Nghiên cứu sử dụng nước thải thủy sản để nuôi chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. israelensis tạo chế phẩm sinh học diệt ấu trùng muỗi

 Đồ án Tốt nghiệp
TÓM TẮT
Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành khảo sát 3 vấn đề sau: Tối ưu hai yếu tố
là pH nuôi cấy và độ pha loãng của nước thải Surimi để nuôi cấy Bacillus
thuringensis var. israelensis. Quan sát, so sánh hình thái tế bào vi khuẩn khi nuôi
trên môi trường này với nuôi trên môi trường chọn lọc GYS (Glucose-Men-Muối).
Cuối cùng là khảo sát hoạt lực diệt ấu trùng muỗi của bào tử vi khuẩn Bacillus
thuringensis var. israelensis sau khi nuôi cấy trên môi trường nước thải. Kết quả
cho thấy: Hình thái tế bào vi khuẩn khi nuôi trên hai môi trường không có sự khác
biệt. Ở pH = 6,7, độ pha loãng của nước thải = 1/2 và thời gian nuôi 30 giờ lượng
sinh khối vi khuẩn nuôi cấy đạt giá trị lớn nhất. Bào tử vi khuẩn Bacillus
thuringensis var. israelensis khi nuôi cấy trên môi trường nước thải có khả năng diệt
ấu trùng muỗi cao tại nồng độ 10
4
(bào tử/ml).
ABSTRACT
In this project, we investigated three problems: optimal two elements cultured
pH and the dilution of wastewater fishery Surimi cultured Bacillus var. israelensis.
Comparing the bacterial cell morphology when cultured on medium wastewater
Surimi with cultured on selective medium GYS (Glucose-Yeast-Salt). We
investigated degree of activity kill mosquito larvae of spores Bacillus thuringensis
var. israelensis. The results show that: Morphology of bacterial cells when cultured
on two culture medium no the differences. At pH = 6,7, the dilution of waste water
= 1/2 and 30 hour of cultivation to reach maximum biomass. Spores of Bacillus
thuringensis var. israelensis has the ability to kill mosquito larvae in high
concentrations 10
4
(spores/ml).
SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 1
 Đồ án Tốt nghiệp
LỜI MỞ ĐẦU

Muỗi là côn trùng truyền nhiều bệnh rất nguy hiểm. Các bệnh sốt rét, sốt xuất
huyết, sốt vàng da, viêm não Nhật Bản, giun chỉ, sùi chân voi, … do muỗi truyền đã
và đang đe dọa sinh mạng của hàng triệu người. [21, 22, 30]
Việt Nam có khí hậu thích hợp cho nhiều loài muỗi truyền bệnh sinh trưởng và
phát triển. Để diệt muỗi, một biên pháp phổ biến là dùng thuốc diệt muỗi hóa học.
Tuy nhiên, việc sử dụng này đã có hiện tượng kháng thuốc, ô nhiễm môi trường và
gây hại đối với côn trùng có ích [7, 12, 17, 22]. Do vậy biện pháp an toàn và hiệu
quả nhất là sử dụng chế phẩm sinh học diệt ấu trùng muỗi từ vi khuẩn Bacillus
thuringiensis var. israelensis (Bti) [8]. Bti đã được sử dụng rộng rãi trên thế giới
hơn 20 năm nay nhưng vẫn chưa có một báo cáo nào về sự xuất hiện tính kháng
[21, 30]. Hiện nay Bti được sử dụng rộng rãi trên thế giới với các dạng chế phẩm
thương mại Vecto Bac, Teknac, … Tuy nhiên giá của các loại chế phẩm này còn
tương đối cao so với nền kinh tế của nước ta.
Những nghiên cứu mới đây chỉ ra rằng, vi khuẩn Bacillus thuringiensis var.
israelensis có thể sinh trưởng và phát triển tốt trên một số môi trường như nước thải
của nhà máy tinh bột sắn, nước thải từ lò giết mổ, … [4, 5]. Những nghiên cứu này
có ý nghĩa to lớn vừa có thể tận dụng được nguồn nước thải của các nhà máy chế
biến thực phẩm, giảm chi phí xử lí đồng thời nuôi cấy vi sinh vật tạo ra chế phẩm
sinh học diệt trừ được ấu trùng muỗi.
Ngành công nghiệp chế biến thủy sản phát triển, đem lại nhiều lợi ích to lớn
trong việc phát triển kinh tế của vùng. Tuy nhiên chất thải ngành thủy sản sẽ tác
động nghiêm trọng đến môi trường đặc biệt là môi trường đất, nước. [3]
Với mong muốn tìm ra một nguồn nguyên liệu sẵn có đồng thời tận dụng được
phần nào nguồn nước bị ô nhiễm vào mục đích nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus
thuringiensis var. israelensis từ đó sản xuất ra chế phẩm diệt trừ ấu trùng muỗi. Em
thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sử dụng nước thải thủy sản để nuôi chủng vi khuẩn
Bacillus thuringiensis var. israelensis tạo chế phẩm sinh học diệt ấu trùng muỗi ”.

SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 2
 Đồ án Tốt nghiệp

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis
1.1.1. Tóm tắt về lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bacillus thuringiensis
Lịch sử về Bacillus thuringiensis bắt đầu từ khi Loius Pasteur phát hiện thấy
một loài vi khuẩn có khả năng gây bệnh cho tằm, ông đặt tên là Bacillus bombyces.
Năm 1901, Ishiwata phân lập ra một loại vi khuẩn từ ấu trùng tằm bị bệnh và đặt tên
là Bacillus sotto. Năm 1911 Berliner đã phân lập được một loại vi khuẩn tương tự từ
xác ấu trùng bướm Địa Trung Hải. Đến năm 1915 vi khuẩn này chính thức mang
tên Bacillus thuringiensis. [14]
Năm 1928, Huszddax phân lập chủng Bacillus thuringiensis (Bt) từ Ephestia,
thử nghiệm nó trên sâu đục thân ngô ở Châu Âu, đây được coi là ứng dụng đầu tiên
của Bacillus thuringiensis. Chế phẩm thương mại đầu tiên, Sporeine, được sản xuất
ở Pháp năm 1938. Năm 1951 - 1956 Steinhaus nghiên cứu khả năng diệt côn trùng
của Bacillus thuringiensis và đã được sản xuất ở Mỹ. Trong suốt những năm 1960,
lần lượt các chế phẩm thương mại của Bt đã được sản xuất ở nhiều nơi như Mỹ,
Pháp, Đức, … với quy mô khác nhau. Sau đó Howard Dulmage và Clayton Beesle
của viện nghiên cứu Nông Nghiệp USDA đã thu thập được bộ sưu tầm đầu tiên về
các chủng Bt. Năm 1970, Dulmage đã phân lập được chủng HD - 1 và đến nay vẫn
được sử dụng cho nhiều nghiên cứu và sản xuất chế phẩm Bt. Thập niên 80, nhiều
công ty sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh đã đăng ký sản xuất và kinh doanh các chế
phẩm Bt. Đầu những năm 90 tại một số quốc gia như Cuba, Trung Quốc, Mỹ đã sản
xuất chế phẩm Bt ở quy mô công nghiệp. Ngày nay một số lượng lớn thương phẩm
trừ sâu sinh học Bt được sử dụng trong việc kiểm soát ấu trùng bộ cánh vẩy, hai
cánh và cánh cứng. [15]
1.1.2. Đặc điểm sinh thái và sinh hóa của Bacillus thuringiensis
 Đặc điểm sinh thái
Bacillus thuringiensis là thành viên của nhóm I, chi Bacillus. Đây là loại vi
khuẩn Gram dương, sinh bào tử, hô hấp hiếu khí hoặc hiếu khí không bắt buộc. Tế
bào có kích thước 3 x 6 µm, có phủ tiêm mao không dày, có khả năng di động, tế
bào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi.

SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 3
 Đồ án Tốt nghiệp
Là một loài thuộc chi Bacillus nên khi gặp điều kiện không thuận lợi như thiếu
dinh dưỡng, nhiệt độ cao, khô hạn… Bt có khả năng sinh nội bào tử giúp cho chúng
chống chịu với điều kiện khắc nghiệt đó. Bào tử của vi khuẩn có dạng hình trứng
với kích thước 1, 5 x 2 µm và có thể nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng khi có điều
kiện thuận lợi.
Sự hình thành bào tử diễn ra đồng thời với sự tạo thành protein tinh thể có khả
năng diệt côn trùng. Tinh thể có nhiều hình dạng khác nhau (hình vuông, chữ nhật,
hình tháp, hình ôvan hoặc vô định hình). Khi tế bào phân giải tinh thể và bào tử
được giải phóng ra ngoài. Tinh thể có kích thước khoảng 0,6 x 0,2 µm, và có thể
chiếm tới 30% trọng lượng khô của tế bào. Tinh thể này được gọi là thể vùi. Tinh
thể và bào tử có thể quan sát dưới kính hiển vi đối pha ở vật kính dầu. Tinh thể bắt
màu sẫm còn bào tử không bắt màu nhưng có mép sáng. Hình dạng của tinh thể
được quyết định bởi gen mã hoá cho tổng hợp protein của tinh thể nằm trên
plasmid. [3]
Hình 1.1: Tinh thể độc của Bt dưới kình hiển vi điện tử [25]
 Đặc điểm sinh hoá
Đa số Bacillus thuringiensis không lên men sinh axít đối với arabinoza,
xiloza, và manitol, khử nitơrat thanh nitơrit, có phản ứng với lòng đỏ trứng gà, phát
triển được trong môi trường thạch kị khí có chứa 1% lizozym. Sinh trưởng tốt
nhất ở nhiệt độ 28 - 30
0
C, pH = 6,8 - 7,2. [26]
SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 4
 Đồ án Tốt nghiệp
1.1.3. Phân loại Bacillus thuringiensis
Bt được chia làm nhiều loại phụ dựa trên các đặc điểm sau:
+ Khả năng hình thành enzyme leucitinase
+ Cấu trúc tinh thể và khả năng gây bệnh cho côn trùng.

+ Đặc tính huyết thanh học.
+ Phản ứng ngưng kết của các tế bào sinh dưỡng với các huyết thanh
tương ứng.
Cho đến nay phương pháp phân loại Bt được sử dụng khá phổ biến là dựa trên
các đặc tính huyết thanh học. Đặc tính huyết thanh học của chủng Bt được xác định
chủ yếu dựa trên kháng nguyên tiêm mao H và tiến hành bằng phản ứng ngưng kết
các tế bào sinh dưỡng với các kháng huyết thanh tương ứng. Tuy nhiên việc phân
loại chỉ dựa trên typ huyết thanh tương ứng. Tuy nhiên việc phân loại chỉ dựa trên
typ huyết thanh vẫn chưa phản ánh được mối liên hệ giữa chủng giống và hoạt lực
diệt côn trùng. Việc phân lập và tuyển chọn các chủng Bt có giá trị vẫn gặp khó
khăn. Chính vì vậy, gần đây một số nhà khoa học đã đề nghị đưa ra phương pháp
phân loại mới dựa trên kết quả xác định typ huyết thanh, hình dạng tinh thể, hoạt
lực diệt côn trùng, gen Cry và thành phần protein tinh thể, hình dạng tinh thể và
hoạt lực diệt côn trùng. [6, 14]
1.1.4. Sự phân bố của Bacillus thuringensis
Bacillus thuringiensis tồn tại ở khắp mọi nơi trong đất và trên bề mặt lá, ở đất
rừng, thảo nguyên, sa mạc hay ở môi trường có điều kiện thuận lợi cho sâu bọ phát
triển như bụi hạt từ các nhà máy xay lúa mì, trong các kho bảo quản ngũ cốc…Sự
phân bố của Bt là không liên quan đến sự phân bố của côn trùng đích. Tuy nhiên, Bt
thường có xu hướng tồn tại nhiều trong môi trường có nhiều sâu bọ phát triển và
giàu dinh dưỡng. Có thể phân lập Bt từ nhiều loại môi trường khác nhau. Bt dễ dàng
phát triển trong môi trường thí nghiệm chỉ với một lượng tối thiểu chất dinh dưỡng.
Mặc dù bào tử Bt tồn tại trong nhiều năm, nhưng chúng không nảy mầm và nhân
lên như các tế bào sinh dưỡng trong đất tự nhiên. Điều này chứng tỏ rằng Bt không
thích nghi với môi trường đất. [14]
1.2. Tìm hiểu về loài Bacillus thuringensis var. israelensis (Bti)
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu
SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 5
 Đồ án Tốt nghiệp
Bacillus thuringensis được chia làm nhiều loài phụ. Theo bộ sưu tập của trung

