Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm coliforms và e. coli

TIÊU CHUẨN HIỆN HÀNH ĐỂ
KIỂM NGHIỆM COLIFORMS VÀ E.COLI
I. TỔNG QUAN VỀ COLIFORMS VÀ E.COLI
1. Coliforms
Coliformsđược xem là những visinh vật chỉ thị an toàn vệ sinh, bởi vì số lượng của
chúng hiện diện trong mẫu chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh
khác trong thực phẩm. Các nhà nghiên cứu cho rằng số lượng Coliform trong thực phẩm
càng cao thì khả năng hiện diện các vi sinh vật gây bệnh khác cũng rất lớn. Tuy vậy mối
liên hệ giữa số lượng vi sinh vật chỉ thị và vi sinh vật gây bệnh còn đang được tranh cãi
về cơ sở khoa học, cho đến nay mối liên hệ này vẫn không được sự thống nhất trong các
hội đồng khoa học.
Coliforms thuộc họ Enterobacteriaceae, hình que, là nhóm những trực khuẩn
đường ruột gram âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi, có khả năng sinh
acid, sinh hơi do lên men lactose ở 37
0
C trong vòng 24 giờ, không sinh bào tử, chứa β-
galactosidase.
Coliforms phát triển tốt trên nhiều loại môi trường, nhiều loại thực phẩm.Có những
nghiên cứu cho thấy chúng có thể phát triển ở nhiệt độ thấp đến -2
o
C và cao đến
50
0
C.Trong thực phẩm chúng phát triển yếu và rất chậm ở 5
0
C tuy cũng có tài liệu ghi
nhận sự phát triển của chúng ở 3 – 6
0
C.
Ngưỡng pH để Coliforms có thể phát triển là 4,4 – 9 E.coli có thể phát triển trên
môi trường tối thiểu chỉ chứa một nguồn carbon hữu cơ duy nhất (chẳng hạn glucose) và

một nguồn nitơ duy nhất như (NH
4
)
2
SO
4
cùng vài loại khoáng khác.
Chúng phát triển tốt trên môi trường thạch thường, cho những khuẩn lạc thấy được
sau 12 – 16 giờ ở 37
0
C, phát triển tốt ở rất nhiều loại thực phẩm trong điều kiện thích hợp.
Nhóm Coliforms gồm 4 giống đó là Escherichia với một loài duy nhất là E .coli,
Citrobacter, Klebsiella, Enterobacte (gồm 2 loài E. aerobacter và E. cloacae).
- Các giống có nguồn gốc từ phân (như Escherichia) phát triển nhanh, khoảng 16
giờ, trong 8 môi trường dinh dưỡng ở 44
0
C, không mọc ở 4
0
C trong 30 ngày. Là loại vi
khuẩn ưa nhiệt, nhiệt độ thích hợp nhất là 41
0
C.
- Các giống không có nguồn gốc từ phân (như Citrobacter, Klebsiella,
Enterobacte), chúng có nguồn gốc thuỷ sinh hay từ đất, mọc nhanh ở 4
o
C trong 3 – 4
ngày và 10
o
C trong 1 ngày. Không mọc ở 41
o

C, ở 44
o
C ức chế hoàn toàn sự phát triển của
tất cả các Coliforms không có nguồn gốc từ phân.
Coliforms chịu nhiệt là những coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi
trong khoảng 24 giờ khi được ủ ở 44
o
C trong môi trường canh EC. Coliforms phân
(Faecal Coliforms hay E. coli giả định) là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indole
khi được ủ khoảng 24 giờ ở 44,5
o
C trong canh Trypton. Coliforms phân là một thành
phần của hệ vi sinh vật đường ruột ở người và các động vật máu nóng khác và được sử
dụng để chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển, thực
phẩm, nước uống cũng như để chỉ thị sự ô nhiễm phân trong mẫu môi trường. Trên thực
tế kiểm nghiệm Coliforms phân được quan tâm nhiều hơn, đặc biệt là E. coli là loài được
quan tâm nhiều nhất về vệ sinh an toàn thực phẩm.
2. Escherichia coli
Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli)
thuộc:
Lớp: Schgzomycetes
Bộ: Eubacteriales
Họ: Enterobacteriaceae
Giống: Escherichia
Loài: Escherichia coli
E. coli là một phân nhóm của nhóm coliforms phân cho kết quả thử nghiệm IMViC
là ++
Escherichia coli còn có tên là Bacteriam coli Commue được ông Escherich phát
hiện năm 1885 trong trường hợp tiêu chảy ở trẻ em.
Theo P. J. Quinn và cs (1994), E. coli có nhiều trong ruột của động vật ăn thịt, ăn

tạp hơn là động vật ăn cỏ, sống vài tuần đến vài tháng trong bụi, phân, nước, ngoài tự
nhiên. Hầu hết chúng không gây hại cho người và động vật, giúp ổn định sinh lý đường
ruột. Tuy nhiên cho đến nay đã phát hiện được 5 dòng có khả năng gây hại cho người và
động vật là:
- EAEC (Enteroaggregative E. coli), E. coli kết tập ở ruột.
- EHEC (Enterohemorrhagic E. coli), E. coli gây xuất huyết ở ruột.
- EPEC (Enteropathogenic E. coli), E. coli gây bệnh đường ruột.
- ETEC (Enterotoxigenic E. coli), E. coli sinh độc tố ruột.
- EIEC (Enteroinvasive E. coli), E. coli xâm lấn niêm mạc ruột.
Tính chất vi sinh học
E. coli là trực khuẩn hình gậy ngắn, gram âm bắt màu hồng, kích thước dài hay
ngắn tuỳ thuộc vào môi trường nuôi cấy trung bình 2 – 3µm x 0,5µm, hai đầu tròn, có
lông quanh tế bào, đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn, di động không hình thành
nha bào. Trong bệnh phẩm có khi bắt màu lưỡng cực hai đầu.
Đặc điểm nuôi cấy
E. coli là vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí tuỳ nghi, nhiệt độ phát triển thích hợp là
37
o
C, pH = 7,4. Mọc tốt trên môi trường dinh dưỡng thông thường chịu được nhiệt độ
biến thiên từ 4 – 45
0
C.
- Môi trường thạch dinh dưỡng tạo khuẩn lạc tròn ướt, màu trắng đục hơi lồi để lâu
có dạng khô rìa hơi nhăn.
- Trên thạch máu có chủng dung huyết α hoặc β.
- Trên thạch gelatin không tan chảy.
- Môi trường canh dinh dưỡng: làm đục đều môi trường, sau lắng xuống đáy, có
màu tro nhạt đôi khi có màu xám, có mùi trứng thối.
- Trên môi trường chuyên biệt.
- Môi trưòng Eosin mythylen blue (EMB) tạo khuẩn lạc tím ánh kim.

