Khảo sát tính đa dạng di truyền của vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học phân lập từ chất thải trong ao nuôi cá tra và ứng dụng vào xử lý nước ao nuôi cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

ĐẶNG THỊ HUỲNH MAI




KHẢO SÁT TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN
CỦA VI KHUẨN TỔNG HỢP CHẤT KẾT TỤ SINH HỌC
PHÂN LẬP TỪ CHẤT THẢI TRONG AO NUÔI CÁ TRA
VÀ ỨNG DỤNG VÀO XỬ LÝ NƢỚC AO NUÔI CÁ TRA
Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG



Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã ngành : 62 42 01 07
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ




2015



BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

ĐẶNG THỊ HUỲNH MAI


KHẢO SÁT TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN
CỦA VI KHUẨN TỔNG HỢP CHẤT KẾT TỤ SINH HỌC
PHÂN LẬP TỪ CHẤT THẢI TRONG AO NUÔI CÁ TRA
VÀ ỨNG DỤNG VÀO XỬ LÝ NƢỚC AO NUÔI CÁ TRA
Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG


Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã ngành : 62 42 01 07
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ


Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
PGS. TS. HÀ THANH TOÀN
PGS. TS. NGÔ THỊ PHƢƠNG DUNG


2015




Công trình được hoàn thành tại: Viện Nghiên cứu và Phát triển Công
nghệ Sinh học - Trường Đại học Cần Thơ.

Có thể tìm hiểu luận án tại:
1. Thư viện Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học -
Trường Đại học Cần Thơ
2. Trung tâm học liệu - Trường Đại học Cần Thơ
3. Thư viện Quốc gia Việt Nam







DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN

Các bài báo đã công bố
1. Đặng Thị Huỳnh Mai, Hà Thanh Toàn và Cao Ngọc Điệp, 2013.
Đa dạng di truyền của vi khuẩn tạo chất kết tụ sinh học phân lập từ bùn đáy
ao nuôi cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long. Báo cáo khoa học
(Proceedings) hội nghị Khoa học Công nghệ Sinh học toàn quốc 2013;
Quyển 1: Công nghệ Gen, Công nghệ Enzyme và Hóa sinh, Công nghệ
sinh học Y - Dược, Công nghệ sinh học Động vật: 137-141. Nhà xuất bản
Khoa học tự nhiên và Công nghệ.
2. Đặng Thị Huỳnh Mai, Hà Thanh Toàn và Cao Ngọc Điệp, 2014.
Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn tạo chất kết tụ sinh học phân
lập từ bùn đáy ao nuôi cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long trên môi trường
polysaccharide và ứng dụng vào xử lý nước ao nuôi cá tra ở quy mô phòng
thí nghiệm. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn - Kỳ 1- Tháng
4/2014 (số 7/2014): 69-76.
3. Đặng Thị Huỳnh Mai, Hà Thanh Toàn và Cao Ngọc Điệp, 2014.
Tối ưu hóa và ứng dụng vi khuẩn tạo chất kết tụ sinh học trên môi trường
protein vào xử lý nước ao nuôi cá tra ở quy mô phòng thí nghiệm. Tạp chí
khoa học trường Đại học Cần Thơ, phần B: Nông nghiệp, Thủy sản và
Công nghệ Sinh học: 30(2014): 13-21.








1

Chƣơng 1
TỔNG QUÁT VỀ LUẬN ÁN
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Nuôi trồng, chế biến và xuất khẩu thủy sản là thế mạnh kinh tế đặc biệt
hiện nay ở đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL); trong đó, loài thủy sản có
tiềm năng rất lớn là cá tra đã đạt sản lượng xuất khẩu nhiều nhất trong các
loài cá nuôi nước ngọt với nhiều mặt hàng chế biến đa dạng, phong phú.
Tuy nhiên, bên cạnh lợi ích về kinh tế, việc nuôi cá tra công nghiệp cũng đã
có những tác động tiêu cực rất lớn đến môi trường do thức ăn dư thừa, chất
thải trong quá trình trao đổi chất, các hóa chất sử dụng… lắng xuống, tích
tụ lại trong đáy ao và nhanh chóng chuyển hóa thành ammonium, nitrate,
phosphate cũng như các hợp chất khác gây ô nhiễm môi trường. Theo các
nghiên cứu do Châu Minh Khôi và ctv. (2012) thì hàm lượng N và P hòa
tan trong các ao nuôi cá tra cao gấp nhiều lần so với quy chuẩn QCVN
08:2008/BTNMT. Nếu nuôi cá tra với mật độ cao (40-50 con/m2), sử dụng
hoàn toàn thức ăn công nghiệp thì lượng chất thải tích tụ trong ao nuôi là
rất lớn (Trương Quốc Phú và Trần Kim Tính, 2012). Ngoài ra, theo Quyết
định 3885/QĐ-BNN-TCTS (2014) quy hoạch thì đến năm 2020 diện tích
nuôi cá Tra của vùng là 7.800 ha và sản lượng khoảng 1,9 triệu tấn. Như
thế, áp lực đối với môi trường sẽ rất cao cũng như có nhiều khó khăn hơn
về chất lượng nguồn nước cấp và khả năng tiêu thoát. Để xử lý nước, quy
trình kết tụ sinh học được đề nghị nhằm giúp loại bỏ tạp chất, tạo thuận lợi
cho các công đoạn xử lý sau với lợi điểm là đầu tư cơ sở hạ tầng ít, hiệu
quả nhanh và thân thiện với môi trường. Chất kết tụ sinh học có hiệu quả
cao, không độc hại, có thể phân hủy sinh học, không gây ô nhiễm thứ cấp,
phạm vi ứng dụng rộng và vi khuẩn tạo chất kết tụ cũng dễ phát triển tăng
sinh khối. Tuy nhiên, hoạt tính của chất kết tụ sinh học được xác định bởi
bản chất di truyền của sinh vật (Salehizadeh và ctv., 2000), cũng như chịu
ảnh hưởng của các yếu tố như thành phần chất dinh dưỡng, điều kiện nuôi

cấy, điều kiện của môi trường tạo chất kết tụ… Vì vậy, để có được hiệu quả
mong muốn, đề tài: “Khảo sát tính đa dạng di truyền của vi khuẩn tổng
hợp chất kết tụ sinh học phân lập từ chất thải trong ao nuôi cá tra và
ứng dụng vào xử lý nƣớc ao nuôi cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long”
2

