Đề tài lên men ethanol bằng phương pháp chu kỳ sử dụng nấm men cố định

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN
BO doa
Giáo viên hướng dẫn
{ký tên)
1
MỤC LỤC
2
SOÍBG8LỜI MỞ ĐẦU
ao doa
Như chúng ta đã biết, Ethanol đóng vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh vực,
như: tổng họp chất hữu cơ; dược phẩm; nhiên liệu sinh học; đặc biệt là lĩnh vực sản
xuất thực phẩm.
Trong sản xuất thực phẩm, Ethanol dùng làm nguyên liệu sản xuất đồ uống
có cồn, dùng làm dung môi, chất diệt khuẩn, . . . nhìn chung Ethanol được biết đến
nhiều nhất như là một loại đồ uống.
Lên men Ethanol là một quy trình sản xuất đã có lịch sử lâu đời, và phổ biến
trên khắp thế giới.
Có nhiều phưomg pháp lên men Ethanol và sử dụng nhiều loài vi sinh vật
khác nhau, ứng với mỗi phưomg pháp, mỗi loại nấm men cho một hiệu suất và giá trị
cảm quan khác nhau. Để có được sản phẩm Ethanol tốt nhất, về mặt kinh tế, cảm
quan, trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về dòng sản phẩm này. Bài báo cáo
của nhóm chúng em sẽ tìm hiều về lên men Ethanol theo phưomg pháp chu kỳ, sử
dụng nấm men cố định, đặt biệt về các yếu tố ảnh hưởng và từ đó rút ra kết luận
chung nhất cho phưomg pháp này.
3
1. TỔNG QUÁT:
1.1 Ethanol:
Ethanol được gọi là rượu etylic, rượu nguyên chất, rượu ngũ cốc, hay rượu
uống, là một chất lỏng không màu, dễ bay hơi, dễ cháy. Nó được biết đến nhiều nhất
là loại đồ uống có cồn, ngoài ra còn được dùng làm dung môi, nhiên liệu từ cồn. Theo
cách dùng thông thường nó được gọi là rượu uống, hay rượu mạnh.

Ethanol là một rượu mạch thẳng, công thức phân tử: C2H5OH.
Lên men Ethanol còn được gọi là quá trình lên men rượu, là một quá trình
sinh học ữong đó các loại đường như glucose, fructose, và sucrose, được chuyển đổi
thành năng lượng cho tế bào và do đó sản sinh ra ethanol, khí C02, cũng như các sản
phẩm trao đổi chất khác.
1.2 Phương pháp lên men chu kỳ:
Flow Diagram
for Ethyl
Alcohol
Production
Hình 1. Mô hình lên men chu kỳ sử dụng nấm men cố định
Lên men chu kỳ hay còn gọi là lên men gián đoạn (lên men theo mẻ) ừong
đó: men giống và dịch đường ban đầu có thể bơm song song để nấm men được đảo
đều ngay từ đầu. Lượng men giống thường chiếm khoảng 10% so với thể tích thùng
4
lên men, nhưng dịch đường không bơm đầy thùng lên men ngay mà thời gian đổ đầy
một thùng lên men kéo dài từ 6- 8h. Nhờ đó tỷ lệ men giống lúc đầu tăng và hạn chế
được phát triển của tạp khuẩn.
1.3 Nấm men cố định.
1.3.1. Sơ lược về kỹ thuật cố định tế bào:
Kỹ thuật cố định tế bào được định nghĩa là: “Kỹ thuật bao bọc hoặc định vị
các tế bào còn nguyên vẹn lên một “vùng không gian nhất định” nhằm bảo vệ các hoạt
tính xúc tác mong muốn”
Cố định thường là sự bắt chước các hiện tượng xảy ra trong tự nhiên do các
tế bào có thể phát triển trên bề mặt hoặc bên Uong các cấu trúc của nguyên liệu có
trong tự nhiên.
5
1.3.2. Một số tính chất của nấm men cố định:
•S Sự thay đổi về sinh trưởng, hình thái tế bào:
Như chúng ta đã biết, quá trình sinh trưởng của vi sinh vật nói chung và nấm

