Slide Đề tài Lên men Ethanol với vi khuẩn Zymomonas mobilis

Lên men ethanol với vi k
huẩn Zymomonas mobilis
1

Đ ÁN MÔN HỌCỒ
CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
•
LÊN MEN ETHANOL VỚI VI KHUẨN
•
ZYMOMONAS MOBILIS
GVHD: PGS. TS. Lê Văn Việt Mẫn
SVTH : Văn Thò Ánh Minh
Chửụng 1: Giụựi thieọu ve loaứi vi
khuaồn Zymomonas mobilis
Lên men ethanol với vi k
huẩn Zymomonas mobilis
3
Nguồn
phân lập
Môi trường Điều kiện, kết quả Người
thực hiện
Hèm bia Thạch gelatin Xuất hiện khuẩn lạc
sau 11 ngày ở
22
o
C.
Barker
và Hillier,
1912
Bia tiệt trùng Thạch agar
(2% glucose )

Yếm khí Shimwell,
1937
Dòch nước táo Môi trường lỏng
(1% chất chiết men,
0.001% actidione)
Yếm khí,
pH = 4.5, 25
o
C
Millis,
1951-1956
Rượu vang cọ
Zairese
3 canh trường chứa
dòch chiết nấm men
(Difco) khác nhau.
Khuẩn lạc sau 4 -5
ngày ở 30
o
C có
dạng hình hạt
đậu, đường kính
từ 1 – 4mm, màu
xanh sậm.
Swings
và Deley,
1974
1. Một số nguồn phân lập Z. mobilis
Lên men ethanol với vi k
huẩn Zymomonas mobilis

4
2. Đặc điểm nhận dạng:
–
Là một loài vi khuẩn gram âm, có roi dài từ 1 – 1.4µm
Là một loài vi khuẩn gram âm, có roi dài từ 1 – 1.4µm
–
Không hình thành bào tử
Không hình thành bào tử
–
Một số loài có từ 1 -4 tiên mao.
Một số loài có từ 1 -4 tiên mao.
–
Không phát triển trên môi trường thạch hoặc nước thòt
Không phát triển trên môi trường thạch hoặc nước thòt
dinh dưỡng.
dinh dưỡng.
–
Là loài vi khuẩn vi hiếu khí (kỵ khí không bắt buộc)
Là loài vi khuẩn vi hiếu khí (kỵ khí không bắt buộc)
–
Có thể lên men đường glucose và fructose
Có thể lên men đường glucose và fructose
–
Tạo ra số mol ethanol và CO
Tạo ra số mol ethanol và CO
2
2
bằng nhau
bằng nhau
–

Chứa khoảng 47.5 – 49.5% guanine và cytosine
Chứa khoảng 47.5 – 49.5% guanine và cytosine
(G+C).
(G+C).
Chương 1: Giới thiệu về loài vi khuẩn
Zymomonas mobilis
Lên men ethanol với vi k
huẩn Zymomonas mobilis
5
3. Danh pháp
3. Danh pháp
Zymomonas mobilis
Zymomonas mobilis

Giống :
Giống :
Zymomonas
Zymomonas



Loài :
Loài :
Zymomonas mobilis
Zymomonas mobilis

Loài phụ
Loài phụ
Zymomonas mobilis subsp. mobilis
Zymomonas mobilis subsp. mobilis

Chủng tiêu biểu
Chủng tiêu biểu
: ATCC 10988 (NCIB 8938,
: ATCC 10988 (NCIB 8938,
NNRL B-806, DSM 424, IMG 1655, L192)
NNRL B-806, DSM 424, IMG 1655, L192)

Loài phụ
Loài phụ
Zymomonas mobilis subsp. pomaceae
Zymomonas mobilis subsp. pomaceae
Chủng tiêu biểu
Chủng tiêu biểu
: ATCC 29192 (NCIB 11200)
: ATCC 29192 (NCIB 11200)
Chương 1: Giới thiệu về loài vi khuẩn
Zymomonas mobilis
6
4. Thành phần hóa học của tế bào:
4. Thành phần hóa học của tế bào:
Thành phần Hàm lượng (theo chất
khô)
Protein: Pha logarit
Pha ổn đònh
ADN
ARN
Carbohydrate
Poly- -hydroxybutyrate
Polphosphate
Lưu huỳnh

