Nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh sản cellulase trong đất đồi tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỘC Sư PHẠM HÀ NỘI 2
NGUYÊN THỊ MINH NGUYỆT
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINHCELLƯLASE
TRONG ĐẤT ĐÒI TẠI KHU Vực XUÂN HÒA, PHÚC YÊN, VĨNH
PHÚC
Chuyên ngành: Sinh thái học
Mã số: 60 42 01 20
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Người hưởng dẫn: PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Cellulose là thành phần quan trọng cấu tạo nên lớp thành tế bào thực vật. Đó là một loại
polysaccharide có cấu trúc phức tạp. Việc phân huỷ cellulose bằng các tác nhân lý hóa gặp nhiều
khó khăn, làm ảnh hưởng đến tốc độ của nhiều quá trình sản xuất công nghiệp. Enzyme cellulase là
nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết (3-1,4-O-glycoside trong phân tử cellulose,
olygosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tương tự khác.
Hiện nay, việc sử dụng các enzyme như cellulase trong một số ngành công nghiệp như: công
nghiệp thực phấm, công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, công nghiệp giấy, sản xuất dung môi hữu
cơ và đặc biệt trong xử lý rác thải hữu cơ là vấn đề đang được con người đặc biệt quan tâm.
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh được enzyme cellulase có nhiều khả năng và trìên Võng
giải quyêt vân đê nêu trên trõtĩg giám định và xử lý ô nhiễm môi trường. Chúng có thế hoạt động
trên chất thải khó xử lý, làm thay đổi đặc tính của chất thải và đưa chúng về dạng dễ xử lý hoặc
chuyển thành các sản phẩm có giá trị hơn. Enzyme cellulase được sinh tổng họp bởi nhiều loài khác
nhau như: các loài xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm mốc, nấm men và động vật nguyên sinh. Ngoài ra,
cellulase còn có ở các loài sinh vật khác như thực vật và động vật.Trong số các nhóm vi sinh vật
nêu trên thì xạ khuấn phân giải cellulose là một trong những đối tượng đã và đang được các nhà
khoa học đặc biệt quan tâm.
Xạ khuẩn trong đất là một trong các nhóm sinh vật đất có số lượng lớn. Chúng chiếm tới 10 -
70 % số tế bào vi sinh vật trong đất. Ở môi trường trung tính xạ khuẩn phát triển mạnh nhất trong
đất giàu hữu cơ và thông thoáng. Xạ khuẩn có vai trò phân giải chất hữu cơ và nhất là phân giải
đường tan trong nước, hemicelluỉose và cellulose. Xạ khuẩn tham gia vào quá trình hình thành các

acid mùn. Một vài loài xạ khuẩn có khả năng cố định nitơ tự do từ khí trời khi cộng sinh với thực
vật thuộc bộ đậu. Xạ khuẩn là vi sinh vật tạo ra kháng sinh chủ yếu (tới 80 % chất kháng sinh) vì
thế trong đất có nhiều xạ khuẩn cây trồng ít bị bệnh hơn [8].
Phường Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc có diện tích tự nhiên là 423,9 ha, trong đó đất diện
tích đất đồi (lâm nghiệp) là 22,3 ha. Đất này có thành phần cơ giói nhẹ, thường có kết cấu kém
hoặc không có kết cấu, tầng đất mỏng do dễ bị rửa trôi, hàm lượng mùn thấp [11]. Do vậy, việc
khảo sát các chủng xạ khuẩn trong đất đồi có khả năng phân hủy cellulose cao là việc có ý nghĩa
hết sức quan trọng trong việc cải tạo đất và bảo vệ môi trường. Xuất phát tù’ những lý do trên,
chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh cellulase trong đất
đồi tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc
2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose góp phần tăng độ phì
nhiêu của đất đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
3.1. Sơ lược đặc điểm tự nhiên khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc.
3.2. Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn từ đất đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc.
3.3. Đặc điểm hình thái của cuống sinh bào tử, bào tử và tính chất nuôi cấy của 2 chủng Đ4, Đ12
2
3.4. Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường và điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh
cellulase của 2 chủng xạ khuẩn Đ4, Đ12.
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cún
Một số chủng xạ khuấn có khả năng phân giải cellulose từ đất đồi tại khu vực Xuân Hòa,
Phúc Yên, Vĩnh Phúc; thời gian nghiên cứu từ tháng 7 năm 2012 đến tháng 7 năm 2013.
5. Phương pháp nghiên cửu
5.1. Phương pháp lấy mẫu
5.2. Phương pháp phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski
5.3. Phương pháp bảo quản chủng giống
5.4. Phương pháp quan sát hình thái xạ khuẩn
5.5. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn
5.6. Phương pháp xác định hoạt tính cellulase của xạ khuấn

5.7. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả
6. Những đóng góp mói của đề tài
Đây là những kết quả nghiên cứu đầu tiên khảo sát sự có mặt của một sô chủng xạ khuân có
khả năng sinh enzyme Cẽllulãsẽ trõíig đât đồi tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc.
NỘI DUNG CHƯƠNG 1. TỒNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm và phân loại xạ khuẩn
Xạ khuấn (Ạctinomycetes) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có trong đất, nước,
rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn, nấm mốc không phát triển được. Sự
phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác của thảm thực vật.
Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 - 2.400.000 mầm xạ khuẩn, chiếm 9
- 45% tổng số vsv [32]. Sự phân bố của xạ khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường.
Chúng có nhiều trong các lóp đất trung tính và kiềm yếu hoặc acid yếu 6,8 - 7,5. Xạ khuẩn có rất ít
trong lóp đất kiềm hoặc acid và càng hiếm trong các lóp đất rất kiềm, số lượng xạ khuấn cũng thay
đối theo thời gian trong năm.
Xạ khuẩn tham gia tích cực vào quá trình chuyển hóa nhiều hợp chất trong đât, nước, dung
đê sản xuât nhiêu enzyme như protéase, amylase, cellulase một số acid amin và acid hữu cơ. Một
số xạ khuẩn có thể gây bệnh cho người, động vật [6].
3
1.1.1. Một số phương pháp trong phân loại xạ khuẩn
Cùng với sự phát triển mạnh của sinh học phân tử, hóa sinh học, lý sinh học nên việc định
tên một chủng xạ khuẩn được tiến hành tương đối nhanh chóng và chính xác với nhiều phương
pháp như phân loại số, nghiên cứu chủng loại phát sinh Song người ta vẫn chủ yếu dựa vào các
đặc điểm hình thái, nuôi cấy đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học và sinh học phân tử.
1.1.1.1. Đặc đỉêm hình thải và tỉnh chât nuôi cây
Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy là một trong những thông tin quan trọng để phân
loại xạ khuẩn. Đe làm cho các chủng xạ khuẩn cần định loại biểu hiện đầy đủ các đặc điểm, người
ta thường xuyên nuôi cấy chúng trên môi trường dinh dưỡng khác nhau trong điều kiện nhiệt độ và
thời gian nhất định. Tiến hành quan sát mô tả chụp ảnh và ghi lại những đặc điếm hình thái và nuôi
cấy của xạ khuẩn, đặc biệt là cơ quan mang bào tử, hình dạng và bề mặt bào tử. dựa vào đặc điểm
hình thái người ta chia xạ khuẩn thành 4 nhóm chính:

Nhóm 1: Gồm các xạ khuẩn mang bào tủ' rõ rệt, sinh sản bằng bào tủ’ và phân hóa thành
HSKS và HSCC.
Nhóm 2: Gồm các xạ khuẩn có bào tử nang, hệ sợi phân chia theo hướng vuông góc với nhau
tạo thành các cấu trúc tương tự nang bào tử.
Nhóm 3: Gồm các xạ khuấn có dạng Nocardia, sinh sản bằng cách phân đốt hệ sợi.
Nhóm 4: Gồm các xạ khuấn có dạng Corynebacter và dạng cầu, tế bào có hình chữ V,T
thường không có hệ sợi.
Dựa vào nghiên cứu các xạ khuấn trên các môi trường khác nhau người ta chia hình chuỗi
bào tử thành 6 kiểu:
+ Kiểu s (Spira): chuỗi bào tủ’ xoắn.
+ Kiểu SRA (Spira Rectinaculum Apertum): chuỗi bào tử xoắn có dạng móc câu hay xoắn
không hoàn toàn.
+ Kiểu SRJF (Spira Rectus Flexibilis): chuỗi bào tủ* xoắn, cong đến
thẳng.
+ Kiểu RA (Rectinaculum Apertum): chuỗi bào tử có móc có khóa.
+ Kiểu RA - RF (Rectinaculum Apertum - Rectus Flexibilis): chuỗi bào tử có móc hay xoắn
không hoàn toàn.
+ Kiểu RF (Rectus Flexibilis): chuỗi bào tử thẳng lượn sóng.
Việc sử dụng các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy vẫn coi là những dữ liệu cơ bản
4
dùng trong phân loại xạ khuẩn. Tuy nhiên, như ta đã biết xạ khuẩn rất không bền vững về mặt di
truyền, thường xuyên xảy ra sự sắp xếp lại trong trong phân tử DNA. Trong cùng một loài có thể
biểu hiện khác nhau về hình thái hay những loài khác nhau có thế giống nhau về mặt hình thái. Vì
vậy, để phân loại được chính xác, ngày nay người ta cần nghiên cứu thêm các chỉ tiêu khác bổ sung
như đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học hay sinh học phân tử [24].
1.1.1.2. Đặc điểm hóa phân loạỉ( Chemotaxonomỵ)
Đặc điểm hóa phân loại được sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong vòng 20 năm trở lại đây.
Đây là phương pháp cơ bản và có hiệu quả thông qua việc định tính và định lượng thành phần hóa
học của tế bào vsv.
Hóa phân loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm sau:

Type thành phần tế bào dựa trên cơ sở phân tích acid amin trong thành phần pettide và
đường trong thành phần tế bào hay các polysaccaride gắn vào thành tê bào.
Type peptidoglycan (PG) dựa vào các thông tin về thành phần và cấu trúc của mạch
tetrapeptide của PG cầu nối peptide và các liên kết giữa các mắt xích của PG.
Acid mycolic là các phần tử có mạch dài phân nhánh thuộc chi Nocarcỉỉa, Rhodococus,
Mycobacterỉum và Cornebacter. Đây là đặc điếm phân loại cơ bản cho các chi đó.
Acid béo thường được sử dụng trong phân loại là acid béo bão hòa mạch thẳng và không bão
hòa với mạch phân nhánh kiểu iso và enteiso metyl hóa ở nguyên tử cacbon thứ 10. Sự có mặt của
acid 10 - metylloctade canoit (acid tubereulostearinoic) là đặc điểm để phân loại đến chi [8].
Phospholipid có 5 type (P[, pir, Pin, Piv, Pỵ) có thành phần đặc trưng, có ý nghĩa cho phân
loại xạ khuẩn.
Trong phân loại xạ khuẩn thì type thành tế bào là đặc điểm quan trọng nhất. Khi muốn đưa
một loài mới hoặc mô tả một loài có ý nghĩa nào đó, người ta không thể nào không xác định thành
tế bào.
1.1.1.3. Đặc điếm sinh lý, sinh hóa
Đe phân loại xạ khuẩn đến loài, người ta sử dụng hàng loạt các đặc điểm sinh lý, sinh hóa
khác nhau như khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh
trưởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ hệ thống ezyme. Nhu cầu về oxy, giới hạn pH,
nhiệt độ tối ưu, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ với chất kìm
hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh, khả
năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của xạ khuẩn.
5
Hop wood (1997) khẳng định rằng phần lớn các đặc điểm sinh lý, sinh hóa cùng đặc điểm
nuôi cấy dễ bị biến động và có giá trị thấp về mặt phân loại. Dõ đó, tính không ôn định và biên dị
Cãõ của xạ khuân mà ngày nay những nguyên tắc sử dụng các đặc điểm sinh lý, sinh hoá để phân
loại xạ khuẩn cũng phải thay đổi [25].
1.1.1.4. Phân loại so (Numerical taxonony)
Đe phát hiện những loài mới trên cơ sở sự khác nhau về đặc điểm sinh lý, sinh hóa người ta
còn sử dụng các kết quả dựa trên phân loại số. Phương pháp này dưạ trên sự đánh giá về số lượng
mức độ giống nhau giữa các vsv theo một số lớn các đặc điểm chủ yếu là các đặc điểm hình thái,

sinh lý, sinh hóa.
Đẻ so sánh các chủng xạ khuẩn với nhau, người ta căn cứ vào hệ số giống nhau (hệ số s -
Similarity) có 2 công thức tính hệ số s hay được sử dụng.
Công thức của Sokal và Michener (SSM)
SsM (AB)=
(Ns+ + Ns_)* 100/ (Ns+ + Ns_ + Nd)
Trong đó: SsM(AB) ■ Mức độ giống nhau giữa hai cá thê A, B (%).
Ns + : Sô các tính trạng giông nhau.
Nd : So các tính trạng khác nhau.
Ns. : Sô các tính trạng đôi lập nhau.
Công thức của Jacard (Sj)
S«AB)=Ns* 100/ (Ns + Nd)
Trong đỏ: sJ(AB) ■ mức độ giông nhau giữa hai chủng A, B (%).
Ns : Tông số các đặc điêm dương tính
(giống nhau) của hai chủng so sánh.
Nd : Tống sô các đặc điêm khác
nhau (tông sô các đặc điêm dương tínhcủa
chủng này và âm tỉnh của chủng kia).
Ket quả của phân loại số là vẽ được sơ đồ phân nhánh (kiểu “rễ cây”) của các thông số. Dựa
vào sơ đồ này nhũng chủng giống nhau nhiều nhất được xếp vào một nhóm. Bằng phân loại số
người ta chia xạ khuẩn chi Streptomyces thành 2 nhóm lớn, 37 nhóm nhỏ và 13 cụm vói những đại
diện nhất định [33].
]. 1.1.5. Phân loại xạ khuấn chi Streptomyces
Chi Streptomyces là một giống xạ khuẩn bậc cao được Waksman và Hemici đặt tên năm
1943 [32]. Đây là chi có số lượng loài được mô tả lớn nhất. Các đại diện chi này có HSKS và
HSCC phát triến phân nhánh. Đường kính sợi xạ khuấn khoảng 1-10 |Lim, khuấn lạc thường không
6
lớn có đường kính khoảng 1 - 5 mm. Khuẩn lạc chắc, dạng da mọc đâm sâu vào cơ chất. Be mặt
khuẩn lạc thường được phủ bởi KTKS dạng nhung, dày hơn cơ chất, đôi khi có kỵ nước.
Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bằng bào tử. trên đầu sợi khí sinh hình thành

cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử- Cuống sinh bào tử có những hình dạng khác nhau tùy loài:
thẳng, lượn sóng, xoắn, có móc, vòng Bào tử được hình thành trên cuống sinh bào tử bằng hai
phương pháp phân đoạn và cắt khúc. Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình nhăn
tùy thuộc vào loài xạ khuẩn và môi trường nuôi cấy.
Thường trên môi trường có nguồn đạm vô cơ và glucose, các bào tử biểu hiện các đặc điểm
rất rõ. Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sợi khí sinh cũng rất khác nhau tùy theo nhóm Streptomyces,
màu sắc này cũng có thể biến đổi khi nuôi cấy trên môi trường khác nhau. Vì vậy, ủy ban Quốc tế
về phân loại xạ khuẩn ISP đã nêu ra các môi trường và phương pháp chung đế phân loại nhóm vsv
này.
Các loại xạ khuấn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuấn Gr+, hiếu khí, dị dưỡng
các chất hữu cơ. Nhiệt độ tối ưu thường là 25 - 30°c, pH tôi ứu 6,5 - 8,0. Một sô loài có thê phát
triên ở nhiệt độ Câo hơn hoặc thâp hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa lạnh).
Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lượng lớn các chất kháng sinh ức chế vi khuấn,
nấm sợi, các tế bào ung thư, virus và nguyên sinh động vật. Cho đến nay để xác định cho thành
phần loài của chi Streptomyces, các nhà phân loại đã sử dụng hàng loạt các điều kiện và các khóa
phân loại khác nhau [32].
1.1.2. Đặc điếm sinh học cửa xạ khuấn
1.1.2.1. Đặc điếm hình thái của xạ khuấn
* Khuẩn lạc
Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách
ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử). Hệ sợi xạ khuấn mảnh hơn của nấm mốc với
đường kính thay đối trong khoảng
0, 2 - 1,0 ụm đến 2,0 - 3,0 ịim, chiều dài có thể đạt tới một vài cm [10],[18].
Kích thước và khối lượng hệ sợi thường không on định và phụ thuộc vào điều kiện sinh lý
và nuôi cấy. Kích thước của hệ sợi xạ khuẩn là một trong những đặc điểm phân biệt khuẩn lạc của
xạ khuẩn và khuẩn lạc của nấm mốc vì hệ sợi của nấm mốc có đường kính rất lớn, thay đổi từ 5 - 50
|im, dễ quan sát bằng mắt thường.
Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng
7
màng dẻo. Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng tùy

thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh. Kích thước và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay đổi tùy
vào loài và tùy vào điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ấm Đường kính
mỗi khuẩn lạc chỉ chừng 0,5 - 2 nm nhưng cũng có khuẩn lạc đạt tới đường kính 1 cm hoặc lớn
hon. Khuẩn lạc có 3 lóp, lóp vỏ ngoài có dạng sợi bền chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa có
cấu trúc tổ ong.
Khuẩn ty trong mỗi lóp có chức năng sinh học khác nhau. Các sản phẩm trong quá trình trao
đổi chất như: chất kháng sinh, độc to, enzyme, vitamin, acid hữu cơ có thể được tích lũy trong sinh
khối của tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra trong môi trường.
* Khuẩn ty
Trên môi trường đặc biệt, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại: một loại cắm sâu vào
trong môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất substrate mycelium) với chức năng chủ yếu
là dinh dưỡng. Một loại phát triến trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi sinh khí (khuấn ty sinh khí aerial
mycelium) với chức năng chủ yếu là sinh sản.
Nhiều loại chỉ có hệ sợi cơ chất nhưng cũng có loại (như chi Sporỉchthya) lại chỉ có hệ sợi
khí sinh. Khi đó HSKS vừa làm nhiệm vụ sinh sản vừa làm nhiệm vụ dinh dưỡng.
1.1.2.2. Câu tạo của xạ khuân
Xạ khuấn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gr+, toàn bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao
gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn
nhập.
Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10-20 nm có tác dụng duy trì hình dạng
của khuẩn ty, bảo vệ tế bào. Thành tế bào gồm 3 lớp: lớp ngoài cùng dày 60 - 120A°, khi già có thể
đạt tới 150 - 200A°, lóp giữa rắn chắc, dày khoảng 50A°, lóp trong dày khoảng 50A°. các lóp này
chủ yếu cấu tạo từ các lóp glucopeptide bao gồm các gốc N - axetyl glucozamin liên kết với N -
axetyl muramic bởi các liên kết glucoside. Khi xử lý bang lyzozyme, các liên kết 1,4 glucoside bị
cắt đứt, thành tế bào bị phá hủy tạo thành thể sinh chat (protoplast), cấu trúc sợi cũng bị phá hủy
khi xử lý tế bào hỗn họp este chloroform và các dung môi hòa tan lipid khác. Nguyên nhân là do
lớp ngoài cùng có cấu tạo chủ yếu bằng lipid (thành HSKS có nhiều lipid hơn so với HSCC) khác
với nấm. Thành tế bào xạ khuẩn không chứa cellulose và kittin nhưng chứa nhiều enzyme tham gia
vào quá trình trao đổi chất và quà trình vận chuyển các chất qua màng tế bào [22], [23], [26], [28],
[29].

Căn cứ vào thành phần hóa học, thành tế bào xạ khuẩn được chia thành 4 nhóm chính [3],
8
[7].
Nhóm /: thành phần chính của thành tế bào là acid L- 2,6 diaminopimelic (L -ADP) và
glyxin. Chi Streptomyces thuộc nhóm này.
Nhóm II'. thành phần chính của thành tế bào là acid meso - 2,6 - diaminopimelic (m - ADP)
và glyxin.
Nhóm III: thành phần chính của thành tế bào là acid meso - 2,6 - diaminopimelic.
Nhóm IV\ thành phần chính của thành tế bào là acid meso - 2,6 - diaminopimelic, arabinose
và galactose.
Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 nm được cấu tạo chủ yếu bởi 2 thành
phần là phospholipid và protein. Chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất
và quá trình hình thành bào tử của xạ khuẩn.
Nguyên sinh chất nhân tế bào xạ khuẩn không có khác biệt lớn so với tế bào vi khuẩn. Trong
nguyên sinh chất của xạ khuẩn cũng chứa mezoxom và các thể ẩn nhập (các hạt polyphosphate:
hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm sudan III và các hạt polysaccharide bắt màu với dung dịch
lugol). Tuy nhiên, điếm khác biệt của xạ khuẩn so với các sinh vật prokaryote ở chỗ chúng có tỷ lệ
Gr+ c rất cao trong DNA, thường lớn hon 55%, trong đó ở vi khuẩn tỷ lệ này chỉ là 25 - 45% [9].
Xạ khuẩn thuộc loại vi khuẩn Gram+ nên ngoài yếu tố di truyền trong nhiêm săc thê còn có
các yêu tô di truyên ngoài nhiêm săc thê, chúng có thê tự nhân lên, được Lederberg gọi là plasmid.
Các plasmid đem lại cho tế bào nhiều đặc tính chọn lọc quý giá như có thêm khả năng phân giải
một số họp chất, chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với các kháng sinh, chuyến gene, sản
xuất chất kháng sinh trong đất và môi trường tuyển chọn [2].
Xạ khuẩn thuộc loại cơ thể dị dưỡng, nguồn cacbon chúng thường dùng là đường, tinh bột,
rượu và nhiều chất hữu cơ khác. Nguồn nitơ hũu cơ là protein, pepton, cao ngô, cao nấm men.
Nguồn nitơ vô cơ là nitrat, muối amon Khả năng đồng hóa các chất ở các loài hay chủng xạ
khuẩn khác nhau là khác nhau.
1.1.2.3. Đặc đỉêm sinh lý, sinh hóa của xạ khuân
Xạ khuẩn là một nhóm cơ thể dị dưỡng, chúng sử dụng đường, rượu, acid hữu cơ, lipid,
protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác làm nguồn cacbon. Còn nitrat, nitrit, muối amon, ure,