- Môi trường MacConkey (MCK) tạo khóm đỏ hồng.
- Môi trường Kligler iron agar (KIA) lên men đường glucose và lactose (vàng /
vàng), sinh gas, không sinh H
2
S.
- Môi trường Brilliant green agar (BGA) tạo khuẩn lạc xanh lá mạ.
Đặc tính sinh hoá
E. coli lên men sinh hơi đường glucose, manitol, lactose, galactose nhưng không
sinh hơi đường maltose, arabinose.E. coli không lên men dextrin, glycogen, inositol,
salisin, ít khi lên men inulin, pectin.
E. coli không sinh H
2
S, không tan chảy gellatin, không phân hủy đạm, hoàn
nguyên Nitrate thành Nitrite.
Để phân biệt E. coli với vi khuẩn đường ruột khác, người ta thường sử dụng thử
nghiệm IMViC. E. coli cho kết quả IMViC là: + + - - hay - + - - .
Sức đề kháng
E. coli bị diệt ở 55
o
C trong 1 giờ, 60
o
C trong 15 - 30 phút, các chất sát trùng như
acid phenic, formol có thể bị diệt trong 5 phút. Đề kháng với sự sấy khô, 95% E. coli bị
diệt ở nhiệt độ đông lạnh trong 2 giờ.
Kháng nguyên
Vi khuẩn đường ruột E. coli có cấu trúc kháng nguyên phức tạp. Dựa vào tính chất
kháng nguyên, người ta phân chia các vi khuẩn cùng loại thành các tuýp huyết thanh
(serotype) khác nhau.
Kháng nguyên O (somatic antigen) là kháng nguyên chịu nhiệt, không bị hủy khi
đun nóng 100

o
C trong 2 giờ, kháng cồn không bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%, bị hủy
bởi formol 5%, rất độc chỉ cần 0,05mg đủ để giết chuột nhắt sau 24 giờ. Được phân bố
trong vách tế bào, bao gồm hỗn hợp lipid–polysaccharid–protein.Lipid xác định độc tính
colitoxin, polysaccharid xác định tính đặc thù của huyết thanh và protein mang tính kháng
nguyên. Kháng nguyên O được chia làm 4 nhóm chính: OI , OII, OIII, OIV, với trên 150
loại khác nhau, nó bám vào nhung mao ruột làm giảm sự hấp thụ.
Kháng nguyên K (capsalar antigen) có bản chất là polysaccharid hay protein, chịu
nhiệt kém (dễ bị phá huỷ ở 100
0
C trong 1 giờ). Có hơn 100 loại khác nhau và nằm ngoài
kháng nguyên O. Nếu kháng nguyên K che phủ hoàn toàn thân vi khuẩn thì sẽ ngăn cản
phản ứng ngưng kết O. Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen) giúp E. coli bám vào
tế bào biểu mô trước khi xâm lấn đường tiêu hóa hay đường tiết niệu.
Kháng nguyên H (flagellar antigen) có trên 50 loại khác nhau, cấu tạo bởi protein
và có tính chất không chịu nhiệt, bị hủy bởi cồn 50% và các proteinase, không bị hủy bởi
formol 5%. Khi kháng nguyên H gặp kháng thể tương ứng sẽ xảy ra hiện tượng ngưng kết
H.
Kháng nguyên F (fimbrial antigen) có dạng hình sợi, dài khoảng 4 m, thẳng hay
xoắn, đường kính 2,1 – 7nm, giúp vi khuẩn bám vào tế bào niêm mạc ruột nên rất quan
trọng trong khả năng gây bệnh của vi khuẩn.
Hiện nay có hơn 700 tuýp huyết thanh của E. coli từ sự tổ hợp các nhóm kháng
nguyên O, H, K, F. Dựa vào đó, ngƣời ta có thể định danh vi khuẩn.
Độc
tố
E.
coli sinh
ra các
độc tố sau
Nội

độc tố:
gồm 2 loại
Enterotoxin LT: không bền với nhiệt độ, trọng lượng phân tử 91,5 KDa, chia làm 2
phần LTa và LTb, mang tính kháng nguyên. LT gây hoạt hoá adennylcylase trong tế bào
biểu mô ruột, làm tăng lượng AMP vòng do đó kích thích bài tiết CT và Bicarbonate, ức
chế tái hấp thụ Na
+
, hậu quả cuối cùng là tiêu chảy mất nước.
Enterotoxin ST: bền với nhiệt gồm STa và STb không có tính kháng nguyên. ST
hoạt hoá fuanylcylase làm tăng GMP vòng dẫn đến kích thích bài tiết nước muối gây tiêu
chảy.
Ngoại độc tố: trọng lượng phân tử 70 KDa, mang tính kháng nguyên.
Tình hình nhiễm
Các ổ dịch trên gia súc và người gây ra bởi các kiểu huyết thanh O157:H7, đã được
phát hiện lần đầu tiên ở Mỹ vào năm 1982. Sau đó được ghi nhận ở một số nơi như: Bắc
Mỹ, Châu Âu, Nam Phi, Nam Mỹ, Nhật, Úc…Đặc biệt là ở Nhật vào năm 12 1996 làm 10
ca tử vong và hơn 8000 ca bệnh.
Ở các nước phát triển, có thể do sự hạn chế về trang thiết bị kỹ thuật trong chẩn
đoán nên người ta chưa điều tra xác định được tầm quan trọng của bệnh. Các vụ dịch lớn
làm một số người chết do ăn bánh mì kẹp thịt nấu chưa chín, do uống sữa chưa được khử
trùng, có khi do uống rượu táo được chế biến từ táo bị nhiễm phân bò. Ở Châu Âu và Bắc
Mỹ dịch thường xảy ra vào mùa hè, có thể do nhiều yếu tố như sự gia tăng tiêu thụ nước,
sự nhiễm khuẩn cao hơn trong thịt bò.
Đặc điểm gây bệnh
Chúng tiết ra các độc tố tế bào (cytotoxin), các dòng vi khuẩn này có một plasmid
có thể giúp chúng bám dính vào màng nhày của ruột, gây tiêu chảy không có máu hoặc có
máu và các hội chứng khác ở người.
Cơ chế gây bệnh
Cơ chế gây bệnh đường ruột của vi khuẩn E. coli cũng có một số điểm giống vi
khuẩn Salmonella và họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae). Để gây bệnh trước hết

