NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI PROTEIN VÀ THỬ NGHIỆM XỬ LÝ NƯỚC THẢI NUÔI TRỒNG THỦY SẢN TẠI QUẢNG NAM ĐÀ NẴNG

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG
LÊ THỊ CẨM
NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ
CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI
PROTEIN VÀ THỬ NGHIỆM XỬ LÝ NƯỚC THẢI
NUÔI TRỒNG THỦY SẢN TẠI
QUẢNG NAM - ĐÀ NẴNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đà Nẵng - 2015
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG
LÊ THỊ CẨM
NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ
CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI
PROTEIN VÀ THỬ NGHIỆM XỬ LÝ NƯỚC THẢI
NUÔI TRỒNG THỦY SẢN TẠI
QUẢNG NAM - ĐÀ NẴNG
Ngành: Quản lý Tài nguyên và Môi trường
Giảng viên hướng dẫn: TS. VÕ CHÂU TUẤN
Đà Nẵng - 2015
LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi.
Các số liệu, kết quả trong khóa luận là trung thực và chưa từng công
bố trong bất kỳ công trình khác.
Tác giả
Lê Thị Cẩm
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đề tài khóa luận của mình (từ 4/2014 đến 03/2015), tôi

xin cảm ơn sự quan tâm, tạo điều kiện của Khoa Sinh – Môi trường, Trường
Đại học Sư phạm Đà Nẵng. Xin chân thành cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ
nhiệt tình và quý báu của Thầy Võ Châu Tuấn cùng các thầy cô giáo tại khoa
Sinh – Môi trường để tôi được thực hiện đề tài và hoàn thành báo cáo một
cách tốt nhất. Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó!
Đà Nẵng, tháng 04 năm 2015
Sinh viên
Lê Thị Cẩm
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
MỞ ĐẦU 1
1. Tính cấp thiết của đề tài 1
2. Mục tiêu đề tài 2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2
3.1. Ý nghĩa khoa học 2
3.2. Ý nghĩa thực tiễn 3
Chương 1 4
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE 4
1.2. TỔNG QUAN VỀ CÁC LOẠI VI SINH VẬT SINH TỔNG HỢP
ENZYME PROTEASE 5
1.2.1. Vi khuẩn 5
1.2.2. Nấm 6
1.2.3. Xạ khuẩn 6
1.3. TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VI KHUẨN PHÂN
GIẢI PROTEIN 6
1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới 6

1.3.2. Các nghiên cứu tại Việt Nam 8
1.4. TỔNG QUAN VỀ THỰC TRẠNG Ô NHIỄM VÀ XỬ LÝ NƯỚC
NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Ở VIỆT NAM 10
1.5. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI SINH VẬT XỬ LÝ NƯỚC THẢI. 13
1.5.1. Ứng dụng vi sinh vật xử lý nước thải 13
1.5.2. Ứng dụng vi sinh vật xử lý nước thải nuôi trồng thủy sản 17
Chương 2 19
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG 19
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 19
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 19
2.3. ĐỊA ĐIỂM, PHẠM VI VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 19
2.3.1. Địa điểm nghiên cứu 19
2.3.2. Phạm vi nghiên cứu 20
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
2.4.1. Phương pháp thu mẫu ngoài thực địa 20
2.4.2. Phương pháp phân lập 20
2.4.3. Phương pháp giữ giống vi sinh vật 21
2.4.4. Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh protease của vi khuẩn 21
2.4.5. Xác định thời gian sinh enzyme protease mạnh nhất của vi khuẩn 22
2.4.6. Phương pháp nhuộm Gram 22
2.4.7. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn 23
2.4.8. Phương pháp xử lý nước thải thủy sản bằng vi khuẩn tuyển chọn
trong hệ thống bể sinh học hiếu khí 23
2.4.9. Xác định một số chỉ tiêu lý, hóa của nước 23
Chương 3 25
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25
3.1. PHÂN LẬP CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN
GIẢI PROTEIN TỪ NƯỚC THẢI THỦY SẢN 25
3.2. TUYỂN CHỌN CÁC VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI

PROTEIN CAO 27
3.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA 3 CHỦNG
VI KHUẨN TUYỂN CHỌN 29
3.3.1. Nghiên cứu thời gian sinh enzyme protease cao nhất 29
3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố nuôi cấy đến sinh trưởng
của các vi khuẩn 30
3.4. THỬ NGHIỆM XỬ LÝ NƯỚC THẢI NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
BẰNG BỂ SINH HỌC HIẾU KHÍ 32
3.4.1. Sự hay đổi giá trị pH của nước thải nuôi trồng thủy hải sản khi xử
lý bằng chủng vi khuẩn C8 33
3.4.2. Hàm lượng BOD
5
của nước thải thủy hải sản khi xử lý bằng chủng
vi khuẩn C8 34
3.4.3. Hàm lượng NH
4
+
của nước thải thủy hải sản khi xử lý bằng chủng
vi khuẩn C8 35
3.4.4. Hàm lượng photphat của nước thải thủy hải sản khi xử lý bằng
chủng vi khuẩn C8 36
3.4.5. Hàm lượng tổng chất rắn lơ lửng (TSS) 37
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39
1. Kết luận 39
2. Kiến nghị 39
DANH MỤC CÁC BẢNG
Số hiệu
Tên bảng
Trang
3.1

