tóm tắt luận án Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của cá mú chấm cam Epinephelus coioides (Hamilton, 1822) nuôi tại Khánh Hòa đối với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG




NGUYỄN THỊ THANH THÙY




NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH Ở CÁ MÚ CHẤM
CAM (Epinephelus coioides Hamilton, 1822) NUÔI TẠI
KHÁNH HÒA ĐỐI VỚI VI KHUẨN
Vibrio parahaemolyticus

Chuyên ngành : Nuôi trồng Thủy sản
Mã ngành : 62 62 03 01



TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

KHÁNH HÒA - 2014





Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Nha Trang


Người hướng dẫn khoa học:
1. TS. Nguyễn Hữu Dũng
2. GS.TS. Heidrun I. Wergeland

Phản biện 1: ………………………………
………………………………

Phản biện 2: ………………………………
………………………………

Phản biện 3: ………………………………
………………………………

Luận án được bảo vệ tại Hội đồng đánh giá luận án cấp trường
họp tại Trường Đại học Nha Trang
vào hồi ……… giờ, ngày …… tháng ……. năm ……… …




Có thể tìm hiểu luận án tại:

Thư viện Quốc gia
Thư viện Trường Đại học Nha Trang
1
MỞ ĐẦU
1. Sự cần thiết của luận án
Cá mú chấm cam Epinephelus coioides có giá trị dinh dưỡng
cao, lớn nhanh nên được nuôi phổ biến ở nhiều nước. Trong những
năm gần đây, nghề nuôi cá mú đang chịu thiệt hại do dịch bệnh,
thường gặp nhất là bệnh lở loét do vi khuẩn Vibrio gây ra.
Cho đến nay, việc phòng trị bệnh Vibriosis cho cá mú chủ yếu
bằng kháng sinh và hóa chất vẫn chưa đem lại hiệu quả ổn định.
Thiệt hại do bệnh vẫn luôn là mối đe dọa cho nghề nuôi cá mú. Vì
vậy, nghiên cứu cơ bản về miễn dịch học của cá mú đối với tác nhân
gây bệnh góp phần cung cấp thêm những thông tin về cơ chế kháng
bệnh ở cá, đặc điểm tác nhân gây bệnh, làm tiền đề cho nghiên cứu
ứng dụng vaccine phòng bệnh cho cá là hướng tiếp cận mới, phù hợp
với định hướng phát triển nghề nuôi cá biển công nghiệp, bền vững,
thân thiện môi trường.
2. Mục tiêu và nội dung của luận án
2.1. Mục tiêu của luận án
Làm rõ đặc điểm đáp ứng miễn dịch của cá mú chấm cam đối với
vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus.
2.2. Nội dung nghiên cứu
 Nghiên cứu đặc điểm của vi khuẩn V. parahaemolyticus gây
bệnh lở loét ở cá mú chấm cam.
 Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch tự nhiên của cá mú chấm cam
và ảnh hưởng của chất kích thích miễn dịch β-glucan đến đáp ứng
này.
 Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá mú chấm cam
đối với vi khuẩn V. parahaemolyticus bất hoạt bằng formalin.

2
3. Ý nghĩa và điểm mới của luận án:
 Kết quả của luận án đóng góp những thông tin khoa học về đặc
điểm đáp ứng miễn dịch của cá mú chấm cam đối với vi khuẩn
Vibrio; Là cơ sở khoa học cho nghiên cứu ứng dụng sản xuất vaccine
và dùng chất kích thích miễn dịch để phòng bệnh Vibiosis cho cá
biển nuôi và đặc biệt là cá mú chấm cam tại Việt Nam.
 Luận án là công trình đầu tiên nghiên cứu cơ bản về miễn dịch
học ở cá mú tại Việt Nam; Là công trình đầu tiên nghiên cứu ảnh
hưởng của β-glucan đến đáp ứng miễn dịch tự nhiên của cá mú ở Việt
Nam.
4. Bố cục của luận án
Luận án gồm 127 trang, 27 hình và 6 bảng, 219 tài liệu tham khảo
và phụ lục. Cấu trúc luận án gồm: Mở đầu (3 trang); Chương 1: Tổng
quan tài liệu (36 trang); Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
(17 trang); Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận (46 trang);
Chương 4: Kết luận và đề xuất ý kiến (2 trang); Tài liệu tham khảo (23
trang) và Phụ lục (19 trang).
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vài nét về đối tƣợng cá mú chấm cam
1.1.1. Một số đặc điểm sinh học chủ yếu
Luận án tổng quan các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước
về đặc điểm cá mú nói chung và cá mú chấm cam nói riêng, bao gồm
các đặc điểm hình thái, phân bố, sinh trưởng, dinh dưỡng, sinh sản và
ấu trùng.
1.1.2. Nghề nuôi cá mú trên thế giới và Việt Nam
Trên thế giới, nghề nuôi cá mú bắt đầu từ năm 1970. Tại Việt
Nam, cá mú được nuôi bắt đầu từ năm 1988, tập trung ở Hải Phòng, Phú
Yên, Khánh Hòa, Vũng Tàu.

