Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm vibrio

Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio
Tiêu chuẩn hiện hành
để kiểm nghiệm Vibrio
Trang 1
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio
1. Giới thiệu chung
Giống Vibrio thuộc họ Vibrionaceae, bộ Vibrionales, lớp Gammaproteobacteria,
ngành Proteobacteria. Đặc điểm chung các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio: Gram
âm, hình que thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước 0.3-0.5 x 1.4-2.6 μm. Chúng
không hình thành bào tử và chuyển động nhờ một tiên mao hoặc nhiều tiên mao
mảnh.
Vibrio là vi sinh vật gram âm, hình que hai đầu không đều nhau tạo thành hình dấu
phẩy, di động, sống kị khí tuỳ ý, có các phản ứng catalase và oxidase (+), lên men
glucose nhưng không sinh hơi, không sinh H
2
S, nhạy cảm với Vibriostaticum O/129. Trừ
V. cholera hiện diện ở vùng nước ngọt, tất cả các loài Vibrio khác đều cần muối để tăng
trưởng và thường xuyên được phân lập được từ các vùng nước ven biển. Giống này có 4
loài là tác nhân gây bệnh cho người gồm: V. cholera, V. parahaemolyticus, V.vulnificus,
V. alginolyticus.
Người ta đã xác định được 21 loài thuộc giống Vibrio, trong đó có 4 loài thuộc tác
nhân gây bệnh cho người gồm: V. cholera, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V.
alginolyticus.
Vi khuẩn tả (Vibrio cholerae) là vi khuẩn hình cong dấu phẩy (do đó được gọi là phẩy
khuẩn) không bắt mầu gram, không sinh nha bào, di động nhanh nhờ có một lông. Phẩy
khuẩn tả dễ nuôi cấy trong môi trường nghèo dinh dưỡng, pH kiềm (pH từ 8,5-9,0) và
mặn. Phẩy khuẩn tả có khoảng 140 nhóm huyết thanh đã được xác nhận, nhưng chỉ có
nhóm huyết thanh O là gây được bệnh tả. Phẩy khuẩn tả được chia thành V. cholerae O1
và không O1 (Vibrio cholera không ngưng kết với O1 còn được gọi là chủng NAG).
Vibrio cholerae gồm 2 tuýp sinh học (biotype) là vi khuẩn tả cổ điển và tả El Tor. Mỗi
tuýp sinh học lại được chia thành các tuýp huyết thanh như Ogawa, Inaba và Hikojima.

Phẩy khuẩn tả gây bệnh bằng độc tố ruột. Độc tố ruột gắn vào niêm mạc ruột non, hoạt
hoá enzyme adenylcyclase dẫn đến tăng AMP vòng, làm giảm hấp thu Na
+
, tăng tiết Cl
-
và nước gây tiêu chảy cấp tính. Phẩy khuẩn tả có thể chuyển hóa trong thiên nhiên, thay
Trang 2
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio
đổi tính di truyền do đột biến từ chủng không gây dịch có thể thành chủng gây dịch và
kháng nhiều loại kháng sinh. Phẩy khuẩn tả dễ bị tiêu diệt bởi nhiệt độ (80
0
C/5 phút), bởi
hóa chất (Clo 1 mg/lít) và môi trường axit. Khô hanh, ánh nắng mặt trời cũng làm chết
phẩy khuẩn tả. Nó có thể tồn tại lâu trong phân, đất ẩm, nước, thực phẩm.
Trong đất, phẩy khuẩn có thể sống 60 ngày, trong phân 150 ngày, trên bề mặt thân thể
30 ngày, trong sữa 6-10 ngày, trên rau quả 7-8 ngày, trong nước 20 ngày. Nhiệt độ 25
0
C-
37
0
C, nồng độ muối 0,5 đến 3%, độ pH kiềm (7 - 8,5) và giàu chất dinh dưỡng hữu cơ
trong nước là những điều kiện tối ưu cho phẩy khuẩn tả tồn tại.
Vibrio parahaemolyticus và Vibrio cholerae có khả năng gây bệnh đường ruột.
Vibrio vulnificus có thể vào cơ thể thông qua vết thương hở hoặc do bệnh nhân uống
nước biển chứa vi khuẩn. Triệu chứng nhiễm khuẩn thường xảy ra là nôn, sốt, tiêu chảy
và hạ huyết áp. Những người có hệ miễn dịch hoạt động yếu như bệnh nhân ung thư, rối
loạn thận, bệnh gan mạn tính, hoặc nhiễm HIV dễ có nguy cơ nhiễm vi khuẩn này.
V. cholerae V. parahaemolyticus V. vulnificus
V.
alginolyticus