Các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải protein phân
lập từ nước thải nuôi trồng thủy sản ở Quảng Nam và
Đà Nẵng
25
3.2
Khả năng phân giải protein của các chủng vi khuẩn phân
lập
27
3.3
Đường kính vòng phân giải protein của 3 chủng vi
khuẩn
29
DANH MỤC CÁC HÌNH
Số hiệu
Tên Hình
Trang
3.1
Các chủng vi khuẩn có hoạt tính phân giải protein phân
lập được từ nước thải nuôi trồng thủy hải sản
26
3.2
Hình thái khuẩn lạc của một số chủng vi khuẩn phân lập
27
3.3
Đường phân giải protein của 3 chủng có hoạt tính mạnh
nhất
28
3.4
Vòng phân giải của 3 chủng vi khuẩn sau 48h nuôi cấy
29

3.5
Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của 3 chủng vi
khuẩn C2, C4, C8
30
3.6
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của 3 chủng
vi khuẩn C2, C4, C8
31
3.7
Vi khuẩn C8 khi nhuộm Gram
32
3.8.
Sự thay đổi pH của nước thải thủy sản sau các khoảng
thời gian xử lý
33
3.9
Sự thay đổi BOD của nước thải thủy hải sản sau các
khoảng thời gian xử lý
34
3.10
Hàm lượng NH4+ của nước thải nuôi trồng thủy hải sản
khi xử lý bằng chủng vi khuẩn C8
35
3.11
Hàm lượng photphat của nước thải nuôi trồng thủy hải
sản khi xử lý bằng chủng vi khuẩn C8
36
3.12
Hàm lượng chất rắn lơ lửng trong nước thải khi xử lý
bằng vi khuẩn C8

37
1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Việt Nam được xem là nước có tài nguyên biển khá đa dạng và
phong phú. Ngành đánh bắt, nuôi trồng và chế biến thuỷ hải sản chiếm tỷ
trọng khá lớn trong kim ngạch xuất khẩu của Việt Nam [1]. Trong những
năm gần đây, nhận thấy tầm quan trọng của nghề nuôi trồng thủy hải sản,
Chính phủ và Bộ Thuỷ sản đã dành sự ủng hộ mạnh mẽ cho phát triển bền
vững của nuôi trồng thủy hải sản. Chính vì thế ngành khai thác và nuôi
trồng thủy hải sản ở nước ta đã có những buớc tiến vượt bậc, đóng góp
quan trọng vào tổng kim ngạch xuất khẩu, giải quyết công ăn việc làm
cho hàng triệu lao động của nuớc ta [19].
Những năm gần đây, các tỉnh, thành phố duyên hải miền Trung đã tập
trung phát triển nuôi trồng thủy hải sản. Năm 2013, diện tích nuôi trồng toàn
vùng đạt xấp xỉ 34 nghìn ha. Sản lượng đạt hơn 180 nghìn tấn [1]. Hình thức
sản xuất trước đây chủ yếu theo hộ gia đình với quy mô nhỏ, song trong
những năm gần đây, ngành nuôi trồng thủy hải sản của vùng duyên hải miền
Trung đã và đang thu hút được nhiều nhiều nhà đầu tư sản xuất nuôi trồng,
kinh doanh thức ăn nuôi thủy sản và các dịch vụ thú y Tuy nhiên, việc phát
triển mạnh diện tích nuôi trồng đã gây ảnh hưởng xấu - làm suy thoái môi
trường trên diện rộng, trong đó có tỉnh Quảng Nam và Đà Nẵng. Tình trạng ô
nhiễm môi trường đang xảy ra nghiêm trọng trong nuôi trồng thủy sản do
phần lớn các chất hữu cơ dư thừa từ thức ăn, phân và các rác thải khác đọng
lại dưới đáy ao nuôi. Ngoài ra, còn các hóa chất, kháng sinh được sử dụng
trong quá trình nuôi trồng cũng dư đọng lại mà không được xử lý. Việc hình
thành lớp bùn đáy do tích tụ lâu ngày của các chất hữu cơ, cặn bã là nơi sinh
sống của các vi sinh vật gây thối, các vi sinh vật sinh các khí độc như NH
3
,

2
NO
2
, H
2
S, CH
4
Các vi sinh vật gây bệnh như: Vibrio, Aeromonas, E. Coli,
Pseudomonas, Proteus, Staphylococcus nhiều loại nấm và nguyên sinh động
vật làm phát sinh nhiều loại dịch bệnh nguy hại, ảnh hưởng lâu dài đến đời
sống và kinh tế người dân. Bên cạnh đó, việc xả chất thải chưa qua xử lí ra môi
trường đã và đang hủy hoại môi trường sinh thái, làm cạn kiệt nguồn nước ngọt
dùng cho sinh hoạt và nuôi trồng.
Tại Quảng Nam và Đà Nẵng hiện nay vẫn chưa có công trình nghiên cứu
nào về việc xử lý nước thải hồ nuôi cũng như đưa ra các biện pháp để giảm
thiểu ô nhiễm. Như vậy, việc tìm ra giải pháp xử lý ô nhiễm môi truờng, xử lý
nuớc thải nuôi trồng thủy hải sản đang là một vấn đề mang tính thời sự, rất
cấp bách. Xuất phát từ những cơ sở trên đây, chúng tôi tiến hành thực hiện đề
tài “Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng phân giải
protein và thử nghiệm xử lý nước thải nuôi trồng thủy hải sản tại Quảng
Nam – Đà Nẵng”
2. Mục tiêu đề tài
Tuyển chọn được các chủng vi khuẩn có hoạt tính protease mạnh
đồng thời xác định được khả năng xử lý nước thải hồ nuôi trồng thủy hải
sản của các chủng vi khuẩn tuyển chọn nhằm tìm ra giải pháp xử lý nước
thải nuôi trồng thủy hải sản đơn giản, hiệu quả, chi phí thấp và thân thiện
với môi trường.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
Đề tài cung cấp dữ liệu khoa học mới về khả năng và đặc điểm sinh học

