,12x10
6
4,24x10
9
4,12x10
8

4,26x10
8
3,28x10
7
3,8x10
7
2,28x10
6
SHX012
5,26x10
5
3,44x10
8
5,24x10
8
5,38x10
8
4,16x10
7
4,6x10
7
2,16x10
6
SHXDL47
4,32x10
5
4,52x10
8
6,18x10
9

6,34x10
8
5,44x10
8
5,04x10
7
1,44x10
6
SHX01
5,46x10
5
4,36x10
8
4,62x10
8
5,34x10
8
5,42x10
8
5,2x10
7
2,42x10
6
SHY06
3,56x10
5
4,68x10
9
4,06x10
9

4,12x10
8
4,34x10
7
4,16x10
7
4,06x10
9
Bảng 14: Hoạt tính của các chủng trong chế phẩm sau thời gian bảo quản
Chủng
VSV
Hoạt tính (mm)
0h 1 tháng 2 tháng 3 tháng 4 tháng 5 tháng 6 tháng
SHB17
24 26 25 24 22 20 17
SHV7
22 23 22 22 20 18 15
SHX012
30 32 31 31 30 28 25
SHXDL47
32 33 32 32 30 28 25
SHX01
29 30 30 30 28 27 25
SHY06
++ +++ +++ +++ ++ ++ +
Kết quả bảng 13, 14 cho thấy chế phẩm sản xuất và bảo quản sử dụng tốt nhất sau 3
tháng. Với các kết quả đạt được chế phẩm xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp làm vật liệu che
phủ đất sản xuất tại vùng DHNTB đã được công bố tiêu chuẩn cơ sở về chất lượng. Sản
phẩm được sản xuất tại Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp DHNTB và Công ty cổ phần
Phân bón và Dịch vụ tổng hợp Bình Định có tên thương mại DHSH-01.

A/ Yêu cầu kĩ thuật
Yêu cầu về nguyên liệu chính
- Môi trường nuôi cấy VSV: Than bùn, cám gạo, rỉ mật
- Các chủng VSV (Bacillus, Strepmomyces, Saccharomyces)
9
- Các enzym thủy phân (xenlluloza, proteaza, phytaza)
Yêu cầu đối với sản phẩm
Sản phẩm chế phẩm vi sinh xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp có các chỉ tiêu và mức
chất lượng theo quy định sau:
Tên chỉ tiêu Mức chất lượng
1.Ngoại quan Tơi xốp, không vón cục, màu nâu nhạt hoặc
trắng xám
2.VSV(CFU/g):
- Bacillus không nhỏ hơn
- Strepmomyces không nhỏ hơn
- Saccharomyces không nhỏ hơn
10
7
10
7
10
7
3.Các enzim thủy phân:
Xenluloaza (D-d, cm) Không nhỏ hơn
Proteaza (D-d, cm) Không nhỏ hơn
Phytaza (D-d, cm) Không nhỏ hơn
3,0
2,5
2,0
4. Khối lượng đóng gói:

Gram
Gram
Gram
1.000
2.000
5.000
B/ Phương pháp thử
Ngoại quan: Dùng mắt và tay để kiểm tra dạng và màu sắc của sản phẩm
- Xác định thành phần và số lượng các nhóm VSV theo phương pháp cấy pha loãng trên
môi trường thạch đĩa (Koch)
- Nhận biết Bacillus bằng kĩ thuật soi kính hiển vi, hoặc nhận dạng khuẩn lạc trên môi
trường thạch đĩa, hoặc bằng kĩ thuật sinh học phân tử giải trình tự gen 16s ARN reboxom
- Nhận biết Strepmomyces bằng kĩ thuật soi kính hiển vi hoặc nhận dạng khuẩn lạc trên môi
trường thạch đĩa, hoặc bằng kĩ thuật sinh học phân tử giải trình tự gen 16s ARN reboxom
- Nhận biết Saccharomyces bằng kĩ thuật soi kính hiển vi hoặc nhận dạng khuẩn lạc trên
môi trường thạch đĩa, hoặc bằng kĩ thuật sinh học phân tử giải trình tự gen 16s ARN
reboxom
- Xác định hoạt lực enzym ngoại bào bằng phương pháp khuyêch tán trên thạch
C/ Khối lượng đóng gói theo quy định hiện hành
- Bao gói: Sản phẩm được đóng trong túi PE hoặc bao gói theo yêu cầu của khách hàng.
- Ghi nhãn: Sản phẩm có nhãn ghi với nội dung sau
- Tên cơ sở
- Các chỉ tiêu, mức chất lượng chính:
- Địa chỉ
- Ngày, tháng, năm sản xuất:
- Tên sản phẩm
- Thời hạn sử dụng
- Thành phần
- Khối lượng tịnh
- Công dụng