- Phản ứng oxidase (+)
- Tăng trưởng được trong môi
trường canh trypton ở 42
o
C
- Arginine dehydrolase (-)
- Lysine decarboxylase (+)
- Lên men được sucrose
- Khử nitrate thành nitrite
- Có thể tăng trưởng trong
môi trường chứa 0-3%
NaCl, không phát triển được
trong môi trường chứa 6,8-
10% muối.
- Phản ứng oxidase (+)
- Phát triển được trong
canh trypton ở 24
o
C
- Phản ứng ADH (-), LDC
(+)
- Khử nitrate thành nitrite
- Không lên men sucrose
- Không sinh hơi
- Tăng trưởng trong môi
trường chứa 8% muối, ức
chế trong môi trường
chứa 10% muối.
- Không lên
men sucrose

- Không tăng
trưởng được
trong môi
trường không
có muối, ức
chế trong môi
trường có 8-
10% muối.
- Không lên
men sucrose
- Phát triển
được trong
môi trường
chứa đến
10% muối.
o Có thể phát hiện các loài Vibrio dựa trên nguyên tắc sau:
Trang 3
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio
- Một lượng mẫu xác định được tăng sinh trong môi trường chọn lọc đặc trưng.
- Cấy phân lập từ môi trường tăng sinh sang môi trường phân biệt chọn lọc đặc
trưng. Các khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường phân lập được khẳng định bằng
các thí nghiệm sinh hoá và huyết thanh lọc.
- Môi trường tăng sinh chọn lọc cho V. cholera, V. alginolyticus và V. vulnificus
là nước pepton kiềm. Trong khi đó môi trường Clistine Polymicine Broth
thường được dung để tăng sinh V. parahaemolyticus. Môi trường thường dùng
để phân lập Vibrio là TCBS (Thiosulphate Citrate Bile Sucrose Agar). Các vi
sinh vật lên men được sucrose trong môi trường này sẽ cho khuẩn lạc màu vàng
và làm acid hoá môi trường bên dưới khuẩn lạc. Nếu vi sinh vật không lên men
được đường sucrose sẽ cho khuẩn lạc màu xanh.
2. Quy trình phân tích và nguyên tắc xác định

2.1 Tăng sinh chọn lọc:
- Rất khó phát hiện Vibrio trong mẫu, vì vậy ta sử dụng lượng mẫu lớn. Và cũng
chính vì khó phát hiện nên phải tạo điều thuận lợi để Vibrio sinh trưởng bằng
cách tăng sinh trong môi trường pepton kiềm chứa 1% muối NaCl cho trường
hợp V. cholera, V. alginolyticus và V. vulnificus; canh Colistine cho trường hợp
V. parahaemolyticus.
- Mẫu lỏng: cho vào nước peptone kiềm, ủ ở 37
o
C trong 18 – 24 giờ
Trang 4
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio
- Mẫu rắn: cho vào túi PE vô trùng chứa nước peptone kiềm và đồng nhất trong
máy dập mẫu rồi ủ ở 37
o
C trong 18 – 24 giờ.
2.2 Phân lập:
- Phân lập từ phần váng của dịch tăng sinh lên môi trường TCBS agar. Ủ ở
37
0
C/24h.
- Cấy khuẩn lạc đặc trưng sang môi trường TSA hay thạch máu.
- Ủ 37
0
C để lấy sinh khối cho bước tiếp theo là thử nghiệm sinh hóa.
 Nhận diện khuẩn lạc điển hình :
Trang 5
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio
2.3 Thử nghiệm sinh hóa
+ Quan sát tính di động và hình thái trên kính hiển vi
• Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X.