các chủng vi sinh vật phân giải protein; đồng thời cung cấp cơ sở khoa học về
khả năng xử lý nước thải thủy sản ở quy mô phòng thí nghiệm của các chủng
vi khuẩn.
3
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở tốt để thiết lập quy trình xử lý
nước thải nuôi trồng thủy sản bằng vi sinh vật; góp phần phát triển sản xuất
bền vững, giảm thiểu ô nhiễm nước, bảo vệ môi trường.
4
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE
Protease là enzyme xúc tác thủy phân các mối liên kết peptide (CO-NH)
trong phân tử protein và các cơ chất tương tự. Nhiều protease có khả năng
liên kết este và vận chuyển acid amin. Nó được ứng dụng một cách rộng rãi
trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp chế biến thực phẩm, y học,
nông nghiệp, công nghiệp thuộc da, công nghiệp sản xuất xà phòng và
chiếm khoảng 60% thị truờng enzyme [10].
Chế phẩm enzyme protease có thể thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau
như thực vật, động vật và vi sinh vật. Tuy nhiên, hiện nay trên thế giới, đa số
các chế phẩm enzyme này được thu nhận từ vi sinh vật do có nhiều ưu điểm
vuợt trội như chu kỳ phát triển ngắn, môi truờng nuôi cấy rẻ, dễ điều khiển….
Vì vậy, hai phần ba protease ứng dụng trong công nghiệp được sản xuất ra từ
vi sinh vật, đặc biệt là vi khuẩn. Quá trình thu nhận các chế phẩm protease
phụ thuộc rất nhiều yếu tố như tính chất nguyên liệu, tác nhân vi sinh vật,
điều kiện thu nhận Vì vậy, tùy từng truờng hợp cụ thể, cần nghiên cứu lựa
chọn điều kiện thích hợp để thu nhận các chế phẩm protease phù hợp với mục
đích sử dụng. [2]
Theo phân loại quốc tế, các enzyme thuộc nhóm này chia thành 4 phân
nhóm phụ :

- Aminopeptidase : xúc tác sự thủy phân liên kết peptid ở đầu nitơ của
mạch polypeptid.
- Cacboxypeptydase : xúc tác sự thủy phân liên kết peptid ở đầu cacbon
của mạch polypeptid. Cả hai phân nhóm enzyme trên đều là các exo-
peptidase.
5
- Dipeptihydrolase : xúc tác sự thủy phân các liên kết dipeptid.
- Proteinase : xúc tác sự thủy phân các liên kết peptid nội mạch.
Trong cơ thể, các protease đảm nhiệm nhiều chức năng sinh lý như: hoạt
hóa zymogen, đông máu và phân hủy sợi fibrin của cục máu đông, giải phóng
hormon và các peptid có hoạt tính sinh học từ các tiền chất, vận chuyển
protein qua màng [7]. Ngoài ra, các protease có thể hoạt động như các yếu
tố phát triển của cả tế bào ác tính và tế bào bình thường đó là tăng sự phân
chia tế bào, sinh tổng hợp ADN [10]. So với protease động vật và thực vật,
protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi
sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau
về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó phân tách ra dưới
dạng tinh thể đồng nhất. Do phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên
protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân
triệt để và đa dạng [8].
1.2. TỔNG QUAN VỀ CÁC LOẠI VI SINH VẬT SINH TỔNG HỢP
ENZYME PROTEASE
1.2.1. Vi khuẩn
Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn,
chiếm 59% sản lượng enzyme được dùng. Protease của động vật và thực vật
chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn
có khả năng sinh ra hai loại trên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu
cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong
phân tử protein.
Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là