3
1.1.3. Một số bệnh thƣờng gặp ở cá mú nuôi
Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam đã phát
hiện các bệnh do vi rút, vi khuẩn, ký sinh trùng trên cá mú nuôi.
Trong đó, bệnh do vi khuẩn Vibrio là phổ biến nhất, lây lan nhanh và
gây thiệt hại lớn (Sarjito et al., 2009); Sun et al., 2011; Yambot và
Song, 2006; Đỗ Thị Hòa và cs, 2008 ).
1.2. Vi khuẩn Vibrio và bệnh Vibriosis trên cá biển
1.2.1 Vi khuẩn Vibrio
Luận án đã tổng quan các kết quả nghiên cứu trong và ngoài
nước về các đặc điểm hình thái cấu tạo, sinh lý, sinh thái, sinh hóa và
độc tính của vi khuẩn Vibrio.
1.2.2 Bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên cá biển
Nhiều loài cá phân bố ở các vùng biển khác nhau đều nhiễm
bệnh do vi khuẩn Vibrio. Dấu hiệu chính của bệnh do Vibrio là xuất
hiện các đốm đỏ, xuất huyết hoặc các vết loét trên thân. Bệnh này
gây chết cá rải rác đến hàng loạt nếu nhiễm nặng. Tác nhân thường
gặp là vi khuẩn V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. alginolyticus,
V. cachariae. Cách phòng trị bệnh chủ yếu bằng hóa chất và kháng
sinh nhưng chưa có kết quả ổn định.
1.3. Đặc điểm hệ miễn dịch ở cá xƣơng
1.3.1. Miễn dịch tự nhiên
Nhiều nghiên cứu về các khía cạnh khác nhau của hệ miễn
dịch không đặc hiệu ở cá xương đã được tổng quan bởi các tác giả
Ellis (2001), Rombout et al. (2005), Magnadottir (2006),Whyte
(2007), Chistiakov et al. (2007), Van Muiswinkel (2008).
1.3.2. Miễn dịch đặc hiệu
Cho đến nay, các nghiên cứu tương đối đầy đủ các khía cạnh liên
quan đáp ứng miễn dịch (ĐƯMD) đặc hiệu ở cá chỉ mới tập trung trên
4

các đối tượng quen thuộc như cá hồi, cá da trơn và cá chép (Rombout et
al., 2005; Swain et al., 2007; Uribe et al., 2011 ).
Đã có vài công trình nghiên cứu về hệ miễn dịch ở cá mú: xác
định thời điểm hoàn thiện các cơ quan lympho, đặc điểm của phân tử
kháng thể, thử nghiệm vaccine và chất kích thích miễn dịch (Lin et
al., 2005; Kato et al., 2004; Harikrishnam et al., 2011).
1.3.3 Các nhân tố ảnh hƣởng đến đáp ứng miễn dịch ở cá
Các nhân tố ảnh hưởng đến ĐƯMD ở cá bao gồm các yếu tố
nội tại liên quan đến quá trình phát triển của cá và các yếu tố ngoại
cảnh, trong đó, nhiệt độ có ảnh hưởng lớn nhất.
1.4. Sử dụng vaccine và các chất kích thích miễn dịch trong nghề
nuôi cá
1.4.1. Nghiên cứu ứng dụng các chất kích thích miễn dịch ở cá nuôi
Đã có 22 chất kích thích miễn dịch không đặc hiệu được
nghiên cứu sử dụng ở cá mú.
1.4.2. Nghiên cứu và sử dụng vaccine ở cá nuôi
Lịch sử nghiên cứu và sự ra đời các loại vaccine thương mại sử
dụng cho cá nuôi được tổng quan từ các nghiên cứu trên thế giới, tập
trung ở các loài cá nước lạnh như cá hồi, cá tuyết, hoặc cá nước ngọt
như cá nheo, cá chép.
1.5. Tình hình nghiên cứu miễn dịch và vaccine cho cá ở Việt Nam
Ở Việt Nam, tình hình nghiên cứu về miễn dịch và vaccine cho
cá vẫn còn khá mới mẽ, chủ yếu trên các loài cá nước ngọt. Nghiên
cứu đặc điểm miễn dịch trên cá biển vẫn còn bỏ ngõ, trong đó có cá
mú. Mới đây, vaccine thương mại kháng bệnh do vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri ở cá tra Việt Nam vừa được công bố.