men nói riêng phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trường quanh nó. Khi cố định tế
bào, do sự tương tác giữa tế bào - chất mang và giữa các tế bào bới nhau mà khả năng
sinh trưởng và hình thái của tế bào cũng có một vài biến đổi.
Theo một số tác giả khả năng sinh trưởng của nấm men cố định kém hơn so
với nấm men tự do.
Nhiều nghiên cứu cũng cho thấy rằng nấm men cố định luôn sinh trưởng đạt
đến một số lượng tế bào không đổi và giữ nguyên như vậy cho đến khi kết thúc quá
trình lên men.
Bên cạnh đó Melzoch và cộng sự ( năm 1994), cũng thấy rằng 80% tế bào cố
định trong gel alginate đều duy trì hoạt tính trao đổi chất và khả năng phát triển khi
nuôi cấy trong thời gian dài. Saccharomyces cerevisiae cố định trong gel alginate có
thể duy trì khả năng sử dụng đường của chúng ở mức độ tương đối cao và ổn định, chỉ
giảm khoảng 20% sau 1122 giờ nuôi cấy, [1].
Hình thái của nấm men cố định cũng thay đổi nhiều so với nấm men tự do.
■S Sự thay đổi về hoạt động trao đổi chất của tế bào:
6
Nhiều nghiên cứu của các tác giả cho thấy rằng nấm men cố định có tốc độ
sử dụng glucose, tốc độ sinh tổng họp Ethanol và glycerol cao hơn nhiều so với nấm
men tự do mặc dù diện tích bề mặt tế bào của nấm men cố định dùng để vận chuyển
chất dinh dưỡng nhỏ hơn so với của nấm men tự do.
Kết quả nghiên cứu của thầy Lê Văn Việt Mẩn và cô Bùi Thanh
Huyền( 2008), về quá trình lên men cồn sử dụng nấm men cố định trên canxi alginate
cho thấy nấm men cố định có tốc độ sử dụng đường cũng như tốc độ sinh tổng hợp
Ethanol cao hơn hẳn nấm men tự do,[2].
V Những thay đổi về khả năng chống lại các yếu tố bất lợi của môi trường:
Lượng cơ chất càng cao hoặc lượng sản phẩm càng cao thì càng ức chế hoạt
động sống của tế bào nấm men. Tuy nhiên, so với nấm men tự do thì nấm men cố định
khả năng chịu sự ức chế cơ chất và sản phẩm cao hơn.
1.3.3. Nấm men dùng trong lên men Ethanol theo phương pháp chu kỳ bằng
nấm men cố định:

Thường sử dụng nấm men Saccharomyces cerevỉsỉae cho phương pháp lên men
này.
> Yêu cầu về dinh dưỡng của nấm men Saccharomyces cerevỉsỉe:
Tất cả các chủng của s. cerevỉsỉae có thể phát triển trên glucose, maltose và
trehalose, không phát triển trên lactose và cellobiose. Tuy nhiên sự sinh trưởng trên
các loại đường khác nhau thì khác nhau.
Khả năng sử dụng các loại đường khác nhau của nấm men có thể khác nhau
phụ thuộc vào môi trường hiếu khí hoặc kỵ khí. Một vài chủng không thể phát triển
kỵ khí trong môi trường sucrose và trehalose.
Tất cả các chủng có thể sử dụng ammoniac và urê là nguồn nitơ duy nhất,
nhưng không thể dùng nitrat, vì chúng thiếu khả năng phân giải nitrat thành các ion
amoni. Chúng có thể sử dụng hầu hết các amino axit, peptit ngắn mạch, và đạm cơ
bản như nguồn nitơ. Một số chủng s. cerevìsìae không có enzyme protease vì vậy
7
không thể chuyển hóa được protein ngoại bào.
Nấm men cũng cần photpho, được dùng như là một ion dihydrogen
phosphate, lưu huỳnh, có thể chuyển hóa như một ion suníate, hoặc lượng sulíur hữu
cơ như amino axit methionine và cysteine. Một số kim loại, như magiê, sắt, canxi và
kẽm, cũng cần thiết cho sự tăng trưởng tốt của nấm men.
1.4 Chất mang cố định sử dụng trong sản xuất ethanol:
Kỹ thuật cố định nấm men trong sản xuất rượu đã được nghiên cứu rộng rãi,
tuy nhiên việc ứng dụng kỹ thuật này trong công nghiệp vẫn còn hạn chế. Mục đích
của việc sử dụng nấm men cố định là để cải thiện năng suất sinh Ethanol cũng nhu
chất lượng sản phẩm. Để có thể ứng dụng thành công trong công nghiệp, chất mang
được sử dụng để cố định phải đạt được độ an toàn thực phẩm, có nhiều trong tự nhiên,
8
giá thành thấp và không làm ảnh hưởng đến tính chất cảm quan của rượu.
Các chất mang thường được sử dụng gồm [3,4]:
- Chất mang hữu cơ: Alinate, PVA (polyvinil Alcohol) K-carrageenan, Aga,
DCM DCM (Deligniíìed Cellulosic Material),

