BÁO CÁO THỰC TẬP-Phương pháp nghiên cứu enzym protein

Tiểu luận
1. Amylase (phân loại, đặc điểm, nguồn gốc, ứng dụng)
2. Protease (phân loại, đặc điểm, nguồn gốc, ứng dụng)
3. Lipase (phân loại, đặc điểm, nguồn gốc, ứng dụng)
4. Ứng dụng enzym trong xử lý rác thải, ô nhiễm môi trường
5. Ứng dụng enzym trong chẩn đoán bệnh
6. Các phương pháp xác định hoạt tính và hoạt độ enzym (amylase,
protein, lipase)
7. Ứng dụng enzym trong dược phẩm
8. Các enzym sử dụng trong công nghệ thực phẩm
9. Nguồn enzym từ vi sinh vật (loại enzym, loại vi sinh vật)
10.Các enzym, protein sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử
11.Phương pháp cải biến enzym (tạo enzym chịu nhiệt, chịu chất hoạt
động bề mặt, kiềm, axit )
12.Các phương pháp tinh sạch protein, enzym
13.Protein đơn bào
14.Các chất ức chế protease (vô cơ, hữu cơ)
Phương pháp nghiên cứu enzym protein
1. Thu nhận enzym protein
2. Tách chiết, tinh sạch enzym protein
3. Định lượng protein enzym
5. Xác định hoạt độ enzym
4. Xác định hoạt tính enzym
6. Nghiên cứu động học enzym
1.
1.
Thu nhận enzym protein
Thu nhận enzym protein
Enzym nội bào: Mô, tế bào động vật, thực vật, vi sinh vật
Enzym ngoại bào: Dịch enzym được tiết ra trong môi trường
nuôi cấy vi sinh vật

Nguồn enzym:
Quy trình tách chiết protein enzym
Mô động, thực vật
Nuôi cấy tế bào,
vi sinh vật
Nội bào
Phá vỡ mô,
tế bào
Ngoại bào
Thu sinh khối
Dịch enzym thô
Tủa enzym,
cô đặc
Tinh sạch
Thử hoạt tính
Xác định hoạt độ
Nghiên cứu động học
Xác định hoạt độ
Xác định đặc điểm, tính
chất enzym
Chế phẩm enzym
tinh khiết
Sơ đồ thu nhận, tinh sạch và nghiên
cứu enzym ở phòng thí nghiệm
Nuôi cấy
VSV
Tách pha
Cô đặc
Tách phaDịch chiết tế bào
Tinh sạch enzym Làm khô

Phối trộn
Chế phẩm
enzym
Tế bào, mô
(động thực vật)
Phá vỡ tế bào
Nội bào
Ngoại bào
Sơ đồ quy trình sản xuất enzym
Quy trình chung
Enzym ngoại bào:
Enzym ngoại bào:
•
Dịch enzym được tiết ra trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật, tế bào
•
Ly tâm thu dịch nuôi cấy, loại bỏ tế bào và cặn tạp
•
Sử dụng các biện pháp kết tủa, ly tâm kết hợp với màng lọc để thu
nhận enzym.
•
Cô đặc enzym
•
Tinh sạch (nếu cần thiết)
•
Thu nhận chế phẩm enzym sạch
•
Nghiên cứu tính chất, thử hoạt tính, xác định hoạt độ, động học
enzym
Dịch chứa enzym
Enzym thô

Ly tâm dùng
màng lọc
Kết tủa
Cô đặc
Tinh sạch enzym
Tinh sạch enzym
•
Xác định hoạt tính, hoạt độ
Xác định hoạt tính, hoạt độ
•
Nghiên cứu động học
Nghiên cứu động học
•
Thử phản ứng xúc tác
Thử phản ứng xúc tác
chuyển hóa cơ chất
chuyển hóa cơ chất
Tối ưu
quy trình
Sản xuất thử ở quy mô vừa
Sản xuất ở quy mô công nghiệp
Enzym nội bào:
Enzym nội bào:
•
Enzym được tổng hợp bên trong tế bào vi sinh vật, tế bào động, thực
vật.
•
Ly tâm thu dịch sinh khối tế bào (nếu tế bào được nuôi cấy trong môi
trường lỏng)