5
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.1.1. Đối tƣợng: Cá mú chấm cam Epinephelus coioides
2.1.2.Vật liệu:
i) Cá mú chấm cam: cá mú bệnh dùng để phân lập vi khuẩn
được thu tại Khánh Hòa. Cá mú chấm cam khỏe được thu mua từ trại
sản xuất giống nhân tạo tại Khánh Hòa. Cá được nuôi thuần dưỡng
trước khi tiến hành các thí nghiệm.
ii) Vi khuẩn V. parahaemolyticus: Chủng V3 được phân lập từ cá
mú bệnh lở loét thu tại Khánh Hòa; chủng V1 được cung cấp bởi Trung
tâm Quan trắc cảnh báo môi trường và Phòng ngừa dịch bệnh khu vực
miền Bắc; chủng V2 được cung cấp bởi Trung tâm Quan trắc cảnh báo
môi trường và Phòng ngừa dịch bệnh khu vực Nam Bộ; chủng A là V.
parahaemolyticus 17802 được mua từ ngân hàng chủng ATCC.
iii) Chất kích thích miễn dịch: β-glucan (Macrogard-Biorigin,
Na Uy).
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu: Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III
và Phòng Nghiên cứu miễn dịch cá- Bộ môn Sinh học- Khoa toán và
Khoa học tự nhiên- Trường Đại học Bergen, Na Uy.
2.1.4. Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 1/2008 đến 11/2012.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm của vi khuẩn V. parahaemolyticus
 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa
Phân lập vi khuẩn và nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh
lý, sinh hóa dựa theo phương pháp của Whitman (2004). Định danh
vi khuẩn theo khóa phân loại của Bergey và phân tích trình tự gen
16S rDNA theo Harris và Hartley (2003).
6
 Phân tích thành phần protein của các chủng vi khuẩn
Thành phần protein của các chủng vi khuẩn được xác định
bằng kỹ thuật SDS-PAGE theo Tsang et al. (1983).

 Xác định khả năng gây bệnh của V. parahaemolyticus ở cá
mú chấm cam
Cá mú chấm cam được gây nhiễm thực nghiệm bằng các
chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus V1, V2, V3 và A ở 4 nồng độ
10
2
, 10
3
, 10
4
và 10
5
cfu/g bằng cách tiêm vào cơ. Phosphate Buffered
Saline (PBS) tiệt trùng được sử dụng tiêm cho nhóm đối chứng (Mỗi
nhóm cá thí nghiệm gồm 6 cá thể). Thí nghiệm được lặp lại 2 lần
trong cùng thời điểm.
Độc lực của mỗi chủng vi khuẩn được đánh giá qua liều gây
chết 50% được tính toán theo công thức của Reed và Muench (1938).
2.2.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của β-glucan đến đáp ứng miễn
dịch không đặc hiệu ở cá mú chấm cam
 Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức tương ứng với 3 nồng độ
cho ăn β-glucan (500 ppm, 1000 ppm và 2000 ppm) và nhóm đối
chứng không cho ăn β-glucan. Mật độ cá thí nghiệm là 30 con/bể.
Thức ăn viên (M503, Uni-president Việt Nam) trộn β-glucan và bao
bên ngoài bằng dầu mực được chuẩn bị trước mỗi bữa ăn và sử dụng
cho cá ăn liên tục trong 2 tuần với khẩu phần 2% khối lượng thân
mỗi ngày. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần trong cùng thời điểm.
 Thu mẫu: Ở ngày thứ nhất và ngày thứ 15 sau khi ngưng cho
ăn β-glucan, thu mẫu cá (6 cá thể/nghiệm thức) để lấy máu và tiền
thận (Head kidney).