vi khuẩn phải bám dính vào tế bào nhung mao ruột bằng các nhân tố xâm nhập, vi khuẩn
bám dính vào lớp tế bào biểu mô của thành ruột. Ở đây, chúng phát triển và nhân lên làm
phá huỷ các lớp tế bào biểu mô gây viêm ruột. Đồng thời sản sinh độc tố đường ruột
enterotoxin gồm yếu tố chịu nhiệt (ST) làm tăng tính thẩm xuất của tế bào thành ruột và
phá huỷ tế bào, yếu tố không chịu nhiệt (LT) sẽ tác động vào quá trình trao đổi muối,
nước làm rối loạn chu trình này. Nước từ cơ thể chảy vào ống ruột làm căng ruột, cùng
với khí do lên men ở ruột gây nên một tác động cơ học làm nhu động ruột đẩy nước và
thức ăn gây nên hiện tượng tiêu chảy. Sau khi đã phát triển ở thành ruột, chúng vào hệ
bạch huyết, đến hệ tuần hoàn gây nhiễm trùng máu, chúng chống lại hiện tượng thực bào,
gây dung huyết làm cho cơ thể thiếu máu. Từ hệ thống tuần hoàn chúng theo các vi quản
đến các tổ chức, cơ quan, ở đây chúng lại phát triển nhân lên lần thứ hai. Chúng phá huỷ
tế bào tổ chức gây viêm và sản sinh ra độc tố toxogenic và verotoxin phá huỷ tế bào tổ
chức gây tụ huyết và xuất huyết.
Triệu chứng trúng độc
E. coli là vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy phổ biến nhất, đặc biệt là ở trẻ em. Đường
lây nhiễm chủ yếu là qua đường tiêu hoá do sử dụng nguồn nước và ăn phải thức ăn bị ô
nhiễm có chứa lượng lớn vi khuẩn E. coli.13 Sau khi sử dụng thực phẩm bị nhiễm E. coli
thì trong vòng 4 – 48 giờ sẽ có các triệu chứng như đau bụng, đi ngoài phân lỏng từ 5 –
15 lần/ngày có lẫn máu trong phân, đôi khi có buồn nôn. Nếu không được cấp cứu, xử trí
kịp thời sẽ bị mất nước, điện giải, rối loạn thân nhiệt, hạ huyết áp và có thể tử vong.
Phòng ngừa
E. coli gây bệnh theo phân ra ngoài và phát tán trong đất, nước, không khí. Ngoài
ra, bệnh có thể lây truyền từ người sang người do tay bẩn, thực phẩm và nước uống bị
nhiễm. Do đó, bệnh có thể gây thành dịch, đặc biệt ở nhà trẻ, khoa nhi của bệnh viện và
người già.
Vì vậy phòng bệnh chủ yếu là tuân thủ nghiêm ngặt qui chế vệ sinh, chú ý xử lý
phân và dụng cụ của bệnh nhân. Không nên ăn những loại thực phẩm không đảm bảo chất
lượng, đặc biệt là sản phẩm từ thịt chưa nấu chín. Có thể xác định mật độ E. coli trong
nước để xem nước có nhiễm bẩn hay không.
II. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG

1. Định tính
a. Nguyên tắc:
 E. coli lên men sinh hơi đường glucose, manitol, lactose, galactose nhưng
không sinh hơi đường maltose, arabinose. E. coli không lên men dextrin, glycogen,
inositol, salisin, ít khi lên men inulin, pectin.
 Trong môi trường BGBL, khuẩn lạc dẹt, có ánh kim
 E. coli không sinh H
2
S, không tan chảy gellatin, không phân hủy đạm, hoàn
nguyên Nitrate thành Nitrite.
Lấy 1g (1mL) mẫu vào 10mL môi trường BGBL
Ủ ở 44 ± 0.5 oC trong 24-48 giờ
Chọn các ống sinh hơi cấy sang Endo agar
Mẫu không sinh hơi được xem là âm /nh với E.coli
Ủ ở 37 ± 0.5 oC trong 24 giờ
Chọn khuẩn lạc dẹt, có ánh kim, đường kính khoảng 1mm để cấy sang TSA hay BHI
Ủ ở 37 ± 0.5 oC qua đêm
Cấy chuyển vào các môi trường thử nghiệm sinh hóa: Canh trypton, MR-VP, Simmon Citrate, để thuer nghiệm IMViC
Indol (+), MR (+), VP (-), Citratase (-)
Một trong những phản ứng trên sai thì không phải là E.coli
KẾT LUẬN: phát hiện hay không phát hiện E.coli trong 1g (1mL) mẫu
b. Quy trình định tính:
2. Định lượng
a. Phương pháp MPN (Most Probable Number)
Phương pháp MPN (phương pháp có số xác suất cao nhất; số tối khả) còn được gọi
là phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ.
Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm
được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. Thông thường, việc định lượng này được
thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm.
Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm

định trong từng ống nghiệm (thường là các hiện tượng như sinh hơi, đổi màu, đục …), ghi
nhận số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng.
Sử dụng các số liệu này và dựa vào bảng Mac Crady suy ra mật độ vi sinh vật
được trình bày dưới dạng số MPN/100ml hay số MPN/1g mẫu. Độ chính xác của trị số
MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại trong mỗi độ pha loãng.
Cụ thể là xác định số lượng Coliforms trong thực phẩm, nước uống, nước sinh hoạt
hoặc nước thải.
 Nguyên tắc
Số lương E.coli trong mẫu nước, thực phẩm chứa mật độ thấp có thể được xác
định bằng phương pháp MPN ( Most Probable Number). Phương pháp này dựa vào
nguyên tắc mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân (hai nồng độ kế tiếp khác nhau
10 lần); 3 hoặc 5 mẫu có độ pha loãng thập phân liên tiếp được ủ trong ống nghiệm chứa
môi trường thích hợp có ống bẫy khí Durham. Mỗi nồng độ pha loãng được ủ từ 3 đến 5
ống lặp lại. Theo dõi sự sinh hơi và đổi màu để định tính sự hiện diện trong từng ống thử
nghiệm; đây là các ống dương tính. Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính ở
mỗi nồng độ pha loãng và được vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương
ứng hiện diện trong 1g (hoặc 1ml) mẫu ban đầu.
Môi trường và hóa chất :
- Môi trường lỏng Lauryl Sulphate Broth LSB (canh Lauryl Sulphate)
- Môi trường lỏng Brilliant Green Lactose Bile Salt (canh BGBL)
- Môi trường lỏng E.coli (E.coli medium, canh EC)
Các môi trường lỏng trên được chuẩn bị trong các ống nghiệm chứa ống Durham úp
ngược. Sau khi khử trùng, chỉ sử dụng các ống nghiệm không có bọt khí bên trong ống
Durham.
- Môi trường thạch đĩa EMP
- Môi trường rắn Simmon Citrate Agar (thạch Simmon Citrate)
- Canh MR-PV
- Thuốc thử Methyl Read
- Thuốc thử α-napthol.
 Thao tác:

Bước 1: Lấy mẫu và pha loãng mẫu đến 3 nồng độ liên tiếp thích hợp.
Bước 2: Mỗi độ pha loãng hút 3 lần, mỗi lần 1 ml cấy vào 3 ống nghiệm môi
trường Lauryl Sulphate broth (LSB). Hút 3 nồng độ liên tiếp, mỗi nồng độ 3 ống nghiệm.
Bước 3: Ủ ấm từ 35 – 37
0
C, thời gian 24 - 48 giờ.
Bước 4: Ống dương tính là có bọt khí trong ống durham.
Bước 5: Tra bảng Mac Crady – loạt 3 ống nghiệm ở 3 nồng độ liên tiếp.
Bảng MPN/100ml tính theo lượng mẫu là 10 ml, 1ml và 0,1ml tương đương
MPN/ml của mẫu đã pha loãng 10
-1
, 10
-2
và 10
-3
dùng phân tích.
Kết quả tra bảng MPN/ml = kết quả tra bảng x f/10
( f độ pha loãng thấp nhất 10
n
)
Lưu ý: Các ống nghiệm có khả năng hiện diện của coliform là dương tính cả hai
môi trường LSB và BGBL.
 Quy trình phân tích
Tuần tự cấy 1ml dung dịch mẫu đã pha loãng 10
-1
vào 3 ống nghiệm giống nhau, mỗi
ống chứa 10ml canh LSB. Thực hiện tương tự với dịch mẫu đã pha loãng 10
-2
và 10
-3

. Đây
là trường hợp xác định MPN bằng hệ 3 dãy nồng độ và 3 ống nghiệm lặp lại (hệ 3 x 3 hay
9 ống nghiệm). nếu nghi ngờ số lượng vi sinh vật trong mẫu quá cao, phải sử dụng các
mẫu có bậc pha loãng cao hơn. Ủ các ống nghiệm ở 37
0
C trong 48 giờ.Ghi nhận ống có
sinh hơi. Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu từ các ống LSB (+) sang các ống có
chứa canh BGBL và ủ ở 37
0
C ± 1
0
C trong 48 giờ. Ghi nhận số ống cho kết quả (+) (có
sinh hơi) ứng với mỗi độ pha loãng.
Dùng que cấy vòng chuyển một vòng dịch mẫu từ các ống canh LSB (+) sang môi
trường canh EC, ủ ở 44,5 ± 0,2
0
C trong 24 giờ. Đếm số lượng các ống cho kết quả (+)
(sinh hơi) ở mỗi độ pha loãng.
Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ các ông (+) trên môi trường canh EC sang môi
trường thạch đĩa MBN. Ủ các đĩa này ở 37
0
C trong 24 giờ để tìm khuẩn lạc E.coli giả
định (tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim tím). Chọn khuẩn lạc có đường kính lớn hơn 1mm
và cấy vào các môi trường MRVP, Simmon Citrate Agar để thực hiện các thử nghiệm
IMViC. Khuẩn lạc E.coli giả định cho kết quả thử nghiệm IMViC tuần tự là + + - - chính
là E.coli. Ống nghiệm cho kết quả trong môi trường EC và khuẩn lạc E.coli giả định trên
môi trường EMB cho kết quả thử nghiệm IMViC như trên là ống nghiệm có E.coli
(+).Thực hiện tương tự cho tất cả các ông nghiệm cho kết quả (+) trong môi trường EC và
tạo được khuẩn lạc E.coli giả định trên môi trường EMB. Ghi nhận số lượng các ống
nghiệm có E.coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu.

 Cách đọc kết quả
Ở tất cả các trường hợp nêu trên, từ số lượng các ông nghiệm có E.coli (+) ở mỗi độ
pha loãng của mẫu, dùng bảng MPN thích hợp (bảng 3 x 3 tức 9 ống nghiệm) để tính ra
mật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/g hay MPN/ml mẫu ban
đầu chưa pha loãng.
b. Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
 Nguyên tắc
Mẫu đã được đồng nhất hóa được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn
lọc thích hợp chứa lactose.Đếm số khuẩn lạc lên men lactose & sinh acid sau khi ủ ở
37±1oC trong 24-48h., đếm các khuẩn lạc có hình dạng đặc trưng của Coliforms.Khẳng
định khuẩn lạc đã đếm là E.coli bằng các thử nghiệm IMViC.
 Môi trường và hóa chất
- Môi trường canh Tryptone Soya Agar (TSA) và môi trường Violet Red Bile Agar (VRB)
được chuẩn bị vô trùng trong các chai thủy tinh, đun chảy và làm nguội ở nhiệt độ 45
0
C
trong bể điều nhiệt trước khi sử dụng.
- Môi trường canh Escherichia coli broth (EC Broth) được phân phối 10ml trong mỗi ống
nghiệm chứa ống Durham úp ngược, hấp khử trùng để nguội và kiểm tra không có sự
hiện diện của bọt khí trong ống Durham. Các ống EC này được bảo quản ở 2 – 8
0
C.
- Môi trường canh Lactose Tryptone Lautyl Sulphate Broth (LST Broth) được chuẩn bị
tương tự môi trường canh EC.
- Môi trường canh Tryptone Broth được phân phối 5ml vào mỗi ống nghiệm, hấp khử
trùng.
- Môi trường canh MR-VP Broth được phân phối 5ml vào mỗi ống nghiệm, hấp khử trùng,
để nguội và bảo quản ở 2-8
0
C cho đến khi sử dụng.

- Môi trường thạch Simmon Citrate được chuẩn bị dưới dạng các ống thạch nghiêng có
màu xanh lục.
- Thuốc thử Kovac’s.
 Quy trình phân tích
Mẫu được đồng nhất hóa bằng cách đối với mẫu rắn xay nhuyễn mẫu trong điều
kiện vô trùng rồi cân chính xác 10g (hoặc 25g), đối với mẫu lỏng hút 10ml (hoặc 25ml),
bổ sung vào trong bình tam giác chứa 90ml (hay 225ml) nước SPW đã được hấp khử
trùng. Lắc đều trong một thời gian nhất định (ít nhất là 2 phút đối với mẫu rắn). Sau khi
được làm đồng nhất bằng cách trên, dung dịch mẫu thu được có độ pha loãng là 10
-1
so
với ban đầu.
Dịch mẫu đồng nhất được tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân bằng cách chuyển
1ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng. Dung dịch này có độ pha
loãng 10
-2
, sau đó tiếp tục chuyển 1ml dịch mẫu này vào ống nghiệm thứ hai chứa 9ml
dung dịch pha loăng ta sẽ thu được dịch mẫu có độ pha loãng 10
-3
. Tiếp tục thực hiện để
được các độ pha loãng thập phân tiếp theo sao cho chứa <100 tế bào E.coli trong 1ml
dung dịch pha loãng.
Chuyển 1ml dịch pha loãng mẫu đã chọn vào đĩa petri. Bổ sung vào mỗi đĩa đã cấy
mẫu khoảng 5ml môi trường TSA đã được đun chảy và ổn định trong bể điều nhiệt 45
0
C.
Lắc tròn đĩa petri xuôi và ngược kim đồng hồ, mỗi chiều 3 – 5 lần để trộn dịch mẫu với
môi trường. Để nhiệt độ phòng trong 1 – 2 giờ để hồi phục các tế bào bị tổng thương.
Bổ sung vào mỗi đĩa 10 – 15ml môi trường thạch VRB ở nhiệt độ 45
0

