Khảo sát khả năng nhiễm Coliform và E.coli trong nước uống, nước uống có gas trên địa bàn quận Bình Thạnh, Thành phố Hồ Chí Minh

Đồ án tốt nghiệp GVHD: KS. Phạm Minh Nhựt
Chương 1: GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Xã hội ngày càng phát triển, cuộc sống con người không ngừng cải thiện, tiện
nghi và đầy đủ hơn. Con người không chỉ ăn no mặc ấm mà còn được ăn ngon mặc
đẹp và quan trọng hơn hết sức khỏe con người được chăm sóc tốt và chu đáo. Song
song những mặt tích cực nhận thấy được thì mặt trái của vấn đề cũng rất đáng quan
tâm, đặc biệt trong lĩnh vực ăn uống, vệ sinh an toàn thực phẩm.
Các loại thực phẩm, đồ uống ngày nay rất phong phú về chủng loại, màu sắc,
thành phần và giá cả cũng như giá trị dinh dưỡng. Bên cạnh những sản phẩm chất
lượng, uy tín tồn tại không ít các sản phẩm có chất lượng kém. Mặc dù, việc kiểm
định chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm được các cơ quan chức năng thực hiện
thường xuyên nhưng vẫn không kiểm soát hết được những sản phẩm kém chất
lượng trôi nổi trên thị trường. Do đó, người tiêu dùng sử dụng những sản phẩm này
sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe.
Khả năng nhiễm đối với các loại sản phẩm đồ uống thuộc các thương hiệu nổi
tiếng: Pepsi, Lavie, Coca Cola… tuy thấp nhưng không phải không có. Còn đối với
các loại nước uống không đóng chai như nước mía, nước sâm, nước đậu nành…
được bày bán khắp đường phố thì nguy cơ tiềm ẩn mầm bệnh rất cao. Do nhu cầu
thị hiếu người tiêu dùng “ngon, bổ, rẻ” nên quy trình chế biến những sản phẩm này
rất “đơn giản” là đã có được một ly nước mát. Chính vì thế, các bệnh liên quan tới
ăn uống như rối loạn đường tiêu hóa, hô hấp, tiêu chảy… không ngừng phát triển
thậm chí thành dịch ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe con người. Mà điển hình
trong những loại vi sinh vật gây hại cho sức khỏe con người có nhiều trong thực
phẩm, đồ uống phải kể tới đó là Coliforms và E.coli.
Từ thực tiễn nêu trên và được sự đồng ý của khoa Môi Trường và Công Nghệ
Sinh Học, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát khả năng nhiễm
SVTH: Trần Minh Tùng 1 MSSV: 106111038
Đồ án tốt nghiệp GVHD: KS. Phạm Minh Nhựt
Coliforms và E.coli trong nước uống, nước uống có gas trên địa bàn quận
Bình Thạnh, TP. Hồ Chí Minh”. Đề tài này được thực hiện tại phòng Thí nghiệm

Vi sinh, Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Kỹ Thuật
Công Nghệ TP.HCM.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Khảo sát tỷ lệ nhiễm Coliforms và E.coli trong các loại nước uống, nước uống
có gas trên địa bàn quận Bình Thạnh góp phần đánh giá mức độ an toàn của những
sản phẩm đồ uống đang lưu hành trên thị trường.
1.3. Nội dung nghiên cứu
Đánh giá tỷ lệ nhiễm Coliforms trong các sản phẩm nước uống.
Đánh giá tỷ lệ nhiễm E.coli trong các sản phẩm nước uống.
1.4. Phạm vi nghiên cứu
Đề tài thực hiện thông qua việc khảo sát giới hạn định lượng, khảo sát mật độ
nhiễm và đánh giá tình hình nhiễm Coliforms và E.coli của một số mẫu nước uống
trên địa bàn quận Bình Thạnh.
SVTH: Trần Minh Tùng 2 MSSV: 106111038
Đồ án tốt nghiệp GVHD: KS. Phạm Minh Nhựt
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về nước giải khát
2.1.1. Khái niệm
Nước uống giải khát là loại thức uống không có cồn, có thể có gas và bổ sung
các chất có nguồn gốc tự nhiên hay tổng hợp.
2.1.2. Lịch sử hình thành và phát triển
Lịch sử của nước giải khát có thể bắt nguồn từ nguồn nước khoáng được tìm
thấy trong các dòng suối tự nhiên. Từ lâu, việc ngâm mình trong suối nước khoáng
được xem là tốt cho sức khỏe do tác dụng trị bệnh của khoáng chất có trong nước
suối. Các nhà khoa học cũng nhanh trong phát hiện ra Carbon dioxide (CO
2
) có
trong các bọt nước khoáng thiên nhiên.
Theo dòng lịch sử, loại nước giải khát không gas (không CO
2

) đầu tiên xuất
hiện vào thế kỷ 17 với thành phần pha chế gồm nước lọc, chanh và một chút mật
ong. Năm 1676, Công ty Compagnie de Limonadiers tại Paris (Pháp) độc quyền
bán các loại nước chanh giải khát. Đến năm 1767, Tiến sĩ Joseph Priestley – một
nhà hóa học người Anh – đã pha chế thành công loại nước giải khát có ga. Ba năm
sau, nhà hóa học Thụy Điển Torbern Bergman phát minh loại máy có thể chế tạo
nước có ga từ đá vôi bằng cách sử dụng acid sulfuric. Máy của Bergman cho phép
sản xuất loại nước khoáng nhân tạo với số lượng lớn. Năm 1810, bằng sáng chế Mỹ
đầu tiên dành cho các loại máy sản xuất hàng loạt nước khoáng nhân tạo được trao
cho Simons và Rundell ở Charleston thuộc Nam Carolina (Mỹ). Tuy nhiên, mãi
đến năm 1832 loại nước khoáng có gas mới trở nên phổ biến nhờ sự ra đời hàng
loạt của loại máy sản xuất nước có gas trên thị trường.
SVTH: Trần Minh Tùng 3 MSSV: 106111038
Đồ án tốt nghiệp GVHD: KS. Phạm Minh Nhựt
John Mathews – cha đẻ nước giải khát Mỹ là người tiên phong trong lĩnh vực
kinh doanh nước giải khát ở Mỹ, ông nhập cư vào Mỹ từ năm 1832, trước đó ông là
người đi đầu trong ngành kinh doanh nước giải khát tại Anh. Mathews đã học một
số nguyên lý cơ bản về pha chế khí cacbonic và máy tạo gas từ Joseph Bramah
(nhà phát minh máy nén thủy lực từ thế kỷ thứ 18). Mathews định cư hẳn tại Mỹ và
bắt đầu cung cấp nước giải khát có gas cho các cơ sở giải khát ở khu vực New
York – thời gian này thường phổ biến loại thức uống ướp lạnh nhưng không có
hương vị. Nhờ tay nghề cao của Mathews, ngành công nghiệp nước giải khát Mỹ
phát triển nhanh chóng.
Những thập niên sau đó – kể từ 1852, với việc nước gừng được tung ra thị
trường, các sản phẩm có thương hiệu đã xuất hiện và được cấp quyền kinh doanh.
Bắt đầu từ những năm 1880, thị trường nước giải khát tràn ngập các loại nước uống
có nhãn hiệu như Coca – Cola (1886), Moxie (1885), Dr.Pepper (1885), Pepsi –
Cola (1898) (Theo inventors.com)
2.1.3. Dinh dưỡng trong nước giải khát
Đối với các loại nước đóng chai không có gas chẳng hạn nước khoáng tự