đã được tiến hành nhằm tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng tạo
kết tụ sinh học với tỉ lệ cao nhất để ứng dụng vào xử lý nước ao nuôi cá tra,
góp phần làm giảm thiểu ô nhiễm môi trường nước ở ĐBSCL.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
- Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng tạo kết tụ sinh học với tỉ
lệ cao, đồng thời khảo sát đa dạng di truyền của các vi khuẩn tuyển chọn.
- Xác định được các điều kiện phù hợp về pH, chất dinh dưỡng, thời
gian nuôi cấy đối với các chủng vi khuẩn tuyển chọn để kết tụ đạt tỉ lệ
cao nhất nhằm chọn ra được một số chủng, tổ hợp vi khuẩn có khả năng
ứng dụng vào xử lý nuớc ao nuôi cá tra ở ĐBSCL.
1.3. Đối tƣợng, phạm vi nghiên cứu
Đề tài nghiên cứu các vi khuẩn tạo chất kết tụ sinh học từ các mẫu
(nước+bùn đáy) trong các ao nuôi cá tra ở 10 tỉnh/thành phố vùng ĐBCSL.
1.4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án
Luận án đã phân lập, tuyển chọn được các vi khuẩn có khả năng tạo kết
tụ cao; xác định được các điều kiện phù hợp để kết tụ đạt hiệu quả nhất;
đánh giá đa dạng di truyền của các vi khuẩn qua tính đa hình của các
nucleotide và thiết lập được giản đồ phả hệ giữa các vi khuẩn tuyển chọn và
với các chủng tương đồng di truyền. Các kết quả này đóng góp, bổ sung
thông tin cho các tài liệu tham khảo, giảng dạy cũng như cho các nghiên
cứu chuyên ngành sâu hơn. Trong thực tiễn, đề tài mở ra hướng ứng dụng
vi khuẩn tạo kết tụ giúp giải quyết nhu cầu xử lý nước ao nuôi cá tra, góp
phần làm giảm ô nhiễm môi trường nước.
1.5. Những đóng góp mới của luận án

- Tuyển chọn được một số vi khuẩn có khả năng tạo kết tụ cao từ các ao
nuôi cá tra ở ĐBSCL. Định danh các chủng vi khuẩn tuyển chọn và xác
định các chủng tương đồng di truyền bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Khảo
sát đa dạng di truyền của các vi khuẩn qua tính đa hình của các nucleotide
dựa trên dấu phân tử SNP. Thiết lập sơ đồ phả hệ thể hiện mối tương quan
giữa các vi khuẩn tuyển chọn và với các chủng tương đồng di truyền.
- Xác định được các điều kiện phù hợp giúp các chủng vi khuẩn tuyển
chọn đạt tỉ lệ cao nhất. Giới thiệu được một số chủng, tổ hợp vi khuẩn hiệu
quả cao có thể ứng dụng vào xử lý nước ao nuôi cá tra.
3

Chƣơng 2
NỘI DUNG, PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nội dung nghiên cứu
Luận án được thực hiện với các nội dung sau:


4

2.2. Phƣơng tiện nghiên cứu
Các thí nghiệm được thực hiện với thiết bị, dụng cụ và hóa chất chuyên
dụng tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật và Sinh học phân tử - Viện Nghiên
cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Cần Thơ. Sản
phẩm PCR đoạn gen 16S rDNA của các chủng vi khuẩn được gửi sang
công ty MACROGEN ở Hàn Quốc để xác định trình tự đoạn DNA. Ảnh
các chủng vi khuẩn tuyển chọn được chụp qua kính hiển vi điện tử quét tại
Phòng thí nghiệm Chuyên sâu - Trường Đại học Cần Thơ. Hàm lượng TSS
và COD trong mẫu nước ao được phân tích tại Trung tâm Kỹ thuật và Ứng
dụng Công nghệ - Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Cần Thơ. Phân
tích các chỉ tiêu Sinh-hóa tại Khoa Thủy sản - Trường Đại học Cần Thơ.

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Thu mẫu và xác định mật số
Thu mẫu (nước + bùn đáy) trong các ao nuôi cá tra ở 10 tỉnh ĐBSCL là
An Giang, Bến Tre, Cần Thơ, Đồng Tháp, Hậu Giang, Kiên Giang, Sóc
Trăng, Tiền Giang, Trà Vinh, Vĩnh Long. Ở mỗi tỉnh, thu từ 8-25 mẫu tùy
theo số lượng ao nuôi cá. Mẫu nước thu cách bờ ao từ 2 m, cách mặt nước
0,5 m; mẫu bùn dùng gàu/lon múc ở mặt đáy. Chứa riêng mẫu nước và bùn
đáy trong lọ nhựa 50 ml có nắp đậy, trữ lạnh 4
o
C ở phòng thí nghiệm. Khi
tiến hành phân tích thì trộn nước và bùn đáy lại, khuấy đều, lấy dung dịch
mẫu sử dụng. Mẫu được thu 2 lần: 1 lần vào mùa khô và 1 lần vào mùa
mưa để có thể so sánh sự phát triển mật số vi khuẩn theo mùa.
2.3.2. Phân lập vi khuẩn tạo chất kết tụ sinh học
Sử dụng mẫu thu vào mùa khô để phân lập vi khuẩn. Vi khuẩn tạo chất
kết tụ sinh học được phân lập trên 2 loại môi trường là môi trường kết tụ
protein (theo Hazana và ctv., 2008; Bùi Thế Vinh, 2012) và môi trường kết
tụ polysaccharide (theo Deng và ctv., 2003, Bùi Thế Vinh, 2012).
Các khuẩn lạc của vi khuẩn tạo chất kết tụ có bề mặt trơn, nhầy và ướt.
Tái phân lập liên tục nhiều lần đến khi các khuẩn lạc tách rời nhau rõ trên
các đường cấy. Sau khi kiểm tra độ ròng trên kính hiển vi, cấy chuyển sang
ống, xem như một chủng riêng biệt và trữ lại dùng cho các thí nghiệm sau.
2.3.3. Tuyển chọn vi khuẩn có tỉ lệ kết tụ cao
Mỗi chủng vi khuẩn phân lập được nuôi trong từng môi trường như trên,
5

không bổ sung agar. Chứa 50 ml dịch môi trường trong bình tam giác, lắc
đều trên máy với vận tốc 120-150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng thí nghiệm
27
o

C (theo Gong và ctv., 2008; Xia và ctv., 2008) khoảng 4 ngày.
Chuẩn bị dung dịch kaolin (5g/L) và CaCl
2
(1%) theo tỉ lệ 9:1. Chuẩn
pH = 7. Cho vào ống nghiệm 20 ml dung dịch kaolin (kaolin + CaCl
2
) và
20µl dịch vi khuẩn nói trên (mật số ≥10
7
CFU/ml đối với vi khuẩn kết tụ
protein và ≥10
8
CFU/ml đối với vi khuẩn kết tụ polysaccharide). Mẫu đối
chứng thực hiện tương tự nhưng không chủng vi khuẩn. Khuấy hỗn hợp
trong 5 giây trên máy khuấy và giữ yên 5 phút. Lấy phần trong phía trên đo
mật độ quang OD ở bước sóng 550 nm. Mỗi nghiệm thức thực hiện 3 lần
lặp lại. Tính tỉ lệ kết tụ theo Deng và ctv. (2003).
Tỉ lệ kết tụ % =
OD

đối chứng

 OD (mẫu)
OD (đối chứng )
x 100
Dựa vào tỉ lệ kết tụ, trên mỗi loại môi trường (kết tụ protein và kết tụ
polysaccharide) chọn 1 vi khuẩn có tỉ lệ kết tụ cao nhất / tỉnh. Tổng cộng có
10 vi khuẩn kết tụ protein và 10 vi khuẩn kết tụ polysaccharide được chọn.
2.3.4. Nhận diện, dịnh danh các chủng vi khuẩn tuyển chọn
*Quan sát khuẩn lạc qua: màu sắc, hình dạng, độ nổi, kích thước Hình

dạng, chuyển động của vi khuẩn được quan sát qua kính hiển vi quang học.
* Định danh vi khuẩn qua phân tích trình tự gen 16S rDNA
- Tách chiết DNA theo quy trình của Breugelmans và Uyttebrock (2004)
- Khuếch đại chuỗi gen 16S rDNA bằng kỹ thuật PCR
Sử dụng cặp mồi (primer) theo Gao và ctv. (2006), Gupta và ctv.(1983):
Mồi xuôi 37F : 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGG-3’
Mồi ngược 1497R: 5’-ACGGCAACCTTGTTACGAGTT-3’
Tiến trình thực hiện PCR:

6

Thành phần hợp chất dùng trong kỹ thuật PCR:
Thành phần
Nồng độ
Thể tích (µl)
H
2
O (cất 2 lần)
PCR buffer
dNTP
MgCl
2

Đoạn mồi xuôi
Đoạn mồi ngược
BSA
Taq DNA polymerase
DNA

10X

1mM
10X
50ng/µl
50ng/µl
5U/µl
5U/µl
25ng/ml
24,0
5,0
8,0
4,0
2,0
2,0
0,5
0,5
4,0
Tổng

50,0
- Điện di sản phẩm PCR trên gel, ước lượng kích thước đoạn DNA
Đun nóng 0,5 g agarose trong 40 ml TAE 1X cho tan hoàn toàn. Để
nguội khoảng 50
o
C, cho 0,8 µl EtBr vào, lắc đều. Đỗ vào khuôn để định
hình và tạo giếng, sau 90 phút có thể sử dụng. Trộn 10 µl mẫu DNA (đã
qua PCR) với 2 µl dung dịch tải trên giấy paraffin. Cho dịch DNA thang
chuẩn vào giếng 1 và các mẫu DNA cần điện di vào các giếng tiếp sau.
Tiến hành điện di ở hiệu thế 50-70 volt, khoảng 60 phút, trong dung dịch
đệm TAE 1X. Kết quả quan sát trên hệ thống máy chụp gel bằng tia UV.
Kích thước band DNA của vi khuẩn được ước lượng dựa theo thang chuẩn.

- Giải trình tự DNA
Sản phẩm PCR được chuyển sang công ty MACROGEN (Hàn Quốc)
để xác định trình tự đoạn gen DNA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
- Định danh vi khuẩn tuyển chọn, xác định chủng tương đồng di truyền
Trình tự đoạn DNA của các vi khuẩn được so với trình tự DNA của
các vi khuẩn lưu trữ trên ngân hàng gen NCBI và tìm tỉ lệ tương đồng bằng
phần mềm BLAST N. Bước đầu định danh các vi khuẩn tuyển chọn và xác
định các chủng tương đồng di truyền (2 chủng tương đồng/1 vi khuẩn).
2.3.5. Khảo sát đa dạng di truyền của các vi khuẩn tuyển chọn
2.3.5.1. Tính đa hình của các nucleotide trên các chuỗi trình tự
Các phần mềm BioEdit (Hall, 1999), Clustal W (Thompson và ctv.,
1994), MEGA 5.1(Tamura và ctv., 2011) được sử dụng để so sánh 10 chuỗi
trình tự của các vi khuẩn tuyển chọn (trên từng loại môi trường). Căn cứ
vào dấu SNP nhận ra những điểm tương đồng và biến đổi giữa các trình tự.
7

Tính giá trị số Pi và Theta (2 trong các chỉ số giúp ước tính đa dạng
nucleotide) bằng phần mềm Dna SP v5 (Rozas và ctv., 2009). Đồng thời sử
dụng phần mềm Dna SP Graph vẽ đường biểu diễn của Pi và Theta, xác
định vùng có biến động cao trên các chuỗi trình tự, qua đó thấy được đa
hình của các nucleotide. Trong khoảng biến động, khảo sát 40 vị trí base
bất kỳ có dấu SNP để ước đoán mối liên hệ giữa các chủng vi khuẩn thể
hiện qua tỉ lệ biến đổi của các chuỗi trình tự.
Sử dụng phần mềm MEGA 5.1 lập giản đồ phả hệ thể hiện tương quan
di truyền giữa các chủng vi khuẩn tuyển chọn (10 chủng/1 loại môi trường),
kết hợp với phân tích kết quả khảo sát các vị trí base bất kỳ nói trên.
2.3.5.2. Giản đồ phả hệ thể hiện tƣơng quan di truyền giữa các
chủng vi khuẩn tuyển chọn và các chủng tƣơng đồng di truyền
Dựa trên trình tự DNA của các chủng vi khuẩn đã định danh và các
chủng tương đồng di truyền, sử dụng phần mềm MEGA 5.1 thiết lập giản

đồ phả hệ (cây di truyền). Phân tích di truyền phả hệ xác định tương quan
giữa các chủng vi khuẩn tuyển chọn và với các chủng vi khuẩn tương đồng
trên ngân hàng gen NCBI.
2.3.6. Chọn lọc các vi khuẩn có tỉ lệ kết tụ cao hơn 70% từ các
chủng đã tuyển chọn
Từ các chủng vi khuẩn được tuyển chọn nói trên, trên mỗi loại môi
trường (môi trường kết tụ protein và môi trường kết tụ polysaccharide),
chọn ra 3 chủng vi khuẩn có tỉ lệ kết tụ cao hơn cả (cao hơn 70%). Căn cứ
vào ảnh chụp qua kính hiển vi điện tử quét (SEM) và khóa phân loại
Bergey để củng cố kết quả định danh các chủng vi khuẩn này.
2.3.7. Xác định các điều kiện để các vi khuẩn chọn lọc đạt tỉ lệ kết tụ
cao nhất.
Các chủng vi khuẩn chọn lọc được nuôi trong môi trường lỏng tương
ứng (môi trường kết tụ protein và kết tụ polysaccharide) với thành phần
tương tự như trước, không bổ sung agar. Lắc đều trên máy với vận tốc 120-
150 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng thí nghiệm 27
o
C trong 4 ngày.
2.3.7.1. pH môi trƣờng (theo Gong và ctv., 2008; Bùi Thế Vinh, 2012)
Chuẩn bị 5 bình chứa dung dịch kaolin (5g/L) và CaCl
2
(1%) theo tỉ lệ
9:1. Điều chỉnh pH ở từng bình theo các giá trị 5, 6, 7, 8, 9. Cho vào từng
8

ống nghiệm 20 ml dung dịch kaolin (kaolin + CaCl
2
) và 20 µl dịch vi khuẩn
(mật số ≥ 10
7

CFU/ml đối với vi khuẩn kết tụ protein và mật số ≥ 10
8

CFU/ml đối với vi khuẩn kết tụ polysaccharide). Khuấy hỗn hợp trong 5
giây trên máy khuấy, giữ yên trong 5 phút. Lấy phần trong phía trên đo chỉ
số OD ở bước sóng 550 nm, tính tỉ lệ kết tụ. Mẫu đối chứng ở từng giá trị
pH được thực hiện tương tự nhưng không chủng dịch vi khuẩn. Các nghiệm
thức được bố trí ngẫu nhiên, thực hiện 3 lần lặp lại. Ghi nhận giá trị pH, ở
đó tỉ lệ kết tụ cao nhất (theo từng chủng vi khuẩn).
2.3.7.2. Ion kim loại trong môi trƣờng (theo Gong và ctv., 2008; Bùi
Thế Vinh, 2012)
Chuẩn bị 5 bình chứa dung dịch kaolin (5g/L) và dung dịch 1% từng
loại muối kim loại CaCl
2
, NaCl, KCl, MnSO
4
,