 Xác định công thức bạch cầu trong máu: Làm tiêu bản và
đếm các loại tế bào máu theo phương pháp của Selvaraj et al. (2006).
Phân loại các loại bạch cầu theo Ainsworth (1992).
7
 Phân lập, nuôi cấy, khảo sát các thông số miễn dịch không
đặc hiệu của bạch cầu tiền thận: Phân lập bạch cầu từ thận bằng cách
ly tâm trên phân lớp gradient percoll theo Yeh et al. (2008); Khảo sát
hoạt tính thực bào dựa trên khả năng bắt nuốt các hạt nhuộm huỳnh
quang của bạch cầu theo Yeh et al. (2008); Khảo sát hoạt tính bùng
nổ hô hấp của bạch cầu theo Cheng et al. (2007).
 Khảo sát khả năng kháng bệnh của cá mú chấm cam sau khi
ăn β-glucan: Tiêm cảm nhiễm V. parahaemolyticus với liều 1,07 x
10
5
cfu/g cá ở 2 thời điểm: ngày thứ nhất và ngày thứ 15 sau khi
ngừng ăn thức ăn có bổ sung β-glucan. Tại mỗi thời điểm, 24 cá
thể/nghiệm thức được tiêm cảm nhiễm. Theo dõi ghi nhận tỷ lệ cá
chết ở mỗi nghiệm thức.
2.2.3. Nghiên cứu đặc điểm phân tử kháng thể của cá mú chấm
cam
 Thu huyết thanh cá mú thực hiện theo phương pháp của Aakre
et al. (1994). Tinh sạch kháng thể IgM từ huyết thanh trên hệ thống
sắc ký FPLC (Pharmacia, Uppsala, Sweden) theo Havarstein et al.
(1988). Phân tích IgM bằng kỹ thuật SDS-PAGE theo Tsang et al.
(1983).
 Tạo huyết thanh thỏ kháng IgM của cá mú chấm cam: Gây
miễn dịch cho thỏ qua 3 lần tiêm dưới da 0,2 mg IgM cá mú và chất
bổ trợ (FCA/FIA) với tỷ lệ 1:1 (v/v), mỗi lần tiêm
cách nhau 4 tuần. Thu huyết thanh sau mũi tiêm cuối cùng 2 tuần, lưu
giữ huyết thanh ở -70

o
C.
 Phân tích liên kết đặc hiệu giữa IgM cá mú chấm cam với
kháng huyết thanh thỏ bằng kỹ thuật Western Blot theo Towbin et al.
(1979).
8
2.2.4. Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá mú chấm
cam đối với vi khuẩn V. parahaemolyticus
 Kháng nguyên: Vi khuẩn được bất hoạt bằng formalin 0,5%
(v/v) rồi pha trong PBS hoặc kết hợp chất bổ trợ FIA (tỷ lệ 1:1) để
đạt nồng độ 10
9
tế bào/mL.
 Đáp ứng tạo kháng thể của cá mú chấm cam đối với kháng
nguyên không bổ sung chất bổ trợ FIA: Các chủng vi khuẩn V1, V2,
V3 và A sau khi bất hoạt formalin được tiêm gây miễn dịch cho 20
con cá/chủng với liều 0,1 mL/con cá, cá đối chứng được tiêm 0,1 mL
PBS tiệt trùng. Sau khi gây miễn dịch 30, 45 và 60 ngày, thu huyết
thanh (10 con cá/nghiệm thức/mỗi thời điểm) để định lượng kháng
thể bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp theo phương pháp của Jakobsen
(1999). Thí nghiệm lặp lại 2 lần trong cùng thời điểm.
 Đáp ứng tạo kháng thể và khả năng kháng bệnh của cá mú
chấm cam được gây miễn dịch bằng kháng nguyên có bổ sung chất
bổ trợ FIA:
Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức: nhóm cá được gây miễn dịch
bằng vi khuẩn V. parahaemolyticus V3 bất hoạt có bổ sung FIA (ký
hiệu là V3F), nhóm cá được tiêm vi khuẩn V3 bất hoạt không có FIA
(ký hiệu V3), nhóm đối chứng tiêm PBS (PBS-C) và đối chứng
không tiêm (C). Mỗi nhóm gồm 50 con ( 49,8 ± 12,8 g).
Tại các thời điểm 30, 45 và 60 sau khi gây miễn dịch, 10 cá

thể/nghiệm thức được thu huyết thanh để phân tích tính đặc hiệu của
kháng thể bằng kỹ thuật Western Blot và xác định hàm lượng kháng
thể bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp.
Đồng thời, tại thời điểm 30 ngày và 60 ngày sau khi gây miễn
dịch, 20 con/nghiệm thức/thời điểm được tiêm cảm nhiễm vi khuẩn
V. parahaemolyticus lần lượt với liều 2,5 x 10
5
cfu/g và 2,0 x 10
5