• Ghi nhận kết quả: di động hay bất động, hình dạng tế bào.
- Lam kính 1: Hoà mẫu phân vào nước muối sinh lý, nhỏ 1 giọt lên lam
kính, đậy phiến kính mỏng (lamen) lên trên.Soi tiêu bản trực tiếp trên kính hiển vi
thấy vi khuẩn tả di động rất nhanh theo những đường thẳng từ đầu đến cuối vi trường.
- Lam kính 2: Nhỏ 1 giọt huyền dịch phân lên lam kính, nhỏ 1 giọt kháng huyết
thanh tả đa giá. Nếu là vi khuẩn tả thì vi khuẩn sẽ bị bất hoạt, không di động nữa.
Soi tiêu bản trên kính hiển vi nền đen, vi khuẩn tả di động như sao đổi ngôi .
+ Thử nghiệm khả năng lên men đường
• Môi trường: Phenol red broth base pH 7.4
• Chỉ thị pH: đỏ phenol, màu đỏ chuyển sang vàng khi pH dưới 6.8
• Kiểm nghiệm khả năng lên men: lactose, sucrose, mannose
• Bổ sung đường vào môi trường rồi khử trùng
• Sau đó cấy và ủ 370C trong 18 – 20 giờ
• Đánh giá dựa vào sinh acid (làm đổi màu chỉ thị) và sinh hơi (CO
2
tạo thành được bẫy lại trong ống Durham).
• Kết quả:
o Phản ứng (+): môi trường chuyển vàng
Trang 6
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio
o Phản ứng (-): môi trường có màu đỏ
+ Thử nghiệm Decarboxylase
• Enzyme carboxylase do VK tạo ra loại nhóm carboxyl của acid amin
tạo amin hay diamin và CO
2

• Môi trường: Decarboxylase Basal Medium
• Chỉ thị: Bromothymol purple pH 6.0, vùng chuyển màu pH 5.2 – 6.8
thay đổi từ vàng thành tím
• Kiểm nghiệm: ADH, LDC

• Hấp khử trùng môi trường rồi cấy
• Bổ sung dầu khoáng hay parafin rồi ủ 37
0
C trong 1 đến 4 ngày
• Kết quả:
(+) Môi trường đục, màu tím (CO
2
sinh ra làm thay đổi pH, đổi màu
chỉ thị).
(-) Môi trường trong, màu vàng
+ Thử nghiệm khả năng sinh Indol
• Môi trường: Trypton
• Thuốc thử: Kovac’s
• Cho thêm eter để chiết Indol
• Ủ 44.5
0
C trong 24 giờ
• Kết quả:
(+) Bề mặt môi trường màu đỏ
(-) Bề mặt môi trường có màu vàng của thuốc thử
(đôi khi có màu cam do Skatol là tiền chất Methyl hóa của Indol tạo ra)
Trang 7
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio
+ Thử nghiệm H
2
S
• Enzym desulfohydrase do VK tổng hợp sẽ xúc tác sự chuyển hóa
acid amin chứa lưu huỳnh (cystein, cystin, methionin) và phóng thích H
2
S.

• Môi trường:
• Thạch nghiêng: KIA, TSI
• Thạch đứng: SIM, PIA
• Đĩa petri: BSA
• Cấy vào môi trường rồi ủ 37
0
C trong 24 – 48 giờ hoặc đến 7 ngày
nếu cần.
• Kết quả:
(+) Môi trường xuất hiện màu đen do H
2
S tạo tủa đen với sulfide trong môi
trường.
(-) Môi trường không có sự xuất hiện hay chuyển màu đen.