MgSO
4
theo tỉ lệ 9:1. Điều
chỉnh pH ở giá trị cho tỉ lệ kết tụ cao nhất. Cho vào ống nghiệm 20 ml dung
dịch kaolin (kaolin + muối kim loại) và 20 µl dịch vi khuẩn (mật số ≥ 10
7
CFU/ml đối với vi khuẩn kết tụ protein và mật số ≥ 10
8
CFU/ml đối với vi
khuẩn kết tụ polysaccharide). Khuấy hỗn hợp trong 5 giây trên máy khuấy,
giữ yên trong 5 phút. Lấy phần trong phía trên đo chỉ số OD (bước sóng
550 nm) và tính tỉ lệ kết tụ. Mẫu đối chứng của từng loại muối kim loại

được thực hiện tương tự nhưng không chủng dịch vi khuẩn. Các nghiệm
thức được bố trí ngẫu nhiên, thực hiện 3 lần lặp lại. Xác định ion kim loại
cho tỉ lệ kết tụ cao nhất đối với từng chủng vi khuẩn.
2.3.7.3. Các nguồn dinh dƣỡng phù hợp nhất (theo Gong và ctv.,
2008; Bùi Thế Vinh, 2012)
Từ 3 nguồn carbon (glucose, sucrose, tinh bột), 4 nguồn nitrogen
(glutamate, yeast extract, urea, (NH
4
)
2
SO
4
) và 4 nguồn khoáng vô cơ (KCl,
FeCl
3
, CaCl
2
, K
2
HPO
4
+ KH
2
PO
4
) khác nhau, phối hợp lại để tạo các môi
trường có nguồn dinh dưỡng khác nhau, cần thiết cho sự phát triển của vi
khuẩn. Kết quả có 48 tổ hợp tức là 48 loại môi trường nuôi vi khuẩn.
Vi khuẩn được nuôi trong ống 50 ml, lắc đều trên máy với vận tốc 120-
150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng thí nghiệm 27

o
C trong 4 ngày (đạt mật số
≥ 10
7
CFU/ml đối với vi khuẩn kết tụ protein và mật số ≥ 10
8
CFU/ml đối
với vi khuẩn kết tụ polysaccharide). Tính tỉ lệ kết tụ với huyền phù kaolin
theo các điều kiện cho hiệu quả cao nhất về pH, ion kim loại đã được xác
9

định ở các thí nghiệm trước. Dịch vi khuẩn trong môi trường được sử dụng
với liều lượng 0,1% (v/v). Mẫu đối chứng không chủng vi khuẩn. Các
nghiệm thức được bố trí ngẫu nhiên, thực hiện 3 lần lặp lại. Xác định môi
trường có nguồn carbon, nitrogen và khoáng vô cơ tốt nhất cho sự phát
triển của từng chủng vi khuẩn.
2.3.7.4. Thời gian nuôi cấy - Liều lƣợng vi khuẩn sử dụng
Khả năng tạo kết tụ của từng chủng vi khuẩn ở những liều lượng khác
nhau với các tỉ lệ (dịch vi khuẩn:dịch môi trường) 0,08; 0,09; 0,1; 0,11;
0,12; 0,2% được xác định theo từng ngày nuôi cấy. Đồng thời các vi khuẩn
cũng được phối hợp lại để tạo từng tổ hợp gồm 2 vi khuẩn theo tỉ lệ 1:1.
Vi khuẩn được nuôi trong môi trường chứa nguồn dinh dưỡng phù hợp
nhất. Chuẩn bị dung dịch kaolin và muối kim loại như các thí nghiệm trên
với giá trị pH và ion kim loại thêm vào cho hiệu quả kết tụ cao nhất. Cho
vào ống nghiệm dung dịch kaolin (kaolin + muối kim loại) và dịch vi khuẩn
với từng liều lượng theo tỉ lệ 0,08; 0,09; 0,1; 0,11; 0,12; 0,2%. Khuấy hỗn
hợp trong 5 giây trên máy khuấy, giữ yên trong 5 phút. Lấy phần trong phía
trên đo OD và tính tỉ lệ kết tụ. Mẫu đối chứng thực hiện tương tự nhưng
không chủng dịch vi khuẩn. Các nghiệm thức được bố trí ngẫu nhiên, thực
hiện 3 lần lặp lại. Thí nghiệm được thực hiện tương tự, liên tục qua các thời

điểm: ngày 2, 3, 4, 5 sau nuôi cấy nhằm xác định thời gian nuôi cấy và liều
lượng vi khuẩn sử dụng để đạt tỉ lệ kết tụ cao nhất đối với từng chủng vi
khuẩn. Bên cạnh đó, theo từng ngày, tỉ lệ kết tụ của các tổ hợp theo liều
lượng phù hợp nhất của từng chủng vi khuẩn cũng được khảo sát, từ đó
chọn ra được các tổ hợp hiệu quả cao.
2.3.7.5. Khảo sát tƣơng quan giữa mật số vi khuẩn và tỉ lệ kết tụ
theo thời gian nuôi cấy
Theo từng ngày, tỉ lệ kết tụ và mật số của vi khuẩn cũng được khảo sát
để ghi nhận mối tương quan giữa sự phát triển mật số vi khuẩn và hiệu quả
tạo kết tụ (căn cứ vào tỉ lệ kết tụ) theo thời gian nuôi cấy.
2.3.8. Kiểm tra hiệu quả của các chủng, tổ hợp vi khuẩn chọn lọc
Các chủng vi khuẩn, tổ hợp vi khuẩn được kiểm tra qua 2 lần:
- Lần 1: Kiểm tra tỉ lệ kết tụ trong huyền phù kaolin của các chủng vi
khuẩn và tổ hợp vi khuẩn theo các điều kiện về pH môi trường, ion kim loại
10

thêm vào môi trường, các nguồn dinh dưỡng, thời gian nuôi cấy và liều
lượng vi khuẩn sử dụng đã được xác định ở trên. Chọn 2 tổ hợp có tỉ lệ kết
tụ cao nhất đưa vào kiểm tra lần 2 cùng với 6 chủng vi khuẩn chọn lọc.
- Lần 2: Lặp lại thí nghiệm tương tự nhưng thay dung dịch kaolin bằng
nước ao cá tra ở 2 địa điểm khác nhau (ao cá ở Ô Môn và ao cá ở Trà Vinh)
để khẳng định các chủng, tổ hợp vi khuẩn hiệu quả cao. Chọn ra các vi
khuẩn, tổ hợp vi khuẩn đạt tỉ lệ kết tụ cao hơn cả đưa vào ứng dụng.
2.3.9. Ứng dụng xử lý nƣớc ao nuôi cá ở quy mô phòng thí nghiệm
Thí nghiệm ứng dụng vi khuẩn tạo chất kết tụ sinh học vào xử lý nước
ao nuôi cá tra được thực hiện bước đầu ở quy mô phòng thí nghiệm với thể
tích 100 L. Ba ao nuôi cá tra được chọn thu mẫu nước thực hiện thí nghiệm
là Cần Thơ 1, Cần Thơ 2 và Cần Thơ 3 thuộc cồn Khương, phường Cái
Khế, quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ.
- Ao Cần Thơ 1: ngưng cho cá ăn từ 10 ngày trước, chờ thu hoạch cá.