tâm Bacillus diệt côn trùng Quốc tế, Viện Pastuer Paris năm 1996, đã có tới hơn 69
loài phụ khác nhau như: cánh vẩy, cánh cứng, hai cánh, ở một số loài phụ Bacillus
thuringensis var. berliner, Bacillus thuringensis var. thompsoni…
Khác với loài Bacillus thuringensis, loài phụ Bacillus thuringensis var.
israelensis mới được phát hiện gần đây. Loài phụ này có tác dụng diệt ấu trùng
muỗi. Các nhà khoa học Goldberg, Margarit là nhưng người đầu tiên phân lập,
nghiên cứu loài vi khuẩn này và De Bajac đặt tên cho là Bacillus thuringensis var.
israelensis. Họ đã phân lập và nuôi cấy, thử hoạt lực diệt ấu trùng muỗi với hàng
trăm chủng khác nhau. Tuy nhiên chỉ có một số chủng có hoạt lực diệt các loài muỗi
Culex pipens, Culex univttatus, Aedes aegypti và Anopheles sergentti…
Chủng đầu tiên đó được kí hiệu là ORN - 60A và thuộc typ huyết thanh H
14
…
Ngày nay đã có rất nhiều chủng Bacillus thuringensis var. israelensis được tìm thấy
và được phân loại làm phong phú thêm bộ sưu tập về Bacillus diệt côn trùng. Các
chủng thường được sử dụng trong việc sản xuất chế phâm sinh học diệt muỗi với
các tên gọi khác nhau: Bactimos, Skeetam, Vectobac…chế phẩm dạng lỏng dạng
bột thấm nước, dạng viên, bánh nổi có tác dụng diệt ấu trùng của nhiều loài ruồi
muỗi trong đó có loài Aedes Aegypti. Chế phẩm Bacillus thuringensis var.
israelensis có tác dụng tốt trong môi trường nước sạch, nước có nồng độ muối
loãng và được Tổ chức Y tế thế giới lựa chọn để diệt trừ các vectơ truyền bệnh sốt
rét, sốt xuất huyết ở các nước nhiệt đới. [21, 28]
1.2.2. Đặc điểm sinh học của Bacillus thuringiensis var. israelensis
- Trực khuẩn, kích thước 1-1,2 x 3-5 µm.
- Phủ tiêm mao, di chuyển được, Gram +.
- Sinh bào tử hình trứng dài, kích thước 1,6 – 2 µm.
- Hiếu khí hoặc hiếu khí không bắt buộc.
- Nhiệt độ sinh trưởng 15º - 45ºC.
- Phổ biến trong tự nhiên, cư trú trong đất, trên bề mặt cây và trên xác sâu.
- Tạo ra tinh thể protein trong giai đoạn tạo bào tử, kích thước 0,6 – 2 µm.

Bản chất là protein [14].
SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 6
 Đồ án Tốt nghiệp
Hình 1.2: Hình dạng dưới kính hiển vi và khuẩn lạc của vi khuẩn
Bacillus thuringensis var. israelensis [27]
1.2.3. Đặc điểm phân loại
Bacillus thuringensis var. israelensis là loài phụ của loài Bacillus thuringensis.
De Bajac là người đầu tên phân loại loài phụ Bacillus thuringensis var. israelensis
thuộc typ huyết thanh H
14
. Tuy nhiên vào năm 1988, Ohba và Aiawa (Nhật Bản) đã
phân lập được hai chủng Bacillus thuringensis thuộc typ huyết thanh H
14
nhưng lại
không có hoạt lực diệt muỗi, ruồi đen. Trước đó (năm 1982) Pachun và cộng sự đã
phân lập được chủng PG - 14 thuộc typ huyết thanh H8A, B có hoạt lực cao đối với
ấu trùng muỗi Aedes Aegypti, Culex pipens, Culex univttatus, Aedes aegypti và
Anopheles sergentti…
Do đó nếu chỉ dựa trên đặc điểm typ huyết thanh thì không thể đảm bảo được
phân loại một cách chính xác mà phải dựa trên những đặc điểm khác nhau như lớp
Cry, thành phần và hình dạng protein tinh thể. Hofte và Whiteley là những người
đầu tiên đưa ra ý tưởng phân loại Bacillus thuringensis var. israelensis dựa trên sự
kết hợp của tất cả các đặc điểm: gen Cry, thành phần và hình dạng protein tinh thể,
hoạt lực diệt côn trùng và typ huyết thanh. Ý tưởng này đa được rất nhiều nhà khoa
học hưởng ứng và được sử dụng chủ yếu cho đến nay để phân loại Bacillus
thuringensis var. israelensis. [14, 15, 22]
SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 7
 Đồ án Tốt nghiệp
Bảng 1.1: Đặc điểm phân loại loài phụ Bacillus thuringensis var. israelensis
(theo Hofte và Whiteley, 1989) [14]

Lớp gen
Cry
Thành phần
protein
(Kda)
Hình dạng
tinh thể
Typ huyết
thanh
Hoạt lực
diệt côn
trùng
Cry4A 135 Hình cầu H
14
Muỗi,
ruồi đen
Cry4B 138 Hình cầu H
14
Muỗi,
ruồi đen
Cry4C 78 Hình cầu H
14
Muỗi,
ruồi đen
Cry4D 67 Hình cầu H
14
Muỗi,
ruồi đen
Cyt 28 Hình cầu H
14

Muỗi,
ruồi đen
1.2.4. Protein diệt muỗi của loài phụ Bacillus thuringensis var. israelensis
Sự hình thành protein tinh thể Bacillus thuringensis thường xảy ra trong quá
trình hình thành bào tử và nhiều nghiên cứu gần đây đã cho thấy nó có liên quan
mật thiết tới sự có mặt của DNA plasmit. Gen mã hóa protein độc thường nằm trên
các plasmit cỡ lớn trên 3kb gồm một phần là gen mã hóa protein độc và phần còn
lại mã hóa protein liên quan đến tính gắn.
Khi nghiên cứu các cách chủng Bacillus thuringensis var. israelensis có hoạt
lực đối với côn trùng thuộc bộ hai cánh, người ta thấy protein độc của chúng bao
gồm các tiểu phần protein có trọng lượng phân tử: 130KDa, 128KDa, 78KDa,
67KDa, 28KDa do các lớp gen Cry4A, Cry4B, Cry4C, Cry4D và Cyt mã hóa tổng
hợp nên. Đây cũng chính là đặc điểm quan trọng nhất để phân biệt loài phụ Bacillus
thuringensis var. israelensis với các loài khác.
Nhóm Cry4 mã hóa tổng hợp các protein tinh thể có trọng lượng 130, 128, 78
và 67 KDa, có kích thước thông thường khoảng từ 0,7- 1,2 µm. Nhóm gen Cry4 mã
hóa tổng hợp các protein tinh thể có trọng lượng 130, 128, 78 và 67KDa có kích
thước thông thường đạt từ 0,7 – 1,2 µm. Nhóm gen Cyt bao gồm hai lớp CytA và
SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 8
 Đồ án Tốt nghiệp
CytB thường tồn tại ở các chủng Bacillus thuringensis var. israelensis mang nhóm
gen Cry4 và tổng hợp các protein có trọng lượng phân tử khoảng 28KDa. Các
chủng Bacillus thuringensis var. israelensis thường tổng hợp các tinh thể protein
hình cầu chỉ gây độc đối với côn trùng hai cánh. Tinh thể độc của Bti gồm hai loại
thể vùi protein khác nhau gắn với nhau bằng các lớp vỏ bọc. Mỗi thể vùi được bảo
quản bởi một hay nhiều lớp nguyên liệu giống thành phần vỏ bọc mà đây cũng là
một đặc điểm chỉ có vỏ Bacillus thuringensis var. israelensis giúp cho tinh thể độc
vẫn giữ được độc tính với côn trùng dưới tác dụng của proteaza cùng một số hóa
chất khác mà cụ thể như sau:
Protein 28KDa có trong thể vùi lớn nhất (chiếm khoảng 40 - 50% tinh thể). Nó