NH
3
Acid amin
ATP: Pha logarit
Trong điều kiện thiếu thức ăn
65 – 69%
54%
17 – 22%
2.7%
4 – 5%
0%
0%
0.5%
0.1 – 0.5 µmol/mg
0.02 – 0.2 µmol/mg
1 – 5 µg/mg
0 – 0.4 µg/mg
Lên men ethanol với vi k
huẩn Zymomonas mobilis
7
5. Điều kiện sinh trưởng:
5. Điều kiện sinh trưởng:




–
pH = 3.5 – 7.5
pH = 3.5 – 7.5
–

Nhiệt độ: 25 - 30
Nhiệt độ: 25 - 30
o
o
C
C
–
Nồng độ ethanol là 5.5%
Nồng độ ethanol là 5.5%
–
Nồng độ glucose là 20%
Nồng độ glucose là 20%
–
Nồng độ NaCl 1%
Nồng độ NaCl 1%
–
Rất nhạy cảm với thuốc nhuộm (brilliant
Rất nhạy cảm với thuốc nhuộm (brilliant
green, malachite green…)
green, malachite green…)
–
…
…
Chương 1: Giới thiệu về loài vi khuẩn
Zymomonas mobilis
Chương 2: Cơ chế chuyển hóa
đường thành ethanol bởi
Zymomonas mobilis
Cơ chế lên men chính của vi
khuẩn Zymomonas từ nguồn

cơ chất glucose và fructose là
con đường Entner-
Doudoroff.
Lên men ethanol với vi k
huẩn Zymomonas mobilis
9
Con ñöôøng Entner – Doudoroff
Lên men ethanol với vi k
huẩn Zymomonas mobilis
10
Do đó cân bằng chung của con đường KDPG là :
Do đó cân bằng chung của con đường KDPG là :
Glucose
Glucose


2 piruvat + ATP + NADH
2 piruvat + ATP + NADH
2
2
+ NADPH
+ NADPH
2
2
Các enzyme của con đường Entner – Doudoroff có thể
Các enzyme của con đường Entner – Doudoroff có thể
kháng cự tốt hơn với ethanol nên
kháng cự tốt hơn với ethanol nên
Z. mobilis
Z. mobilis

có thể
có thể
nhanh chóng hấp thu glucose và sản xuất ethanol
nhanh chóng hấp thu glucose và sản xuất ethanol
nhiều hơn 15% w/v.
nhiều hơn 15% w/v.
Màng tế bào của
Màng tế bào của
Z. mobilis
Z. mobilis
có chứa nhiều loại acid béo
có chứa nhiều loại acid béo
giúp nó chòu được nồng độ ethanol cao.
giúp nó chòu được nồng độ ethanol cao.
Chương 2: Cơ chế chuyển hóa đường
thành ethanol bởi Zymomonas mobilis
Lên men ethanol với vi k
huẩn Zymomonas mobilis
11


Sự hình thành các sản phẩm phụ
Sự hình thành các sản phẩm phụ
1. Sản phẩm phụ là Acrolein
1. Sản phẩm phụ là Acrolein
2. Sản phẩm phụ là sorbitol
2. Sản phẩm phụ là sorbitol
3.Sản phẩm phụ là glycerol 3-phosphate,
3.Sản phẩm phụ là glycerol 3-phosphate,
dihydroxyacetone và glycerol

dihydroxyacetone và glycerol


Chương 2: Cơ chế chuyển hóa đường
thành ethanol bởi Zymomonas mobilis
Lên men ethanol với vi k
huẩn Zymomonas mobilis
12
Chương 3: Phương pháp lên men
ethanol với Zymomonas mobilis
1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
1.1. Nồng độ đường ban đầu

Hiệu suất lên men cực đại ứng với 15% (w/v)
Hiệu suất lên men cực đại ứng với 15% (w/v)
nồng độ đường ban đầu.
nồng độ đường ban đầu.