- Ao Cần Thơ 2: cá tra nuôi được 4,5 tháng tuổi.
- Ao Cần Thơ 3: cá được 6,5 tháng tuổi.
Mẫu nước thu về được bảo quản trong thùng 100L và sử dụng trong
ngày. Các chủng, tổ hợp vi khuẩn sử dụng được chọn ở kết quả kiểm tra;
các bước thực hiện tương tự những thí nghiệm trước theo các điều kiện phù
hợp đã xác định. Khuấy đều nước ao trong thùng chứa bằng tay với cây gỗ
cứng hoặc tre (đường kính ≈ 4 cm, dài ≈ 150 cm) với tần số 60 vòng/phút
trong 5 phút và để lắng sau 30 phút. Mỗi lần xử lý nước ở 1 ao đều kiểm tra
giá trị pH và tỉ lệ kết tụ trong nước ao của các chủng vi khuẩn và tổ hợp vi
khuẩn. Khả năng tạo kết tụ của các chủng, tổ hợp vi khuẩn được kiểm tra
bằng cách đo lượng TSS và COD trong nước ao trước và sau xử lý nước
với vi khuẩn để thấy được tỉ lệ TSS và COD giảm đi sau xử lý, từ đó đánh
giá được hiệu quả của chúng.
* Các số liệu ghi nhận trong các thí nghiệm được phân tích phương sai
(ANOVA) và hệ số tương quan với phần mềm phân tích thống kê Minitab
16, phương pháp Fisher, để so sánh các trung bình của các nghiệm thức, có
tính đến độ lệch chuẩn. Các biểu đồ, sơ đồ thể hiện tương quan giữa các
nghiệm thức được xử lý bằng phần mềm Excel 2007.

11

Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Mật số vi khuẩn trong mùa khô và mùa mƣa
Các kết quả ghi nhận được cho thấy trong mùa khô cũng như mùa mưa,
trung bình mật số vi khuẩn kết tụ protein và vi khuẩn kết tụ polysaccharide
đều khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95%. Như thế cả 2
nhóm vi khuẩn đều phát triển tương đương nhau trong cùng điều kiện môi
trường theo mùa trong năm (Hình 3.1).

Ghi chú: TB: trung bình; VK: vi khuẩn; P: kết tụ protein; S: kết tụ polysaccharide
Những số theo sau cùng một chữ khác biệt không ý nghĩa với độ tin cậy 95%
Hình 3.1. Biểu đồ thể hiện các trung bình mật số vi khuẩn theo mùa
3.2. Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn tạo kết tụ sinh học
3.2.1. Số liệu tổng quát kết quả phân lập
Từ 155 mẫu thu thập trong các ao nuôi cá tra ở 10 tỉnh ĐBSCL đã phân
lập được 389 chủng vi khuẩn tạo chất kết tụ. Có 304/389 chủng có tỉ lệ kết
tụ > 50% (117 chủng kết tụ protein và 187 chủng kết tụ polysaccharide).
Bảng 3.1. Số liệu kết quả phân lập vi khuẩn

Ghi chú: TS: tổng số; P: vi khuẩn kết tụ protein; S: vi khuẩn kết tụ polysaccharide
12

3.2.2. Đặc điểm các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc
Phần lớn tế bào có dạng que ngắn, rời rạc; một số là que dài, hình cầu.
Các tế bào cũng có thể kết thành nhóm 2 hay nhiều tế bào hoặc kết thành
chuỗi dài. Hầu hết đều chuyển động trong môi trường nước. Khuẩn lạc có
thể trắng trong, đục, kem ngà hoặc xám, vàng, cam… Đa số khuẩn lạc có
dạng tròn, bìa nguyên, mô cao, đường kính 1,0-1,5 mm. Các khuẩn lạc có
thể nhầy ướt ít, trung bình hoặc rất nhầy. Nhìn chung, các đặc điểm này đều
tương tự với những nghiên cứu về vi khuẩn tạo kết tụ ở các tác giả trước
(Gong và ctv., 2008; Zaki và ctv, 2011; Arafa và ctv., 2014…) và tất cả đều
có chung đặc điểm cơ bản nổi bật là khuẩn lạc đều nhầy ướt, láng.
3.3. Kết quả tuyển chọn vi khuẩn có tỉ lệ kết tụ cao
Trên mỗi loại môi trường, có 10 chủng vi khuẩn được tuyển chọn để
định danh và khảo sát đa dạng di truyền (Bảng 3.2).
Bảng 3.2. Các chủng vi khuẩn tuyển chọn
Môi trường Protein

Môi trường Polysaccharide

TT
Vi khuẩn
Tỉ lệ kết tụ %

TT
Vi khuẩn
Tỉ lệ kết tụ %
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
AG08P
BT24P
CT04P
DT07P
HG06P
KG15P
ST05P
TG03P
TV05P
VL02P
72,00±1,64
67,50±0,50
65,00±0,66

74,25±0,43
73,00±0,66
55,75±1,56
64,00±1,32
67,50±0,43
62,50±1,56
65,50±0,90

01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
AG19S
BT36S
CT27S
DT45S
HG09S
KG50S
ST37S
TG09S
TV35S
VL22S
71,95±0,40
69,66±0,60

69,20±0,82
56,78±1,80
65,75±0,69
57,70±0,83
71,03±0,61
70,57±0,80
60,00±1,05
67,82±0,83
3.4. Kết quả định danh các chủng vi khuẩn tuyển chọn
3.4.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR từ DNA của các vi khuẩn
Phổ điện di cho thấy các vi khuẩn đều có band ở vị trí khoảng 1500 bp.
Kết quả này phù hợp với nhiều nghiên cứu về vi khuẩn tạo kết tụ ở các tác
giả trước như Methylobacterium sp. Obi (Ntsaluba và ctv., 2011), Bacillus
sp. Gilbert (Nontembiso và ctv., 2011), Bacillus velezensis 40B (Zaki và
ctv., 2012), Bacillus thuringiensis (Arafa và ctv., 2014)
3.4.2. Kết quả phân tích trình tự, xác định chủng tƣơng đồng di
truyền, định danh các chủng vi khuẩn (VK) tuyển chọn
Kết quả ở Bảng 3.3, 3.4 cho thấy chi Bacillus chiếm tỉ lệ cao (16/20
13

chủng) phù hợp với nghiên cứu của nhiều tác giả (Shih và ctv., 2001; Deng
và ctv., 2003; Haleem và ctv., 2008 ). Bên cạnh đó, tương tự với các
nghiên cứu trước, các Staphylococcus, Arthrobacter sp. và Agrobacterium
tumefaciens lần lượt đều được ghi nhận có khả năng tạo kết tụ (Qiang và
ctv., 2007; Su và ctv., 2011; Li và ctv., 2011).
Bảng 3.3. Mười vi khuẩn kết tụ protein và các chủng tương đồng