C trên môi
trường TSA. Chờ cho môi trường trong đĩa đông đặc, lật ngược đĩa và ủ ở 37 ± 1
0
C trong
24 – 48 giờ. Thực hiện tương tự trên mẫu ở 2 nồng độ pha loãng liên tiếp sao cho mỗi đĩa
xuất hiện từ 10 – 100 khuẩn lạc và lặp lại ít nhất 2 đĩa ứng với mỗi nồng độ pha loãng.
Chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ (khuẩn lạc màu đỏ đến đỏ đậm, có vòng tủa muối mật,
đường kính ≥ 0,5 mm), dung que cấy vòng chuyền sang môi trường canh EC, ủ ở 44 ±
0,5
0
C trong 24 giờ.
Chọn các ống cho kết quả (+) (sinh hơi) và dung que cấy vòng chuyền sang các
môi trường sau: canh Tryptone, canh MR-VP, thạch Simmon Citrate. Ủ các môi trường
trên ở 44 ± 0,5
0
C trong 24 giờ
Thử nghiệm Indol, Methyl Read, Voges Proskauer, Citrate. Ghi nhận khuẩn lạc
cho thử nghiệm khẳng định E.coli (+) ( IMViC là + + - -).
 Cách tính kết quả
Dựa vào số khuẩn lạc đếm được và tỷ lệ khẳng định, tính mật độ của E.colitheo
công thức sau:
A(CFU/mghayCFU/ml)=x R
N: tổng số khuẩn lạc đếm được
n
i
: số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi độ pha loãng
V: dung tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa
f
i
: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm

R: tỷ lệ khẳng định
c. Phương pháp đếm trực tiếp bằng kính hiển vi huỳnh quang
Khi sử dụng kính hiển vi huỳnh quang với các chất nhuộm khác như acridin cam
(AODC), 4’,6-dianidino-2-phenyl-indol (DAPI), fluorescein isothiocyanate (FITC) cũng
được sử dụng rộng rãi để đếm số lượng vi khuẩn. Các nghiên cứu của K.G. Porter và Y.S.
Feig cho thấy rằng khi sử dụng DAPI để đếm số lượng vi khuẩn trong nước cho kết quả
tốt hơn khi sử dụng chất nhuộm AODC khi trong mẫu nước có nhiều chất dinh dưỡng và
nhiều phiêu sinh vật khác. Về độ bền tính phát huỳnh quang của DAPI cũng cao hơn
AODC.Hai tác giả trên cũng chứng minh rằng khi nhuộm với DAFI có thể bảo quản trong
tối đến 24 tuần mà cường độ phát quan không thay đổi.Trong khi đó AODC cường độ và
số lượng phát quang bị giảm khi bảo quản trong vòng 1 tuần ở củng điều kiện.
Một kỹ thuật khác dựa trên nguyên tắc nhuộm màu đặc hiệu DNA được gọi là Hoechst
33258 cũng được sử dụng để nhuộm và đếm số lượng vi sinh vật trên kính hiển vi huỳnh
quang. Phương pháp này như sau: Bisbenzumide kết hợp với vùng DNA giàu adenine và
thyamine sau khi gắn phức hợp này sẽ phát huỳng quang. Hoechst 33258 được sử dụng
nhiều trong việc định lượng vi sinh vật trên bề mặt. Đặt biệt trên bề mặt có gắn các
acridine orange. Một sự thuận lợi khác khi sử dụng phương pháp nhuộm màu
bisbenzimide cho phép đếm số lượng vi sinh vật trong các dụng dịch chất tẩy rửa, trong
muối dùng cho các phòng thí nhiệm hay trong các chế phẩm sinh học khác mà không có
sự hiện diện của DNA. Phương pháp đếm số lượng vi sinh vật bằng phương pháp phát
huỳnh quang được ứng dụng rộng rãi trong việc phân tích các mẫu môi trường như nước
đất ….
Sử dụng dầu nhúng phát quang thấp là một phát minh quan trọng trong việc hạn chế sự
phát huỳnh quang của các màng lọc. Màng carbonate Nuclepore là một màng cellulose
cao cấp dùng trong việc đếm trực tiếp vi khuẩn bởi vì chúng có kích thước lổ đồng nhất
và bề mặt màng phẳng, chúng có thể giữ lại tất cả các vi sinh vật trên bể mặt của chúng.
Màng Nuclepore có thể nhuộm với thuốc nhuộm Irgalan đen hay các loại thuốc nhuộm
phù hợp khác để tạo nên một nền màu đen tương phản với màu phát quang của vi sinh vật
vì thế việc đếm được thực hiện dễ dàng. Khi sử dụng thuốc nhuộm là acridine cam vi
khuẩn và các vi sinh vật khác phát quang màu xanh hay màu cam. Màu phát quang xanh