+ Thử nghiệm Oxidase
Trang 8
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio
• Xác định sự hiện diện của enzym oxidase ở VSV. Enzym quan trọng
nhất của hệ enzym này là cytochrome oxydase trong chuỗi truyền điện tử
của hô hấp hiếu khí.
• Thuốc thử: p – phenylenediamine
• Cấy lên ống thạch nghiêng rồi ủ 24 – 48 giờ
• Tiếp tục tiến hành theo 1 trong 2 cách:
• Nhúng giấy lọc vào tetramethyl – p – phenylenediamine
dihydrochloride 1%, dùng que cấy dàn đều sinh khối lên tấm giấy lọc đó.
• Nhỏ lên sinh khối vài giọt p – aminophenylenediamine oxalate 1%
và α – napthol 1% trong ethanol.
• Kết quả:
(+) Xuất hiện màu xanh dương đậm do có sự hiện diện của cytochrom khử

trong tế bào làm thuốc thử oxy hóa thành indolphenol.
(-) Không xuất hiện màu xanh dương
+ Thử nghiệm ONPG
• Các VK lên men lactose tổng hợp trong tế bào tạo enzym β –
galactosidase. Enzym này xúc tác thủy phân lactose và permease có vai trò
vận chuyển lactose vào trong tế bào
• Môi trường: ONPG broth 0.6% (o – nitrophenyl – D –
galactopyranoside) trong dung dịch Na
2
HPO
4
1mM.
• Khử trùng môi trường, cấy và ủ 37
0
C trong 24 giờ
• Kết quả:
(+) Xuất hiện màu vàng trong dịch cấy do quá trình thủy phân phóng
thích o – nitrophenol có màu vàng.
(-) Không xuất hiện màu vàng
Trang 9
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio
+ Thử nghiệm khả năng oxi hóa – lên men
• Nhằm xác định VSV biến dưỡng carbohydrate theo phương thức oxi
hóa hay lên men, quá trình lên men tạo môi trường có tính acid cao hơn quá
trình oxi hóa => làm đổi màu chỉ thị.
• Môi trường: Hugh – Leifson chứa glucose là nguồn carbon duy nhất
• Chỉ thị: Bromothymol Blue
• Cấy VSV vào 2 ống môi trường, sau đó chỉ có 1 ống phủ lên bề mặt
lớp dầu khoáng parafin để cản sự tiếp xúc với oxi không khí.
• Ủ 2 ống ở 37

0
C trong 24 – 48 giờ
+ Thử nghiệm kháng huyết thanh
Nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh lên lam kính sạch và một giọt nước muối sinh lý
lên một vị trí khác của lam. Dùng que cấy vô trùng khác nhau chuyển vi khuẩn từ
TSA lên hai giọt dung dịch trên rồi phân tán đều vi khuẩn. Kết luận dương tính khi
có hiện tượng ngưng kết ở giọt có kháng huyết thanh và không có hiện tượng
Trang 10
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio
ngưng kết ở giọt nước muối. Sử dụng chủng chứng dương và chủng chứng âm
trong quá trình thực hiện.
Một số phương pháp nhanh:
+ Test kit: Thường được dùng để sàng lọc ở một phạm vi lớn, một số sản phẩm
cũng đã được thương mại.
+ Phương pháp miễn dịch: như EIA, ELISA cũng được phát triển, tuy nhiên các
bộ kit được thương mại hoá thì không phổ biến khiến phương pháp này không
được thịnh hành.
+ Phương pháp sinh học phân tử: Ngày nay một số phương pháp phân tử đã
được phát triển,đáng chú ý là kỹ thuật PCR. Hiện nay đã có bộ sinh phẩm dùng
xác định cả 3 loài: V. cholerae, V. parahaemolyticus và V. vulnificus chỉ trong
vòng 24h bằng kỹ thuật real time PCR (Labelled DNA probes ) từ mẫu thực phẩm,
hơn nữa còn có thể xác định độc tố của V.cholerae mà bằng phương pháp phân
tích từ các chủng V.cholerae rất khó khăn.
Trang 11
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio
Quy trình phát hiện và định danh V. cholera và V. parahaemolyticus
3. Trường hợp cụ thể cho Vibrio parahaemolyticus
THƯỜNG QUY KỸ THUẬT
ĐỊNH LƯỢNG VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS TRONG THỰC PHẨM
(Ban hành kèm theo Quyết định số 3349/2001 QĐ-BYT ngày 31 tháng 7 năm 2001 của