Bảng 3.4. Mười vi khuẩn kết tụ polysaccharide và các chủng tương đồng

14

Trên cơ sở này, bước đầu định danh 20 chủng vi khuẩn như sau:
Vi khuẩn tạo kết tụ protein
Vi khuẩn tạo kết tụ polysaccharide
1. Bacillus megaterium AG08P
2. Bacillus subtilis BT24P
3. Bacillus amyloliquefaciens CT04P
4. Bacillus megateirum DT07P
5. Bacillus sp. HG06P
6. Bacillus subtilis KG15P
7. Staphylococcus xylosus ST05P
8. Bacillus amyloliquefaciens TG03P
9. Staphylococcus xylosus TV05P
10. Bacillus methylotrophicus VL02P
1. Bacillus megaterium AG19S
2. Bacillus megaterium BT36S
3. Bacillus sp. CT27S
4. Arthrobacter sp. DT45S
5. Bacillus megaterium HG09S
6. Bacillus megaterium KG50S
7. Agrobacterium tumefaciens ST37S
8. Bacillus subtilis TG09S
9. Bacillus megaterium TV35S
10. Bacillus megaterium VL22S
3.5. Đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn.
3.5.1. Tính đa hình của các nucleotide
3.5.1.1. Các chủng vi khuẩn (VK) tạo kết tụ protein
* Với Pi và Theta là 2 trong các chỉ số giúp ước tính đa hình nucleotide,
đường biểu diễn Pi và Theta trên 10 chuỗi trình tự cho thấy vùng biến động
nucleotide cao nằm trong khoảng các vị trí base 124-693 (Hình 3.2).

Hình 3.2. Đường biểu diễn Pi và Theta
(trên 10 chuỗi trình tự của vi khuẩn tạo kết tụ protein)
π = 0,09484. Đây là giá trị số thể hiện đa dạng nucleotide khá cao vì
thông thường thì π < 0,02 ở phần lớn các acid nhân (Nei, 1987).
θ = 66,102±23,366. Chỉ số này cũng là khá cao, thể hiện rõ đa hình của
các nucleotide.
* Kết quả khảo sát 40 vị trí base bất kỳ có dấu SNP cho thấy vi khuẩn
có nhiều dấu SNP nhất là Bacillus methylotrophicus VL02P (26/40); 2
Staphylococcus xylosus ST05P và TV05P có 14-15 dấu SNP; 2 chủng

15

Bacillus megaterium AG08P, DT07P và Bacillus sp. HG06P đều có số dấu
SNP là 11. Cuối cùng, 2 chủng Bacillus amyloliquefaciens TG03P, CT04P
và 2 chủng Bacillus subtilis BT24P, KG15P đều cùng có 6 dấu SNP.
* Giản đồ phả hệ dựa trên 10 chuỗi trình tự của vi khuẩn kết tụ protein,
kết hợp với kết quả khảo sát các vị trí base trong vùng biến động nêu trên
cho thấy tương quan giữa các vi khuẩn và với khoảng cách di truyền của
chúng. Theo đó, chủng vi khuẩn có nhiều dấu SNP nhất, có sự khác biệt
nhất và tách thành nhánh riêng; các chủng có ít dấu SNP có khoảng cách di
truyền ngắn hơn và các chủng tương đồng xếp vào chung nhóm (Hình 3.3)

Hình 3.3. Giản đồ phả hệ mô tả mối tương quan giữa các VK kết tụ protein
3.5.1.2. Các chủng vi khuẩn (VK) tạo kết tụ polysaccharide
* Hai đường biểu diễn Pi và Theta căn cứ trên chuỗi trình tự của các vi
khuẩn kết tụ polysaccharide cũng có dạng tương tự nhau; vùng biến động

cao nằm trong khoảng các vị trí base 233-903 (Hình 3.4).







Hình 3.4. Đường biểu diễn Pi và Theta
(trên 10 chuỗi trình tự của vi khuẩn tạo kết tụ polysaccharide)
π = 0,08914. Đây cũng là giá trị số thể hiện đa dạng nucleotide khá cao
vì theo Nei (1987) thông thường thì π < 0,02 ở phần lớn các acid nhân.
θ = 81,655±28,864. Chỉ số này cũng là khá cao, thể hiện rõ đa hình của
các nucleotide.

16

* Kết quả khảo sát 40 vị trí base bất kỳ có dấu SNP cho thấy vi khuẩn
có nhiều dấu SNP nhất là Arthrobacter sp. DT45S (21/40), kế tiếp là
Agrobacterium tumefaciens ST37S với 16/40 dấu, rồi đến Bacillus subtilis
TG09S có 13/40 dấu SNP. Các chủng còn lại như Bacillus sp. CT27S, các
B. megaterium BT36S, HG09S, KG50S, TV35S chỉ có 6-1 dấu SNP. Riêng
Bacillus megaterium VL22S và B. megaterium AG19S đều không có biến
đổi trên chuỗi trình tự và tại 40 vị trí khảo sát các base đều giống nhau.
* Giản đồ phả hệ dựa trên 10 chuỗi trình tự (Hình 3.5) của vi khuẩn kết
tụ polysaccharide cũng cho thấy tương quan giữa các vi khuẩn và với
khoảng cách di truyền của chúng. Theo đó, các chủng vi khuẩn có nhiều
dấu SNP (nhóm 2, 3, 4) có sự khác biệt rõ rệt và tách thành nhánh riêng;
các chủng có ít dấu SNP có khoảng cách di truyền ngắn hơn và các chủng
tương đồng xếp vào chung nhóm và có vị trí gần nhau (nhóm 1).

Hình 3.5. Giản đồ phả hệ mô tả mối tương quan giữa các VK kết tụ polysaccharide
3.5.2. Giản đồ phả hệ thể hiện tƣơng quan giữa vi khuẩn tạo kết tụ
đƣợc tuyển chọn và các chủng vi khuẩn tƣơng đồng di truyền
Giản đồ phả hệ ở Hình 3.6 cho thấy các vi khuẩn tạo kết tụ protein và
các chủng tương đồng được xếp thành 5 nhóm. Các chỉ số bootstrap cao
(99-100) ở các node của nhánh thể hiện mối liên hệ mật thiết giữa các
chủng vi khuẩn trong nhóm cũng như mối tương quan gần gũi giữa các
nhóm. Giản đồ cho thấy 2 chi Staphylococcus và Bacillus có mối quan hệ
rất gần nhau: chúng đều là vi khuẩn gram dương thuộc Firmicutes. Đặc biệt
Bacillus methylotrophicus VL02P được xếp thành 1 nhóm riêng, không
chung nhóm với 2 chủng tương đồng (được xếp vào nhóm 4) mặc dù có tỉ
lệ tương đồng 98%. Có thể đây là 1loài mới, tương tự cách nhận định trong
nghiên cứu của Shcherbakova và ctv. (2011) trên chủng M2
T
của tác giả.
17

TroTng


















Hình 3.6. Giản đồ phả hệ mô tả tương quan giữa các VK kết tụ protein và các
chủng tương đồng di truyền


Hình 3.7. Giản đồ phả hệ mô tả tương quan giữa các VK kết tụ polysaccharide
và các chủng tương đồng di truyền