hay cam là phụ thuộc vào tình trạng sinh lý của từng vi sinh vật. Nhưng khả năng phân
biệt tế bào đang sống hay tế bào đã chết bởi mầu phát quang đôi khi đưa đến sự nhầm lẫn.
Sử dụng ADPI nhuộm DNA của tế bào vi khuẩn chúng đưa đến sự phát quang màu xanh
dương được cho là tối ưu hơn so với việc sử dụng acridin cam để nhuộm các vi khuẩn có
kích thước nhỏ.
Số đếm nhận được từ phương pháp đếm trực tiếp trên kính hiển vi phát huỳnh quang luôn
cho kết quả cao tương đương hai lần so với kết quả nhận được bằng kỹ thuật nuôi cấy
khác. Những vi khuẩn có kích thước nhỏ, có hình dạng bất thường khác cũng đều có thể
nhìn thấy bằng phương pháp phát huỳnh quang. Một số dạng vi sinh vật không thể nuôi
cấy trong các môi trường tổng hợp trong phòng thí nghiệm. Hiện tượng không thể nuôi
cấy của các vi sinh vật cho đến nay vẫn chưa rõ là do chúng thoái hoá, không thể nhân lên
trong các môi trường nhân tạo hay do không đáp ứng được các điều kiện sinh lý cần thiết
cho sự phát triển của chúng. Trong một số trường hợp, sự tương quan cao giữa phương
pháp đếm trực tiếp bằng phương pháp phát huỳnh quang và phương pháp đếm khuẩn.Tuy
nhiên trong một số trường hợp khác sự tương quang này rất kém.Sự khác biệt giữa
phương pháp đếm trực tiếp và phương pháp đếm khuẫn lạc phản ánh sự chọn lọc của môi
trường và điều kiện nuôi cấy, một phần tế bào bị chết hay bị thương tổn và số loài cụ thể
trong mẫu.
d. Phương pháp đếm khuẩn lạc trên màng lọc:
Phương pháp này thường được áp dụng cho các mẫu lỏng như nước, sữa… và được đánh
giá là cho kết quả chính xác hơn so với phương pháp ứơc đoán MPN. Các mẫu chất lỏng
được lọc qua màng lọc có kích thước lổ lọc nhỏ hơn kích thước của vi sinh vật. Vi sinh
vật được giữa lại trên màng lọc. Màng được đặt trên môi trường agar hay trên giấy thấm
được ngấm sủn môi trường nuôi cấy lỏng đã chọn và ủ trong điều kiện xác định.Sau khi ủ,
đếm các khuẩn lạc sẽ xuất hiện trên bề mặt màng lọc.
Mật độ VSV trong dịch lọc thích hợp: <150 khuẩn lạc/màng
Thể tích dịch lọc trong 1 lần: 50 -100ml
Thiết bi lọc có thể bằng thủy tinh, bằng kim loại hay bằng nhựa, bao gồm phễu lọc giá đở
màng lọc, bộ thiết bị hổ trợ hút chân không và bình chứa. Màng lọc được làm bằng
cellulose ester có lỗ lọc mằm trong khoảng 0,1-1 µm, các loại màng lọc dùng cho việc

phân tích tổng số vi sinh vật thường có kích thước lổ lọc là 0,47µm, đường kính màng lọc
có nhiều kích cở khác nhau phù hợp với đường kính của phễu lọc, bề dày của màng
khoảng 120 µm. Khi lọc tất cả các vi khuẩn đều được giữ lại trên màng. Khi đặc màng lọc
sao cho bề trên của màng hướng lên phía trên, vi khuẩn không tiếp xúc trực tiếp với môi
trường nhưng, các thành phần của môi trường dễ dàng thấm qua màng và nuôi vi khuẩn
phát triển thành khuẩn lạc. Một số loại màng lọc có gắn các lưới kỵ nước chỉ cho phép
khuẩn lạc phát triển trong mỗi ô của lưới và không cho lan sang các ô khác nhằm tạo điều
kiện thuận tiện khi đếm.
e. Dùng Đĩa Petrifilm
Đĩa Petrifilm E.coli/Coliform Count dùng để xác định cả E.coli và các loại coliform khác.
Với một bước kiểm tra đơn giản, bạn có thể xác định kết quả chỉ trong vòng 24 đến 48
giờ.
Bằng cách loại bỏ yêu cầu bước xác định các khuẩn lạc nghi ngờ, bạn sẽ gia tăng hiệu quả
phòng thí nghiệm đáng kể và cắt giảm được tổng chi phí.Đĩa Petrifilm là phương pháp
làm sẵn và cung cấp chi phí hiệu quả nhất, thuận tiện và đáng tin cậy để kiểm tra thiết bị,
nguyên liệu tươi sống, thực phẩm thành phẩm và môi trường sản xuất.
Sử dụng đĩa Petrifilm tiết kiệm công lao động, bạn sẽ có thời gian để giám sát các điểm
kiểm soát tới hạn thường xuyên hơn. Kết quả cuối cùng là kiểm soát quá trình sản xuất tốt
hơn và chất lượng sản phẩm được nâng cao hơn.
Nhanh chóng, chính xác. Chỉ qua 3 bước đơn giản:
1- Cấy và trải đều 1 ml mẫu trên đĩa.
2- Ủ ở nhiệt độ thích hợp.
3- Đếm số khuẩn lạc.
Vì đĩa Petrifilm được làm đồng nhất và dễ dàng sử dụng nên ít xảy ra sai sót so với các
phương pháp khác.Đĩa có kẻ ô thuận tiện cho việc đếm khuẩn lạc.Cho kết quả nhanh,
chính xác và nhất quán.
Có thể sử dụng máy đếm khuẩn lạc Quebec-type hoặc nguồn sáng phóng đại.
Chất nhuộm chỉ thị trong đĩa cho tất cả khuẩn lạc màu đỏ, tấm film phía trên giữ khí
(giống như bọt khí) sinh ra bởi coliforms. Ngoài ra, chất chỉ thị glucuronidase hình thành
nên chất tủa màu xanh xung quanh các khuẩn lạc E.coli.

E. coli O157:H7 không sinh glucuronidase, do đó không xuất hiện chất tủa màu xanh.
Đĩa Petrifilm E.Coli/Coliform Count (EC) có chứa Violet Red Bile (VRB), chất gel tan
được trong nước lạnh, chất chỉ thị hoạt động của glucuronidase và một chất chỉ thị giúp
cho việc đếm khuẩn lạc dễ dàng hơn. Hầu hếtE.coli (khoảng 97%) sinh beta-
glucuronidase, chất này tạo tủa màu xanh gắn kết với khuẩn lạc.Tấm film phíatrên giữ bọt
khí sinh ra từ quá trình lên men lactose của E.coli và coliforms. Khoảng 95% E.coli có
sinh bọt khí,cho khuẩn lạc có màu từ xanh đến xanh – đỏ kèm theo bọt khí trên đĩa
Petrifilm.
AOAC INTERATIONAL và U.S FDA Bacteriological Analytical Manual (BAM) xác
định Coliforms là trực khuẩn gram âm, hình que, sinh hơi và acid suốt quá trình lên men
chuyển hoá lactose.Khuẩn lạc coliform phát triển trên đĩa Petrifilm 3M EC sinh acid, chất
chỉ thị pH trong đĩa làm cho lớp keo có màu đỏ.Khí sinh ra được giữ lại xung quanh
khuẩn lạc Coliform màu đỏ là dấu hiệu để xác định Coliform.
Việc xác định E. coli có thể theo nhiều cách khác nhau theo từng quôc gia. (Xem phần
hướng dẫn thời gian và nhiệt độ ủ ). Theo AOAC INTERNATIONAL:
– E.coli = 49 (khuẩn lạc màu xanh có khí).
– Coliform tổng = 87 (khuẩn lạc xanh và đỏ có khí).
Không sử dụng đĩa này riêng rẻ để phát hiện E. coli O157.Như hầu hết những môi trường
kiểm tra E.coli/coliform khác, đĩa này sẽ không hiển thị đặc biệt với bất kì dòng O157 nào
hiện diện.
+ Đối với coliforms: Ủ 24h ± 2h 35°C ± 1°C.
+ Đối với E.coli : Ủ 48h ± 2h 35°C ± 1°C.
– AOAC Official Method 998. 08
+ Đối với E.coli (trong thịt, thịt gia cầm và hải sản): Ủ 24h ± 2h 35°C ± 1°C.
– NMKL method (147.1993)
+ Đối với coliforms: Ủ 24h ± 2h 37°C.
+ Đối với E.coli: Ủ 48h ± 2h 37°C.
f. Dùng Colilert
Colilert – bộ phân tích nhanh chỉ tiêu vi sinh mẫu nước của hãng Idexx – Mỹ cho phép
phát hiện đồng thời định tính và định lượng cả hai chỉ tiêu Coliform và Ecoli chỉ sau 24