thể hiện rõ trên gen polyarcylamide (SDS - PAGE) bởi tính hòa tan của nó cao hơn
hắn các protein khác. Đối với protein này dưới tác dụng của enzyme proteaza, nó bị
thủy phân thành protein có trọng lượng chỉ còn là 25KDa và hoạt lực diệt ấu trùng
muỗi rất thấp.
Protein 67KDa có trong thể vùi lớp thứ hai chiếm khoảng 15 - 20% tinh thể.
Cũng giống như tiểu phần 28KDa thì protein này cũng bị thủy phân thành các tiểu
phần nhỏ hơn 31KDa, 35KDa bởi enzyme proteaza và hoạt tính đối với ấu trùng
muỗi cũng kém.
Cuối cùng các protein 128KDa và 135KDa có trong thể vùi nhỏ nhất, bị phân
hủy thành các nhân độc 58 - 73KDa dưới tác dụng của proteaza nhưng có hoạt lực
diệt ấu trùng muỗi cao nhất. Hiện nay protein này đang được tập trung nghiên cứu
nhiều nhất và người ta cho rằng hai protein này là thành phần quan trọng đối với
hoạt lực diệt ấu trùng của tinh thể. [15, 20, 28]
Các thử nghiệm thực tế bằng cách tách riêng rẽ từng loại protein tinh thể của
Bacillus thuringensis var. israelensis cho thấy rằng các protein 28, 67, 128, 135
KDa đều có hoạt tính độc đối với ấu trùng muỗi [13, 20]. Tuy nhiên, Chichott và
Ellar đã chứng minh rằng việc sử dụng cả 4 loại protein tinh thể sẽ cho hiệu quả cao
hơn do có sự tác động qua lại giữa 2 hay nhiều protein. [15]
Bảng 1.2: So sánh hoạt lực diệt ấu trùng muỗi Aedes aegypti của protein riêng
rẽ và hỗn hợp protein (theo Chichott và Ellar, 1988) [14]
SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 9
 Đồ án Tốt nghiệp
Chế phẩm LC50 (µg/ml)
Hỗn hợp tinh thể 0.32
Tinh thể hòa tan 1
Protein 130 KDa 32
Protein 67 KDa 4
Protein 28 KDa 115
1.2.5. Cơ chế gây độc của protein tinh thể do Bacillus thuringensis var.
israelensis tổng hợp.

Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chủng Bacillus thuringensis var. israelensis
lên tế bào côn trùng thì có thể thấy rằng cơ chế hoạt động của tinh thể độc chủ yếu
diễn ra trong ruột của côn trùng. Bởi khi nuốt phải tinh thể (hay còn gọi là tiền độc
tố) dưới tác dụng của pH cao và enzyme proteaza của đường ruột mà tinh thể độc
được hòa tan, thủy phân và hoạt hóa thành các nhân độc có hoạt tính. Sau đó các
nhân tố độc này bám dính lên tế bào thượng bì ruột, làm phá hủy cấu trúc tế bào
ruột và tạo nên các lỗ rò rỉ. Vì vậy, trong ruột côn trùng có sự chênh lệch áp suất
thẩm thấu giữa ruột côn trùng với môi trường ngoài tạo điều kiện cho các ion cũng
như nước khuếch tán từ ngoài vào gây nên sự phình của tế bào ruột. Cuối cùng, côn
trùng ngừng ăn trở nên chậm chạp và sau đó chết hắn. [8, 11, 16, 20]
1.2.6. Cơ chế tác dụng của bào tử vi khuẩn Bacillus thuringensis var. israelensis
- Bước 1: Xâm nhập vào các ấu trùng của côn trùng qua đường tiêu hóa.
- Bước 2: Protein tinh thể do Bacillus thuringensis var. israelensis tổng hợp
được hoạt hóa dưới tác động của môi trường kiềm trong ruột ấu trùng muỗi.
- Bước 3: Chọc thủng ruột giữa gây ra sự tổn thương làm chúng ngừng ăn. Sau
đó một vài ngày thì ấu trùng muỗi chết.
Bti sẽ diệt ở giai đoạn ấu trùng (lăng quăng). Sau khi trứng muỗi được đẻ vào
nơi ngập nước hay ẩm ướt (lá khô đọng nước, nước mưa ), trứng sẽ nở thành lăng
quăng. Lăng quăng ăn các hạt thức ăn và cả vi sinh vật để phát triển. Đây là thời
điểm thích hợp để người ta diệt chúng bằng Bti. Giai đoạn tuổi ấu trùng kéo dài
khoảng 10 - 12 ngày. Khi ấu trùng hoá nhộng (khoảng 24 giờ), chúng không ăn nữa,
rồi lột vỏ nhộng chui ra thành muỗi.
SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 10
 Đồ án Tốt nghiệp
Không chỉ tiêu diệt một cá thể, Bti còn được lây lan cho các ấu trùng khác qua
phân, xác chết của ấu trùng bị nhiễm. Do đó, có thể tạo ra sự lây nhiễm trên một
diện tích lớn. Khi ấu trùng nhiễm Bti bị tiêu diệt tới 90% thậm chí đạt tới 99%. [10,
18, 25]
1.3. Tổng quan về muỗi
Muỗi là một nhóm sinh vật thuộc lớp côn trùng hợp họ Culicidae, bộ Hai cánh