nhiên lấy từ mạch nước ngầm sâu, đó là các dung dịch muối có chứa nhiều chất
khoáng. Các loại nước khoáng tự nhiên có tính phóng xạ thường dùng để chữa
bệnh, giải khát. Nước khoáng nhân tạo được sản xuất bằng cách bão hòa nước ăn
với khí CO
2
và một số muối khoáng. Bên cạnh đó, loại nước giải khát bằng hoa quả
tự nhiên như nước chanh, cam, dưa hấu, dứa, bưởi …phải chứa ít nhất từ 15 – 20%
dịch quả tự nhiên, thêm đó là năng lượng, các vitamin, khoáng chất…tốt cho sức
khỏe. Ngoài ra, các loại nước bằng hoa quả hay nước giải khát có gas, có chất màu
và khí CO
2
hòa tan trong nước như Pepsi, Coca Cola… (Theo vneconomy.vn)
2.1.4. Tình hình sản xuất và thị trường nước giải khát trên thế giới và Việt Nam
hiện nay
SVTH: Trần Minh Tùng 4 MSSV: 106111038
Đồ án tốt nghiệp GVHD: KS. Phạm Minh Nhựt
2.1.4.1. Tình hình sản xuất và thị trường nước giải khát trên thế giới
Ngành công nghiệp nước giải khát thế giới đã hình thành và phát triển từ rất
lâu nhưng chỉ bùng nổ thực sự từ thế chiến thứ hai và kéo dài tới ngày nay mà điển
hình nhất đó là hai đại gia Coca Cola và Pepsi.
Tiêu thụ toàn cầu vượt quá 327 tỷ lít mỗi năm, Trong đó Châu Âu, Bắc Mỹ,
Nhật là những thị trường lớn nhất của ngành công nghiệp này.
Do không ngừng mở rộng thị trường nên hai ông lớn này chi phối cổ phần thị
trường thế giới là tất nhiên. Coca Cola nắm khoảng ½ thị phần thế giới và bán 4
loại nước giải khát hàng đầu. Doanh thu bán hàng trong năm 2006 đạt 241 tỷ USD,
lợi nhuận đạt 20% và có hơn 400 dự án đang triển khai.
Xếp thứ 2 và thứ 3 thế giới trong ngành giải khát phải kể tới đó là Pepsi và
Cadbury Schweppes kiểm soát hầu hết thị phần còn lại. Doanh thu đạt hơn 129 tỷ
USD. Một số sản phẩm của Pepsi như: Pepsi, Diet Pepsi, Slice, Moutain Dew và
Root Beer Mug. Một số sản phẩm của Cadbury Schweppes gồm: La Casere, Trina,

Spring Vallye và Ware.
Ngoài ra trong năm 1898, Pepsi – Cola được thành lập ở New Bern, Bắc
Carolina, bởi Caleb Bradham DPepsiCo Inc nắm giữ khoảng một phần ba của thị
trường Hoa Kỳ. (Theo inventors.com)
2.1.4.2. Tình hình sản xuất và thị trường nước giải khát tại Việt Nam
Việt Nam là một trong những thị trường tiêu thụ nước giải khát không cồn có
tốc độ tăng trưởng nhanh nhất thế giới. Đó là nhận định của GS. Phạm Song, Chủ
tịch Tổng hội Y học Việt Nam. GS cũng cho biết thêm, trung bình mỗi năm, một
người Việt Nam mới chỉ uống khoảng 3 lít nước giải khát đóng chai không cồn,
trong khi mức bình quân của người Philippines là 50 lít/năm. Theo dự báo đến năm
2012, tổng lượng đồ uống bán lẻ ở Việt Nam sẽ tăng gần 50% so với năm 2007.
SVTH: Trần Minh Tùng 5 MSSV: 106111038
Đồ án tốt nghiệp GVHD: KS. Phạm Minh Nhựt
Mức tăng trưởng này cũng chưa thể đáp ứng nhu cầu còn quá lớn trong thời điểm
hiện nay. Ông Nguyễn Thanh Phong, Cục phó Cục An toàn Vệ sinh Thực phẩm
(Bộ Y tế) cho biết, miếng bánh của thị trường nước giải khát Việt Nam còn khá
nhiều đối với doanh nghiệp trong nước. (Nguyễn Thị Tuyết (2008), Giáo trình
Thương phẩm hàng thực phẩm và đồ uống).
Hiện nay, đa số người tiêu dùng đều hướng tới nhu cầu sử dụng những thực
phẩm từ tự nhiên. Những sản phẩm này không chỉ có lợi cho sức khỏe mà còn thân
thiện với môi trường. Nhiều doanh nghiệp Việt Nam sản xuất nước giải khát đang
triển khai những sản phẩm với thành phần tự nhiên, đảm bảo vệ sinh an toàn thực
phẩm, đáp ứng nhu cầu thực tế của người dân trong nước.
Trước sự thay đổi thị hiếu của thị trường, các doanh nghiệp sản xuất nước giải
khát đã lập tức thay đổi cơ cấu sản xuất, đầu tư dây chuyền sản xuất ngày càng hiện
đại, đồng thời nghiên cứu và cho ra đời những sản phẩm với hương vị mới. Các đại
gia: Vinamilk, Tribeco, Wonderfarm, Number One… đã tung ra thị trường nhiều
loại nước trái cây: táo, xoài, nho, mãng cầu, trà xanh, trà thảo mộc không đường
dành cho người mắc bệnh tiểu đường hay không thích thức uống có đường để đáp
ứng nhu cầu khách hàng. Hiện các doanh nghiệp kinh doanh nước giải khát đã tăng