Bộ trưởng Bộ Y tế)
I. NGUYÊN LÝ PHƯƠNG PHÁP
Trang 12
Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml APW
hoặc Colistine
Ủ canh khuẩn ở 37
o
C Phân lập lên TCBS
Phân lập lên TCBS
Ủ ở 37
o
C trong 24 giờ
Chọn khuẩn lạc đặc trưng:
- V. cholera: khuẩn lạc vàng, đường kính 2-3 mm
- V. parahaemolyticus: khuẩn lạc xanh, đường kính 3-4 mm
Ria lên TSA chứa 1% NaCl hay BHI, ủ qua đêm ở 37
o
C
Thử nghiệm sơ bộ:
- KIA: đỏ/vàng, H2S (-), gas (+)
- Di động trong thch5 mềm: (+)
- Oxidase: (+)
- KOH thử Gram: (-)
Thử nghiệm khẳng định
Kết luận V. cholera/V. parahaemolyticus
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio
Vibrio parahaemolyticus phát triển được trong môi trường có nồng độ muối cao. Lựa
chọn khuẩn lạc V. parahaemolyticus xác định tính chất sinh vật hoá học theo thường quy.
II. PHẠM VI ÁP DỤNG
Phát hiện các ô nhiễm do Vibrio parahaemolyticus trong sản phẩm thuỷ sản và thức ăn

chế biến sẵn.
III. DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG, THUỐC THỬ
1. Dụng cụ thiết bị
Các dụng cụ và thiết bị thông thường trong phòng kiểm nghiệm vi sinh vật.
2. Môi trường, thuốc thử
- Thạch TCBS (Thiosunfat - Citrat - Bile - Salt - Sucroza)
- Thạch Tryple sugar iron (TSI)
- Thạch Wagatsuma
- Môi trường Clark - lubs
- Canh thang Trypticase Soy (TSB)
- Thạch Trypticase Soy (TSA)
- Canh thang muối glucoza (GSTB)
- Canh thang Glucose Hugh Leifson (HLGB)
- Môi trường di động
- Môi trường đường có chỉ thị màu bromocresol
(Các đường manitol, lactoza, sacaroza, arabinoza)
- Môi trường decarboxylaza (ADH, LDC, ODC)
- Thuốc thử hoặc giấy thử Oxidaza
Trang 13
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio
- KOH, α naphton
- Dầu parafin vô trùng
- Thuốc nhuộm Gram
Chú ý: tất cả các loại môi trường phải có ít nhất 3% muối NaCl
IV. CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG, THUỐC THỬ
1. Chuẩn bị môi trường
Môi trường nuôi cấy, canh thang, nước pha loãng và môi trường sinh vật hoá học được
điều chế theo công thức. Các môi trường được đóng sẵn vào bình cầu, bình nón, ống
nghiệm và được hấp tiệt trùng (110
o