Bacillus subtilis, B.mesentericus, B.thermorpoteoliticus và một số Clotridium.
Trong đó, B.subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất. Các vi khuẩn
thường tổng hợp protease ở vùng pH trung tính và kiềm yếu là thích hợp nhất.
6
Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động trong khoảng pH hẹp (pH 5-8)
và có khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân
protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh
dưỡng. Các protease trung tính có khả năng ái lực cao với các amino acid ưa
béo và thơm. Chúng được sinh ra nhiều bởi Bacillus subtilis, B.mesentericus,
B.thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clotridium [11].
1.2.2. Nấm
Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được
ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm như các chủng: Aspergillus,
A.terricola, A.saitoi… Các nấm mốc này có khả năng sinh cả ba loại protease:
acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu là các protease acid,
có khả năng thủy phân protein ở pH 2.5-3. Một số nấm mốc như
A.candidatus, P.camerberti, P.roqueforti… cũng có khả năng tổng hợp
protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất phomat [22].
1.2.3. Xạ khuẩn
Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi
khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng tìm ra một số chủng có khả
năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S.fradiae,
S.terimosus,…[11].
1.3. TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VI KHUẨN PHÂN
GIẢI PROTEIN
1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới
Trong các protease, các enzyme của hệ tiêu hóa được nghiên cứu sớm
hơn cả. Năm 1857, Corvisart tách được tripxin từ dịch tụy, đó là protease đầu
tiên nhận được ở dạng chế phẩm. Năm 1861 Brucke cũng đã tách được
pepxin từ dịch dạ dày chó ở dạng tương đối tinh khiết. Ngoài các enzyme của

hệ tiêu hóa, người ta cũng đã quan sát đầu tiên về các Protease trong máu [5].
7
Các protease thực vật được phát hiện muộn hơn. Năm 1879 Wurtz được xem
là người đầu tiên tách được protease thực vật. Đến nay người ta đã nghiên cứu
được khá đầy đủ về cấu trúc phân tử của nhiều protease như: papain, tripxin,
kimotripxin, subtilizin… Các protease của vi sinh vật mới được nghiên cứu
nhiều từ năm 1950, mặc dù từ năm 1918- 1919 Waksman đã phát hiện được
khả năng phân giải protein của xạ khuẩn. Trong hơn 10 năm nay, số công
trình nghiên cứu protease vi sinh vật tăng lên đáng kể, nhiều hơn các protease
của động và thực vật. Những kết quả đạt được trong lĩnh vực này đã góp phần
mở rộng quy mô sản xuất chế phẩm enzyme và ứng dụng enzyme trong thực
tế [5].
Trong công nghệ thực phẩm, người ta sử dụng protease để sản xuất
phomat từ sữa (Mohanty và cộng sự, 1999), sản xuất bánh từ bột mì (Hozova
và cộng sự, 2003) hay chế biến các sản phẩm giàu protein từ đậu tương
(Ghazi và cộng sự, 2003; Ma và cộng sự, 2004); trong công nghiệp thuộc da,
protease được dùng để thủy phân một số thành phần phi collagen của da và
loại bỏ các protein phi fibrin như albumin, globulin (Gupta và Rammani,
2006); trong chất tẩy rửa, protease là một trong những thành phần quan trọng
của tất cả các loại chất tẩy rửa, từ các chất tẩy rửa dùng trong gia đình đến
những chất làm sạch kính hoặc răng giả, kem đánh răng (Rao và cộng sự,
1998). Trong những năm gần đây, giá trị thương mại của các enzyme công
nghiệp trên toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD, trong đó chủ yếu là các
enzyme thủy phân (75%), và protease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất
sử dụng trong công nghiệp (60%) (Rao và cộng sự, 1998).
Từ năm 1950 trở lại đây trên thế giới có hàng loạt protease động vật,
thực vật và vi sinh vật được tách chiết nghiên cứu. Thời gian gần đây các nhà
khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu về protease vi sinh vật và đã đạt
nhiều thành tựu to lớn về lĩnh vực này (protease từ vi sinh vật chiếm tới 40%
8

tổng doanh thu của enzyme toàn thế giới (Godfrey west, 1996). Hiện nay,
số lượng các enzyme được sản xuất hàng năm trên thế giới, ở các nước
phát triển nhất là châu Âu, Mỹ và Nhật Bản vào khoảng 300.000 tấn với
doanh thu từ sản xuất enzyme ước tính vào khoảng 500 triệu USD [10].
Trong đó khoảng 600 tấn protease tinh khiết được sản xuất từ vi sinh vật
bao gồm khoảng 500 tấn từ vi khuẩn và 100 tấn từ nấm mốc. Những nước
có công nghệ sản xuất và ứng dụng protease tiên tiến trên thế giới là: Đan
Mạch, Nhật Bản, Mỹ, Anh, Pháp, Hà Lan, Trung Quốc, Đức, Áo. Các nước
này đã đầu tư thích đáng cho công tác nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng
protease từ vi sinh vật. Chính vì thế nhịp độ sản xuất protease ở quy mô
công nghiệp tại các nước phát triển hàng năm tăng vào khoảng 5% - 10%.
Ngày nay người ta có thể sản xuất các enzyme cố định trên các chất mang
không tan cho phép có thể tái sử dụng enzyme nhiều lần. Vì vậy mà việc
ứng dụng protease ngày càng gia tăng [18].
1.3.2. Các nghiên cứu tại Việt Nam
Từ nước thải một số nhà máy thủy sản, Trương Thị Mỹ Khanh và Vũ
Thị Hương Lan (2012) đã phân lập được 6 chủng vi khuẩn có khả năng phân
giải protein. Bước đầu ứng dụng vào việc xử lý nước thải thủy sản đã mang
lại hiệu quả cao, nước thải sau khi xử lý đều đạt tiêu chuẩn xả thải loại B theo
QCVN 24: 2009/BTNMT [20]. Phạm Bích Hiên và cộng sự (2012) đã phân
lập được 17 chủng vi sinh vật có khả năng phân giải xenluloza, 12 chủng
phân giải tinh bột và 6 chủng phân giải protein từ các mẫu phân ủ, thức ăn và
chất thải chăn nuôi, phân ủ từ rác thải, phế phụ phẩm nông nghiệp, bã nấm
Sàng lọc được 15 chủng sinh trưởng mạnh, hoạt tính sinh học ổn định và đa
hoạt tính, trong đó chủng vi khuẩn B15 có hoạt tính phân giải protein mạnh
nhất, từ đó chủng vi sinh vật này được sử dụng để tạo chế phẩm sinh học xử
lý chất thải rắn chăn nuôi [14].
9
Võ Hồng Thi và cộng sự (2012) đã tuyển chọn 10 chủng Bacillus có khả
năng phân giải protein tốt. Kết quả khảo sát cho thấy, sau thời gian 72 giờ