pepton, cao thịt đế làm nguồn nitơ. ở các loài khác nhau thì các loài hấp thụ các hợp chất này là
khác nhau. Phần lớn xạ khuẩn là vi sinh vật hiếu khí, ưa ẩm, nhiệt độ cho sinh trưởng và phát triển
là 25 - 30°c. Đa số xạ khuẩn phát triển tốt trong môi trường có pH là 6,8 - 7, một số ít có khả năng
9
phát triến tốt trong môi trường kiềm [14].
Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gr+, đặc biệt khác với các sinh vật khác của nhóm nhân sơ có tỉ
lệ (G+X) cao (trên 70%), trong khi đó vi khuẩn khá thấp (25 - 45%). Một trong những đặc điểm
đáng lưu ý của xạ khuẩn là chúng không bền vững về mặt di truyền và thường xảy ra sự sắp xếp lại
trong phân tử DNA. Điều này gây ra tính đa dạng của hình thái, tính chất sinh lý, sinh hóa của xạ
khuẩn (khả năng đồng hóa nguồn cacbon, nitơ, hoạt tính kháng sinh, tính kháng thuốc, khả năng
phân giải cellulose ) [14].
Đặc điếm sinh lý của xạ khuấn Streptomyces
Chi Streptomyces có sô lượng lõài mô tả lớn tthât, chi này có HSKS, HSCC phát triển và
phân nhánh, khuẩn lạc thường không lớn, đường kính khuấn lạc từ 1 - 5 mm. Khuấn lạc chắc dạng
da, mọc đâm sâu vào cơ chất, bề mặt khuấn lạc thường được phủ bởi HSKS dạng nhung, dày hơn
HSCC và đôi khi không thấm nước. Chuỗi bào tủ’ được tạo thành trên cuống sinh bào tủ’, chúng có
thể thẳng, lượn sóng hoặc xoắn. Be mặt bào tử có thể nhẵn, xù xì, có lông hoặc có gai. Xạ khuẩn có
khả năng tạo thành các loại sắc tố khác nhau, sắc tố này có thể nhuộm màu HSKS, HSCC, đôi khi
nhuộm màu môi trường.
Các loài thuộc chi Streptomyces có cấu tạo thành giống thành của vi khuẩn Gr+, là vi sinh
vật hiếu khí, dị dưỡng. Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là từ 25 - 30°c, pH tối ưu là 6,5-8. Một số loài
có thể sinh trưởng ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và xạ khuẩn ưa ẩm).
1.1.3. Vai trò của xạ khuân
Xạ khuấn có vai trò quan trọng trong quá trình hình thành đất và tạo độ phì nhiêu cho đất.
Chúng đảm nhận nhiều chức năng khác nhau trong việc làm màu mỡ cho đất bằng cách tham gia
tích cực vào các quá trình chuyến hóa và phân giải nhiều hợp chất hữu cơ phức tạp và bền vững
như cellulose, mùn, kitin, ketratin, lignin [18].
Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì có tới 80% là do xạ
khuẩn sinh ra [9]. Trong đó có trên 15% có nguồn gốc tò các xạ khuấn hiếm như Actỉnomadura,
Mỉcromonospora, Actỉnoplanes, Streptovertỉcillium, Streptosporangium, Điều đáng chú ý là các

xạ khuấn hiếm đã cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị đang dùng trong y học, thú y học, bảo
vệ thực vật như gentamycin, tobramycin, vancomycin, rosamycin, tetraxycline Bên cạnh đó
trong quá trình trao đổi chất, xạ khuẩn có thể sản sinh ra nhiều chất hữu cơ. Trong đó, điển hình là
các enzyme ngoại bào (cellulâsê, prõtêâse ), vitamin nhóm B (Bi, B2, B5,Bò B12), một SO acid
hữu cơ (acid lactate, acid acetate ) [18].
1
Ngày nay xạ khuẩn còn được ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp lên men, chế tạo
các sản phấm enzyme, ứng dụng các chế phẩm này vào đời sống do một số xạ khuẩn có khả năng
sinh ra nhiều enzyme ngoại bào như protease, amylase, kitinase Một số khác còn có khả năng
tạo thành chất kích thích sinh trưởng cho thực vật.
1.2. Nhu cầu dinh dưõìig của xạ khuấn
Theo Nguyễn Thành Đạt trong quá trình tiến hóa của các vsv có quan hệ mật thiết đối với
các yếu tố của điều kiện sống, vsv cần ở tự nhiên hay môi trường nuôi cấy nhân tạo chất dinh
dưỡng để xây dựng nên các họp chất của tế bào và những hợp chất dùng để trao đổi năng lượng
[10].
Nhu cầu dinh dưỡng của các vsv rất khác nhau. Ngay trong cùng một loài vsv nhu cầu này
cũng không có sự thống nhất. Giống như các loài vsv khác nhu cầu dinh dưỡng ở các loài xạ khuẩn
cũng khác nhau. Trong công nghiệp tùy thuộc vào mục đích mà người ta sử dụng các nguồn dinh
dưỡng thích hợp nhằm thu được năng suất cao nhất, ví dụ nuôi cấy thu enzyme cellulase người ta
quan tâm đến nguồn cacbon; nếu mục đích sản xuất là thu được một lượng lớn chất kháng sinh thì
người ta lại quan tâm đến nguồn nitơ.
1.2.1. Nhu cầu cacbon
Cacbon chiếm 50% vật chất khô của vsv, là yếu tố quan trọng trong tất cả các họp chất hữu
cơ có mặt trong tế bào. Các hợp chất cacbon là nguyên liệu cho các hoạt động sống [9]. Trong tự
nhiên có 2 dạng hợp chất cacbon cơ bản là cacbon vô cơ và cacbon hữu cơ, mỗi sinh vật khác nhau
sử dụng các nguồn cacbon khác nhau. Dựa vào nguồn dinh dưỡng cacbon mà người ta chia vsv
thành 2 nhóm chính: dị dưỡng cacbon và tự dưỡng cacbon.
Xạ khuân là vsv dị đương câcbõiĩ, xạ khuân có khả năng phân giải các họp chất
hydratcacbon khac nhau từ các dạng đơn giản (acetat, lactate, các loại đường đơn) đến các dạng
phức tạp (oligosaccharide, polisaccharide). Các hợp chất hữu cơ này ngoài việc cung cấp nguồn

