Bộ môn : Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Đề tài : Lai Phân Tử Nhóm : 12, Tiết 910, thứ 5

Trường Đại Học Công Nghiệp Thực
Phẩm TPHCM
Khoa Công Nghệ Thực Phẩm
•
Bộ môn : Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm
•
GVHD : Nguyễn Thị Mỹ Lệ
•
Đề tài : Lai Phân Tử
•
Nhóm : 12, Tiết 9-10, thứ 5
Thành viên nhóm
•
1. Nguyễn Ngọc Hoàng Yến
•
2. Ngô Thị Mộng Tình
•
3. Lê Thị Ngọc Huyền
•
4. Bùi Quốc Khánh
•
5. Nguyễn Mai Huyền Trân
•
6. Nguyễn Mai Ngọc Hân
•
7. Trần Khánh Thanh Trúc
Nội dung chính
•
I. Lịch sử lai phân tử
•
II. Khái niệm về lai phân tử

•
III. Các phương pháp lai phân tử
•
IV. Ứng dụng của lai phân tử
•
V. Ví dụ của lai phân tử
I. Lịch sử lai phân tử
•
1960 Julius Marmur và những đồng nghiệp của ông quản
lý, ngành học tại đại học Harvard đã khám phá ra quá
trình ủ lại (reannealing). Quá trình này bao gồm sự kết
hợp lại của những mạch đơn thành các phân tử 2 mạch
đôi bền vững. Từ sự khám phá ra quá trình reannealing,
phương pháp lai các sour nucleic được phát triển.
•
Sử dụng kỹ thuật những mạch bổ sung từ các nguồn khác
nhau của acid nucleic có thể trộn lẫn thành dạng phân tử
2 mạch đôi được đặt tên là thể lai (hybrid).
II. Khái niệm về lai phân tử
•
Sau khi hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau
dưới tác động của Tm, sự bắt cặp sẽ không xảy ra
nếu nhiệt độ phản ứng hạ xuống đột ngột.
•
Lúc đó phân tử DNA sẽ tồn tại trong môi trường
ở dạng mạch đơn dưới một cấu hình không gian
vô trật tự. Ngược lại, nếu sau khi hai mạch tách
rời, nhiệt độ được giảm từ từ cộng với điều kiện
thí nghiệm thích hợp, hai mạch sẽ bắt cặp trở lại.
Hiện tượng này được gọi là sự lai phân tử

(molecular hybridization).
II. Khái niệm về lai phân tử
•
Đặc điểm :
Đặc hiệu tuyệt đối : sự tái bắt cặp chỉ xảy ra
giữa hai trình tự hoàn toàn bổ sung.
Các trình tự bổ sung có thể là DNA hay
RNA, dẫn đến sự hình thành các phân tử DNA-
DNA, RNA-RNA hay các phân tử lai DNA-
RNA
II. Khái niệm về lai phân tử
Hình – sự lai giữa DNA và RNA
Các yếu
tố ảnh
hưởng
Nhiệt độ
Độ dài các
trình tự
Lực ion
Nồng độ
DNA và
thời gian
phản ứng
II. Khái niệm về lai phân tử
1. Nồng độ DNA và thời gian phản ứng
- Nồng độ DNA nghĩa là số
lượng các trình tự bổ sung càng
cao thì xác suất chúng tiếp xúc
với nhau càng tăng, kết quả là

tốc độ phản ứng lai phân tử tăng
lên.
- Thời gian phản ứng càng dài thì
xác suất trên càng lớn hơn và số
lượng phân tử lai tăng dần cho
đến khi toàn bộ các trình tự bổ
sung đều tái bắt cặp (lai).
2. nhiệt độ
•
Tốc độ phản ứng lai phụ thuộc
nhiệt độ. Thông thường phản
ứng lai cực đại ở nhiệt đố thấp
hơn Tm của chính nucleic acid
đó độ 25%.
3. Độ dài của các trình tự
•
Tốc độ lai tăng tỷ lệ thuận với căn bậc 2 của
độ dài các trình tự bổ sung.
4. Lực ion
•
Nồng độ NACl 1M
làm tằng tốc độ phản
ứng lên từ 5 đến 10
lần. Nồng độ NaCl
vượt quá 1,2M lại
hoàn toàn không còn
tác dụng.
III. Các phương pháp lai phân tử
Gồm 3
phương