sản lượng vượt mức so với năm ngoái: Vinamilk tăng 30% sản lượng nước trái cây
nhãn hiệu Fresh, Pepsi tăng 30% sản lượng nước giải khát không gas. Các nhà
nhập khẩu cũng làm đa dạng thêm thị trường bằng những mặt hàng cùng loại có
thương hiệu: Ligo, Welch"s, Regain, Berri, Drwitt Công ty Delta cũng khẳng
định sẽ sản xuất nhiều sản phẩm nước trái cây, đặc biệt là các loại sử dụng nguyên
liệu có tác dụng thanh nhiệt: atisô, mía lau, sâm, bí đao (Lê Văn Nam (2007), Thị
trường đồ uống).
2.1.5. Mức độ vệ sinh an toàn của nước giải khát hiện nay
SVTH: Trần Minh Tùng 6 MSSV: 106111038
Đồ án tốt nghiệp GVHD: KS. Phạm Minh Nhựt
Theo ông Nguyễn Thanh Phong cho biết, miếng bánh của thị trường nước giải
khát Việt Nam còn khá nhiều đối với doanh nghiệp trong nước. Tuy nhiên, theo
ông Phong, không vì thế mà doanh nghiệp Việt Nam lơ là việc nâng cao chất
lượng, nhằm đem đến những sản phẩm tốt nhất cho người tiêu dùng. Sự cạnh tranh
trên thị trường đồ uống ngày càng trở nên khốc liệt, đòi hỏi doanh nghiệp không
ngừng đẩy mạnh nghiên cứu, nhằm đưa ra những sản phẩm mới có chất lượng cao.
Chính vì thế, ngày càng nhiều các cơ sở sản xuất, các doanh nghiệp nước giải khát
mọc lên. Bên cạnh những đại gia: Vinamilk, Pepsi, Tribeco, Coca Cola…luôn luôn
tung ra thị trường những sản phẩm mới cạnh tranh, hạ giá thành, đáp ứng nhu cầu
khách hàng. Tuy nhiên, không ít sản phẩm có giá cạnh tranh nhưng chất lượng
“trời ơi”.
Đầu tháng 05/2010, một sản phẩm nổi tiếng nước khoáng Joy của công ty
TNHH Coca Cola Việt Nam đã xuất hiện nhiều mảng rêu màu xanh đen bằng đầu
ngón tay út. Qua xác nhận của công ty cho thấy sản phẩm bị nhiễm mốc.
Đến giữa tháng 05/2010, xuất hiện một mùi lạ trong nước uống Vĩnh Hảo,
một thương hiệu uy tín. Đại diện công ty, sau khi lấy mẫu nước về phân tích xác
nhận, đó là mùi hôi thối từ xác chết chuột.
Và cũng gần đây ngày 20/05/2010, theo kết quả nghiên cứu Bang Virginia
(Mỹ) đăng trên tạp chí Quốc tế Food Microbiology, 48% thức uống từ chiếc máy
bán nước giải khát có chứa Coliforms và 11% chứa E.coli (có thể gây bệnh tiêu

chảy, nhiễm trùng đường tiểu, bệnh về hô hấp và viêm phổi…). Điều đó cho thấy
khả năng thức uống này đã bị làm nhiễm bẩn.
Những trường hợp nêu trên đều thuộc các thương hiệu nổi tiếng, thế còn
những sản phẩm bán rong ngoài đường phố thì sao?
Các sản phẩm nước uống đường phố hiện nay bày bán tràn lan mà không
được kiểm soát. Các đợt thanh tra về loại nước uống đường phố cho thấy đa số các
SVTH: Trần Minh Tùng 7 MSSV: 106111038
Đồ án tốt nghiệp GVHD: KS. Phạm Minh Nhựt
loại nước uống này bị nhiễm khuẩn rất cao, không đảm bảo vệ sinh an toàn thực
phẩm. Theo kết quả khảo sát 50 mẫu thực phẩm giải khát (tháng 07/2003) của Viện
Y tế vệ sinh công cộng thành phố Hồ Chí Minh cho thấy: 75% mẫu sữa, 55% mẫu
nước giải khát trái cây tươi không đạt tiêu chuẩn vi sinh vì trong đó có nhiều loại vi
khuẩn như: C.perringens, Coliforms, E.coli, S.faecalis, Staphylococcus aureus,
P.aeruginosa vượt quá tiêu chuẩn cho phép nhiều lần.
Trong số mặt hàng sử dụng nước đá có 93% sử dụng đá cây là loại đá chưa
được kiểm soát nguồn nước xem có đạt tiêu chuẩn vệ sinh hay không. Hơn 47%
điểm bán thức ăn, nước uống đường phố không che đậy, 27% điểm bán có thừa
được sử dụng lại để bán tiếp cho ngày hôm sau. Kết quả cho biết: 29% khách hàng
khi được hỏi đã bị đau bụng, ói mửa hoặc tiêu chảy sau khi ăn hay uống loại thức
ăn đồ uống đường phố này và tỷ lệ nhập viện vì ngộ độ là 3,5%.
Cũng trong một lần khảo sát mới đây của Viện Y tế thành phố Hồ Chí Minh
trên 400 người mua, 400 người bán thức ăn, đồ uống đường phố cho thấy: 85,7% là
bán cố định trên vỉa hè, lề đường, 29% điểm bán gần các khu cống, rãnh, bãi rác
hoặc nhà vệ sinh. (Viện Y tế thành phố Hồ Chí Minh (7/2009), Báo cáo An toàn vệ
sinh thực phẩm TP. Hồ Chí Minh).
2.2. Một số vi sinh vật liên quan đến vệ sinh an toàn thực phẩm
2.2.1. Coliforms
2.2.1.1. Khái niệm
Coliforms và Feacal coliforms (Coliforms phân) là nhóm các vi sinh vật dùng
để chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm.

Hay nói cách khác Coliforms có nghĩa là các vi khuẩn có khả năng lên men sinh
hơi trong khoảng 48 giờ khi được ủ ở 37
0
C trong môi trường canh Brilliant Green
Lactose Bile Salt (BGBL).
SVTH: Trần Minh Tùng 8 MSSV: 106111038
Đồ án tốt nghiệp GVHD: KS. Phạm Minh Nhựt
2.2.1.2. Phân loại
Dựa vào nhiệt độ tăng trưởng, Coliforms được chia thành 2 nhóm nhỏ là
Coliforms và Coliforms phân. Coliforms phân được quan tâm nhiều hơn có nguồn
gốc từ ruột người và các động vật máu nóng bao gồm các giống Escherichia với
một loài duy nhất đó là E.coli, Klebsiella và Enterobacter.
Coliforms có nguồn gốc từ phân phát triển nhanh khoảng 16 giờ, trong môi
trường dinh dưỡng ở 44
0
C.
Coliforms không có nguồn gốc từ phân, chúng có nguồn gốc từ thủy sinh hay
từ đất, mọc nhanh ở 4
0
C trong 3 – 4 ngày và trong 10
0
C trong 1 ngày. Không mọc
ở 41
0
C, 44
0
C ức chế hoàn toàn.
2.2.1.3. Đặc điểm
a. Đặc điểm chung
Coliforms là nhóm những trực khuẩn đường ruột gram âm, không sinh bào tử,