cacbon còn cung cấp nguồn năng lượng cho các hoạt động sống. Phần lớn xạ khuẩn có đời sống dị
dưỡng hiếu khí, quá trình oxy hóa thu năng lượng xảy ra kèm theo việc liên kết với oxy không khí.
Xạ khuẩn có khả năng phát triển được trong những môi trường chứa nguồn cacbon duy nhất.
1.2.2. Nhu cầu nỉtơ
Nitơ có ý nghĩa quan trọng đối với sự phát triến của vsv. Trong đó nguồn nitơ dễ hấp thụ
nhất là nguồn NO3" và NH4+. Chúng thâm nhập vào tế bào dễ dàng, ở đó chúng tạo nên các nhóm
imin và amin. Các muối amon hữu cơ thích họp đối với dinh dưỡng vsv hơn là các muối amon vô
1
cơ. Các muối NO3" không có độ chua sinh lý nên sau khi sử dụng dạng này dễ còn lại các ion K+,
Na+, Mg+. Các ion này đều làm kiềm hóa môi trường [9]. Nguồn nitơ khó hấp thụ hơn cả là nguồn
nitơ khí trời. Một số loài vsv có thể sử dụng nguồn này nhờ khả năng cố định nitơ (chuyển hóa N2
-> NH3).
Phần lớn xạ khuẩn đều có đời sống dị dưỡng nitơ. Chỉ có một số loài thuộc chi Frankraceae
có khả năng cố định nitơ nhờ sống cộng sinh với rễ cây họ đậu.
1.2.3. Nhu cầu vitamin và chất khoáng
Vitamin và chất khoáng đóng vai trò không nhỏ trong quá trình sống của vsv. Trong tế bào
vsv ngoài nước, các chất hữu cơ còn có một lượng lớn các vitamin và chất khoáng, lượng chất này
trong tế bào thay đổi tùy theo loài. Tùy giai đoạn, điều kiện sinh trưởng mỗi yếu tố đều có tác động
nhất định đối với sự phát triển của tế bào vsv mà các nhân tố khác không thể thay thế được.
Nguyên tô khoáng được chia làm 2 loại:
Nguyên tố đa lượng: p, K, Ca, Mg, Fe, Na, Cl,
Nguyên tố vi lượng: Mn, Cu, Co, Bo,
1.3. Cellulose và cellulase
1.3.1. Cellulose
Cellulose là hợp chất hữu cơ có công thức cấu tạo (C
6
Hi
0
O5)n và là
thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật, gồm nhiều cellobiose liênkết

với nhau, 4-0-(p-D-Glucopyranosyl)-D-glucopyranose (Hình 1.1). Cellulose cũng là hợp chất hữu
cơ nhiều nhất trong sinh quyển, hàng năm thực vật tổng hợp được khoảng 10
11
tấn cellulose (trong
gỗ, cellulose chiếm khoảng 50% và trong bông chiếm khoảng 90%).
1
Hình 1.1. Công thức hóa học của cellulose
Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và liên kết Van
Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là tinh thể và vô định hình. Trong
vùng tinh thể, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tấn
công bởi enzyme cũng như hóa chất. Ngược lại, trong vùng vô định hình, cellulose
liên kết không chặt với nhau nên dễ bị tấn. Có hai mô hình cấu trúc của cellulose đã
được đưa ra nhằm mô tả vùng tinh thể và vô định hình như hình 1.2.
Single strand molecule, a
Hình 1.2. Mô hình Fringed flbrillar và mô hình chuỗi gập
Trong mô hình Fringed Fibrillar: phân tử cellulose được kéo thẳng và định
hướng theo chiều sợi. Vùng tinh thể có chiều dài 500 A° và xếp xen kẽ với vùng vô
định hình.
Trong mô hình chuỗi gập: phân tử cellulose gấp khúc theo chiều sợi. Mỗi đon
vị lặp lại có độ trùng họp khoảng 1000, giới hạn bởi hai điểm a và b
W;
C
£T'
►-
O':
K
>
Fo
ÍI
T

Lin
ear
Crysfal
Line
I
Single ^
strand
molecule.b
amorpho
us
n
fl
Folding
chain
Fringed
fibrillar
như trên hình vẽ. Các đơn vị đó được sắp xếp thành chuỗi nhờ vào các mạch glucose nhỏ,
các vị trí này rất dễ bị thủy phân. Đối với các đơn vị lặp lại, hai đầu là vùng vô định hình,
càng vào giữa, tính chất kết tinh càng cao. Trong vùng vô định hình, các liên kết ß-
glycoside giữa các monomer bị thay đối góc liên kết, ngay tại cuối các đoạn gấp, 3 phân tử
monomer sắp xếp tạo sự thay đối 180° cho toàn mạch. Vùng vô định hình dễ bị tấn công
bởi các tác nhân thủy phân hơn vùng tinh thể vì sự thay đổi góc liên kết của các liên kết
cộng hóa trị (ß - glycoside) sẽ làm giảm độ bền của liên kết, đồng thời vị trí này không tạo
được liên kết hydro.
Cellulose có cấu tạo tương tự’ carbohydrate phức tạp như tinh bột và glycogen. Các
polysaccharide này đều được cấu tạo từ các đơn phân là glucose. Cellulose là glucan không
phân nhánh, trong đó các gốc glucose kết họp với nhau qua liên kết ß-l“> 4-glycoside, đó
chính là sự khác biệt giữa cellulose và các phân tử carbohydrate phức tạp khác. Giống như
tinh bột, cellulose được cấu tạo thành chuỗi dài gồm ít nhất 500 phân tử glucose. Các chuỗi
cellulose này xếp đối song song tạo thành các vi sợi cellulose có đường kính khoảng 3,5

nm. Môi chuôi có nhiêu nhóm OH tự do, vì vậy giữâ các sợi ở cạnh nhau kết hợp với nhau
nhờ các liên kết hidro được tạo thành giữa các nhóm OH của chúng. Các vi sợi lại liên kết
với nhau tạo thành vi sợi lớn hay còn gọi là bó mixen có đường kính 20 nm, giữa các sợi
trong mixen có những khoảng trống lớn. Khi tế bào còn non, những khoảng này chứa đầy
nước, ở tế bào già thì chứa đầy lignin và hemicellulose.
Cellulose có cấu trúc rất bền và khó bị thủy phân. Người và động vật không có
enzyme phân giải cellulose (cellulase) nên không tiêu hóa được cellulose, vì vậy cellulose
không có giá trị dinh dưỡng. Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy cellulose có thế có vai
trò điều hòa hoạt động của hệ thống tiêu hóa. Vi khuẩn trong dạ cỏ của gia súc, các động
vật nhai lại và động vật nguyên sinh trong ruột của mối sản xuất enzyme phân giải
cellulose. Nấm đất cũng có thể phân hủy cellulose. Vì vậy, chúng có thể sử dụng cellulose
làm thức ăn [23], [29].
1.3.2. Hệ thống enzyme cellulase
Liên kết chủ yếu trong cấu trúc của cellulose là ß-(l ->4) glucoside. Nói chung, đế
phá hủy hoàn toàn cấu trúc của polysaccharide này cần có các enzyme cellulase với những
tác động đặc trưng riêng biệt. Dựa theo nghiên cứu về hệ enzyme cellulase của nấm
1
Trỉchoderma reeseỉ [31], hệ enzyme thủy phân gồm 3 loại hoạt tính enzyme (Hình 1.3).
Endoglycanase hoặc 1,4-ß-D-glucan glucanohydrolase Enzyme endoglycanase hoặc
1,4-ß-D-glucan glucanohydrolase là enzyme thủy phân nội bào liên kết 1,4-ß-D-glucosidic
trong phân tử cellulose bởi tác dụng ngẫu nhiên trong chuỗi polymer hình thành các đầu
chuỗi khử tự do và các chuỗi oligosaccharide ngắn. Các endoglucanase không thế thủy
phân cellulose tinh thể hiệu quả nhưng nó sẽ phá vỡ các liên kết tại khu vực vô định hình
tương đối dễ tiếp cận.
Exogỉucanase
Enzyme ngoại bào exoglucanase gồm cả 1,4-beta-D-glucan glucanohydrolase, giải
phóng D-glucose từ ß-glucan và cellodextrin và 1,4- beta-D-glucan cellobiohydrolase, giải
phóng D-cellobiose. Tỷ lệ thủy phân của enzyme cellobiohydrolase ngoại bào bị hạn chế
bởi sự sẵn có các đầu chuỗi cellulose.
ß-glucosidase hay ß-D-glucoside glucohydroỉase ß-glucosidase hay ß-D-glucoside