giờ hoặc 18 giờ mà không cần quá trình đếm khuẩn lạc phức tạp và dễ sảy ra sai xót.
Ưu điểm nổi bật của Colilert:
• Dễ sử dụng:
Thao tác đơn giản, không cần pha loãng mẫu, Không cần tạo môi trường cấy, không cần
đếm khuẩn lạc, Giảm tối đa yếu tố cản trở hay dị dưỡng.
• Tốc độ phân tích nhanh:
Thực hiện nhanh Phân tích đồng thời Coliform và E.coli trong vòng 18 tiếng hoặc 24
tiếng.Thời gian chuẩn bị mẫu ít (dưới 1 phút), tăng hiệu suất phân tích mẫu.
• Chính xác:
- Độ tin cậy đạt 95 % cao hơn phương pháp đa ống nghiệm và màng lọc.
- Có khả năng định lượng từ 1 đến 200 MPN/100mL đối với khay 51 giếng , từ 1 đến
2419 MPN/100mL đối với khay 97 giếng vượt xa so với phương pháp truyền thống.
• Tin cậy:
Bộ phân tích Colilert xác định Ecoli, coliform là phương pháp được chấp thuận bởi US
EPA (Cục bảo vệ môi trường Mỹ), US FDA (Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ)
và các tổ chức quốc tế như AOAC, WHO, IBWA.
• Hiệu quả kinh tế:
-Tiết kiệm 70 % chi phí thiết bị so với phương pháp màng lọc
- Không cần kiểm tra lại do không có những yếu tố cản trở.
Các bước đơn giản để phân tích định tích và định lượng Coliform và Ecoli bằng Colilert:
1- Pha thuốc thử vào 100mL mẫu.
2- Đổ mẫu vào khay nhựa định lượng.
3- Dán khay bằng máy dán và ủ mẫu ở thời gian và nhiệt độ thích hợp.
4- Định tính: Quan sát kết quả định tính dễ dàng bằng mắt thường: Giếng màu vàng
dương tính với Coliform, soi đèn UV giếng phát huỳnh quang cho kết quả dương tính với
Ecoli.
5- Định lượng: Đếm số gếng trên khay có kết quả dương tính, đối chiếu với bảng MPN để
định lượng Ecoli và Coliform
III. CÁC TIÊU CHUẨN HIỆN HÀNH
1. Đối với nước

Theo TCVN 5942 – 1995 qui định hai mức sau:
• Loại A dùng làm nguồn cấp nước sinh hoạt nhưng phải qua quá trình xử lý, giới
hạn tối đa số Coliforms cho phép là 5000 MPN/100ml
• Loại B dùng cho các mục đích khác, giới hạn tối đa số Coliforms cho phép là 10
000 MPN/100ml
• Đối với nước ngầm, tiêu chuẩn chất lượng về vi sinh vật theo TCVN 5944 –1995
được quy định là Coliforms không quá 3 MPN/100ml, không cho phép có
Coliforms phân
Bảng: Chỉ tiêu coliforms và E.coli trong nước uống
Chỉ tiêu Mức tối đa cho phép
+Coliforms (MPN/100ml) 0
+Coliforms phân (MPN/100ml) 0
+E. coli (CFU/100ml) 0
Tiêu chuẩn nước cấp cho sinh hoạt ở các nước tiên tiến qui định:
• Trị số E.Coli không nhỏ hơn 100 mL, nghĩa là cho phép chỉ có 1 vi khuẩn E.Coli
trong 100 mL nước (chỉ số E.Coli tương ứng là 10). TCVN qui định chỉ số E.Coli
của nước sinh hoạt phải nhỏ hơn 20.
• Trị số E.Coli là đơn vị thể tích nước có chứa 1 vi khuẩn E.Coli. Chỉ số E.Coli là số
lượng vi khuẩn E.Coli có trong 1 lít nước
• Số lượng E.Coli nhiều hay ít tùy thuộc mức độ nhiễm bẩn của nguồn nước.
• Đặc tính của khuẩn E.Coli là khả năng tồn tại cao hơn các loại vi khuẩn, vi trùng
gây bệnh khác nên nếu sau khi xử lý nước, nếu trong nước không còn phát hiện
thấy E.Coli thì điều đó chứng tỏ các loại vi trùng gây bệnh khác đã bị tiêu diệt hết.
Giới hạn ô nhiễm vi sinh vật trong nước khoáng thiên nhiên đóng chai, nƣớc uống
đóng chai và nước đá dùng liền
1. Kiểm tra lần đầu:
Chỉ tiêu Lượng
mẫu (ml)
Yêu cầu Phân loại
chỉ tiêu

E.coli hoặc
coliform chịu nhiệt
1x250 Không phát hiện A
Coliform tổng số 1x250 Nếu số vi khuẩn (bào tử) ≥1 và ≤2 thì
tiến hành kiểm tra lần thứ 2. Nếu số vi
khuẩn (bào tử) >2 thì loại bỏ
A
2. Kiểm tra lần 2:
2.
Đ
ối với thực phẩm
Bảng: QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA ĐỐI VỚI Ô NHIỄM VI SINH VẬT
TRONG THỰC PHẨM
QCVN 8-3:2012/BYT
Chỉ tiêu Kế hoạch lấy mẫu Giới hạn cho phép
(CFU/ml)
Phân loại
chỉ tiêu
N c m M
Coliform tổng số 4 1 0 2 A
Sản phẩm Chỉ tiêu Kế hoạch lấy
mẫu
Giới hạn cho
phép (CFU/ml
hoặc CFU/g)
Phân
loại chỉ
tiêu
n c m M
Phomat được sản xuất từ sữa