C/30 phút hoặc 121
o
C/15 phút).
2. Chuẩn bị mẫu và dung dịch mẫu thử
2.1. Chuẩn bị mẫu
Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện vô trùng cho tới
khi được thể đồng nhất.
Lưu ý:
- Cá: Thịt cá, ruột và mang cá.
- Sò, hến: Toàn bộ cơ quan nội tạng.
- Tôm, cua : Thịt và cơ quan nội tạng. Nếu cần có thể tách riêng xét nghiệm các bộ phận
của chúng (ruột, mang, gạch ).
Trước khi xét nghiệm, phải làm tan băng.
2.2. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10
-1
- Cân chính xác 50 g thực phẩm đã được chuẩn bị (hoặc hút chính xác 50ml thực phẩm
lỏng) cho vào bình nón chứa sẵn 450 ml nước đệm muối 3%.
- Lắc đều 2 - 3 phút. Thu được dung dịch mẫu thử 10-1.
Trang 14
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio
2.3. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10
-2
,10
-3
,10
-4

- Hút chính xác 50ml dung dịch mẫu thử 10
-1
cho sang bình nón chứa sẵn 450ml nước

đệm muối 3%.
- Lắc đều trong 2 - 3phút. Thu được dung dịch 10
-2
.
- Tiếp tục làm tương tự như vậy, ta thu được các dung dịch mẫu thử tương ứng 10
-3
, 10
-4
,
10
-5
(theo sơ đồ )
3. Phương pháp tiến hành
Bước 1:
- Lấy 10ml dung dịch mẫu thử 10
-1
cho sang ống nghiệm chứa sẵn 10 ml canh thang
glucoza muối (GSTB) đậm đặc gấp 2 lần và 1ml vào GSTB đậm độ thường. Mỗi đậm độ
cấy 3 ống.
- Lấy 1ml dung dịch mẫu thử từ 10
-2
, 10
-3
, 10
-4
cho sang ống nghiệm chứa sẵn 10ml
GSTB đậm độ thường. Mỗi nồng độ pha loãng cấy vào 3 ống. ủ ấm ở 35
0
C/18-24 giờ.
- V. parahaemolyticus hiếu khí tuyệt đối, phát triển tạo thành màng trên bề mặt ống canh

thang, chuyển mầu môi trường sang mầu vàng.
Bước 2:
- Lấy canh trùng từ ống canh thang có đậm độ pha loãng thấp nhất vẫn có vi khuẩn phát
triển cấy sang các đĩa thạch TCBS. Ria cấy để tạo được các khuẩn lạc riêng rẽ.
- Ủ ở 35
0
C/18 - 24 giờ.
Bước 3:
- Quan sát và nhận định khuẩn lạc trên thạch TCBS.
- V. parahaemolyticus có khuẩn lạc tròn, lồi, bờ đều, đường kính 2 - 3mm trung tâm
khuẩn lạc có màu xanh hoặc xanh lá cây.
Trang 15
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio
Bước 4: Tăng sinh thuần chủng và xác định hình thể, tính chất bắt mầu
a) Tăng sinh thuần chủng
- Trích khuẩn lạc điển hình từ thạch TCBS cấy vào môi trường canh thang TSB hoặc
canh thang thường có NaCl 3% và ủ ấm 18 - 24 giờ/ 35
0
C, thu được canh trùng thuần
nhất.
- Từ canh trùng thuần nhất cấy vào Thạch TSI, TSA nghiêng có NaCl 3%;
ủ ấm 18 - 24 giờ/ 35
0
C.
- Thử nghiệm Oxidaza: Lấy khuẩn lạc trên môi trường TSA làm phản ứng oxidaza trên
giấy thử hoặc thuốc thử, oxidaza (+).
b) Hình thể và tính chất bắt mầu
- Từ canh trùng thuần nhất, nhuộm Gram xem hình thể: hình phẩy khuẩn, cong hoặc hình
trụ, đầu tròn, không bắt mầu thuốc nhuộm Gram, Gr (-).
- Canh trùng được soi tươi trên lam kính: phẩy khuẩn di động nhanh.