glucohydrolase giải phóng phân tử D- glucose từ đường cellodextrin hòa tan và một loạt
các glucoside khác [30], [31].
Hình 1.3. Tác dụng của từng enzyme trong cellulase
1.3.3. Cơ chế phân giải cellulose
Reese và các cộng sự lần đầu tiên đưa ra cơ chế phân giải vào năm 1952 như
sau:
p-Glucosidase Tấn công cellobiose, oligosaccharide tạo glucose
1
Theo tác giả này thì enzyme C] (tương ứng với exoglucanase) là “tiền nhân tố
thủy phân” hay là enzyme không đặc hiệu, làm biến dạng cellulose tụ’ nhiên thành
chuỗi cellulose hoạt động có mạch ngắn hơn. Sau đó, enzyme c
x
(tương ứng với
endoglucanase) tiếp tục phân cắt, giải phóng các đường hòa tan cellodextrin và
cellobiose, cuối cùng cellobiose bị cắt tạo thành glucose dưới tác dụng của
cellobiase.
Erickson và cộng sự, 1973 lại có quan điếm khác, thế hiện trên một sơ đồ
phức tạp hơn nhiều về quá trình thủy phân cellulose (Hình 1.4)
Hình 1.4. Sơ đồ quá trình thủy phân cellulose theo Erickson, 1973
Đầu tiên, exoglucanase tấn công vào các vùng vô định hình trên bề mặt cellulose,
cắt đứt các liên kết 1,4-glucoside để tạ ra các mạch tự do. Tiếp đó, dưới tác dụng của
endogluconase từ phía cực kín (phía không có tính khử), cellulose bị cắt thành các
cellodextrin, sau đó cùng với sự hiệp trợ của exoglucanase phân cắt các cellulose tạo ra
cellobiose và glucose. Cuối cùng (3-1,4-glucosidase thủy phân một phần cellodextrin và
cellobiose thành glucose.
Năm 1997, Tuula T.T [29], đã đưa ra một sơ đồ khác về cấu tạo của cellulose và tác
động của cellulase. Theo ông, cellulose là một polimer tự nhiên cho nên sự kết tinh cũng
không hoàn hảo. Các vùng vô định hình xen kẽ với các vùng kết tinh một cách tự nhiên.
Các vùng vô định hình có thể ở trên bề mặt sợi cellulose hoặc ở ngay dưới vùng kết tinh
hoàn hảo nhất. Các loại cellobiohydrolase (CBH) sẽ tấn công vào các vùng kết tinh và các

mạch bị cắt dở dang có các đầu khử hoặc không khử (CBHI tấn công vào đầu khử còn
CBHII tấn công vào đầu không khử) lần lượt tách các cellobiose ra khỏi chuỗi polymer.
Khả năng làm giảm mức polymer hóa của exoglucanase chậm song hàm lượng đường khử
lại tạo ra nhiều. Trong khi đó edoglucanase phân cắt mạch polymer tùy tiện, không theo trật
1
tự nào, tạo ra các chuỗi oligosaccaride ngắn, dẫn đến giảm nhanh mức polymer hóa của
cellulose. Trong quá trình cắt gẫy mạch polymer, edoglucanase tạo ra các đầu khử và
không khử tự do, tạo cơ hội cho CBH phân cách thành cellobiose. Bởi vậy, khi có tố hợp
endo - exoglucanase quá trình phân cat cellulose mạnh lên nhiều. Tính chất và cấu trúc
cũng như những thay đổi của cơ chất trong quá trình thủy phân đều tác động đến vận tốc
phân cắt của enzyme. Hiệu ứng này đã được nghiên cứu trên quan điểm cơ chế phản ứng
[29].
Tổng họp các yếu tố cấu trúc, sự hấp thụ của cellulase, sự kìm hãm của sản phẩm và
sự vô hoạt của cellulase, tất cả đều có ảnh hưởng quan trọng đến vân tốc thủy phân
cellulose. Nói chung cho đến nay chưa có giả thuyết nào giải thích được đầy đủ và thỏa
đáng về cơ chế tác động của cellulase. Tuy nhiên, công nghệ và giải pháp thiết bị để chuyển
hóa cellulose bằng con đường công nghệ sinh học thì hiện nay nhiều nước trên thế giới đã
đưa vào triển khai ở quy mô công nghệ và đã thu được nhiều kết quả.
1.4. Triên vọng và ứng dụng của cellulâse
1.4. LTrỉến vọng của cellulase
Hàng năm hoạt động trong ngành nông nghiệp đã thải ra môi trường hàng ngàn tấn
phế phấm và đang là một trong những nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường. Neu lượng
phế phẩm này được xử lý làm thức ăn gia súc hoặc phân bón vi sinh thì sẽ là một nguồn lợi
lớn. Vì vậy, trên thế giới và ở Việt Nam đã có những nghiên cún về khả năng sinh cellulase
của các visinh
vật trong đất để phân giải cellulose từ các phế phẩm nông nghiệp. Đặc biệtxạ
khuẩn là một loài vi sinh vật có khả năng sinh cellulase khá mạnh và có thể cho nguồn
enzyme dồi dào phục vụ cho việc xử lý rác thải, chế biến thức ăn gia súc probiotin
Khả năng sinh tổng họp cellulase của xạ khuẩn đã được nghiên cứu tò rất lâu. Ngay
từ năm 1930, Jensen đã phân lập được nhiều loài Micromonospora có khả năng thủy phân