nuôi cấy ở các điều kiện pH 7 và 50
0
C, hoạt tính protease của cả 10 chủng
đều đạt cực đại và dao động trong khoảng từ 1 đến 1,15U/ml. Đó là cơ sở để
tiếp tục triển khai nghiên cứu ứng dụng khả năng xử lý nước thải chế biến thịt
và thủy hải sản trong thực tế với các tổ hợp Bacillus tuyển chọn. [21]. Từ các
mẫu đất, nước tại địa bàn Hà Nội đã tuyển chọn được 4 chủng vi sinh vật có
khả năng làm sạch nước thải và sử dụng chúng để tạo chế phẩm vi sinh vật đó
là: chủng Bacillus TL1, chủng L. plantarum L5, chủng Nitrosomonas NA7 và
chủng Nitrobacter NT2. Chế phẩm probiotic được tạo dưới dạng rắn, bước
đầu thử nghiệm chế phẩm trong xử lý nước thải thủy sản. Kết quả cho thấy,
chất lượng nước đã chuyển biến đáng kể theo chiều hướng tích cực sau 10
ngày xử lý (theo Nguyễn Thị Quỳnh Trang, 2011) [9].
Lê Nguyễn Ðoan Duy và cộng sự (2014) khảo sát khả năng sinh tổng
hợp enzyme protease từ Aspergillus oryzae trên môi truờng bán rắn với cơ
chất cảm ứng là gelatin cũng như xác định các thông số động học của enzyme
như pH, nhiệt độ tối ưu, V
max
và K
m
. Kết quả cho thấy, thành phần môi truờng
bán rắn nuôi cấy thích hợp là hỗn hợp 70% cám, 25% trấu, 5% gelatin với độ
ẩm môi truờng là 60%, nhiệt độ ủ 30°C, pH = 5 trong thời gian 72 giờ.
Enzyme thu hồi thể hiện hoạt tính tối ưu ở nhiệt độ 45°C và pH = 5,5. Ðộng
học của enzyme protease được xác định trên cơ chất casein có V
max
= 1,2548
µmol/phút và K
m
= 0,3932%. Khả năng thủy phân của enzyme protease trong

dịch acid protein (da cá tra ngâm acid acetic trong 24 giờ) ứng với thời gian
thuỷ phân là 50 phút với thể tích dung dịch enzyme là 1ml protein, pH dung
dịch là 3,2 và nhiệt độ thuỷ phân là 45°C. Kết quả đã chỉ ra rằng, enzyme
protease có nguồn gốc từ Aspergillus oryzae được nuôi cấy trên môi trường
bán rắn có khả năng sử dụng tốt trong việc thủy phân dung dịch protein [6].
10
Nhìn chung, các công trình nghiên cứu trên đã mang lại nền tảng cơ bản
cho việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có hoạt tính protease,
tuy nhiên các nghiên cứu này tập trung nhiều vào việc thu nhận enzyme
protease để ứng dụng trong sản xuất thực phẩm hay các chế phẩm phục vụ
nông nghiệp, ngư nghiệp…Những nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật phân giải
protein vào xử lý nước thải nuôi trồng thủy hải sản còn khá hạn chế, mặc dù
tiềm năng của vi sinh vật này là rất lớn, chưa được khai thác ở nước ta.
1.4. TỔNG QUAN VỀ THỰC TRẠNG Ô NHIỄM VÀ XỬ LÝ NƯỚC
NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Ở VIỆT NAM
Trong khi tỷ trọng đóng góp của khối nông, lâm nghiệp và thủy sản vào
tổng GDP cả nước liên tục giảm từ 24,5% năm 2000 xuống khoảng 21% năm
2009, tỷ trọng của riêng lĩnh vực nuôi trồng thủy sản vẫn tăng dần, từ 2,7%
năm 2000 lên gần 5% năm 2009. Sự tăng trưởng của nuôi trồng thủy sản chủ
yếu là nhờ vào những tiến bộ về kỹ thuật nuôi, sự công nghiệp hóa quá trình
nuôi để cho năng suất nuôi cao hơn. Tuy nhiên, đồng hành với sự tăng trưởng
lại là những cảnh báo ngày càng gia tăng về tác động xấu đến môi trường do
sự phát triển quá nóng, thiếu quy hoạch, thiếu bền vững của nuôi trồng thủy
sản. Ví dụ, loại hình nuôi tôm trên cát cho lợi nhuận rất cao, nhưng đang gây
ra hai vấn đề môi trường đáng lo ngại cho vùng ven biển miền Trung là khai
thác nước ngầm quá mức (do nhu cầu nuớc ngọt dùng để pha với nước biển
làm nước nuôi rất lớn, ước khoảng 16.000 – 27.000 m
3
/ha/vụ nuôi) và nước
thải gây ô nhiễm cho môi trường xung quanh. Hậu quả lâu dài sẽ làm cạn kiệt