kỵ khí tùy nghi, có khả năng sinh acid, sinh hơi do lên men lactose ở 37
0
C trong 24
– 48 giờ.
b. Đặc điểm sinh hóa
Coliforms có khả năng lên men sinh hơi trong môi trường canh BGBL.
Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi
trong môi trường canh EC. Coliforms phân (Feacal Coliforms hay E.coli giả định)
là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh Indol trong canh trypton. E.coli chính là
Coliforms phân cho kết quả thử nghiệm IMViC + + - - (Indol +, Methyl Red +,
Voges – Proskauer -, Citrate -).
Tính chất sinh hóa đặc trưng của nhóm Coliforms được thể hiện qua các thử
nghiệm IMViC.
SVTH: Trần Minh Tùng 9 MSSV: 106111038
Đồ án tốt nghiệp GVHD: KS. Phạm Minh Nhựt
Bảng 2.1: Tính chất sinh hóa của Coliforms
Phản ứng Indol Methyl red Voges Proskauer Citrate
Escherichia
Citrobacter
Klebsilla
Enterobacter
+(-)
-(+)
-(+)
-(+)
+
+
-
-
-

-
+
+
-
+
+
+
Ghi chú: + phản ứng dương tính, - phản ứng âm tính, +(-): đa số là phản ứng dương tính và
-(+): đa số là phản ứng âm tính.
c. Đặc điểm nuôi cấy
Coliforms có khả năng lên men sinh hơi trong khoảng 48 giờ khi được ủ ở
37
0
C trong môi trường canh BGBL. Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có
khả năng lên men lactose sinh hơi trong khoảng 24 giờ khi được ủ ở 44
0
C trong
môi trường canh EC. Coliforms phân (Feacal Coliforms hay E.coli giả định) là
Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh Indol khi được ở 44,5
0
C khoảng 24 giờ trong
canh trypton. Coliforms phân được dùng để chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình
chế biến, bảo quản…. E.coli chính là Coliforms phân cho kết quả thử nghiệm
IMViC + + - - (Indol +, Methyl Red +, Voges – Proskauer -, Citrate -).
2.2.1.4. Vai trò của Coliforms trong thực phẩm
Nhóm Coliforms hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người và động
vật. Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng
trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng
hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng khi số
Coliforms của thực phẩm cao thì khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh

khác cũng cao. Tuy nhiên, mối liên hệ giữa vi sinh vật gây bệnh và vi sinh vật chỉ
thị này vẫn còn nhiều tranh cãi.
SVTH: Trần Minh Tùng 10 MSSV: 106111038
Đồ án tốt nghiệp GVHD: KS. Phạm Minh Nhựt
2.2.2. E.coli
2.2.2.1. Khái niệm
Escherichia coli (E.coli) là vi sinh vật hiếu khí tùy nghi hiện diện trong đường
ruột của người và các loại động vật máu nóng, ở phần cuối của ruột non và ruột
già. Hầu hết các dòng E.coli không gây hại và đóng vai trò quan trọng trong việc
ổn định sinh lý đường ruột. Tuy nhiên, có 5 dòng có thể gây bệnh cho người chẳng
hạn rối loạn đường tiêu hóa và một số loài động vật.
Chúng hiện diện rộng rãi trong môi trường bị ô nhiễm phân hay chất thải hữu
cơ, phát triển và tồn tại rất lâu trong môi trường. E.coli dễ dàng nhiễm vào thực
phẩm từ nguyên liệu hay thông qua nguồn nước trong quá trình sản xuất, chế biến.
2.2.2.2. Phân loại
Dựa vào đặc điểm gây bệnh gồm các đặc tính độc lực, sự tác động khác nhau
lên màng nhày ruột, hội chứng lâm sàng của bệnh và sự khác nhau về mặt dịch tễ
của bệnh. E.coli được chia thành 5 nhóm:
 VTEC (Verotoxigenic E.coli) hoặc STEC (Shiga toxin – producing E.coli)
và EHEC (Enterohaemorrhagic E.coli), E.coli gây xuất huyết ở ruột.
 EPEC (Enteropathogenic E.coli), E.coli gây bệnh đường ruột.
 ETEC (Enterotoxigenic E.coli), E.coli sinh độc tố ruột.
 EAGGEC hay EAEC (Enteroaggregative E.coli), E.coli kết tập ở ruột.
 EIEC (Enteroinvasive E.coli), E.coli xâm lấn niêm mạc ruột.
2.2.2.3. Đặc điểm
a. Đặc điểm chung
SVTH: Trần Minh Tùng 11 MSSV: 106111038
Đồ án tốt nghiệp GVHD: KS. Phạm Minh Nhựt
E.coli là trực khuẩn Gram âm, hình que ngắn, kích thước trung bình từ 0,5 x 1
– 3µm hai đầu tròn, di động bằng tiên mao quanh tế bào, đứng riêng lẻ, đôi khi xếp

thành chuỗi ngắn, không tạo bào tử, loại có độc lực thì có vỏ bao capsule, loại
không có động lực thì không có vỏ bao capsule.
Theo hệ thống phân loại của Bergey, vi khuẩn Escherichia coli (E.coli) thuộc:
 Lớp: Schgzomycetes
 Bộ: Eubacteriales
 Họ: Enterobacteriaceae
 Gống: Escherichia
 Loài: Eschierchia Coli
Hình 2.1: Vi khuẩn Escherichia E.coli
Escherichia coli còn có tên là Bacteriam colic được ông Theodor Eschrich
nhà nghiên cứu người Đức phát hiện và phân lập năm 1885 trong trường hợp tiêu
chảy ở trẻ em.
b. Đặc điểm sinh hóa
E.coli lên men sinh hơi lactose, glucose, manitol, galactose, không sinh hơi
đường maltose, lên men không đều saccarose, không lên men dextrin, glycogen.
E.coli không sinh H
2
S, không tan chảy gelatin, không phân hủy đạm, hoàn
nguyên nitrate thành nitrite.
Phân biệt E.coli với các vi khuẩn đường ruột khác thông qua thử nghiệm
IMViC: + + - -; phản ứng Indol dương tính (+), phản ứng Methyl Red (MR) dương
tính (+), phản ứng Voges – Proskauer (VP) âm tính (-) và Citrate âm tính (-).
c. Đặc điểm nuôi cấy
SVTH: Trần Minh Tùng 12 MSSV: 106111038
Đồ án tốt nghiệp GVHD: KS. Phạm Minh Nhựt
E.coli là loại hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi. Nhiệt độ thích hợp cho sự phát
triển từ 35 – 37
0
C, nhưng có thể phát triển trên 40
0