Gia tăng nồng độ đường ban đầu từ 15–20%
Gia tăng nồng độ đường ban đầu từ 15–20%
sẽ làm giảm hiệu suất lên men.
sẽ làm giảm hiệu suất lên men.

Với 25 % (w/v) tất cả các chủng đều giảm khả
Với 25 % (w/v) tất cả các chủng đều giảm khả
năng hấp thu cơ chất và lên men ethanol.
năng hấp thu cơ chất và lên men ethanol.
13
Chương 3: Phương pháp lên men
ethanol với Zymomonas mobilis

1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
1.2. Cơ chất
1.2.1. Glucose hoặc fructose
Thông số Glucose Fructose
Tốc độ hấp thu đường riêng cực đại
(g đường/g tế bào.giờ )
8.5
2.1
Tốc độ sản xuất ethanol riêng cực đại
(g ethanol/g tế bào.giờ)
4.1
1.0
Hiệu suất sinh trưởng trung bình
(g sinh khối tế bào/g đường)
0.055 0.034
Giá trò hiệu suất ATP (YATP)
(g sinh khối tế bào /mol ATP)
9.9
5.1
14
Chương 3: Phương pháp lên men
ethanol với Zymomonas mobilis
1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
1.2. Cơ chất:
1.2.2. Hỗn hợp glucose và fructose
Với cùng một nồng độ trong hỗn hợp glucose và fructose
Với cùng một nồng độ trong hỗn hợp glucose và fructose
thì
thì
fructose được

fructose được
Z. mobilis
Z. mobilis
hấp thu chậm hơn
hấp thu chậm hơn
, do :
, do :

Sự kìm hãm enzyme fructokinase bởi glucose.

Enzyme glucose-fructose oxidoreductase xúc tác phản
ứng hình thành sorbitol từ fructose, một chất giúp Z.
mobilis chòu được áp suất thẩm thấu trong môi trường
có nồng độ đường cao.
Lên men ethanol với vi k
huẩn Zymomonas mobilis
15
Cơ chế tích lũy và chuyển hóa glucose và fructose
ở Z. mobilis
16
Chương 3: Phương pháp lên men
ethanol với Zymomonas mobilis
1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
1.2. Cơ chất:
1.2.3. Hỗn hợp glucose và xylose
17
Chương 3: Phương pháp lên men
ethanol với Zymomonas mobilis
1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
1.2. Cơ chất:

1.2.3. Hỗn hợp glucose và xylose
•
Tốc độ sinh trưởng, sử dụng cơ chất riêng, sản
Tốc độ sinh trưởng, sử dụng cơ chất riêng, sản
lượng sinh khối và sản xuất ethanol trên cơ chất
lượng sinh khối và sản xuất ethanol trên cơ chất
là xylose của chủng
là xylose của chủng
Z.mobilis
Z.mobilis
ZM4 (pZP5) tái tổ
ZM4 (pZP5) tái tổ
hợp
hợp
thấp hơn
thấp hơn
trên cơ chất là glucose hoặc hỗn
trên cơ chất là glucose hoặc hỗn
hợp glucose – xylose.
hợp glucose – xylose.
•
Z. mobilis
Z. mobilis


hấp thu đường glucose trước
hấp thu đường glucose trước
, còn
, còn
xylose thì được hấp thu sau với tốc độ chậm hơn

xylose thì được hấp thu sau với tốc độ chậm hơn
Lên men ethanol với vi k
huẩn Zymomonas mobilis
18
•
●
●
- Xylose;
- Xylose;





- glucose;
- glucose;
•
■
■
- ethanol;
- ethanol;



- sinh khối.
- sinh khối.
•





- xylitol;
- xylitol;





- acetic
- acetic
acid;
acid;
•
□
□
, glycerol;
, glycerol;



- acetoin.
- acetoin.
Sự lên men
của chủng
tái tổ hợp
ZM4 (pZB5)
trên các cơ
chất khác
nhau
19