(Diptera). Họ Culicidae thuộc bộ Diptera và chứa khoảng 2700 loài trong 35 giống
gồm: Anopheles, Culex, Psorophora, Ochlerotatus, Aedes, Sabethes, Wyeomyia,
Culiseta, Haemagoggus, Chúng có một đôi cánh vảy, một đôi cánh cứng, thân
mỏng, các chân dài. Kích thước thay đổi theo loài, đa số có trọng lượng khoảng 2
đến 2,5 mg và có thể bay với tốc độ 1,5 đến 2,5 km/h.
Thức ăn của muỗi là chủ yếu là nhựa cây và hoa quả. Muỗi cái cần hút thêm
máu để có nguồn protein sản sinh ra trứng. Muỗi đực không có vòi thích hợp để hút
máu. Cũng có một nhánh muỗi, tên là Toxorhynchites, không hút máu. Muỗi cái dựa
vào nhiệt độ cơ thể con mồi, mùi mồ hôi, mùi cơ thể, axit lactic, cacbon dioxit để
tìm ra con mồi. Trong nước bọt của muỗi cái chứa protein chống máu đông nên máu
sẽ không bị đông lại. Khi muỗi đốt xong và bay đi, nước bọt của chúng vẫn đọng lại
trong vết thương. Lượng protein trong nước bọt này sẽ khiến cơ thể phản ứng lại
qua việc da căng phồng lên và cảm thấy ngứa, chỉ đến khi các protein nước bọt bị
các tế bào miễn dịch trong cơ thể phá vỡ thì cơn ngứa mới chấm dứt. [16, 24]
1.3.1. Vòng đời và đặc tính sinh học của muỗi.
Muỗi thuộc loài biến thái hoàn toàn, vòng đời trải qua 4 giai đoạn: Trứng, ấu
trùng, nhộng, trưởng thành. Mỗi giai đoạn có thể dễ dàng nhận biết bởi những đặc
điểm khác biệt. Toàn bộ thời gian từ trứng đến muỗi trưởng thành, ở điều kiện tốt
nhất là khoảng 7 - 13 ngày. Nhiệt độ môi trường càng cao, vòng đời phát triển của
muỗi càng ngắn, nhưng nếu cao quá 35
0
C thì muỗi không phát triển được. Nhiệt độ
môi trường thích hợp cho muỗi phát triển khoảng 25
0
C - 30
0
C. [24]
1.3.1.1. Giai đoạn trứng
Muỗi đẻ trứng trên mặt nước, trứng của chúng kết lại với nhau thành mảng
trôi nổi trên mặt nước, một mảng có thể bao gồm đến 100 - 300 trứng, giống như

vết váng bẩn trôi nổi trên mặt nước. Một con muỗi cái có thể cứ sau 3 đêm lại đẻ ra
SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 11
 Đồ án Tốt nghiệp
một mảng trứng như vậy trong suốt cuộc đời. Phần lớn trứng muỗi sẽ nở thành ấu
trùng trong vòng 24 - 48 giờ. Ở một số loài như ở loài Aedes và Ochlertatus trứng
có thể chịu được điều kiện khô hạn và chỉ nở khi có nước ngập trở lại hoặc có loài
thì trứng có thể tồn tại được trong điều kiện nhiệt độ dưới 0
0
C trong mùa đông, sau
đó khi ấm áp sẽ nở ra. Nước là điều kiện quan trọng trong đời sống của muỗi. Phần
lớn các loài muỗi thường đẻ trứng trên mặt nước sạch hoặc những nơi chứa nước tù
đọng như: trong bể nước, vại nước, vỏ lon, chậu cảnh, bể tắm, mảnh chậu vỡ, vũng
nước đọng .v.v. Đặc biệt là ở những nơi nước đọng được che khuất ánh sáng và gió.
[24]
Hình 1.3: Muỗi đẻ trứng [24]
1.3.1.2. Giai đoạn ấu trùng
Ấu trùng muỗi thường sống trong nước từ 4 – 14 ngày tùy vào nhiệt độ của
môi trường. Trong quá trình sống phải chạm vào mặt nước để thở. Phần lớn ấu
trùng muỗi treo ngược mình gần mặt nước và có một ống thở thò lên trên mặt nước.
Riêng ấu trùng của loài muỗi Anopheles không có ống thở do đó nó phải nằm song
song với mặt nước. Ở giai đoạn ấu trùng này muỗi cần rất nhiều thức ăn là các loài
vi sinh vật hoặc các chất hữu cơ trong nước như tảo, sinh vật phù du, nấm, vi
khuẩn v.v. Đặc biệt, loài muỗi Toxorhynchites với cơ thể khá lớn lại là thiên địch
của muỗi thông thường vì ấu trùng của nó ăn ấu trùng của các loài muỗi khác.
Trong quá trình phát triển, ấu trùng lột xác 4 lần và lớn dần sau mỗi lần lột xác. Ở
lần thứ nhất, ấu trùng có kích thước khoảng 1,5 mm và ở lần thứ tư nó có kích
SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 12
 Đồ án Tốt nghiệp
thước khoảng 8 - 10mm. Trong lần lột xác thứ tư ấu trùng chuyển sang giai đoạn
nhộng. [24]

Hình 1.4: Ấu trùng muỗi [24]
1.3.1.3. Giai đoạn nhộng
Đây là giai đoạn ngủ nghỉ nhưng nhộng muỗi vẫn di chuyển đồng thời là thời
gian để chuyển đổi cơ thể thành muỗi trưởng thành. Giai đoạn này kéo dài 1 - 4
ngày . Tùy thuộc vào sự thay đổi ánh sáng, bằng một cái búng mình hoặc quẫy đuôi,
nhộng muỗi có thể dịch chuyển xuống đáy nước hoặc khu vực an toàn hơn. Nhộng
muỗi thường có màu sáng hơn so với màu nước. Chúng bám vào mặt nước và sử
dụng 2 ống thở để hô hấp. Khi đã phát triển hoàn chỉnh, muỗi trưởng thành sẽ phá
vỡ bọc nhộng để thoát ra.
Hình 1.5: Nhộng muỗi [24]
1.3.1.4. Giai đoạn trưởng thành
SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 13
 Đồ án Tốt nghiệp
Khi vừa mới thoát ra khỏi bọc nhộng, cơ thể trưởng thành còn yếu ớt, chúng
phải lưu lại trên mặt nước một thời gian ngắn để cơ thể cứng cáp, cánh mở hẳn ra
và đủ khô rồi mới bay đi.một vài ngày sau khi vũ hóa nhu cầu hút máu làm thức ăn
và giao phối chưa xuất hiện. Muỗi trưởng thành của những loài như Aedes và
Ochlerotatus có khả năng bay xa khỏi nơi sinh ra đến cả chục cây số. Tuy nhiên
phần lớn chúng thích lẩn quẩn trong khu vực nhà ở của người, gia súc hoặc nơi cư
trú quen thuộc, chỉ khi nào thời tiết thuận lợi và nhu cầu tìm nguồn nước để đẻ
trứng chúng mới di chuyển xa.
Hình 1.6: Quá trình vũ hóa của muỗi [24]
Hình 1.7: Các giai đoạn ấu trùng muỗi [16]
SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 14
 Đồ án Tốt nghiệp
1.3.2. Tác hại của muỗi
Muỗi là tác nhân lây truyền những căn bệnh nguy hiểm. Muỗi Anopheles
mang ký sinh trùng sốt rét. Một số loài muỗi có khả năng là vật trung gian truyền
bệnh giữa người với người, hay giữa động vật và người. Các bệnh do muỗi truyền
có thể gây tử vong cao chủ yếu là sốt xuất huyết, sốt rét, sốt vàng da,