C, pH thích hợp 6,4 – 7,5 nhưng
pH tối ưu nhất từ 7,2 – 7,4.
 Trên môi trường thạch dinh dưỡng (NA) tạo khuẩn lạc tròn ướt (dạng S)
sau 24 giờ, màu trắng đục hơi lồi, kích thước khoảng 2 – 3mm, để lâu có dạng khô
rìa hơi nhăn (dạng R).
 Trên thạch máu có chủng dung huyết α hoặc β.
 Trên môi trường chẩn đoán chuyên biệt EMB (Eozin Methylen Blue) tạo
khuẩn lạc có ánh kim tím.
 Trên môi trường Rapid có khuẩn lạc màu tím.
 Trên môi trường MacConkey (MCK) khuẩn lạc màu hồng đỏ.
 Trên thạch Gelatin không tan chảy.
 Trên môi trường thạch nghiêng Triple Sugar Iron Agar: E.coli tạo
acid/acid màu vàng/vàng.
 Trên môi trường Kliger Iron Agar (KIA) lên men đường glucose và
lactose (vàng/vàng), sinh gas, không sinh H
2
S.
 Trên môi trường Brilliant Green Agar (BGA) tạo khuẩn lạc xanh lá mạ.
 Trên môi trường canh dinh dưỡng: sau 4 – 5giờ E.coli làm đục nhẹ môi
trường, để càng lâu càng đục, sau lắng xuống đáy có màu tro nhạt hay xám, sinh
H
2
S có mùi hôi thối, sau vài ngày có thể có váng mỏng nổi trên mặt môi trường.
2.2.2.4. Kháng nguyên
SVTH: Trần Minh Tùng 13 MSSV: 106111038
Đồ án tốt nghiệp GVHD: KS. Phạm Minh Nhựt
E.coli có cấu trúc kháng nguyên rất phức tạp. Năm 1947 Kauffmann đưa ra hệ
thống phân nhóm huyết thanh (serotype) dựa vào việc xác định kháng nguyên bề
mặt O, H, K.
a. Kháng nguyên thân O (somatic antigen): có bản chất là lipopolysaccharide

của màng ngoài tế bào, bền với nhiệt và cồn. Khi đung nóng ở 100
0
C trong 2 giờ
vẫn giữ được tính kháng nguyên, kháng cồn không bị hủy khi tiếp xúc với cồn
50%, bị hủy bởi formol 5%, rất độc chỉ cần 0,05mg đủ giết chết chuột nhắt sau 24
giờ. Kháng nguyên O có thể phát hiện được bằng phản ứng ngưng kết. Kháng
nguyên O giữ vai trò nhất định đối với khả năng gây bệnh của dòng vi khuẩn và có
tính chất chuyên biệt cho từng loài vật chủ. Kháng nguyên O tạo nền tảng cho việc
phân loại serogroup của E.coli. Có hơn 170 serogroup kháng nguyên O và được
chia làm 4 nhóm chính O
I
, O
II
, O
III
, O
IV
. Trong mỗi serogroup có một hay nhiều
serotype, kháng nguyên O bám vào nhung mao ruột làm giảm sự hấp thụ.
b. Kháng nguyên lông H (flagellar antigen): có bản chất là protein, tạo nên
khả năng di động của E.coli, kém chịu nhiệt, bị hủy bởi cồn 50% và các proteinase,
không bị hủy bởi formol 5% , có khoảng 50 type kháng nguyên H.
c. Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen): kháng nguyên K lúc đầu được
xác định bằng phản ứng ngưng kết. Người ta xác định có sự hiện diện của kháng
nguyên K ở vi khuẩn nếu vi khuẩn chỉ ngưng kết với kháng nguyên huyết thanh O
khi bị đun nóng. Dựa vào khả năng chịu nhiệt người ta chia kháng nguyên K thành
3 type là A, L và B. Về sau người ta phân loại kháng nguyên K dựa vào thành phần
hóa học của chúng và đã có hơn 80 loại kháng nguyên K được xác định.
SVTH: Trần Minh Tùng 14 MSSV: 106111038
Đồ án tốt nghiệp GVHD: KS. Phạm Minh Nhựt

Hình 2.2: Vị trí các loại kháng nguyên trên E.coli
2.2.2.5. Độc tố
a. Khả năng gây bệnh của STEC
STEC sản xuất độc tố Shiga toxin (Stx). Họ độc tố Stx gồm 2 nhóm chính
không phản ứng chéo với nhau là Stx1 và Stx2, Stx1 có tính bảo tồn cao, trong khi
đó Stx2 rất thay đổi về trình tự. Một dòng STEC có thể sản sinh Stx1 hay Stx2
hoặc cả Stx1 và Stx2, thậm chí nhiều dạng của Stx2.
Cả hai độc tố Stx1 và Stx2 đều được cấu tạo từ 5 tiểu đơn vị B 7,7kDa và 1
tiểu đơn vị A 32kDa. Tiểu đơn vị A gồm peptide A1 28kDa và peptide A2 4kDa
nối với nhau bằng cầu disulfur. Peptide A1 có hoạt tính enzyme và peptide A2 có
nhiệm vụ gắn tiểu đơn vị A vào những tiểu đơn vị B. Những tiểu đơn vị B giúp độc
tố kết hợp với receptor đặc hiệu Gb3 (globotriaosylceramide) hiện diện trên bề mặt
của những tế bào eukaryote (Stx2e có receptor là Gb4). Sau khi được chuyển vào
bên trong tế bào tiểu đơn vị A đến tế bào chất và tác động lên tiểu phần 60S của
ribosome. Peptide A1 có hoạt tính enzyme hoạt động như một N – glycosidase cắt
một gốc adenine khỏi rRNA 28S của ribosome, do đó gây trở ngại cho tổng hợp
ribosome. Do không tổng hợp được protein, những tế bào bị Stx tác động (tế bào
nội mô của thận, tế bào biểu mô ruột, tế bào Vero, tế bào Hela hay bất cứ tế bào
nào có receptor là Gb3, receptor Gb4 đối với Stx2e) sẽ chết. Hậu quả gây độc cho
tế bào ruột do Stx và các yếu tố độc lực khác của STEC là gây sự hư hại những tế
bào nhung mao ruột, gây tiêu chảy và viêm kết màng xuất huyết (haemorrhagic
colits – HC). Sự hư hại những tế bào thành mạch máu do Stx2 gây ra sẽ dấn đến
SVTH: Trần Minh Tùng 15 MSSV: 106111038
Đồ án tốt nghiệp GVHD: KS. Phạm Minh Nhựt
hiện tượng phù thủng. Những tổn thương ở tế bào nội mô thận gây nên hội chứng
huyết niệu (haemolytic uraemic syndrome) – HUS) ở người.
b. Khả năng gây bệnh của EPEC
EPEC là nhóm E.coli gây tiêu chảy quan trọng có liên quan đến tiêu chảy ở
trẻ sơ sinh tại những nước đang phát triển.
Dấu hiệu của sự nhiễm bệnh do EPEC là hình thành bệnh tích kiểu A/E, có