nguồn nước ngọt, nước ngầm và ô nhiễm biển, gây mặn hóa đất và nước
ngầm, thu hẹp diện tích rừng phòng hộ, làm tăng hoạt động cát bay và bão
cát. Thông thường ở nước ta, việc xử lý nước thay ra để tuần hoàn được tiến
hành trong một ao lắng và một ao xử lý, chiếm tỷ lệ 15-20% diện tích; trong
ao xử lý có thể thả nuôi cá rô phi, các loài nhuyễn thể (vẹm, sò huyết ).
11
Trong các loại hình nuôi trồng thủy sản, một lượng rất lớn thức ăn, phân
vô cơ, phân hữu cơ được đưa vào ao nuôi nhằm tăng năng suất sản phẩm.
Hiệu quả sử dụng các thành phần bổ sung này thường khá thấp, ví dụ lượng
thức ăn đưa vào chỉ được hấp thu khoảng 25 - 30%. Do vậy nước thải từ các
ao nuôi rất giàu các chất hữu cơ (từ thức ăn, phân bón), nitơ, photpho (từ phân
hủy các protein) và chất rắn lơ lửng. Với mật độ vi sinh vật hữu ích thấp, việc
xử lý bằng các ao tự nhiên khó đạt yêu cầu chất lượng nước (giảm BOD,
COD, N, P) để tuần hoàn và đòi hỏi diện tích ao lớn [13].
Hiện nay, có rất nhiều loại sản phẩm thuốc, hoá chất và chế phẩm sinh
học (CPSH) được dùng rộng rãi trong nuôi trồng thuỷ sản. Hoá chất được
dùng thuờng ở các dạng sau: thuốc diệt nấm, thuốc khử trùng, thuốc diệt tảo,
thuốc trừ cỏ, thuốc trừ sâu, thuốc diệt ký sinh trùng và thuốc diệt khuẩn và
chất kháng sinh được sử dụng đáng kể trong nuôi trồng thuỷ sản hoặc để chữa
các bệnh lây nhiễm hoặc phòng bệnh.
Những hoá chất trên có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ sức khoẻ
động vật thuỷ sản nếu như sử dụng đúng, nhưng khi lạm dụng dẫn dến
những hậu quả khôn lường, gây rủi ro cho người lao động, tồn dư các chất
độc trong sản phẩm thuỷ sản gây hại cho nguời tiêu dùng, làm giảm giá trị
thương phẩm và còn tạo các chủng vi khuẩn kháng thuốc làm giảm hiệu
quả trong điều trị bệnh.
Thành phần lớp bùn trong các đầm, ao nuôi trồng thuỷ sản chủ yếu là các
chất hữu cơ như protein, lipid, axit béo với công thức chung
CH
3

(CH
2
)
n
COOH , photpholipids, Sterol - vitamin D3, các hoocmon,
carbohydrate, chất khoáng và vitamin, vỏ tôm lột xác, Lớp bùn này luôn ở
trong tình trạng ngập nước, yếm khí, các vi sinh vật yếm khí phát triển mạnh,
phân huỷ các hợp chất trên tạo thành các sản phẩm là khí H
2
S, NH
3
, CH
4
,
rất có hại cho thủy sinh vật, ví dụ nồng độ 1,3 ppm của H
2
S có thể gây sốc, tê
12
liệt và thậm chí gây chết tôm. Khí NH
3
cũng được sinh ra từ quá trình phân
huỷ yếm khí thức ăn tồn dư gây độc trực tiếp cho tôm, làm ảnh hưởng đến độ
pH của nước và kìm hãm sự phát triển của thực vật phù du (Hassanai
Kongkeo, 1990). Tóm lại, các chất ô nhiễm chủ yếu trong nuớc thải nuôi
trồng thuỷ sản bao gồm:
- Các bon hữu cơ (gồm thức ăn, phân bón, chế phẩm sinh học )
- Nitơ được phân huỷ từ các protein
- Photpho phân huỷ từ các protein
Có rất nhiều phương pháp sinh học đã và đang được ứng dụng rộng rãi
trong xử lý ô nhiễm môi trường, đặc biệt là các chất thải hữu cơ. Tiêu biểu là