- Sản xuất theo TCCS
- Hướng dẫn sử dụng
Tiến hành lấy mẫu chế phẩm VSV và kiểm tra chất lượng của sản phẩm sau khi sản
xuất, kết quả cho thấy sản phẩm sản xuất đảm bảo được tiêu chuẩn Việt Nam.
Bảng 15: Chất lượng chế phẩm VSV sản xuất tại Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp
DHNTB và Công ty cổ phần Phân bón và Dịch vụ tổng hợp Bình Định
Loại VSV Đơn vị đo Chất lượng
Xạ khuẩn chuyển hóa hyratcacbon CFU/g 5,1 x 10
8
VSV phân giải lân CFU/g 4,3 x 10
9
VSV đối kháng VSV gây bệnh CFU/g 7,8 x 10
9
10
3.7. Sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học DHSH-01, cơ chất hữu cơ làm chất che
phủ hữu cơ sinh học và hiệu chỉnh quy trình kỹ thuật.
Năm 2012, dự án đã triển khai sản xuất thành công 15 tấn chế phẩm DHSH-01 đảm
bảo theo TCVN 7168, phù hợp với điều kiện vùng DHNTB tại Công ty cổ phần Phân bón
và Dịch vụ tổng hợp Bình Định. Với giá bán 100.000.000 VNĐ/tấn, tổng doanh thu đạt
1.500.000.000 VNĐ, tổng chi phí cho sản xuất là 1.133.155.000 VNĐ, như vậy lãi thuần đạt
được từ sản xuât 15 tấn chế phẩm DHSH-01 là 366.845.000 VNĐ.
V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
- Lựa chọn được 04 chủng VSV chuyển hóa hợp chất hữu cơ giàu hydratcacbon phù hợp
với điều kiện vùng DHNTB là SHX01, SHX15, SHX012, SHXDL47.
- Lựa chọn được 03 chủng VSV chuyển hóa hợp chất phosphat khó tan phù hợp với điều
kiện vùng DHNTB là SHV7, SHV10, SHV17.
- Lựa chọn được 05 chủng VSV đối kháng VSV gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn phù hợp
với điều kiện vùng DHNTB là NA1, SHB17, SHB18, SHB19, SHB21.
- Xác định được bộ chủng giống gồm 06 chủng VSV làm cơ sở tiến hành sản xuất chế phẩm
VSV xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp làm vật liệu che phủ đất là SHX012, SHXDL47,

SHX01, SHB17, SHV7, SHY06.
- Hoàn thiện quy trình sử dụng chất che phủ hữu cơ sinh học và kiểm tra, đánh giá chất
lượng chất che phủ hữu cơ sinh học.
- Xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm VSV xử lý phế phụ phẩm nông
nghiệp làm vật liệu che phủ đất với đầy đủ các thông số kĩ thuật, mật độ tế bào VSV ≥10
8
CFU/g.
- Xác định được điều kiện bảo quản chế phẩm, sử dụng tốt nhất sau 3 tháng bảo quản,
phương pháp kiểm tra và xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở về chất lượng chế phẩm.
- Sản xuất thành công 15 tấn chế phẩm sinh học DHSH01 an toàn đối với môi trường và
sức khỏe người, vật nuôi, mật độ VSV hữu ích đạt ≥ 10
8
CFU/g.
TÀI LIÊU THAM KHẢO
1. Nguyễn Lân D€ng (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập 1, 2, 3, Nhà xuất
bản Khoa học kỹ thuật nông nghiệp.
2. Coughlan, M. and Mayer F. (1998): Cellulose decomposing bacteria and their enzyme system
,The procayotes, chapter 20, 460-502
3. Demain A.L. and Soloman N.A. (1986): Manual of industrial microbiology and biotechnology,
32-39, Ameriacan Society for microbiology, Washington D.C.
4. Gaur.A.C. (1992): Manure and organic matter
5. Nguyễn Xuân Thành, Lê Văn Hưng, Phạm Văn Toản (2003): Công nghệ vi sinh vật trong
nông nghiệp và xử ly môi trường. Nhà xuất bản nông nghiệp, Hà Nội
6. Phạm Văn Toản (2002): Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm VSV chuyển hoá nguyên
liệu, phế thải giàu hợp chất cacbon (Compost maker) làm phân bón hữu cơ sinh học. Báo cáo hội
nghị KH chuyên ngành đất, phân bón và hệ thống nông nghiệp - Bộ NN&PTNT, Nha Trang
8/2004.
7. Phạm Văn Toản & CTV (2005). Báo cáo tổng kết đề tài KC.04.04: Nghiên cứu công nghệ sản
xuất phân bón vi sinh vật đa chủng, phân bón chức năng phục vụ chăm sóc cây trồng cho một số
vùng sinh thái

8. Uta Krogman (1994): Neueste Erkenntnisse ueber die Grundlagen der Kompostierung,
Abfallwirtschaft 4/94, 13-21
9. TCVN 6168-2002: Chế phẩm vi sinh vật phân giải xenlulo
10. TCVN 6167:1996: Phân vi sinh vật phân giải lân
Người phản biện: TS. Nguyễn Thanh Phương
11