Trên thế giới, bệnh sốt rét hiện dẫn đầu trong số ca tử vong, nhất là đối với trẻ
em dưới 5 tuổi, với khoảng 5,3 triệu trẻ em chết mỗi năm. Muỗi gây ra bệnh sốt rét
có tên Khoa học là Anopheles. Ở Việt Nam có 3 loại muỗi truyền sốt rét là
Anopheles dirut, Anopheles sundaiais và Anopheles. Chúng thường trú đậu trên
tường, mái, vách, gầm, gập, vật treo, hốc cây, hố đất, lùn bụi Chúng thường chích
đốt máu người suốt đêm, đỉnh cao là từ 8 giờ tối đến 3 giờ sáng.
Hầu hết các loài muỗi đều mang ký sinh trùng giun chỉ, loại ký sinh trùng gây
nên biến dạng trên cơ thể phổ biến là bệnh chân voi thông qua việc gây sưng phồng
lớn một vài bộ phận trên cơ thể. Trên thế giới có khoảng 40 triệu người đang sống
tàn phế do ký sinh trùng giun chỉ gây ra. Các bệnh do virút gây ra như sốt vàng da
và dịch hạch được lan truyền chủ yếu bởi loài muỗi vằn có tên khoa học là Aedes
aegypti.
Ở Việt Nam, vào mùa hè và mùa mưa hàng năm, sự phát triển của muỗi
thường xuyên diệt trừ muỗi gây nên các dịch bệnh gây tử vong ở nhiều người.
Theo nhận định của Tổ chức Y tế Thế giới ( World Health Organization –
WHO), trong 5 – 8 năm tới tất cả các loại bệnh này đều chưa có vắcxin phòng ngừa.
[23, 24]
1.3.3. Các biện pháp phòng và diệt trừ muỗi
Để tiêu diệt và khống chế muỗi có hiệu quả cần nghiên cứu kỹ địa bàn tập
trung và chọn lựa giai đoạn phát triển dễ tác động. Một số biện pháp phòng trừ tổng
hợp đối với loài muỗi như sau:
- Khống chế trứng và bọ gậy: San lấp các hố nước đọng, khai thông cống rãnh,
đổ hết nước đọng tại các dụng cụ tồn lưu nước như chum, vại, làm mất nơi cư trú
của bọ gậy và nơi sinh sản của muỗi trưởng thành. Dọn dẹp, phát quang bụi cây, thu
SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 15
 Đồ án Tốt nghiệp
dọn rác thải xung quanh khu vực cần xử lý. Dọn dẹp đồ đạc gọn gàng làm mất môi
trường sinh sống của muỗi trưởng thành.
- Phun hoá chất định kỳ để diệt côn trùng và các vectơ truyền bệnh, thời gian
phun tốt nhất là vào đầu và cuối mùa mưa. Các diện tích cần phun bao gồm: Tường,

các khoảnh sân, khoảng trống, các tường phía ngoài bao quanh diện tích cần xử lý,
các rèm cửa, quần áo nơi muỗi có thể trú ngụ; các nắp cống rãnh nơi trú ẩn của bọ
gậy. Phun với độ cao 2m trở xuống.
- Đốt hương muỗi: Được sử dụng nhiều do giá thành rẻ và không tốn năng
lượng nhưng có nhược điểm là gây mùi khó chịu đối với một số người đặc biệt là
trẻ em.
- Dùng đèn bẫy và vợt bắt muỗi: Đèn bẫy muỗi được bao quanh bởi lưới kim
loại có hiệu điện thế thấp với một đèn phát ánh sáng hấp dẫn muỗi và côn trùng tụ
tập đến. Khi muỗi và côn trùng sa vào lưới, dòng điện nhỏ sẽ phóng qua và tiêu diệt
chúng. Phương pháp này sử dụng được cả trong nhà và ngoài trời. [24]
Những phương pháp phòng và diệt trừ muỗi trên đây đã và đang mang lại
những hiệu quả nhất định. Tuy nhiên, còn tồn tại nhiều nhược điểm như cần phải
thực hiện định kỳ, tốn thời gian, công sức, hóa chất, dụng cụ Do vậy, việc sử dụng
chế phẩm sinh học từ vi khuẩn Bacillus thuringensis var. israelensis đang là lựa
chọn hàng đầu của nhiều nước trên thế giới bởi những ưu điểm vượt trội của nó. Tại
Việt Nam chế phẩm này đã được sản xuất và thử nghiệm thành công. Tuy nhiên, giá
thành còn khá cao. Việc nghiên cứu thành công môi trường là nước thải thủy sản có
thể thay thế môi trường ban đầu để nuôi chủng vi khuẩn này sẽ giúp giảm đáng kể
giá thành của sản phẩm.
1.4. Thành phần nước thải thủy sản Surimi
Thuật ngữ Surimi của Nhật bản là cách nói thông dụng để gọi tắt tên của các
sản phẩm làm từ thịt cá xay nhuyễn. Surimi còn được gọi là chả cá, là một loại
protein trung tính, được chế biến qua nhiều công đoạn rửa, nghiền và định hình cấu
trúc. Các protein đã làm sạch phối trộn với các chất phụ gia và sau đó đem đi cấp
đông, nó sẽ hình thành gieo cứng và đàn hồi. Tính tạo gel, tính giữ nước và tạo nhũ
tương tạo nên cấu trúc để làm nguyên liệu cho việc sản xuất Kamaboko, Chikuwa
của Nhật hay mô phỏng các loại hải sản khác như tôm, cua, sò rất được ưa thích
SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 16
 Đồ án Tốt nghiệp
trên thế giới. Các sản phẩm có tên gọi Surimi có những đặc tính rất nổi bật như là

không có mùi tanh và độ kết dính cao. Nguồn nguyên liệu để sản xuất Surimi rất đa
dạng và phong phú nhưng để cho ra sản phẩm có chất lượng cao, màu sắc và độ bền
của gel Surimi đảm bảo thì thường là các loại cá kích thước nhỏ, giá trị kinh tế thấp,
có lượng thịt trắng nhiều, mỡ ít và khai thác được quanh năm khi đó viêc sản xuất
Surimi có ý nghĩa kinh tế cao hơn. Ở nước ta thường sử dụng các loại cá sản xuất
Surimi như: cá rô phi, cá phèn, cá mối, cá chuồn, …[31]
Quy trình sản xuất Surimi bao gồm nhiều công đoạn như: làm sạch cá, phile,
xay, lọc, ép tách nước, phối trộn…Người ta ước tính để sản xuất được 1kg thành
phẩm sẽ phải thải ra 30 lít nước thải và mức độ nhiễm bẩn của nước thải từ các nhà
máy sản xuất Surimi là rất lớn [31]. Nếu như lượng nước thải ra này không được xử
lý triệt để thì khi thải ra ngoài sẽ gây ra mức độ ô nhiễm môi trường nghiêm trọng
làm ảnh hưởng tới sự phát triển lâu dài của nhà máy và chất lượng sống của người
dân khi môi trường sống bị tác động. [3]
Bảng 1.3: Tính chất nước thải thủy sản Surimi [3]
STT Thông số
Đơn
vị
Giá trị
1 pH - 6.2 - 7.3
2 COD
cr
mg/l 1800 - 4000
3 BOD
5
mg/l 1400 - 3550
4 NH
4
+
mg/l 165 - 238
5 PO