Bước 5: Tính chất sinh vật hoá học
a) Tính chất lên men các loại đường
- Thử tính chất lên men đường glucoza, lactoza, sacaroza, khả năng sinh hơi, sinh H
2
S
trên môi trường TSI.
- Lên men đường sacaroza, manitol, arabinoza.
- Dùng canh thang có chỉ thị màu bromocresol để xác định tính chất lên men các loại
đường. Để tủ ấm 35
0
C/ 4 - 5 ngày rồi đọc kết quả.
b) Tính chất ưa muối
- Từ canh trùng thuần nhất cấy vi khuẩn vào ống canh thang muối (STB) có NaCl từ:
0%; 6%; 8%, 10%. ủ ấm ở 35
0
C/24 giờ.
Trang 16
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio
c) Thử nghiệm VP
- Từ canh thang TSB cấy vào canh thang Clark-lubs, ủ ấm ở 35
0
C/48 giờ. Nhỏ thuốc thử
0,2ml KOH 40% và 0,6ml α napton.
- Để ở nhiệt độ thường trong 1 giờ. Đọc kết quả.
d) Test ADH, LDC, ODC
- Dùng que cấy lấy vi khuẩn từ thạch TSA cho vào 3 ống ADH, LDC, ODC (Các ống
môi trường đã có parafin vô trùng phủ dày 10mm). Nới lỏng nút bông, để ở nhiệt độ
35
0
C/ 24 giờ, kiểm tra hàng ngày, trong 4 ngày.

- Đọc kết quả: V. parahaemolyticus LDC (+), ADH (-), ODC (+).
e) Test Kanagawa
- Xác định khả năng làm tan máu thỏ dạng β (test phân biệt
giữa V.parahaemolyticus phân lập từ thuỷ sản): Cấy vi khuẩn sau khi nuôi cấy 18 giờ lên
bề mặt thạch Wagatsuma có máu thỏ thành các chấm. Thử nghiệm phải có chứng dương
và chứng âm
- Ủ 35
0
C và đọc kết quả sau 24 giờ.
V. TÍNH KẾT QUẢ
Khuẩn lạc điển hình trên môi trường TCBS tương ứng với nồng độ pha loãng nhất của
canh thang GSTB còn có sự phát triển của V.parahaemolysticus. Tra bảng MPN ở nồng
độ tương ứng để tính số khuẩn lạc có trong mẫu thử.
Ví dụ:
Nồng độ 10
-1
: có 3 ống (+);
Nồng độ 10
-2
: có 1 ống (+);
Trang 17
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio
Nồng độ 10
-3
: có 0 ống (+)
Tra bảng MPN , xác định trong 1g mẫu thử có 43 con vi khuẩn
Tiêu chuẩn xác định V. parahaemolysticus trong thực phẩm
Phẩy khuẩn, Gr (-) Oxidaza: (+) VP: (-) Di động: (+)
NaCl 0%; (-), NaCl 6%: (+) NaCl 8%: (+) NaCl 10%: (-)
Glucoza (+), Lactoza (+) Sacaroza(-), Hơi (+); H

2
S: (-)
ADH: (-) ODC: (+) LDC: (+) Kanagawa (-)

Sơ đồ định lượng V. parahaemolyticus
Trang 18
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio
Thạch TCBS
5. Xác định tính chất sinh vật hóa học
6. Tiêu chuẩn xác định V. parahaemolyticus
Phẩy khuẩn, Gr (-) Oxidaza: (+) VP: (-) Di động: (+)
NaCl 0%; (-), NaCl 6%: (+) NaCl 8%: (+) NaCl 10%: (-)
Glucoza (+), Lactoza (+) Sacaroza:(-), Hơi (+); H
2
S: (-)
ADH: (-) ODC: (+) LDC: (+) Kanagawa (-)
4. Chỉ tiêu của Vibrio trong thực phẩm
Trang 19
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio
Bảng 1. Chỉ tiêu vi sinh sản phẩm thuỷ sản đông lạnh - cá basa philê.
Tên chỉ tiêu Mức
1. Tổng số vi sinh vật hiếu khí, tính bằng số khuẩn lạc trong 1g
sản phẩm, không lớn hơn
1.000.000
2. Tổng số Coliforms, tính bằng số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm,
không lớn hơn
200
3. Staphylococcus aureus, tính bằng số khuẩn lạc trong 1g sản
phẩm, không lớn hơn
100