- Chất mang thực phẩm: miếng lê, miếng mộc qua, miếng táo, nho khô, vỏ
nho,
- Chất mang vô cơ: y-alumina, Hydromica, Kissir,
- Chất mang dạng màng: màng membrane, màng vi lọc sinh học
(biocapsule)
2. QUÁ TRÌNH LÊN MEN ETHANOL:
♦í* Cơ chế sinh học của lên men rượu:
9
Lên men rượu gồm các quá trình sinh hóa và sinh học rất phức
tạp, xảy ra dưới tác dụng của nhiều enzyme. Đường và các
chất dinh dưỡng được hấp thụ qua bề mặt tế bào rồi thẩm thấu
vào bên trong. Ở đó các enzyme sẽ xúc tác các phản ứng khác
nhau để cuối cùng tạo ra sản phẩm chính là rượu và khí
carbonic. Hai chất này sau khi sinh ra sẽ qua màng tế bào chất
vào môi trường lên men. Rượu do rất linh động nên hòa tan
nhanh trong dịch lên men, còn khí carbonic hòa tan
kém.Glucose
fìrst __n
priming 0 rATP reactíon s, ADP
Glucose 6-phosphate
©
Fructose 6-phasphate
seccnd ATP
priming (3) reactỉon ■'•N* ADP
Fructose 1,6-bỉsphosphate
cleavage of 6-carbon sugarphosphate to the 3-carbon (4) sugar
phosphates
Glyceraidehyde 3-phosphate +
Dihydroxyacetone phosphate
Hổ

H ÓH
®-0-CH2^0. CH2-OH
IvH HỌyl
Preparatory phase
(X) Hexokinase (5) Phosphohexosé
isomerase
(3) Phospho- fructokinase-1
OHH ^
0_o—CH2 0. CH2—o—® w Aldoỉase
(D Triose
phosphate
isomerase
o
®—o—CH2—C H—
OH H
(p)—o—CH2—c—CH2OH
0
10
11
Glyceraldehyde 3-phosphate «, +
Dỉhydroxyacetone phosphate
0—0—CH,— CH—c^
(p)— o — c H2—c—
CH20H 0
(5) Triose phosphate Iíomerase
(b)
Glyceraldehyde 3-phosphate (2)
r2 P'_
^2NAD+
^ 2 NADH 4- H *

©-t>—CH2—c HÍCH
oxidâtiion and phoíphorylation
1,3-Bisphasphoglycerate (2) íirst ATP- L-2ADP
íorming reaction /O*
(substrăte-level ^ ^ 2 ATP phosphorylation)
3-Phosphoglycerate (2)
(p)—O-—c H2 —c H—c,
_ ôn
Ị
12
2-Phosphogiycerate (2)CHí—CH—
„11 OH 0 0
S,2H2O 1
. L „ ™ ổ s
Phosphoenolpyruvate (2) CH2=C—
second ATP- ^ 2ADP 0 ^
formỉng reaction ÍQỊ
(substrate-level 2 ATP(£) 0
phosphorylation) l CHỊ—c c
Pyruvate (2) II '*0
Payoff phase
Oxidative conversion of c\ gỉyceraldehyde 3-phosphate H to
pyruvatê and thê eoupled tormaiion of ATP and NADH
o (6) Glyceraldehyde
3-phosphate
0—0 dehydrogenase
(7) Phospho- glycerate kinase
® Phospho- glycerate mutase
(?)
Enolase