HQ231223-Bacillus-sp NyZ44-(China)

HQ242772-Bacillus-aryabhattai-isolate-PSB59-(China)
FJ620896-Bacillus-megaterium-strain-XTBG34-(China)
JN084155-Bacillus-aryabhattai-strain-Y8-(China)
Bacillus-megaterium-DT07P
FJ976552-Bacillus-megaterium-strain-LCR43-(India)
JQ229803-Bacillus-megaterium-strain-1CK24-(China)
Bacillus-megaterium-AG08P
Bacillus-sp-HG06P
Staphylococcus-xylosus-TV05P
Staphylococcus-xylosus-ST05P
FJ210844-Staphylococcus-saprophyticus-strain-OTUC3-(China)
HM854231-Staphylococcus-xylosus strain-KTH6-1-(China)
GQ480491-Staphylococcus-saprophyticus-subsp saprophyticus-strain-xf1-4-China)
HM854231-Staphylococcus-xylosus-strain-KTH6-1-(China)
Bacillus-subtilis-BT24P
Bacillus-subtilis-KG15P
AF270793-Bacillus-subtilis-N5-(New Zealand)
JQ039972-Bacillus-subtilis-strain-YNA61-(China)
HQ143570-Bacillus-pumilus-strain-YT1-(China)
JF738142-Bacillus-sp PSM2-(China)
Bacillus-amyloliquefaciens-CT04P
HQ238495-Bacillus-methylotrophicus-strain-S521B-53-(China)
JN086146-Bacillus-amyloliquefaciens-strain-Rx-34-(China)
JF496465-Bacillus-vallismortis-strain-WA1-1-(China)
JF496324-Bacillus-vallismortis-strain-A1-7-(China)
Bacillus-amyloliquefaciens-TG03P
HM055608-Bacillus-amyloliquefaciens-strain-JS-(China)
JF899261-Bacillus-methylotrophicus-strain-Hk9-21-(China)
Bacillus-methylotrophicus-VL02P
100

100
99
42
39
100
100
68
0
0.02
EU912461-Bacillus-sp SuP1-(India)
JF496312-Bacillus-megaterium-strain-XAS5-1-(China)
Bacillus-megaterium-VL22S
FJ976550-Bacillus-megaterium-strain-LCR41-(India)
HQ231223-Bacillus-sp NyZ44-(China)
HM027880-Bacillus-megaterium-strain-RKJ600-(India)
EU661789.1-Bacillus-sp C-18-(China)
JF460759-Bacillus-aryabhattai-strain-Kt10-17-(China)
GQ284474-Bacillus-megaterium-strain-PCWCW5-(India)
JN642548-Bacillus-megaterium-strain-EN2-(India)
HQ908708-Bacillus-aryabhattai-strain-F77063-(India)
EU834243-Bacillus-subtilis-strain-DS13-(Korea)
Bacillus-megaterium-AG19S
JN411325-Bacillus-megaterium-strain-IARI-BK-14-(India)
Bacillus-megaterium-TV35S
Bacillus-megaterium-BT36S
Bacillus-megaterium-HG09S
Bacillus-sp CT27S
EU162025-Bacillus-sp PGBw5-(TAIWAN)
Bacillus-megaterium-KG50S
Bacillus-subtilis-TG09S

JQ900635-Bacillus-subtilis-strain-ME-1-(CHINA)
JN700159-Bacillus-amyloliquefaciens-subsp plantarum-strain-P03-(CHINA)
Agrobacterium-tumefaciens-ST37S
JN048647-Rhizobium-sp SYF-5-(China)
GQ181060-Agrobacterium-tumefaciens-strain-BLN4-(Korea)
HQ657321-Arthrobacter-sp D48-(China)
Arthrobacter-sp DT45S
JF900051-Arthrobacter-sp C3-2-(China)
77
71
66
28
99
63
99
99
100
100
100
67
100
0.02
1
4
5
2
3
4
1
2

3
18

Đối với các vi khuẩn tạo kết tụ polysaccharide và các chủng tương đồng
(Hình 3.7), giản đồ phả hệ cho thấy có 4 nhóm chính trong đó nhóm 3, 4 có
thể xem như là 2 nhánh riêng. Nhóm 1 với nhiều thành viên nhất cho thấy
sự phong phú của chi Bacillus. Chỉ số bootstrap 99-100 ở các nhóm 2, 3, 4
thể hiện mối liên hệ chặt chẽ giữa các vi khuẩn tuyển chọn và các chủng
tương đồng trong nhóm cũng như quan hệ gần gũi giữa các nhóm.
** Tóm lại, khảo sát tính đa hình của các nucleotide trên các chuỗi trình
tự và phân tích giản đồ phả hệ đã cho thấy đa dạng di truyền của các vi
khuẩn tạo kết tụ sinh học cũng như sự phong phú đa dạng của các chi loài
vi khuẩn trong tự nhiên. Thông qua tiến hóa, các loài mới phát sinh qua quá
trình biệt hóa và những biến đổi của các sinh vật sẽ giúp chúng có khả năng
tìm thấy và khai thác một sinh thái thích hợp (Caliskan – 2012).
3.6. Kết quả tuyển chọn các chủng vi khuẩn có tỉ lệ kết tụ hơn 70%
Trên 2 loại môi trường đã chọn ra được 6 chủng vi khuẩn có tỉ lệ kết tụ
hơn 70% như sau:
Môi trường protein
Môi trường polysaccharide
TT
Chủng vi khuẩn
Tỉ lệ kết tụ %
TT
Chủng vi khuẩn
Tỉ lệ kết tụ %
01
DT07P (Hình 3.8a)
74,25
01

AG19S (Hình 3.8d)
71,95
02
HG06P (Hình 3.8b)
73,00
02
ST37S (Hình 3.8e)
71,03
03
AG08P (Hình 3.8c)
72,00
03
TG09S (Hình 3.8f)
70,57












Hình 3.8. Ảnh 6 chủng vi khuẩn qua kính hiển vi điện tử quét (SEM)


a

b
c
d
e
f
19

3.7. Các điều kiện để kết tụ đạt tỉ lệ cao nhất
3.7.1. pH của môi trƣờng
Hình 3.9 cho thấy 6 vi khuẩn tuyển chọn đều có tỉ lệ kết tụ cao nhất với
pH = 6, vì vậy chọn giá trị này để thực hiện các thí nghiệm tiếp sau. Kết
quả này cũng tương tự các nghiên cứu của Dermlim và ctv. (1999), Qiang
và ctv. (2007), Cao Ngọc Điệp và ctv. (2012)… các chủng vi khuẩn đều đạt
tỉ lệ kết tụ cao nhất ở pH6. Giá trị pH này cũng phù hợp với môi trường
nước ao nuôi cá tra, thường có pH là 6-7 (Dương Nhựt Long và ctv., 2004).


Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn tỉ lệ kết tụ của các vi khuẩn theo các giá trị pH
3.7.2. Ion kim loại trong môi trƣờng
Theo kết quả từ Hình 3.10, cả 6 vi khuẩn có tỉ lệ kết tụ cao và khác biệt
không ý nghĩa trong cả 2 dung dịch kaolin có thêm CaCl
2
hoặc NaCl vào.