Chương 3: Phương pháp lên men
ethanol với Zymomonas mobilis
1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
1.2. Cơ chất:
1.2.4. Arabinose
•
3 L-arabinose + 3ADP + 3 Pi
3 L-arabinose + 3ADP + 3 Pi
→ 5 ethanol + 5CO
2
+ 3ATP + 3H
2
O (mol)

Hiệu suất ethanol lý thuyết là 0.51 g ethanol/g L-arabinose
Hiệu suất ethanol lý thuyết là 0.51 g ethanol/g L-arabinose
hoặc 1.67 mol ethanol/ mol L-arabinose.
hoặc 1.67 mol ethanol/ mol L-arabinose.

Có hơn 27g/lít ethanol được sản xuất ra trong môi trường
Có hơn 27g/lít ethanol được sản xuất ra trong môi trường
có nồng độ glucose và arabinose ban đầu cao với pH =5.25.
có nồng độ glucose và arabinose ban đầu cao với pH =5.25.

Do bò kìm hãm cạnh tranh bởi glucose nên
Do bò kìm hãm cạnh tranh bởi glucose nên
arabinose sẽ bò
arabinose sẽ bò
hấp thu chậm hơn
hấp thu chậm hơn

, khi glucose cạn kiệt, arabinose sẽ được
, khi glucose cạn kiệt, arabinose sẽ được
hấp thu nhanh chóng ngay sau đó.
hấp thu nhanh chóng ngay sau đó.
20
Chương 3: Phương pháp lên men
ethanol với Zymomonas mobilis
1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
1.3. Nồng độ glucose
Chủng Glucose (100g/l) Glucose (150g/l) Glucose (200g/l) Glucose (250g/l)
Ye
(% LT)
%
Glucose
sử dụng
Ye
(% LT)
%
Glucose
sử dụng
Ye
(% LT)
%
Glucose
sử dụng
Ye
(% LT)
%
Glucose
sử dụng

3881 93.8 98.2 91.8 98.5 93.6
97.9
95.9 91.2
3883 94.3 98.5 93.4 98.6 94.2
99.0
96.0 98.2
Bảng 16 : Hiệu suất sinh tổng hợp ethanol và sử dụng glucose bởi 2 chủng thuộc
loài Z. mobilis trong lên men tónh
(30
o
C, thời gian lên men 48 giờ và 72 giờ cho nồng độ glucose là 250g/l)
21
Chương 3: Phương pháp lên men
ethanol với Zymomonas mobilis
1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
1.4. pH ban đầu
•
Hiệu suất lên men đạt cực đại ở pH 7 và thấp nhất ở pH
Hiệu suất lên men đạt cực đại ở pH 7 và thấp nhất ở pH
4, chứng tỏ nếu gia tăng pH ban đầu thì sự hấp thu cơ
4, chứng tỏ nếu gia tăng pH ban đầu thì sự hấp thu cơ
chất và hiệu suất lên men cũng tăng.
chất và hiệu suất lên men cũng tăng.
•
Do đó pH tối ưu cho sự lên men ethanol với
Do đó pH tối ưu cho sự lên men ethanol với
Z. mobilis
Z. mobilis

được chọn là 7.
được chọn là 7.
22
Chương 3: Phương pháp lên men
ethanol với Zymomonas mobilis
1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
1.5. Nhiệt độ

Nhiệt độ tối ưu cho quá trình lên men là 30
Nhiệt độ tối ưu cho quá trình lên men là 30
o
o
C.
C.

Khi nhiệt độ của môi trường lên men tăng từ 30
Khi nhiệt độ của môi trường lên men tăng từ 30
– 36oC (nồng độ glucose không đổi trong hỗn
– 36oC (nồng độ glucose không đổi trong hỗn
hợp nhập liệu) thì nồng độ sinh khối giảm và tốc
hợp nhập liệu) thì nồng độ sinh khối giảm và tốc
độ hấp thu glucose tăng dần.
độ hấp thu glucose tăng dần.