•
Sử dụng các biện pháp phá tế bào, mô để giải phóng enzym.
•
Ly tâm thu dịch chiết thô chứa enzym
•
Sử dụng các biện pháp kết tủa chọn lọc để thu enzym quan tâm
•
Cô đặc enzym
•
Tinh sạch enzym
•
Nghiên cứu tính chất, thử hoạt tính, xác định hoạt độ, động học
enzym
Quy trình chung
Tinh sạch enzym
Dịch chiết thô
chứa enzym
Kết tủa chọn lọc
Enzym thô
Ly tâm thu sinh khối
tế bào
Cô đặc
•
Xác định hoạt tính, hoạt độ
Xác định hoạt tính, hoạt độ
•
Nghiên cứu động học
Nghiên cứu động học
•
Thử phản ứng xúc tác

Thử phản ứng xúc tác
chuyển hóa cơ chất
chuyển hóa cơ chất
Ly tâm
Phá vỡ tế bào, mô
Tối ưu quy trình
Sản xuất quy mô vừa
Sản xuất quy mô lớn
Chế phẩm enzym
Ly tâm thu sinh khối
Ly tâm thu sinh khối
Đối với vi sinh vật: Kiểm tra sinh khối bằng phương pháp đo
mật độ quang (độ đục)
Ly tâm: thường ở tốc độ 3.000 đến 5.000 vòng/ phút (thời
gian tùy thuộc vào trọng lượng, kích thước của tế bào).
Máy đo quang phổ (Spectrophotometer): ???
OD (optical density): ???
Bước sóng ánh sáng: ???
Pha loãng huyền phù nuôi cấy: ???
Lực ly tâm & tốc độ ly tâm ???
Một số khái niệm cơ bản
Một số khái niệm cơ bản
Tách chiết enzym protein
Tách chiết enzym protein
Dung dịch đệm chiết:
Dung dịch đệm chiết:
Phá vỡ tế bào:
Phá vỡ tế bào:
Bảo vệ protein enzym trong quá trình tách chiết
Bảo vệ protein enzym trong quá trình tách chiết

Yếu tố pH, lực ion: pH, nồng độ muối
Các chất hoạt động bề mặt: Triton, Tween
Cơ học: Nghiền, siêu âm
Hóa học: Enzym phân giải thành, vách, màng tế bào: lysozyme
Các chất chống oxy hóa, chất làm bền cấu trúc enzym:
Các chất ức chế protease: EDTA, PMSF
Nhiệt độ thấp (4
0
C)
Phương pháp kết tủa enzym
Phương pháp kết tủa enzym
Dựa trên cơ sở của nguyên lý làm kết tủa protein
Sử dụng các yếu tố gây kết tủa (không làm biến tính)
Muối trung hòa
Dung môi hữu cơ không (ít) phân cực
Lưu ý: Khi làm việc với protein phải tiền hành ở nhiệt độ
thấp, tốt nhất là 4
0
C.
Phương pháp cô đặc
Phương pháp cô đặc
Bay hơi ở áp suất và nhiệt độ thấp (chân không, lạnh)
Ly tâm loại bỏ nước, dung dịch đệm chiết enzym
(sử dụng màng ly tâm)
Tủa protein, sau đó hòa tan lại bằng một lượng nhỏ
dung dịch đệm
Phương pháp tinh sạch
Phương pháp tinh sạch
Sắc ký (chromatography)
•

Sắc ký lọc gel (sắc ký loại trừ dựa vào kích thước phân tử)
•
Sắc ký trao đổi ion
•
Sắc ký ái lực
Sắc ký lọc gel
Gel: silicagel, sephadex
Các loại gel sắc ký và kích thước
phân tử được sàng lọc tương ứng
Sephadex
Mạng lưới phân tử của gel đã được
nhồi trong cột sắc ký