pháp
Lai tại chỗ
Lai trên
pha lỏng
Lai trên
pha rắn
1. Lai trên pha lỏng
•
Nguyên tắc : Các trình tự bổ sung (các mạch
đơn) nằm trong môi trường lỏng là một dung
dịch đệm. Sự lai phân tử xảy ra khi các trình tự
này gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi
nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài
độ.
Dùng
quang phổ
kế
Sử dụng
Nuclease
S1
Sắc kí trên
hydroxylapatite
1. Lai trên pha lỏng
•
Phân tích định lượng các phân tử lai: 3 phương
pháp.
Phương pháp dùng quang phổ kế
-
DNA mạch đôi hấp thu ánh sáng yếu hơn DNA mạch đơn.
-

Sự chuyển từ mạch đôi sang dạng mạch đơn được xác
định dễ dàng thông qua việc đo biến động giá trị của mật
độ quang (OD) ở bước sóng 260 nm.
-
Giá trị mật độ quang tăng lên khi phân tử mạch đôi
chuyển thành mạch đơn, hiện tượng này có tên gọi là hiệu
ứng siêu sắc (hyperchromic effect).
Hiệu ứng siêu sắc :
Nhuộm tím phân tử DNA
, nếu đem chúng đun
nóng lên và làm lạnh từ
từ thì kết quả là các phân
tử DNA sẽ trở nên tím
đậm hơn lúc đầu một
chút. Nếu hạ nhiệt độ
một cách đột ngột thì
chúng sẽ trở nên rất đậm.
Đó là do hiện tượng các
mạch đơn DNA hấp thu
tia UV mạnh hơn DNA
mạch đôi.
Phương pháp sử dụng nuclease S1
-
Nuclease S1 là enzyme thủy giải các nucleic
acid mạch đơn bất kể là DNA hay RNA trong
một số điều kiện thực nghiệm.
-
Dung dịch phản ứng lai được trích ra một
phần, đem xử lí với nuclease S1.
-

Các mạch đơn sẽ bị thủy giải, các nucleic acid
còn lại tương ứng với các phân tử lai được thu
nhận qua phương pháp tủa rồi đem định
lượng .
Phương pháp sắc kí trên hydroxylapatite
-
Hydroxylapatite là những tinh thể phosphat calci .
-
Kỹ thuật này sử dụng các mồi đánh dấu (đoạn nucleotide hoặc
kháng thể ) để lai với ADN,ARN hoặc với các protein ở trong
các tế bào mà không cần tách chiết.
-
Sau khi các hỗn hợp bị đốt nóng, chúng được làm lạnh để
những mạch đơn va chạm ngẫu nhiên. Các hỗn hợp được ủ
khoảng 120h ở 600C trong một dung dịch đệm Natri phosphat.
1. Lai trên pha lỏng
•
Các ứng dụng :
1. Tính tỉ lệ % các trình tự giống nhau ở 2 loài
gần nhau
2. Phân tích các trình tự lặp lại
3. So sánh kích thước các bộ gen không chứa
trình tự lặp lại.
2. Lai trên pha rắn
•
Nguyên tắc : Lai trên pha rắn có cùng nguyên tắc với lai trên pha
lỏng. Điểm khác biệt ở đây là 1 trong 2 trình tự bổ sung (thường là
trình tự đích, trình tự cần tìm) được cố định trên 1 giá thể rắn.
•
Ưu điểm :

+ Thao tác dễ dàng.
+ Tách trực tiếp ADN hay ARN gốc ở dung dịch thuốc thử.
+ Ngăn sự tái bắt cặp giữa 2 mạch của cùng 1 phân tử.
2. Lai trên pha rắn
Hình – các bước lai trên pha rắn
2. Lai trên pha rắn
Các yếu tố kỹ thuật quan trọng trong phương
pháp lai trên pha rắn :Giá thể rắn dùng để cố định
nucleic acid là các màng lai, có 2 loại màng lai : (1)
màng lai bằng nitrocellulose và (2) màng lai bằng
nylon.
2. Lai trên pha rắn
•
Nhược điểm :
Phân tích định lượng các phân tử lai kém
chính xác.
Hiệu quả thấp.
Vận tốc lai trên pha rắn <10 lần so với
vận tốc lai trên pha lỏng do một phần các nucleic
acid được cố định trên giá thể bị che khuất,
không tiếp xúc được với các trình tự bổ sung.