Khi tăng nhiệt độ khoảng 2 – 3
Khi tăng nhiệt độ khoảng 2 – 3
o
o
C, hiệu suất
C, hiệu suất

chuyển hóa glucose tăng từ 82% đến 90%.
chuyển hóa glucose tăng từ 82% đến 90%.

Tuy nhiên, nhiệt độ cao quá mức sẽ có nhiều
Tuy nhiên, nhiệt độ cao quá mức sẽ có nhiều
glucose thất thoát trong canh trường, hiệu suất
glucose thất thoát trong canh trường, hiệu suất
chuyển hóa giảm còn 65%.
chuyển hóa giảm còn 65%.
23
Chương 3: Phương pháp lên men
ethanol với Zymomonas mobilis
1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
1.6. Nồng độ ethanol ban đầu
•
Nếu có ethanol ban đầu trong môi trường dinh dưỡng
Nếu có ethanol ban đầu trong môi trường dinh dưỡng
thì sẽ
thì sẽ
làm giảm
làm giảm
sản xuất sinh khối, hấp thu cơ chất, sản
sản xuất sinh khối, hấp thu cơ chất, sản
xuất ethanol, hiệu suất và hệ số chuyển hóa đường.
xuất ethanol, hiệu suất và hệ số chuyển hóa đường.
•
Cụ thể
Cụ thể
:
:


Với môi trường là sucrose có 2.5% ethanol ban đầu thì
Với môi trường là sucrose có 2.5% ethanol ban đầu thì
hiệu suất ethanol giảm 48.8%, hiệu suất sinh khối giảm
hiệu suất ethanol giảm 48.8%, hiệu suất sinh khối giảm
25% và tổng lượng đường hấp thu giảm 28.3%.
25% và tổng lượng đường hấp thu giảm 28.3%.

Với môi trường là glucose có 3% ethanol ban đầu thì
Với môi trường là glucose có 3% ethanol ban đầu thì
hấp thu đường giảm 60 – 65%.
hấp thu đường giảm 60 – 65%.
(Moreau và cộng sự, 1997).
(Moreau và cộng sự, 1997).
24
Chương 3: Phương pháp lên men
ethanol với Zymomonas mobilis
1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
1.6. Nồng độ ethanol ban đầu
•
Ở nồng độ ethanol rất cao (20%, wt/vol), sự lên
Ở nồng độ ethanol rất cao (20%, wt/vol), sự lên
men bò kìm hãm hoàn toàn.
men bò kìm hãm hoàn toàn.
•
Thêm ethanol vào quá trình lên men sẽ ức chế
Thêm ethanol vào quá trình lên men sẽ ức chế
khả năng lên men của tế bào
khả năng lên men của tế bào
Z. mobilis

Z. mobilis
.
.
25
Chương 3: Phương pháp lên men
ethanol với Zymomonas mobilis
2. Phương pháp thực hiện
2.1. Vi khuẩn tự do
Khả năng kết bông của
Khả năng kết bông của
Z. mobilis
Z. mobilis
:
:

So với bông tụ của nấm men, bông tụ của
So với bông tụ của nấm men, bông tụ của
Z. mobilis
Z. mobilis
có thể
có thể
chòu được điều kiện pH cao hơn (pH 6).
chòu được điều kiện pH cao hơn (pH 6).



Z. mobilis
Z. mobilis
có thể sản xuất ra các polyme nhân tạo như
có thể sản xuất ra các polyme nhân tạo như

polyarcylamide, polyethylenimine và chitosan hoặc các đại
polyarcylamide, polyethylenimine và chitosan hoặc các đại
phân tử ngoại bào như polysaccharide (levan, cellulose).
phân tử ngoại bào như polysaccharide (levan, cellulose).

Những chủng
Những chủng
Z. mobilis
Z. mobilis
này có hiệu suất chuyển hóa
này có hiệu suất chuyển hóa
glucose và fructose cao (gần 96%) và năng suất ethanol
glucose và fructose cao (gần 96%) và năng suất ethanol
đạt cực đại ở độ pha loãng 0.9 – 1.8h
đạt cực đại ở độ pha loãng 0.9 – 1.8h
-1
-1
.
.