(13 Pyruvate kinase
Glucose
glycolysis (10
successive reactions)
hypoxic or anaerobic conditions
aerobic conditions V 2CO,
anaerobic
conditions
Fermentaíion to
ethanol ìn yeast
2 Acetyl-CoA
citric
acid
cycle
Fermentation to lactatein vigor- ously contracting muscle, in erythro- cytes, in
some other cells, and ĩn some micro- organisms
4C02 + 4H20
Animal, plant, and many microbia!
Hình 2. Con đường tổng hợp Ethanol
13
14
❖ Phương trình tổng quát của lên men rượu:
C6H1206 V™™* 2C02 + 2CH3CH2OH
Trong quá trình lên men rượu, mỗi phân tử gam glucose sẽ giải phóng ra
khoảng 50kcal. Năng lượng này sẽ được nấm men sử dụng khoảng 20kcal. số còn lại
sẽ thải ra canh trường do đó làm tăng nhiệt độ dịch lên men.
Trong quá trình lên men, ngoài sản phẩm chính là rượu và C02, còn tạo ra nhiều
chất khác. Bằng phân tích sắc ký người ta phát hiện ưên 50 chất khác nhau, nhưng có
thể xếp thành 4 nhóm chính: acid, este, aldehyl, và rượu bậc cao hay rượu có số
carbon lớn hon hai.

3. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH LÊN MEN ETHANOL
THEO PHƯƠNG PHÁP CHU KỲ sử DUNG NẤM MEN CÓ ĐINH:
• •
3.1. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất:
31.1. Đường:
10
20
30
40
50
60 70 80
Time JhourJ
Time- (hour)
(a)
(b)
15
250-€
Hình 3. Tốc độ sử dụng đường trong canh trường nấm men
Saccharomyces
cerevisiae cố định ừong gel alginate
16
Đường là nguồn nguyên liệu chính mà nấm men sẽ sử dụng để chuyển hóa thành cồn.
Tuy nhiên nồng độ dịch đường quá cao sẽ dẫn đến làm tăng áp suất thẩm thấu và làm
mất cân bằng ừạng thái sinh lý của nấm men. Kết quả là rượu nhiều sẽ ức chế không
những các tạp khuẩn mà còn cả nấm men. Mặc khác đường nhiều sẽ dẫn đến tổn thất
hoặc phải kéo dài thời gian lên men. Ngược lại nếu nồng độ dịch đường thấp sẽ
không kinh tế làm giảm năng suất thiết bị lên men. Mặc khác sẽ tốn hơi khi chưng
cất và tổn thất rượu trong bã rượu và nước thải.
250-€
• Cycle I: ♦