cellulose. Krainsky (1941) nghiên cứu khả năng phân giải cellulose của một số loài
Streptomyces. Enger và Sleeper (1965) chứng minh cellulase do Streptomyces antỉbỉolỉcus
là thuộc loại cx, bằng phương pháp điện di các tác giả đã cho rang enzyme này có ba thành
phần khác nhau. Sietsma và cs (1968) đẫ nghiên cứu về enzyme của chủng Streptomyces
sp.0143 và nhận thấy enzyme này tác động lên CMC, thích hợp nhất ở pH 5,9 và nhiệt độ
1
là 37°c. Golovina và cs (1968) đã tuyển chọn được chủng Streptomyces dỉastatỉcus tò đất
rừng, phát triển tốt nhất ở 40°c, tổng họp cellulase và hemicellulase. Fergus (1969) nhận
thấy T.curvata tổng họp khá nhiều enzyme cx khi nuôi trên môi trường có CMC. Khả năng
tích lũy cx còn thấy ở một số loài khác như Streptomyces rectes, Streptomyces
thermovulgarỉs. Stuzeberger và cs (1971) nuôi cấy T.curvata ưa nhiệt trên môi trường chứa
cellulose vi tinh thể và cao nấm men có bổ sung 0.1 % bông nghiền nhỏ thì khả năng tích
lũy C] và cx tăng lên rõ rệt.
Nhìn chung đã có khá nhiêu nghiên cứu vê Streptomỵces, đánh giá, phân loại,
nghiên cứu điều kiện tối ưu để sản sinh cellulase cao nhất (Mc. Carthy và cs 1984;
Goodfellow,1971; Jones, 1975 và Wilian, 1983).
Amira M. Và cs (1988) nghiên cứu sự tống hợp cellulase từ Streptomyces sp.AT7,
nhận thấy chủng này tổng họp cả Ci và cx trong môi trường lỏng chứa 2% CMC với hoạt
tính cao nhất ở 36°c, tương ứng hoạt tính Ci là 6mg/ml/giờ sau 2 ngày và cx là 13.6
mg/ml/giờ sau 9 ngày.
Ở Việt Nam có một số công trình nghiên cứu về xạ khuẩn tổng hợp cellulase như:
Nguyễn Đình Quyến và cs (1986) đã phân lập và định danh 30 chủng ưa nhiệt và ưa
ẩm nhận thấy các chủng này có kha năng phân giải CMC và avicel, trong đó có 1 chủng thể
hiện hoạt tính exoglucanase khá mạnh.
Phạm Văn Ty và cs (1990) đã phân lập được hàng trăm chủng xạ khuẩn ưa nhiệt và
ưa ẩm thuộc chi Streptomyces trong đó chủng Streptomyces L3 có hoạt tính phân giải CMC
và avicel mạnh nhất.
Vũ Thị Thanh Bình và cs (1990) đã phân lập được hàng trăm chủng xạ khuẩn ưa
nhiệt, trong đó có 10 chủng có khả năng tổng họp cellulase trên các nguồn cacbon là CMC,
avicel, bông, giấy lọc.

Trịnh Thị Hồng (1997) đã phân lập được 8 chủng xạ khuẩn và 5 chủng nấm mốc có
khả năng phân giải cellulose, tác giả nhận thấy hiệu suất phân giải rơm đạt 22% và khi nuôi
chúng với nấm mốc thì hiệu suất phân giải rơm tăng lên đến 29%.
Phạm Ngọc Lan và cs (1999) đã phân lập và tuyển chọn được 192 chủng xạ khuẩn
ưa ấm có khả năng phân giải bột cellulose và CMC.
Nguyễn Đức Lượng và cs (1999) nghiên cứu một số tính chat enzyme Cêllulasẽ củâ
1
xậ khuân Actinomyces griseus và nhận thây Cẽllulasẽ củâ Xậ khuẩn hoạt động mạnh ở 50°c
và pH tối ưu là 7 [34].
Việt Nam là đất nước sản xuất nông nghiệp là chủ yếu nên việc nghiên cứu về khả
năng sinh cellulase của xạ khuẩn có triển vọng rất lớn.
1.4.2. Úng dụng của cellulase
Nguồn cơ chất để cellulase phân giải là vô cùng phong phú và đa dạng trong tụ’
nhiên cũng như trong đời sống sinh hoạt. Hàng ngày, một lượng lớn chất thải lignocellulose
từ nông nghiệp, công nghiệp, đô thị luôn chồng chất hoặc sử dụng chúng một cách kém
hiệu quả do giá thành của quy trình sử lý rác thải rất cao. Điều này trở thành vấn đề quan
trọng hàng đầu với sinh thái, công nghiệp hóa học và công nghệ sinh học. Hơn nữa, đây
còn là vấn đề kinh
tế đáng quan tâm trong việc phát triển quy trình tái sử dụng cho hiệu quả và lợi dụng chất
thải cellulose như là nguồn cơ chất rẻ tiền. Cellulase là phức hệ enzymerất quan trọng và
được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực.Trong
hiện tại và tương lai người ta sử dụng cellulase cho mục đích chính:
Dùng cellulase trực tiếp trong phân giải phế thải của công nghệ thực phấm bố sung
và thức ăn gia súc và trong công nghệ môi trường. Thủy phân cellulose tạo cơ chất lên men
để thu các sản phẩm cuối cùng khác nhau.Các lĩnh vực chính ứng dụng cellulase bao gồm:
Công nghệ chế biến thực phấm
• Cải thiện chế độ tiêu hóa thức ăn.
• Chiết rút các chất gây vị, dầu, dịch ép protin từ rau quả.
• Cải thiện độ hòa tan của các nguyên liệu trong công nghệ lên men.
• Sản xuất rượu và một so acid hữu cơ

Công nghệ dược phâm
• Cải thiện độ tiêu hóa rơm, cỏ làm thức ăn gia súc
• Sản xuất thức ăn giàu protein
Công nghệ môi trường
• ứng dụng trong xử lý phế liệu sau thu hoạch, xử lý rác đô thị, phân hủy thành phân bón hữu
cơ.
1
• Phân hủy các chất tồn lun, trong đó có DDT, TNT.
Công nghệ lên men
• Cung cấp cơ chất cho tổng họp khí metan, glyxerin, acid xitric, acid lactic, vitamin, protein
đơn bào, chất kháng sinh, các chất có hoạt tính sinh học khác.
Ngoài ra, trong giao thông vận tải, từ sinh khối cellulose sản xuất ra etanol là nhiên
liệu tuyệt vời cho động cơ đốt trong và nó có thể thay thế cho nhiên liệu hóa thạch đế giảm
bót sự ô nhiễm môi trường và nóng lên toàn cầu (Philippidis và Smith, 1995).
Trong công nghệ dệt may, người ta thấy nếu dùng cellulase ở liều thấp đế xử lý
bông sẽ làm bông trắng và mịn màng hơn, do nó loại bỏ được các sợi và các hạt trên bề
mặt sợi bông làm cho sợi phang, bóng mượt và mềm. Hoặc có thể dùng cellulase (các loại
cellulase trung tính) để mài vải quần áo bò thay thế cho mài bằng đá bọt để tạo ra các điểm
“bạc” tự nhiên của quần áo bò. Điều này có ý nghĩa rất lớn với ngành công nghiệp mài vải
bò vì khi xử lý bang cellulose làm cho vải bò mềm hơn nhiều, nó không phá cấu trúc của
vải mạnh như đá mài, hon nữa khối lượng mài một mẻ tăng lên 50% do đã loại bỏ 50% thể
tích đá bọt phải bổ sung vào vải ở thùng mài.
Trong công nghệ sản xuất bột giấy, giấy sử dụng cellulase để tẩy mực trên các giấy
phế thải thay thế dùng C1 hoặc C10
2
gây ô nhiễm môi trường. Đe làm sạch, trắng giấy
người ta sử dụng chủ yếu là loại hemicellulase, xylanase từ Sporotricchum pulverulentum,
S.dimorphosphorum, cellulase từ A.niger hoặc từ Phanerochaeta chrysosporiym hoặc
mannase từ T.reesei. Cellulase thường được dùng ở (0.001 0.1%), cellobiãse (0.005 -
ỉ- 0.015%).