Hình 3.10. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ kết tụ của các vi khuẩn theo các ion kim loại
Tuy nhiên, ở các tỉ lệ kết tụ cao nhất, liều lượng vi khuẩn sử dụng trên
môi trường có NaCl đều ít hơn trên môi trường có CaCl
2
. Vì vậy, NaCl

được chọn để sử dụng cho các bước tiếp sau với các ưu điểm như: NaCl
thân thiện với môi trường hơn CaCl
2
, đạt hiệu quả kinh tế hơn (NaCl rẽ tiền
57
59
61
63
65
67
69
71
73
75
pH = 5
pH = 6
pH = 7
pH = 8
pH = 9
AG08P
DT07P
HG06P
AG19S
ST37S
0
10
20
30
40
50

60
70
80
AG08P
DT07P
HG06P
AG19S
ST37S
TG09S
CaCl2
NaCl
KCl
MnSO4
MgSO4
Tỉ lệ kết tụ %
Tỉ lệ kết tụ %
20

hơn, sử dụng sinh khối vi khuẩn ít hơn) và cá tra có thể phát triển bình
thường ở độ mặn 0,1% NaCl. Việc sử dụng ion Na
+
để hỗ trợ cho hoạt
động kết tụ cũng tương tự trong các nghiên cứu của Li và ctv. (2007), Arafa
và ctv. (2014) , các vi khuẩn có tỉ lệ kết tụ cao khi có sự hiện diện của Na
+
.
3.7.3. Nguồn dinh dƣỡng phù hợp nhất cho các vi khuẩn
Kết quả với tỉ lệ kết tụ trong 48 tổ hợp có chứa các nguồn carbon,
nitrogen và khoáng vô cơ khác nhau cho thấy cả 3 chủng vi khuẩn tạo kết tụ
protein AG08P, DT07P, HG06P đều phát triển tốt ở môi trường có tinh

bột, glutamate và KCl. Trong khi đó, 3 chủng vi khuẩn tạo chất kết tụ
polysaccharide là AG19S, ST37S và TG09S đều cho tỉ lệ kết tụ cao nhất khi
được nuôi trong môi trường chứa sucrose, glutamate và CaCl
2
. Như thế, so
với các nghiên cứu của những tác giả khác (Kurane và Nohata, 1994; Bùi
Thế Vinh và ctv., 2012; Arafa và ctv., 2014; …), các vi khuẩn được chọn ở
đây sử dụng các nguồn dinh dưỡng dễ tìm và rẽ tiền, vì vậy không tốn kém
nhiều, thuận tiện cho việc nghiên cứu, ứng dụng vào thực tế.
3.7.4. Thời gian nuôi cấy và liều lƣợng vi khuẩn sử dụng
3.7.4.1. Tỉ lệ kết tụ của các chủng vi khuẩn theo thời gian, liều lƣợng
Các kết quả thí nghiệm được ghi nhận liên tục qua các thời điểm: ngày
2, 3, 4, 5 sau khi chủng để xác định thời gian nuôi cấy và liều lượng vi
khuẩn sử dụng cho tỉ lệ kết tụ cao nhất. Theo đó, có 3 chủng vi khuẩn đạt ti
lệ kết tụ hơn 80% là AG08P, DT07P và ST37S (Hình 3.11)


Hình 3.11. Tỉ lệ kết tụ cao nhất của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
80,23
83,08
71,88
70,98
81,2
70,14
60
65
70
75
80
85

AG08P
ngày 3
0, 1%
DT07P
ngày 4
0,09%
HG06P
ngày 3
0,1%
AG19S
ngày 2
0,2%
ST37S
ngày 5
0,08%
TG09S
ngày 2
0,1%
Tỉ lệ kết tụ %
Chủng VK
Ngày nuôi cấy
Liều lượng VK
21

Kết quả ở Hình 3.11 cho thấy thời gian nuôi cấy vi khuẩn ở đây cũng
tương tự trong các nghiên cứu của các tác giả khác (Xia và ctv., 2008;
Zaki và ctv., 2011; Ntsaluba và ctv., 2011 ) nhưng liều lượng sử dụng cho
các vi khuẩn này tương đối ít, chỉ từ 0,08-0,2%.
3.7.4.2. Tỉ lệ kết tụ của các tổ hợp vi khuẩn theo thời gian
Kết quả cho thấy qua từng ngày khảo sát, có 2 tổ hợp luôn có tỉ lệ kết tụ

cao nhất là tổ hợp của DT07P + ST37S, và DT07P + AG08P. Hai tổ hợp
này được phối từ 3 chủng vi khuẩn có tỉ lệ kết tụ cao là DT07P, AG08P và
ST37S trong đó DT07P là chủng vi khuẩn đạt tỉ lệ kết tụ cao nhất có trong
cả 2 tổ hợp. Có lẽ vì thế mà hiệu quả của chúng cao hơn các tổ hợp còn lại.
3.7.5. Tƣơng quan giữa mật số và tỉ lệ kết tụ theo thời gian nuôi cấy
Tương quan giữa mật số vi khuẩn và tỉ lệ kết tụ theo thời gian nuôi cấy
ở 6 chủng vi khuẩn khảo sát được ghi nhận như sau :
- Ở các vi khuẩn tạo chất kết tụ, sự sản xuất tế bào rất nhanh, chỉ sau 1
ngày mật số đã đạt đến 10
7
CFU/ml (ở vi khuẩn tạo kết tụ protein) hay 10
8

CFU/ml (ở vi khuẩn tạo kết tụ polysaccharide).
- Thời gian nuôi cấy để đạt tỉ lệ kết tụ cao nhất khác nhau theo từng
chủng vi khuẩn. Tuy nhiên chất kết tụ thường đạt hiệu quả tối đa sớm, ở
cuối pha tăng trưởng hoặc đầu pha cân bằng của sự phát triển tế bào cho
thấy chất kết tụ sinh học được tạo ra bằng cách tổng hợp trong quá trình
phát triển của vi khuẩn chứ không phải do sự tự phân giải tế bào (Zaki và
ctv., 2011; Xia và ctv., 2008; Gong và ctv., 2008; Lu và ctv., 2005).
- Ở 5/6 vi khuẩn này (trừ ST37S), thời điểm đạt tỉ lệ kết tụ tối đa và mật
số vi khuẩn cao nhất không tương ứng nhau. Điều này hướng đến một lưu ý
là hiệu quả kết tụ không hoàn toàn tương ứng với việc tạo thêm tế bào hay
ít nhất là việc sản sinh vi khuẩn không song song với việc tạo chất kết tụ.
3.8. Kiểm tra các chủng, tổ hợp vi khuẩn tạo kết tụ với tỉ lệ cao
Với các điều kiện phù hợp về pH, ion kim loại hỗ trợ, các nguồn dinh
dưỡng, thời gian nuôi cấy và liều lượng vi khuẩn sử dụng để có tỉ lệ kết tụ
cao nhất đã được xác định ở trên, thực hiện thí nghiệm kiểm tra tỉ lệ kết tụ
của 6 chủng vi khuẩn để chọn ra các chủng, tổ hợp vi khuẩn hiệu quả cao
hơn cả đưa vào ứng dụng.

3.8.1. Kiểm tra tỉ lệ kết tụ trong dung dịch kaolin