thể quan sát được trên mẫu sinh thiết ruột từ những bệnh nhân hay những thú
nhiễm bệnh và trong nuôi cấy tế bào. Kiểu hình riêng biệt này được đặc trưng bởi
sự hư hại của các vi nhung mao và sự dính kết chặt giữa vi khuẩn và màng tế bào
biểu mô. Moon và ctv (1983) báo cáo rằng kiểu tổn thương này liên quan rộng rãi
đến EPEC thì thuật ngữ “ngắn kết và gây hư hại” (“attaching và effacing” – A/E)
mới được đưa ra. Gen cần thiết cho việc tạo ra tổn thương A/E là gen eae mã hóa
protein intimin. Protein này là yếu tố độc lực cần thiết của EPEC.
Đáp ứng viêm tại chỗ và sự tăng tính thấm của ruột trong đáp ứng với EPEC
góp phần vào tiêu chảy. Điểm đáng lưu ý nhất về mặt dịch tễ học của bệnh do
EPEC về sự phân bố về lứa tuổi của người bệnh. Bệnh chủ yếu xảy ra tên trẻ em
dưới 2 tuổi. Bệnh thường biểu hiện cấp tính với tiêu chảy nghiêm trọng. Lý do liên
quan đến khả năng đề kháng được với người trưởng thành và trẻ em lớn còn chưa
được biết rõ nhưng có lẽ là do mất các receptor đặc hiệu. Tuy nhiên EPEC cũng có
thể gây tiêu chảy ở người lớn nếu số lượng vi khuẩn đủ lớn.
c. Khả năng gây bệnh của Enterotoxigenic E.coli (ETEC)
Nhóm ETEC gồm có hai nhóm quyết định độc lực chính là độc tố ruột
(Enterotoxin) và yếu tố định vị (colonization facter – CF).
 Độc tố ruột Enterotoxin
SVTH: Trần Minh Tùng 16 MSSV: 106111038
Đồ án tốt nghiệp GVHD: KS. Phạm Minh Nhựt
Nhóm ETEC gồm những E.coli tạo ra ít nhất một trong hai loại độc tố đường
ruột ST và LT.
ETEC gây bệnh bằng cách vi khuẩn bám vào bề mặt màng nhày ruột non và
tiết ra độc tố ruột, làm gia tăng tình trạng tiết dịch. Nhóm ETEC gây tiêu chảy
thông qua việc tiết độc tố đường ruột ST và LT. E.coli, nhóm này có thể chỉ tiết
độc tố ST hay LT hoặc cả hai.
 Độc tố không chịu nhiệt (heat – labile toxin – LT): độc tố LT của
E.coli là oligopeptide gồm có hai serogroup chính là LT – I và LT – II, chúng
không có phản ứng chéo về mặt miễn dịch.
LT – I được tiết bởi những dòng E.coli gây bệnh trên người và thú, còn LT –

II được tìm thấy chủ yếu ở E.coli trên thú và hiếm khi ở người.
LT – I là một oligopeptide khoảng 86kDa, được cấu tạo bởi 1 tiểu đơn vị A
28kDa và 5 tiểu đơn vị B 11,5kDa. Tiểu đơn vị A chịu trách nhiệm trong hoạt tính
enzyme của độc tố gồm peptide A1 và peptide A2 liên kết với nhau bởi cầu nối
disulfur. Những tiểu đơn vị B sắp xếp thành vòng nhẫn, liên kiết chắc chắn với
ganglioside GM1 và liên kết lỏng lẻo với GD1b và vài glycoprotein ruột – chúng là
các receptor của LT. Gen mã hóa cho LT là elt hay LT – I nằm trên plasmid mà
plasmid này có thể chứa cả gen mã hóa ST và hoặc cả gen mã hóa kháng nguyên
chứa yếu tố định vị (colonization factor antigen – CFA).
Sau khi độc tố đi vào nội bào, chúng di chuyển trong tế bào nhờ hệ thống vận
chuyển Golgi. Đích của LT trong tế bào là enzyme andenylate cyclase nằm ở lớp
màng ngoài của tế bào biểu mô ruột. Peptide A có hoạt tính ADP –
ribosyltransferase chuyển phần ADP – rybosyl từ NAD đến của protein liên kết
GTP là G
s
, gây hoạt hóa enzyme adenylate cyclase, làm tăng AMP vòng (cAMP)
trong tế bào. Vì vậy, enzyme cAMP – dependent protein kinase (A kinase) được
hoạt hóa dẫn đến sự phosphoryl hóa kênh Cl
-
ở màng tế bào biểu mô vượt quá mức
bình thường. Kết quả dây chuyền là kích thích tế bào bên dưới tiết Cl
-
và ngăn cản
SVTH: Trần Minh Tùng 17 MSSV: 106111038
Đồ án tốt nghiệp GVHD: KS. Phạm Minh Nhựt
sự hấp thu NaCl bởi những tế bào có lông nhung. Hàm lượng ion trong lòng ruột
gia tăng kéo theo sự di chuyển thụ động của nước từ tế bào vào lòng ruột gây tiêu
chảy.
LT – II: nhóm LT – II giống với LT – I khoảng 55 – 57% ở tiểu đơn vị A
nhưng không giống ở tiểu đơn vị B, LT – II không liên quan đến bệnh trên người

và thú.
 Độc tố chịu nhiệt (heat – stable toxin – ST): ngược với LT, ST có trọng
lượng phân tử nhỏ và những cầu nối disulfur của nó giải thích cho khả năng chịu
nhiệt của độc tố này. ST được chia thành 2 nhóm là STa và STb, khác nhau về cấu
trúc và cơ chế hoạt động. Gen mã hóa cho cả 2 nhóm chủ yếu được tìm thấy trên
plasmid và vài gen mã hóa ST cũng được tìm thấy trên transposon. STa và STb đều
được tạo bởi ETEC.
STa là một peptide gồm 18 – 19 amino acid với trọng lượng phân tử khoảng
2kDa. Receptor chính của STa là enzyme xuyên màng guanylate cylase C (GC –
C). Sự kết hợp của STa vào GC – C kích thích hoạt tính GC dẫn đến việc gia tăng
lượng cGMP nội bào. Hoạt động này cuối cùng dẫn đến sự kích thích tiết Cl
-
và
hoặc ngăn cản sự hấp thụ NaCl, gây sự tiết chất lỏng trong ruột.
STb không như STa, STb gây ra những tổn thương về mặt mô học trên lớp
biểu mô ruột như mất tế bào nhung mao của biểu mô ruột và teo nhung mao một
phần. Receptor của STb chưa được biết rõ mặc dù gần đây người ta cho rằng độc tố
có thể kết hợp không đặc hiệu với màng tế bào chất trước khi vào trong tế bào.
Không tạo ra sự tiết Cl
-
như STa, nhưng kích thích tế bào ruột tiết bicarbonate
(HCO
3
-
). STb không làm tăng cAMP hay cGMP nội bào mặc dù nó kích thích tăng
lượng canxi nội bào từ ngoại bào.
 Yếu tố định vị (colonization factor – CF)
SVTH: Trần Minh Tùng 18 MSSV: 106111038
Đồ án tốt nghiệp GVHD: KS. Phạm Minh Nhựt
Để gây tiêu chảy ETEC đầu tiên phải kết dính vào tế bào ruột non nhờ lông