Trong công nghiệp sản xuất các chất tay rửa, tác dụng của cellulase trong chất tẩy
rủa chủ yếu là loại bỏ các sợi hỏng, làm cho vải sợi trở nên mịn đẹp, mềm sáng đẹp hơn.
Cellulase thường được sử dụng kết họp với lipase (loại bỏ mỡ) và protease (loại bở
protein). Các enzyme này dùng cho chất giặt đều là các enzyme trung tính hoặc kiềm.
Cellulase còn được sử dụng hiệu quả để phá vỡ thành tế bào thực vật trong công
nghệ lai ghép tế bào trần - một công nghệ lai tế bào giữa các loài hoặc thậm chí giữa các
chi khác nhau tạo giống cây trồng mới trong nông nghiệp.
ứng dụng celỉulase trong chăn nuôi
Trong chăn nuôi, một trong nhũng biện pháp nâng cao năng suất vật nuôi là nâng
2
cao hiệu suất sử dụng các chất dinh dưỡng của thức ăn ở mức cao nhất. Trong nhiệm vụ
này, người ta có thể dùng chế phẩm enzyme bố sung vào khấu phần thức ăn của vật nuôi.
Các enzyme này cùng với các enzyme có sẵn trong đường tiêu hóa sẽ phân giải các chất
dinh dưỡng của thức ăn giúp cho con vật tiêu hóa được tốt hơn.
Cellulase là một trong số các enzyme thường được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi
gia súc. Tuy nhiên, người ta không bổ sung riêng chế pham enzyme này mà thường bổ sung
với các enzyme khác như: amylase, protease, xylanase tạo ra một dạng chế phẩm chứa
nhiều loại enzyme (multienzyme). Việc bổ sung nhiều loại enzyme giúp vật nuôi phân giải
được nhiều loại cơ chất, vật nuôi sẽ hấp thụ tốt hơn các nguồn thức ăn khác nhau.
Khi động vật ở giai đoạn còn non, hệ enzyme tiêu hóa của chúng chưa hoàn chỉnh,
chủ yếu ở động vật ăn bột và ăn cỏ. Sử dụng enzyme trong chăn nuôi, người ta thấy lợn con
theo ổ tăng trọng 20% và giảm thức ăn 6 -ỉ- 14%. Thí nghiệm trên lợn 1 3 tuần tuổi thì
lợn tăng trọng 8 40%, tăng khả năng
sử đụng thức ăn từ 10 -ỉ- 18% [17].
Người ta cũng đã dùng enzyme bổ sung vào thức ăn của trâu bò. Quá trình tiêu hóa
thức ăn trong dạ cỏ của trâu bò được gắn liền với hoạt động enzyme của các vi sinh vật
sống nhờ ở đấy. Vì vậy, bổ sung vào thức ăn những chế phẩm enzyme đế nâng cao khả
năng tiêu hóa là điều rất cần thiết. Dùng các chế phẩm có hoạt tính amylase, protease,
cellulase đều thu được kết quả tốt, khả năng tăng trọng của trâu bò có thể đạt tới 12 -ỉ-
17 %, có khi còn cao hơn [19], [20].

Trên thế giới, người ta sử dụng thức ăn gia súc có chứa các enzyme tiêu hóa tù’ đầu
những năm 1990. Hiện nay, hàng năm người ta sản xuất khoảng 30 triệu tấn thức ăn gia súc
có bổ sung chế phẩm enzyme chiếm khoảng 5% trong tổng số 600 triệu tấn thức ăn gia súc
được sản xuất.
Như vậy, hiệu quả của việc bo sung enzyme vào thức ăn chăn
nuôi là rõ ràng làm tăng tỷ lệ tiêu hóa cho vật nuôi và giảm
chi phí. Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam chế pham enzyme
thường phải nhập khấu với giá thành cao nên nghiên cún.
2
CHƯƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1. Vật liệu và vi sinh vật
2.1.1. Vi sinh vật
Các chủng xạ khuẩn phân lập được từ các mẫu đất đồi khu vực Xuân Hòa,
Phúc Yên, Vĩnh Phúc.
2.1.2. Hóa chất, thiết bị
Hóa chất
Giấy lọc
Cacboxyl methyl cellulose (CMC )
Thuốc thử lugol 1%, đỏ côngô 1%
Các hóa chất: NaN03, MgS0
4
.7H
2
0, KC1, K2HPO4, FeSƠ4, NaCl, NH4CI,
(NH
4
)
2
SO4, CaC03, saccarose các hóa chất thông dụng khác. Thiết bị

Tủ ấm, tủ say Binder (Đức)
Nồi hâp Tommy (Nhật)
Box vô trùng (Haraeus)
Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh)
Micropipet Jinson (Pháp) các loại từ 0.5 [lì - 10 ml Máy so màu uv - vis
(Nhật)
Máy đo pH (MP 200R - Thuỵ Sĩ)
Cân (Precisa XT 320M - Thuỵ Sĩ)
Máy cất nước 2 lần (Hamilton - Anh)
Kính hiển vi quang học Carl Zeiss (Đức)
Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu, hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que
trang, lamen, đèn cồn và nhiều dụng cụ hoá sinh thông dụng khác.
2
2
MT 2: 1% bột giấy
2.2.1. Môi trường phân lập xạ khuẩn
Môi trường Czapeck - tinh bột
Tinh bột tan 20 g CaCƠ3 3g
KC1 0,5 g FeS0
4
(dạng vết) 0,01 g
NaN0
3
3 g Thạch agar 20 g
MgS0
4
.7H
2
0 0,5 g pH 7,2 g
K

2
HPC>4 1 g Nước cất 1000 ml
Môi trường Czapeck - gỉucose
Glucose 20 g CaCOs 3g
KC1 0,5 g FeS0
4
(dạng vết) 0,01 g
NaN0
3
3 g Thạch agar 20 g
MgS0
4
. 7H
2
0 0,5 g
pH 7,0 g
k
2
hpo
4
1 g Nước cất 1000 ml
2.2.2. Môi trường bảo quản và giữ giống
Môi trường Gause I
K
2
HPC>4 0,5 g
H
2
o
10 g

KN0
3
1 g FeS0
4
(dạng vết) 0,01g
MgSƠ4. 7H
2
0 5 g Thạch agar 20 g
NaCl 0,5 g pH 7,2 g
Nước cất 1000 ml
2.2.3. Môi trường thử hoạt tính enzyme
Thử hoạt tính: Thay nguồn cacbon bằng giấy lọc, CMC,
phẩm nông nghiệp
MT1: 1 % CMC
NaNƠ
3
1,5 g NaCl
1%
K
2
HPƠ4 0,5 g Thạch agar
20 g
MgS0
4
.7H
2
0 0,5 g CMC 1%
KC1 0,5 g
H
2

o
1000 m
2
Cao nấm men 3g H20 1000 ml
pH 7,0 - 7,2
MTISP- 9
(NH
4
)
2
S04 2,64 g Dung dịch muối B 1 ml
K2HPO4 5,65 g Thạch agar 20 g
KH2PO4 2,38 g Nguồn cacbon 10 g
MgS047H20 lg H20 1000 ml
pH 6,8 - 7
Dung dịch muối B (%): Q1SO4 - 0,64 g, FeS0
4
- 0,11 g, MgCl
2
- 0,1, nước cất
1000 ml.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu
Dùng dao lấy khoảng 10 - 15 g đất theo các độ sâu: 0 cm, 5 cm, 10 cm, 15 cm,
20 cm, 25 cm, 30 cm ở 5 vị trí A, B, c, D, E (hình 2.1). Các mẫu đất được đựng vào
túi nilon đã khử trùng, buộc kín miệng túi. Mỗi túi đựng một mẫu đất ở một độ sâu
nhất định. Trên mỗi túi ghi rõ nơi lấy mẫu, loại đất, thời gian và độ sâu lấy mẫu. Sau
đó, các mẫu đất được chuyển về phòng thí nghiệm để tiến hành phân lập ngay hoặc
có thể bảo quản trong tủ lạnh ở 4°c tối đa 6 ngày [9].
2