4
3-
mg/l 47 - 95
6 SS mg/l 980 - 1300
Xử lý nước thải thủy sản nói chung và nước thải Surimi nói riêng bằng
phương pháp sinh học đã được ứng dụng nhiều và mang lại hiệu quả cao. Tuy
nhiên, việc sử dụng nước thải để nuôi cấy vi sinh vật trong việc sản xuất các chế
phẩm sinh học, kết hợp xử lý được nguồn nước thải góp phần giảm chi phí xử lý
đang được các nhà sinh học quan tâm và đầu tư nghiên cứu.
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 17
 Đồ án Tốt nghiệp
2.1. Vật liệu
- Chủng vi khuẩn Bacillus thuringensis var. israelensis do phòng thí nghiệm
thuộc Bộ môn công nghệ sinh học trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng cung cấp.
- Nước thải từ nhà máy sản xuất Surimi của công ty Bắc Đẩu có địa chỉ tại
Thọ Quang - Đà Nẵng. Thời gian lấy nước thải từ tháng 11/2013 tới tháng 5/2014.
Nước thải sau khi thu nhận tại nhà máy được lưu trong tủ lạnh 4
0
C nếu chưa được
sử dụng. Thời gian lưu không quá 2 tuần.
- Ấu trùng muỗi: Được mua tại tiệm bán cá cảnh có địa chỉ tại 132 Trưng Nữ
Vương - Đà Nẵng. Vì ấu trùng muỗi có 4 giai đoạn phát triển, nên cần sử dụng ấu
trùng giai đoạn 1 - 2 (chiều dài từ 1,5 - 5 mm) để thời gian chuyển hóa thành nhộng
và muỗi không ảnh hưởng kết quả khảo sát. Do vậy, sau khi mua về cần thực hiện
quá trình chọn lựa.
Hình 2.1: Ấu trùng muỗi thích hợp
- Hóa chất và môi trường
+ Môi trường nuôi cấy Glucose-men-muối (GYS): 0,1% Glucose; 0,2% chiết
nấm men; 0,05% K

2
HPO
4
; 0,2% (NH
4
)
2
SO
4
; 0,002% MgSO
4
; 0,005% MnSO
4
;
0,008% CaCl
2.
[5]
- Thiết bị trong phòng thí nghiệm: Cân phân tích model E1240 – OHAUS – Mỹ, cân
kỹ thuật model ARC 120 OHAU – Mỹ, tủ ấm MEMMERT, box cấy vô trùng, máy
lắc khô, máy đo pH, máy đo mật độ quang, … và các dụng cụ thí nghiệm cần thiết
trong phòng thí nghiệm.
SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 18
 Đồ án Tốt nghiệp
2.2. Phương pháp
2.2.1. Hoạt hóa, cấy chuyền và nhân giống chủng vi khuẩn Bacillus
thuringensis var. israelensis
2.2.1.1. Hoạt hóa
Hình 2.2: Sơ đồ quy trình thực hiện
Nhân giống cấp 1, 2
Thu sinh khối

Hoạt hóa
Giống gốc
Môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy
- Môi trường nuôi cấy Glucose – Men - Muối (GYS): 0,1% Glucose; 0,2%
Chiết nấm men; 0,05% K
2
HPO
4
; 0,2% (NH
4
)
2
SO
4
; 0,002% MgSO
4
; 0,005% MnSO
4
;
0,008% CaCl
2.

Cho môi trường GYS lỏng vào ống nghiệm (môi trường chiếm khoảng
1 4
ống nghiệm), sau đó nút bông, hấp khử trùng ở 121
o
C, 1 atm, 2 giờ. Nếu chưa dùng
SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 19
 Đồ án Tốt nghiệp

ngay có thể được bảo quản ở 2 - 8
0
C. Tiến hành cấy giống và nuôi trong máy lắc
150vòng/phút, nhiệt độ 30
0
C, thời gian 24 – 48 giờ. [15, 29]
 Cấy giống
Mẫu ban đầu ở dạng rắn phải đưa về dạng lỏng bằng cách:
+ Cho 1 ít mẫu chế phẩm có chứa bào tử vi khuẩn vào ống Eppendorf đã chứa
sẵn môi trường GYS và trộn đều mẫu trên máy voltex. Sau đó cho toàn bộ hỗn hợp
vào ống nghiệm chứa môi trường hoạt hóa.
Hình 2.3: Sơ đồ qui trình nhân giống và cấy chuyền
Để nguội 45
0
C
±1
0
C (sử dụng ngay)
Cấy giống (theo từng nồng độ pha loãng)
Đĩa petri
Trải đều, để yên
< 30 phút
Khử trùng
Môi trường (GYS) + agar

Bình Erlenmeyer 250ml
121°C, 2 giờ
Bảo quản ở 2-8
0
C trong 30 ngày

Nút bông
Lật úp đĩa, ủ ấm 30
0
C, 24 - 48 giờ
Chọn khuẩn lạc tốt
Ống nghiệm thạch nghiêng
Ủ ấm 30
0
C, 24 - 48 giờ
Bảo quản 4 - 5
0
C
Tăng sinh khối
2.2.1.2. Cấy chuyền và nhân giống chủng vi khuẩn Bacillus thuringensis.
israelensis
SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 20
 Đồ án Tốt nghiệp
 Chọn khuẩn lạc tốt nhất để nhân giống
SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 21
 Đồ án Tốt nghiệp
Để chọn được khuẩn lạc tốt cần tiến hành cấy vi khuẩn ở các nồng độ pha loãng
khác nhau để thu được khuẩn lạc đơn. Thu nhận khuẩn lạc đơn có một số đặc điểm
nổi bật như: Khuẩn lạc xuất hiện sớm, màu sắc trên khuẩn lạc đồng đều, …
 Chuẩn bị môi trường pha loãng
Nước cất được đậy bằng nút bông không thấm nước, có giấy bọc, hấp khử
trùng ở nhiệt độ 121
o
C , 1at, 20 phút, sau đó để nguội. Lấy 1ml dịch giống cho vào
ống nghiệm chứa 9ml nước cất được độ pha loãng 10
1