đã qua xử lý
E.Coli 5 2 10
2
10
3
A
Phomat whey ( sản xuất từ
whey đã qua xử lý nhiệt)
E.coli 5 2 10
2
10
3
A
Cream và bơ E.coli 5 2 10
1
10
2
A
Thịt và sản phẩm chế biến từ
thịt sử dụng trực tiếp không
cần xử lý nhiệt
E.coli 5 2 5.10
1
5.10
2
B
Thịt và sản phẩm chế biến từ
thiejt phải qua xử lý nhiệt
trước khi sử dụng
E.coli 5 2 5.10

2
5.10
3
B
Nhuyễn thể hai mảnh, động
vật chân bụng, động vật da
gai, hải tiêu (tunicates) còn
sống
E.coli 1 0 230
(1)
700
(1)
B
Giáp xác và động vật thân
mềm có vỏ hoặc đã bỏ vỏ
gia nhiệt
E.coli 5 2 1 10
1
B
Thực phẩm chế biến từ ngũ cốc
cho trẻ từ 6 đến 36 tháng tuổi
Colifor
m
5 2 <3 20 A
Rau ăn sống E.coli 5 2 10
2
10
3
B
Quả ăn ngay E.coli 5 2 10

2
10
3
B
Ghi chú:
- (1) MPN/100g cơ thịt và nội dịch.
- n: số mẫu cần lấy từ lô hàng để kiểm nghiệm.
- c: số mẫu tối đa cho phép có kết quả kiểm nghiệm nằm giữa m và M. Trong n
mẫu kiểm nghiệm được phép có tối đa c mẫu cho kết quả kiểm nghiệm nằm gữa m
và M.
- m: giới hạn dưới, nếu trong n mẫu kiểm nghiệm tất cả các kết quả không
vượt quá giá trị m là đạt.
- M: giới hạn trên, nếu trong n mẫu kiểm nghiệm chỉ 01 mẫu cho kết quả vượt
quá giá trị M là không đạt.
- Chỉ tiêu loại A: là chỉ tiêu bắt buộc phải kiểm nghiệm khi tiến hành đánh giá
hợp quy.
- Chỉ tiêu loại B: là chỉ tiêu không bắt buộc phải kiểm nghiệm khi tiến hành
đánh giá hợp quy nếu nhà sản xuất thực hiện kiểm soát mối nguy trong quá trình
sản xuất (theo HACCP hoặc GMP). Trong trường hợp nhà sản xuất không áp dụng
kiểm soát mối nguy trong quá trình sản xuất thì bắt buộc phải kiểm nghiệm các chỉ
tiêu này.
Bảng: Chỉ tiêu vi sinh cho phép trong thực phẩm, Bộ Y tế 4/1998
Nhóm thực phẩm Giới hạn cho phép (CFU/g hay CFU/ml thực
phẩm)
TVKHK ECO COL
Nhóm thịt
-Thịt tươi, thịt đông lạnh, thịt xay
nhỏ, thịt nghiền, thịt chế biến.
- Sản phẩm chế biến từ thịt: thịt
hun khói, pate, xúc xích.

10
6
10
2
3-10
5
3 50
Nhóm cá và hải sản
-Cá và thủy sản tươi sống.
-Sản phẩm chế biến: tôm, cá hấp
nóng, hún khói, chả cá, chả mực,
các loại giáp xác, nhuyễn thể luộc
hấp.
-Thủy sản khô sơ chế: cá khô.
10
6
10
2
10
5
3 10
10
6
10 10
2
Nhóm trứng
-Trứng tươi, dịch trứng tươi hoặc
đông lạnh.
-Sản phẩm chế biến từ trứng (đã
tiệt trùng bằng phương pháp

Pasteur
10
5
3 10
2
10
6
0 10
Nhóm sữa
-Sữa khô, sữa bột
-Sữa tươi tiệt trùng theo phương
pháp Pasteur.
-Sữa tươi tiệt trùng theo phương
pháp U.H.T
-Sản phẩm chế biến từ sữa (bơ,
sữa chua, pho mát).
5.10
4
0 10
5.10
4
3 10
10 0 0
10
4
0 10
Sản phẩm chế biến từ ngũ côc,
khoai củ, đậu đỗ:
-Cần xử lí nhiệt trước khi dùng:
bột, miến, mì sợi.

-Dùng trực tiếp không xử lí:
bánh bột.
10
6
10
2
10
3
10
4
3 10
Nhóm nước khoáng và nước
giải khát đóng chai:
-Nước giải khát có cồn.
-Nước giải khát không cồn
-Nước khoáng đóng chai.
10 0
10
2
0 10
Theo G.M.P 3 0
Nhóm nước chấm
-Nguồn gốc động vật: nước
mắm.
10
4
0 10
2
10
4

0 10
2
Nhóm thức ăn khô và chứa
dinh dưỡng cho trẻ em, thức ăn
105 10 10
thay thế đặc biệt
-Phải xử lí trước khi sử dụng.
-Dùng trực tiếp, không qua xử lí
nhiệt.
10
4
0 10
Kem, nước đá 5.10
4
0 10
2
Nhóm đồ hộp 0
Nhóm dầu mỡ 10
3
3 10
Bảng: TCVN và TCN (Bộ thủy sản) về vi sinh trên thủy sản
TIÊU CHUẨN TÊN MẶT HÀNG TVKHK COL ECO
TCVN5289/92 Cá fillet, tôm, mực
1.000.000 200 0
TCVN4381/92 Tôm vỏ đông lạnh
TCVN4380/92 Tôm thịt đông lạnh
TCVN4546/94 Tôm mũ ni đông lạnh
TCVN5835/93 Tôm thịt IQF
TCVN2644/94 Mực đông lạnh
TCVN5649/92 Hàng khô (không ăn liền) 1.000.000 0

TCN 118:1998 Thịt nghêu luộc: n:5 m:
50.000
M:
500.000
c: 2
28TCN 119/98 Surimi cá biển 10.000 100 0
28TCN 104/97 Mực nang fillet ăn liền
Sashimi
50.000 10 0
28TCN 105/97 Nhuyễn thể 2 mảnh 1.000.000 200 0
28TCN 117/98 Cá basa fillet 1.000.000 200 0
TCVN6175/91 Mực, cá khô tẩm gia vị 50.000 10 0
TCVN5526/91 Nước mắm 20.000 10/ml 0
3. Một số tiêu chuẩn quốc tế
Bảng: Một số tiêu chuẩn vi sinh trên thủy hải sản ở thị trường Châu Âu