• Cycle II: •
• Nấm men tự do: A, ở 30°c, pH = 4.5 và nồng độ đường ban đầu là 140g/l (a);
170g/l (b) va 220 g/1
Anh hưởng của nồng độ đường đối với hoạt động trao đổi chất của nấm men
được đánh giá qua tốc độ sử dụng đường (hình 3), trích kết quả nghiên cứu của thầy
Lê Văn Việt Mần và cộng sự (2008), [2]. Từ Hình 3.2 cho ta thấy:
Chu kỳ II, kéo dài hon chu kỳ 11 vì sự gia tăng nồng độ đường ban đầu làm
17
250-€
cho thời gian lên men bị kéo dài. Ngoài ra khi nồng độ đường ban đầu tăng cao, tốc
độ sử dụng đường cũng giảm. Tuy nhiên, sự thay đổi trong canh trường dùng nấm
men cố định là không nhiều như canh trường dùng nấm men tự do.
So sánh giữa nấm men cố định và nấm men tự do; nấm men cố định, thời
gian lên men luôn kéo dài hon, nhưng nồng độ đường sót thấp hon, nồng độ cồn từ
8.4-11.7%, cao gấp đôi trường hợp dùng nấm men tự do. Lý do có thể nấm men cố
định đã được bảo vệ, không bị ảnh hưởng bởi các thay đổi bất lợi như pH, tích lũy
cồn, các yếu tố này đều làm giảm hoạt động trao đổi chất của nấm men.
Một khảo sát khác của Irfana Ikram và cộng sự (2009), [5], khảo sát ảnh
hưởng của nồng độ đường ban đầu tới quá ưình lên men. Kết quả như sau:
18
250-€
<d)21 %
Fres yeaat OBI:B
ITTO hi ized roaat DÉla
•Freoyee3t od 5
IniTODí izetí yeast cslla
(a) 12 %
(b) 15 %
Frae 9Qa; ce a
■ lfTTroD;li2«a yeast CB('E I

- ó F ’Ô5 j425t cs: Ẽ
—0— nvnoai bed ysaac csila
(c) 18 %
Hình 4. Anh hưởng của nồng độ đường đến quá trình lên men Ethanol bằng
nấm men s. cerevỉsìa GC-IIB31 tự do và cố định , nhiệt độ 30 độ c, pH 4.5
Nồng độ đường dao động ừong khoảng 12- 21% và thực hiên lên men từ 24-
120h.
Ta thấy rằng ở nồng độ đường 12%, nấm men tự do đạt hiệu suất sinh
Ethanol 2,34%, tiêu thụ 8,08% đường. Tuy nhiên đối với nấm men cố định thì đạt
19
250-€
hiệu suất sinh Ethanol là 4,13% và tiêu thụ 11,04% đường.
20
Hiệu suất tối đa thu nhận được khi nồng độ đường là 15% ở trong cả 2 trường hợp sử dụng
nấm men tự do hay cố định. Nấm men tự do cho 6,49% etanol,tiêu thụ hết 14,92% đường
trong khi đó đối với nấm men cố định thì tạo ra 5,85% Ethanol và tiêu thụ hết 14.9%
đường.
Ở hai nồng độ 18% và 21% còn lại thì hiệu suất thu nhận Ethanol giảm xuống rất
thấp. Khi nồng độ đường lên cao, làm cho độ nhớt tăng cao, làm giảm quá trình trao đổi
chất, giảm hiệu suất tổng hợp ethanol
Kết quả nghiên cứu của Irfana Ikram [5] cho thấy nồng độ đường cho hiệu suất
sinh Ethanol cực đại chỉ đạt 15%, thấp hon so kết quả thu được của thầy Lê Văn Việt Man.
Có thể sự sai lệch này là do kỹ thuật thực hiện khác nhau như mật độ nấm men, tạp nhiễm,
V, V
Nồng độ đường cũng có ảnh hưởng quyết định tới quá trình lên mên và ảnh
hưởng tới tốc độ tạo thành sản phẩm và năng suất cuối cùng khi được bổ sung vào trong
thời kỳ sinh trưởng phát triển của nấm men. Nồng độ đường ban đầu nó ảnh hưởng tới
lượng Ethanol thành phẩm. Theo hình trên ta thấy sản phẩm Ethanol tối đa thu nhận được
ở môi trường có chứa 15% đường ở trong cả 2 trường hợp lên men sử dụng nấm men s.
cerevỉsỉae cố định hay tự do. Khi nồng độ đường tiếp tục tăng dẫn đến làm giảm lượng