việc sử dụng hệ sinh vật để phân hủy hoặc hấp thụ/hấp phụ các chất ô nhiễm
hữu cơ, vô cơ từ chất thải nuôi trồng thủy sản. Có thể nêu lên một số phương
pháp sau : Sử dụng hệ vi sinh vật dễ phân hủy các chất hữu cơ trong chất thải;
sử dụng hệ động thực vật thủy sinh để hấp thụ các chất hữu cơ. Có một số loài
vi sinh vật có khả năng sử dụng các chất hữu cơ và một số chất khoáng làm
nguồn dinh duỡng và tạo năng lượng, sinh trưởng và nhờ vậy sinh khối của
chúng tăng lên. Các vi sinh vật này được sử dụng để phân huỷ các chất ô
nhiễm hữu cơ và vô cơ có trong chất thải từ nuôi trồng thủy sản. Quá trình
phân hủy này được gọi là quá trình phân hủy ôxy hóa sinh hóa.
Benjamas và cộng sự (2003) đã tiến hành thả vi khuẩn lam Spirulina
platensis trong bể nuôi tôm hùm để kiểm soát chất lượng nước. Kết quả
nghiên cứu cho thấy, hàm lượng nitơ vô cơ (NH
4
, NO
2
, NO
3
) được xử lý khá
hiệu quả. Khi số lượng vi khuẩn này tăng có nguy cơ gây ô nhiễm nguồn
nước thì sẽ được vớt ra khỏi bể (kích thuớc vi khuẩn lam khá lớn) [19].
Yanbo Wang và Zhenli He (2009) đã theo dõi ảnh hưởng của vi sinh vật
hữu ích (men vi sinh) lên họat tính của phosphate kiềm (APA) và hàm lượng
dinh dưỡng (Tổng lân: TP, tổng lân vô cơ: TIP, tổng lân hữu cơ: TOP, tổng
13
carbon hữu cơ: TOC và tổng đạm: TN) trong nền đáy các ao nuôi tôm thẻ
chân trắng. Ba ao được xử lý với men vi sinh thương mại và 3 ao được sử
dụng làm ao đối chứng (không sử dụng bất kỳ loại men vi sinh nào). Kết quả
cho thấy TP thấp hơn có ý nghĩa (P<0.05) trong nhóm ao có sử dụng men vi
sinh so với nhóm ao đối chứng vào ngày 20, 40 và 60 sau khi xử lý. Tuy
nhiên, sự khác nhau về hàm lượng TP được giảm tới mức thấp nhất sau 80

ngày xử lý. Hàm lượng TIP trong nền đáy của nhóm ao có xử lý là thấp hơn
(P<0.05) so với nhóm ao không xử lý vào ngày 20, 40 và 80. Việc cung cấp
các vi sinh vật hữu ích đã làm giảm đi rõ rệt lượng TN và TOC (P<0.05)
trong nhóm ao có xử lý sau ngày thứ 20. Số liệu thu được cũng chứng minh
rằng việc sử dụng men vi sinh sẽ làm giảm đi sự ô nhiễm N và P trong nền
đáy ao nuôi.
Angela D. Schulze và cộng sự (2006) đã tiến hành nghiên cứu về sự
đa dạng các dòng vi khuẩn trong các trại sản xuất giống cá biển và nhuyễn
thể được xác định ở Bristish Columbia bởi vì khả năng duy trì sự cân
bằng thích hợp của các nhóm vi sinh này có thể là chìa khoá thành công
trong việc quản lý môi trường nuôi. Trong tổng số 589 dòng phân lập
được, có 172 ngành đã được định danh bằng phương pháp định týp 16S
ribosomal DGGE. 60% của các dòng trên đã được giải trình tự cho thấy
chúng thuộc 112 dòng/chủng vi khuẩn khác nhau. 20% trong những dòng
được định danh thường xuyên xuất hiện trong các trại giống và trong môi
trường nước mặn có khoảng hơn 3 loài.
1.5. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI SINH VẬT XỬ LÝ NƯỚC THẢI
1.5.1. Ứng dụng vi sinh vật xử lý nước thải
Có một số loài vi sinh vật mà chủ yếu là vi khuẩn dị dưỡng hoại sinh có
trong nước thải có khả năng sử dụng các chất hữu cơ và một số chất khoáng
làm nguồn dinh dưỡng và tạo năng lượng, sinh trưởng [7].
14
Phương pháp này dựa trên cơ sở là hoạt động của vi sinh vật vì vậy điều
kiện đầu tiên và vô cùng quan trọng là nước thải phải là môi trường sống của
quần thể vi sinh vật phân hủy các chất hữu cơ có trong nước thải [7].
Từ yêu cầu trên mà nước thải phải thỏa mãn những yêu cầu sau:
+ Không có chất độc làm chết hay ức chế hoàn toàn hệ vi sinh vật trong
nước thải. Trong số các chất độc phải chú ý đến hàm lượng kim loại nặng [7].
+ Chất hữu cơ có trong nước thải phải là cơ sở chất dinh dưỡng nguồn
cacbon và năng lượng cho vi sinh vật. Những chất dinh dưỡng đó thường là