. Lấy 1ml từ độ pha loãng 10
1
cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất được độ pha loãng 10
2
. Cứ tiếp tục như vậy
cho đến khi đạt được độ pha loãng cần thiết. [1]
 Cấy giống
Đối với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 nồng độ pha loãng liên
tiếp, mỗi nồng độ dùng 1 đĩa pêtri vô trùng.
Môi trường đã đun nóng chảy, để nguội đến 45
o
C ± 1
o
C. Rót vào từng đĩa 2ml
đến 15ml môi trường thạch. Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng mát,
nằm ngang, để gần đèn cồn để tránh các đĩa thạch bị nhiễm.
Dùng pipetman và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 0,1 ml dịch chứa
giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường thạch trong đĩa pêtri.
Nhúng đầu thanh gạt (que trải) thuỷ tinh vào cồn 70
0
, hơ qua ngọn lửa để khử
trùng 3 lần. Để đầu thanh gạt nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa.
SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 22
Hình 2.4: Pha loãng mẫu lỏng theo dãy thập phân [26]
 Đồ án Tốt nghiệp
Mở đĩa pêtri, đặt nhẹ nhàng thanh gạt lên bề mặt thạch của đĩa pêtri.
Dùng đầu thanh gạt xoay, trải đều dịch giống lên bề mặt thạch. Trong khi trải,
thực hiện xoay đĩa một vài lần, mỗi lần khoảng 1/2 chu vi đĩa tạo điều kiện cho
thanh gạt trải dịch giống đều khắp bề mặt môi trường.
Rút thanh gạt khỏi đĩa, đậy đĩa, gói và ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp

trong tủ ấm.
Thời gian bắt đầu pha loãng đến khi rót môi trường vào đĩa không được quá
30 phút. Sau đó, lật úp đĩa và cho vào tủ ấm 30
0
C, 24 - 48 giờ.
 Ủ ấm
Khi thạch đông, lật úp đĩa, cho vào tủ ấm 30
0
C trong thời gian từ 24 - 48 giờ.
 Làm thạch nghiêng, đổ thạch vào đĩa pêtri
+ Đổ thạch vào đĩa pêtri
Môi trường sau khi tiệt trùng được đổ từ bình đựng vào từng đĩa. Toàn bộ quy
trình đổ thạch vào đĩa pêtri đều thực hiện trong tủ cấy vô trùng.
+ Làm thạch nghiêng: Cần tiến hành ngay sau khi khử trùng môi trường vừa
kết thúc và môi trường chưa đông đặc.
Hình 2.5: Một số dạng môi trường trong ống nghiệm và đĩa pêtri
 Phương pháp cấy trên thạch nghiêng
- Sử dụng que cấy đầu tròn tiến hành các thao tác theo đúng trình tự nói trên
- Thực hiện việc cấy giống vào ống thạch nghiêng bằng các thao tác:
SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 23
 Đồ án Tốt nghiệp
+ Hoà giống ở đầu que cấy vào giọt nước ở đáy ống nghiệm.
+ Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo đường thẳng .[15, 21]
 Tăng sinh khối
- Cấy truyền từ ống nghiệm này sang ống nghiệm khác
- Dán nhãn ghi: Tên giống vi sinh vật, ngày cấy lên thành ống nghiệm.
- Cấy truyền bằng que cấy
+ Cầm que cấy thẳng đứng, đốt đầu que cấy trên ngọn lửa đèn cồn, đưa ngang
phần kim loại trên đèn vài lần để có que cấy đã vô trùng.
+ Lấy một vòng que cấy đầu tròn vi khuẩn từ đĩa thạch trong điều kiện vô

trùng.
+ Khi đầu que cấy chạm vào môi trường thì lắc khẽ que cấy cho vi khuẩn tan
trong môi trường.
+ Khử trùng que cấy bằng cách đốt trên ngọn lửa đèn cồn.
- Sau khi cấy truyền xong đặt môi trường vào tủ ấm ở nhiệt độ 30
0
C, thời gian
24 – 48 giờ.
 Bảo quản và kiểm tra môi trường
+ Môi trường chưa dùng cần được bảo quản ở chỗ mát, hạn chế ánh sáng,
nhiệt độ từ 2-8
0
C và không để môi trường bị khô. [1, 25]
2.2.2. Phương pháp đếm khuẩn lạc
 Mục đích
Xác định mật độ tế bào của lượng giống đưa vào khảo sát và mật độ bào tử
chủng vi khuẩn Bacillus thuringensis var. israelensis sau khi nuôi trên môi trường
nước thải Surimi.
Phương pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn
sống hiện diện trong mẫu. Tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia tạo thành
khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc. Do vậy phương pháp này có tên gọi là phương
pháp đếm khuẩn lạc hay đếm đĩa.
 Tiến hành
Phương pháp này cần thực hiện 3 bước kỹ thuật cơ bản.
SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 24
 Đồ án Tốt nghiệp
Bước 1: Mẫu tế bào cần đo tiến hành pha loãng mẫu theo dãy thập phân 10
-5
;
10

-6
; 10
-7
; 10
-8
. Hút 0,1 ml tương ứng ở mỗi độ pha loãng vào mỗi đĩa (tiến hành lặp
lại 3 lần ở mỗi độ pha loãng). Các đĩa đã được đổ môi trường dinh dưỡng GYS
Agar. Môi trường đã được khử trùng 121
0
C, 1at, thời gian 20 giờ và chuẩn bị trước
2 ngày để khô bề mặt và kiểm tra sự vô trùng.
Bước 2: Đem ủ ở 30
0
C, 24 giờ
Bước 3: Chọn đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 30 - 300 khuẩn lạc/đĩa, đánh
dấu đếm, lấy giá trị trung bình của 3 đĩa ở mỗi độ pha loãng.
Bước 4: Tính kết quả M
1
( tế bào/ml) =
1 1
A
V
D
×

Trong đó:
1
A
: Số khuẩn lạc trung bình/đĩa

1
D
: Độ pha loãng cuối cho khuẩn lạc đơn

V
: Dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml) [1, 26]
2.2.3. Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ hấp thụ (OD) và mật độ
tế bào (tế bào/ml)
 Mục đích
Chỉ cần đo giá trị OD có thể suy ra mật độ tế bào mà không cần sử dụng
phương pháp cấy trải nên tiết kiệm được thời gian, công sức, hóa chất, …
 Tiến hành
+ Định lượng số lượng tế bào vi khuẩn ban đầu trong dịch nuôi cấy tăng sinh
sau 24 giờ bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.
+ Lấy 10ml dịch lên men sau 24 giờ đem ly tâm 4000 vòng/ phút, thời gian 15
phút. Bỏ dịch lên men thu sinh khối.
+ Rửa sinh khối bằng nước muối sinh lý.
+ Hút nước muối sinh lý vào sinh khối cho đủ 10ml
SVTH: Hoàng Thị Thủy_Lớp: 09SH Trang: 25