trên bề mặt của vi khuẩn gọi là yếu tố định vị (CF).
d. Enteroaggregative E.coli (EAEC hay EAggEC)
EAEC hay EAggEC là nhóm E.coli không sinh enterotoxin và bám dính vào
tế bào Hep – 2 theo kiểu bám dính kết tập (aggregative adhetion – A/A). Nhóm
EAEC gồm cả dòng E.coli gây bệnh và không gây bệnh. Tất cả các EAEC đều có
60MDa chứa gen tạo tổn thương dạng A/A và mã hóa A/A trên plasmid cần thiết
cho quá trình gây bệnh.
EAEC gây tiêu chảy kéo dài (trên 14 ngày). Trong hầu hết các báo cáo đều
mô tả EAEC ở các ca tiêu chảy lẻ tẻ nhưng cũng có thể là tác nhân gây thành ổ
dịch.
e. Khả năng gây bệnh của Enteroinvasive E.coli (EIEC)
Triệu chứng lâm sàng của bệnh do những E.coli dòng EIEC bao gồm sốt, đau
bụng quặn, khó chịu, nhiễm trùng máu và tiêu chảy nước hay bệnh lỵ điển hình với
máu, dịch nhày và nhiều bạch cầu trong phân. EIEC có khả năng xâm nhập vào tế
bào biểu mô kết tràng và chúng điều tiết một hay nhiều độc tố ruột liên quan đến
tiêu chảy. EIEC cũng có thể gây tiêu chảy ở khách du lịch và liên quan đến những
vụ ngộ độc thực phẩm do ăn phải thức ăn bị ô nhiễm.
Tóm lại, một số gen độc lực quan trọng của những nhóm E.coli bao gồm:
Bảng 2.2: Các gen độc lực quan trọng của E.coli
SVTH: Trần Minh Tùng 19 MSSV: 106111038
Đồ án tốt nghiệp GVHD: KS. Phạm Minh Nhựt

2.2.2.6. Tình hình nhiễm
Coliforms và E.coli là vi khuẩn thường thấy trong ruột người và động vật máu
nóng. Coliforms là vi sinh vật chỉ thị an toàn thực phẩm, trong khi đó hầu hết các
chủng E.coli vô hại. tuy nhiên, một số chủng có thể gây bệnh nghiêm trọng. Nó
xâm nhiễm vào con người chủ yếu thông qua tiêu thụ thức ăn, thức uống bị ô
SVTH: Trần Minh Tùng 20 MSSV: 106111038
STT Gen độc lực Nhóm E.coli
1

2
3
4
5
6
7
8
Eae
Hly
Stx1
Stx2
Stx2e
Sta
Stb
LT - I
EPEC, STEC
STEC
STEC
STEC
STEC
ETEC
ETEC
ETEC
Đồ án tốt nghiệp GVHD: KS. Phạm Minh Nhựt
nhiễm, chẳng hạn như sản phẩm thịt chưa nấu chín dính bụi bẩn hay các loại nước
giải khát nhiễm khuẩn hoặc các loại rau củ quả chưa được ngâm và rửa sạch.
E.coli O157: H7 là EHEC serotype quan trọng nhất liên quan đến các dịch
bệnh. Các triệu chứng của bệnh gây ra bởi EHEC bao gồm đau bụng và tiêu chảy
có thể có trong một số trường hợp tiến triển thành bệnh tiêu chảy máu (xuất huyết
viêm đại tràng), sốt và ói mửa cũng có thể xảy ra. Ngoài ra, tiêu chảy là một

nguyên nhân chính của suy dinh dưỡng ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ.
Tỷ lệ nhiễm khuẩn EHEC thay đổi theo nhóm tuổi nhưng tỷ lệ mắc cao nhất
thường xảy ra ở trẻ em độ tuổi dưới 15 với khoảng 100000 trường hợp tại tại Hoa
Kỳ năm 1982. Năm 1996, một ổ dịch của E.coli O157: H7 liên quan đế thức ăn và
đồ uống đường phố tại Nhật Bản làm hơn 6300 học sinh bị ảnh hưởng và kết quả là
2 ca tử vong. Ngày 15/5/2000, tại Ontario, Canada. Các đơn vị y tế công cộng cho
biết tại thị trấn Walkerton với dân số 5000 đã có một ổ dịch của E.coli O157: H7
làm 5 người thiệt mạng và 27 ca nằm viện.
Số lượng ca mắc ngộ độc thực phẩm và đồ uống là khó xác định chính xác,
nhưng một được báo cáo của WHO nói rằng trong năm 2005 đã làm 1.800.000
người chết vì bệnh tiêu chảy.
Ở các nước công nghiệp hóa, tỷ lệ phần trăm của dân số bị bệnh từ thực phẩm
mỗi năm đã được báo cáo để được lên đến 30%. Trong khi đó, tỷ lệ nhiễm này ở
các nước đang phát triển chắc chắn sẽ còn cao hơn nhiều so với các nước phát triển
và điều này đã gây thiệt hại nặng về người và tổn hại nền kinh tế. Sự xuất hiện lại
của dịch tả tại Peru vào năm 1991 có trong xuất khẩu sản phẩm thuỷ sản và cá dẫn
đến sự mất mát của Mỹ 500000000 USD năm đó. Tại Mỹ, các dịch bệnh liên quan
ước tính chi phí lên đến 35 tỷ USD hàng năm. (Theo Tổ chức Y tế thế giới)
Trong khi đó, tháng 7/2007 tại Đà Nẵng, Việt Nam 53% mẫu thức ăn và đồ
uống đường phố nhiễm Coliforms và 25,3% thức ăn nhiễm E.coli, đó là con số
thống kê của Trung tâm Y tế dự phòng thành phố Đà Nẵng qua đợt kiểm tra gần
SVTH: Trần Minh Tùng 21 MSSV: 106111038
Đồ án tốt nghiệp GVHD: KS. Phạm Minh Nhựt
400 cơ sở thức ăn và đồ uống đường phố trong thời gian vừa qua. (Trung tâm Y tế
dự phòng thành phố Đà Nẵng (2007), Báo cáo vệ sinh an toàn thực phẩm đường
phố).
2.3. Một số phương pháp định lượng vi sinh vật trong nước
2.3.1. Phương pháp đổ đĩa
2.3.1.1. Khái niệm
Phương pháp đổ đĩa hay còn gọi là phương pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác

định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống, hiện diện trong mẫu. Tế bào sống là tế
bào có khả năng phân chia tạo khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc.
Phương pháp này cho phép định lượng chọn lọc vi sinh vật tùy môi trường và
điều kiện nuôi cấy. Phương pháp đếm khuẩn lạc có thể thực hiện bằng kỹ thuật hộp
đổ hay hộp trải với các thiết bị hỗ trợ đọc kết quả.
Số lượng khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa phụ thuộc vào lượng mẫu sử dụng, môi
trường và điều kiện ủ. Các tế bào trên đĩa không tăng trưởng và hình thành khuẩn
lạc với tốc độ như nhau, do vậy nhiều tế bào chưa kịp hình thành khuẩn lạc nếu
thời gian ủ chưa đủ dài. Thông thường trong điều kiện nuôi cấy (môi trường, nhiệt
độ, thời gian) cần đảm bảo sao cho số lượng khuẩn lạc xuất hiện tối đa. Phương
pháp đếm khuẩn lạc dễ cho sai số lớn nên cần thực hiện lặp lại trên ít nhất hai đĩa.
Phương pháp đếm khuẩn lạc được cho là tốt nhất để xác định mật độ tế bào
sống. Ngoài ra, phương pháp này còn có ưu điểm là độ nhạy cao, cho phép định
lượng vi sinh vật ở mật độ thấp trong mẫu. Phương pháp này được sử dụng rộng rãi
trong nước, thực phẩm, bệnh phẩm.
2.3.1.2. Quy trình thực hiện
a. Pha loãng mẫu theo dãy thập phân
SVTH: Trần Minh Tùng 22 MSSV: 106111038
Đồ án tốt nghiệp GVHD: KS. Phạm Minh Nhựt
Mẫu được pha loãng tuần tự thành dãy các nồng độ thập phân 10
-1
, 10
-2
,….
Mỗi bậc pha loãng là 1/10 được thực hiện bằng cách dùng 1ml mẫu (hoặc dung
dịch có độ pha loãng trước đó) thêm vào 9ml nước hoặc môi trường trong ống
nghiệm.
Hình 2.3: Hệ thống pha loãng mẫu
b. Kỹ thuật đổ đĩa
Dùng pipetman và đầu tip vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 1ml dịch chứa

giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường trong đĩa petri. Đổ khoảng 15 – 20ml môi
SVTH: Trần Minh Tùng 23 MSSV: 106111038
Đồ án tốt nghiệp GVHD: KS. Phạm Minh Nhựt
trường đã đun chảy và để nguội đến 45 – 55
0
C vào đĩa petri đã cấy mẫu. Xoay nhẹ
đĩa petri cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ vài lần để dung dịch giống được
trộn đều trong môi trường cấy. Đậy nắp đĩa petri, để đông tự nhiên, lật ngược đĩa
lại mang ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp.
2.3.1.3. Cách tính kết quả
Công thức tính số lượng khuẩn lạc có trong 1ml mẫu nước như sau:
A = N / (n
1
v
1
f
1
+ n
2
v
2
f
2
+ n
3
v
3
f
3
+ … + n

i
v
i
f
i
)
Trong đó:
A: tổng số vi sinh vật hiếu khí có trong 1ml (g) mẫu
N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa
n
1
: số đĩa ở độ pha loãng f
1
n
i
: số đĩa ở độ pha loãng f
i
v
i
: thể tích mẫu lấy ở mỗi độ pha loãng
f
i
: độ pha loãng
2.3.2. Phương pháp màng lọc
Phương pháp này thường được dùng để định lượng vi sinh vật chỉ thị trong
mẫu nước khi tiến hành các thử nghiệm môi trường nơi có mật độ vi sinh tương đối
thấp. Phương pháp này bao gồm bước lọc để tập trung vi sinh vật trong một mẫu
nước trên màng lọc và xác định số tế bào vi sinh vật dựa vào số khuẩn lạc đếm
được sau khi đặt màng lọc lên trên môi trường thạch có thành phần môi trường
dinh dưỡng thích hợp cho loại vi sinh cần kiểm tra. Dựa trên khối lượng mẫu nước

ban đầu và quy ước là mỗi khuẩn lạc được hình thành từ một tế bào vi sinh vật,
người ta quy ra số lượng vi sinh vật có trong một đơn vị thể tích. Như vậy, phương
SVTH: Trần Minh Tùng 24 MSSV: 106111038
Đồ án tốt nghiệp GVHD: KS. Phạm Minh Nhựt
pháp này là sự kết hợp của phương pháp lọc vô trùng và phương pháp đếm khuẩn
lạc trên đĩa petri. Màng lọc có kích thước lỗ là 0,45µm hoặc 0,2µm được chế tạo từ
các nguyên liệu là các sợi thủy tinh siêu mảnh, sợi polypropylene, thường được
cung cấp trong trạng thái vô trùng.
Ngoài màng lọc bình thường hiện nay, người ta còn sử dụng màng lọc kỵ
nước trên đó có in các ô vuông bằng vật liệu kỵ nước. Các vạch chia ô bằng vật
liệu này ngăn càn sự mọc lan của các khuẩn lạc. Khác với trường hợp màng lọc
bình thường, từ số các ô vuông có khuẩn lạc mọc, mật độ vi sinh vật trong mẫu
được tính và trình bày dưới dạng số có xác suất lớn nhất (MPN) của lượng vi sinh
vật có trong một đơn vị thể tích theo mẫu công thức:
MPN = Nln(N/N – x)
Trong đó:
N: tổng số các ô vuông
x: ô có số khuẩn lạc mọc
2.3.3. Phương pháp MPN (Most Probable Number)
2.3.3.1. Khái niệm
Phương pháp MPN (phương pháp có số xác suất cao nhất, số tối khả) còn
được gọi là phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ. Đây là
phương pháp dùng để đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác
suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu. Đây là phương định lượng
dựa trên kết quả tính của một loạt thí nghiệm lặp lại ở một số độ pha loãng khác
nhau. Thông thường, việc định lượng này được thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha
loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm.
2.3.3.2. Quy trình thực hiện
SVTH: Trần Minh Tùng 25 MSSV: 106111038