Ethanol là do hàm lượng đường tăng dẫn đến làm tăng độ nhớt môi trường dẫn đến việc
làm giảm quá trình trao đổi chất do đó mà làm giảm hiệu suất tạo thành ethanol.
Maziar Safaei Asli ( 2009), cũng nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường vào
quá trình sản xuất Ethanol theo chu kỳ, sử dụng chủng nấm men Saccharomyces
Cerevesỉae SCI, kết quả thể hiện trên hình 5 và 6, [6],.
21
■» £0 —■—100
—
—^— 500
—>ỉ—35ữ
Hình 5. Ảnh hưởng của nồng
độ đường đầu vào quá trình
sản xuất ethanol.
Hình 6. Ảnh hưởng của nồng độ đường ban đầu vào quá trình chuyển hóa
đường.
Từ hình 5 và 6. cho ta thấy nồng độ đường ban đàu ảnh hưởng tới nồng độ
Ethanol và quá trình chuyển hóa đường trong suốt quá trình lẽn men. Căn cứ theo kết quả,
nồng độ Ethanol tăng khi tăng nồng độ cơ chất nhưng có sự biến đổi rộng trong khoảng
thời gian diễn ra lên men. Những nồng độ Ethanol tối đa là 23, 46.1 và 95.1 g/1 thu nhận
được ở 48, 72 và 120h với các dung dịch đường tương ứng là 50, 100 và 250 g/1.
22
Như ta đã thấy, với nồng độ đường thấp, sản phẩm Ethanol được tạo ra trong giai
đoạn phát triển tăng trưởng của nấm men chỉ trong một thời gian ngắn và do đó cần ít thời
gian lên men. Trong bài nghiên cứu của Pramanik (2003) cho thấy khi nồng độ Ethanol đạt
đến khoảng 95g/l thì nó trở thành chất ức chế, nhưng trong bài nghiên cứu này không cho
thấy hiện tượng trên [7].
Cũng theo kết quả của nghiên cứu này sản lượng Ethanol tối đa và tối thiểu thu
nhận được ở dung dịch đường ban đầu
là 100 và 250 g/1.
B i ể u đ ồ . Ả n h h ư ở n g c ủ a n ồ n g

đ ộ đ ư ờ n g b a n
đ ầ u t ớ i h i ệ u s u ấ t t ổ n g h ự p
E t h a n o l
Hình 7. Ảnh hưởng của nồng
độ đường tới hiệu suất tổng họp
Ethanol
Tốc độ sinh trưởng và
lượng sinh khối đạt cực đại khi
dùng nấm men cố định sẽ cao hom khi dùng nấm men tự do. Vỉ khi lên men với nồng độ
cơ chất cao,
23
Bảng 1. Ảnh hưởng của nồng đồ đường ban đầu tới hiệu suất Ethanol
0,47
0,46
50 100 1 50 200 25 0
dùng nấm men cố định, trên bề mặt chất mang sẽ xuất hiện một gradient nồng độ, và giúp
cho nấm men làm quen dần với môi trường
3.1.2. Ảnh hưởng của khoáng chất:
Khoáng chất đóng vai trò vô cùng quan trọng trong hoạt động của tế bào men,
đặc biệt là phospho. Phospho thường ở dạng liên kết hữu cơ và có trong thành phần của
photphatit, nucleoproteit cũng như axit nucleic. Phospho, Magie và lưu huỳnh có tác dụng
làm hoạt hóa photphataza trong quá trình lên men. Lưu huỳnh và sắt đều tham gia phản
ứng oxy hóa khử, ngoài ra sắt cùng với các chất vô cơ khác như Zn, Mn, Cu, Mg đều là
những chất không thể thiếu đối với nhiều enzym oxy hóa) oxydaza, katalaza peroxydaza).
Canxi còn giúp và loại bỏ các chất độc thải ra khi lên men, đồng thời giúp cho tổng hợp
protit, làm tăng quá trình oxy hóa và có tác dụng tạo thành một số vitamin.
Bảng 2. Ảnh hưởng của các chất khoáng bổ sung vào môi trường trong quá trình
lên men Ethanol bởi nấm men cố định S.cerevỉsỉae trong gel alginate
24
Điều kiện lên men: pH= 5, nhiệt độ 30°c, tốc độ khuấy trộn 100 rpm, nồng độ

đường ban đầu là 150 g/1, mật độ tế bào nấm men ban đầu khoảng 2.5* 107CFU/ml, [8]
25