4. E. coli, tính bằng số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm Không cho phép
5. Salmonella, tính bằng số khuẩn lạc trong 25g sản phẩm Không cho phép
6. Vibrio cholera, tính bằng số khuẩn lạc trong 25g sản phẩm Không cho phép
Bảng 2. Chỉ tiêu vi sinh sản phẩm thuỷ sản đông lạnh – thịt nghêu luộc.
Tên chỉ tiêu Mức
1. Tổng s ố vi sinh vật hiếu khí chịu nhiệt trung bình (300C), tính
bằng số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm
m = 50.000
M = 500.000
n = 5
c = 2
2. Vi sinh vật chỉ thị vệ sinh
- Staphylococcus aureus, tính bằng số khuẩn lạc trong 1g sản
phẩm
m = 100
M = 1000
n = 5
c = 2
- Coliform phân (440C trong môi trường đặc), tính bằng số khuẩn
lạc trong 1g sản phẩm,
m = 10
M = 100
n = 5
c = 2
Trang 20
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio
Hoặc E. coli (trên môi trường đặc), tính bằng số khuẩn lạc trong1g
sản phẩm
m = 10
M = 100

n = 5
c = 1
3. Vi sinh vật gây bệnh, tính bằng số khuẩn lạc trong 25 g sản
phẩm :
- Salmonell
Khôngcho phép
n = 5
c = 0
- Shigella
Không cho phép
n = 5
c = 0
- Vibrio cholera
Không cho phép
n = 5
c = 0
+ Trong đó :
- n là số mẫu.
- m là giới hạn dưới. Mẫu có số khuẩn lạc đếm được ở dưới giới hạn này được coi là đạt.
- M là giới hạn chấp nhận được. Mẫu có số khuẩn lạc vượt quá giới hạn này được coi là
không đạt.
- c là số mẫu có số khuẩn lạc đếm được giữa m và M
+ Chất lượng của một lô được xem là :
- Ðạt khi tất cả các mẫu có số khuẩn lạc 3 m
- Chấp nhận được khi tất cả các mẫu có số khuẩn lạc trong khoảng 3 m và 10 m (M) và
khi c : n 2 : 5, hoặc thấp hơn.
+ Chất lượng của một lô được xem là không đạt khi :
- Trong tất cả các mẫu, số khuẩn lạc đều lớn hơn M.
- Khi c : n > 2 : 5
Bảng 3. Chỉ tiêu vi sinh vật của Surimi

Tên chỉ tiêu Mức và yêu cầu
1. Tổng số vi sinh vật hiếu khí, tính bằng số khuẩn lạc trong 1 g
sản phẩm, không lớn hơn
100.000
2. Tổng số coliform, tính bằng số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm, 100
Trang 21
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio
không lớn hơn
3. Staphylococcus aureus, tính bằng số khuẩn lạc trong 1 g sản
phẩm, không lớn hơn
100
4. Escherichia coli, tính bằng số khuẩn lạc trong 1 g sản phẩm Không cho phép
5. Salmonella, tính bằng số khuẩn lạc trong 25 g sản phẩm Không cho phép
6. Vibrio cholera, tính bằng số khuẩn lạc trong 25 g sản phẩm Không cho phép
Tài liệu tham khảo:
[1] Trần Linh Thước. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực
phẩm, mỹ phẩm. NXB Giáo dục. 2007.
Trang 22