hidratcacbon, protein, lipit hòa tan [7].
+ Nước thải đưa vào xử lý sinh học có hai thông số đặc trưng là COD và
BOD. Tỉ số của hai thông số này là phải là: COD/BOD  2 hay BOD/COD 
0,5 mới có thể đưa vào xử lý sinh học hiếu khí. Nếu COD lớn hơn BOD nhiều
lần, trong đó có cellulose, hemicelluloses, protein, tinh bột chưa tan thì phải
xử lý bằng sinh học kị khí hay thêm các biện pháp xử lý hóa lý như kết tủa,
hấp phụ, v.v… [7].
a. Xử lý nước thải bằng ao hồ sinh học
Ao hồ sinh học hay còn gọi là ao hồ ổn định nước thải, đây là
phương pháp đơn giản nhất và đã được áp dụng từ thời xa xưa. Phương
pháp này không yêu cầu kỹ thuật cao, vốn đầu tư ít, chi phí hoạt động rẻ
tiền, quản lý đơn giản, hiệu quả cao, song yêu cầu về diện tích mặt bằng
lớn và quá trình xử lý có thể sinh ra mùi khó chịu. Cơ sở khoa học của
phương pháp này là dựa vào quá trình tự làm sạch của nước liên quan tới
hoạt động sống của giới thủy sinh. Hoạt động sống của chúng dựa trên
quan hệ cộng sinh của toàn bộ quần thể sinh vật có trong nước [19].
Hồ sinh học chia thành các loại tùy theo độ sâu và mục đích sử dụng
[19].
15
- Ao hồ hiếu khí
- Ao hồ kị khí
- Ao hồ hiếu khí – kị khí
- Ao hồ ổn định xử lý bậc III
b. Cánh đồng tưới và bãi lọc
Việc thực hiện xử lý nước thải trên những cánh đồng tưới và bãi lọc là
dựa vào khả năng giữ cặn của nước trên mặt đất, nước thấm qua đất như đi
qua lọc, nhờ có oxy trong các lỗ hổng và mao quản của lớp đất mặt, các vi
sinh vật hiếu khí hoạt động phân hủy các chất hữu cơ nhiễm bẩn. Càng sâu
xuống, lượng oxy càng ít nên quá trình oxy hóa chất nhiễm bẩn giảm dần.
Cuối cùng đến độ sâu mà tại đó chỉ còn diễn ra quá trình khử nitrat. Các cánh

đồng tưới và bãi lọc chỉ xây dựng ở những nơi có mực nước nguồn thấp hơn
so với mặt đất [19].
c. Xử lý nước thải dựa trên cơ sở sinh trưởng lơ lửng của vi sinh vật
Trong nước thải luôn có những hạt chất rắn lơ lửng và khó lắng, đây
là những giá thể giúp cho vi sinh vật có thể bám vào phát triển thành
những bông cặn có khả năng phân hủy chất hữu cơ trong nước thải. Người
ta có thể ứng dụng sinh trưởng lơ lửng để xử lý nước thải kỵ khí hay hiếu
khí [19].
Những công trình xử lý nước thải hiếu khí ứng dụng sinh trưởng lơ lửng
với vi khuẩn hiếu khí như aeroten, mương oxy hóa, bể arotank, …Những
công trình xử lý nước thải kỵ khí ứng dụng sinh trưởng lơ lửng với vi khuẩn
kỵ khí bắt buộc như xử lý bằng tiếp xúc kỵ khí ANALIFT, xử lý nước thải ở
lớp bùn kỵ khí và dòng nước hướng lên UASB hay còn gọi là lên men ở lớp
bùn ANAPULSE. Phương pháp này có thể loại bỏ BOD
5
80 – 95%, COD từ
65 – 90% với những nước thải bị ô nhiễm nặng [19].
16
d. Xử lý nước thải dựa trên cơ sở sinh trưởng bám dính của vi sinh vật
Trong dòng nước thải có những vật rắn làm giá mang, giá mang là nơi
các vi sinh vật dính bám. Trong số những vi sinh vật thì có những loài có khả
năng sinh ra chất dẻo hay polymer sinh học, chất này có khả năng sính nhờ
vậy có càng nhiều vi khuẩn và ngày càng dày lên gọi là màng sinh học. Màng
này có khả năng kết dính những động vật nguyên sinh, trứng giun sán,… làm
cho nước thải được làm sạch [5].
Những công trình hiếu khí xử lý nước thải ứng dụng màng sinh học như
lọc sinh học, đĩa quay sinh học, BIOFOR, NITRAZUR, OIUR,
BIODROP…[5].
Những công trình kỵ khí xử lý nước thải ứng dụng màng sinh học như
lọc kỵ hí với sinh trưởng gắn kết trên giá mang hữu cơ (ANAFIZ), lọc kỵ khí

với vật liệu giả lỏng trưng nở (ANAFLUX) [5].
e. Xử lý bằng quá trình hợp khối
Quá trình hợp khối trong xử lý nước thải là quá trình kết hợp các phương
pháp hiếu khí, kỵ khí và thiếu khí nhằm xử lý nước thải một cách triệt để [13].
Quá trình hợp khối này thường ứng dụng để khử N và P trong nước.
trong quá trình hiếu khí thì nitơ ở dạng amoni sẽ được chuyển hóa thành nitrat
nhờ những vi khuẩn Notrosomonas và Nitrobacter. Trong điều kiện thiếu khí
thì nitrat lại được các vi khuẩn khử nitrat chuyển hóa thành nitơ phân tử bằng
cách tách đi oxy của nitrat và nitrit. Với muối chứa photpho như polyphotphat
người ta ứng dụng quá trình photphoryl hóa của vi khuẩn kỵ khí tùy tiện
Acinetobacter sp để khử photpho [13].
Dựa trên nguyên lý này, người ta đã thiết lập một quy trình xử lý
nước thải theo phương pháp bùn hoạt tính để khử BOD, N, P trong hệ
thống Bardenpho (gồm hệ thống các bể kỵ khí, bể thiếu khí, bể hiếu
khí,…) [13].