cfu/g. Theo dõi ghi nhận tỷ lệ cá chết ở mỗi nghiệm thức. Tính toán
9
hệ số bảo hộ (RPS) của kháng nguyên vi khuẩn đối với cá mú theo
công thức của Ellis (1988).
Thí nghiệm được lặp lại 2 lần trong cùng thời điểm.
2.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu:
Số liệu thu thập được xử lý thống kê trên phần mềm SPSS
version 15.0. Các giá trị trung bình của các đại lượng được so sánh
theo phương pháp phân tích phương sai một yếu tố (one-way
ANOVA) và Chi- test. So sánh sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa
nhiều giá trị trung bình của các biến bằng phân tích Post Hoc test
theo phép kiểm định Tukey HSD ở độ tin cậy 95 %.

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đặc điểm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh lở loét
ở cá mú chấm cam
3.1.1. Bệnh xuất huyết lở loét ở cá mú chấm cam nuôi tại Khánh
Hòa
Trên 24 mẫu cá mú bệnh thu được tại Khánh Hòa trong thời
gian từ tháng 3-7/2008, tần suất bắt gặp các dấu hiệu bệnh lý chính

cho thấy sự khác nhau tùy thuộc vào tình trạng nhiễm bệnh. Trong
đó, 100 % mẫu cá bệnh có triệu chứng xuất huyết vây, miệng; 75 %
mẫu có nhiều vết loét trên thân; 62,5 % mẫu có gan nhợt nhạt; 58,3
% mẫu có thận bầm, nhão và 33,3 % mẫu có tích dịch vàng trong
xoang bụng.
Từ các mẫu cá bệnh đã phân lập được 16 chủng vi khuẩn V.
parahaemolyticus với tần số bắt gặp 66,7 %. Trong đó, chủng C07K
được phân lập từ thận có độc tính cao nhất với giá trị LD
50
là 2,14 x
10
3
cfu/g. Chủng này được ký hiệu là V3 và được sử dụng để so sánh
với các chủng V. parahaemolyticus V1, V2 và A.
10
3.1.2. Đặc điểm của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
3.1.2.1. Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh lý
Bốn chủng vi khuẩn nghiên cứu (V1, V2, V3 và A) đều thể
hiện các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh thái khá giống nhau: Gram
âm, hình que ngắn, có khả năng di động, tạo khuẩn lạc màu xanh trên
môi trường TCBS, có khả năng chịu mặn cao đến 8 % trong môi
trường TSB và gây dung giải hồng cầu máu thỏ trên môi trường
thạch. Trong đó, chủng V3 cho kiểu dung huyết β trong khi 3 chủng
còn lại có kiểu dung huyết α.
Các chủng V1, V2, V3 đều có hầu hết đặc điểm hình thái, sinh
hóa, sinh lý khá tương đồng với chủng chuẩn ATCC 17802 và được
định danh V. parahaemolyticus dựa theo khóa phân loại của Bergey
và phân tích trình tự gen 16S rDNA với mức độ tương đồng đến 99%
so với chủng chuẩn.
3.1.2.2. Thành phần protein của vi khuẩn V. parahaemolyticus

Thành phần protein của 4 chủng V. parahaemolyticus tương tự
nhau. Trong phổ protein của các chủng vi khuẩn này có các protein
khối lượng phân tử 66, 47, 31, 28 và 21 kDa tương đồng với các
protein mang độc tố và có tính kháng nguyên cao đã được nhiều tác
giả công bố (Hình 3.5). Phát hiện này có ý nghĩa quan trọng trong
việc chọn lựa các chủng vi khuẩn tiềm năng ứng dụng cho nghiên
cứu sản xuất vaccine phòng bệnh cho cá biển.






11









3.1.3.Khả năng gây bệnh và độc lực của V. parahaemolyticus trên
cá mú chấm cam
Sau 10 ngày cảm nhiễm, kết quả thí nghiệm cho thấy chủng
V3 có độc lực cao nhất so với các chủng V1, V2 và A với giá trị LD
50

là 1,78 x 10

3
cfu/g (Hình 3.6).

















0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240
Thời gian (giờ)
Tỷ lệ chết tích lũy (%)
ĐC 10^2cfu/g 10^3 cfu/g
10^4 cfu/g 10^5 cfu/g
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240
Thời gian ( giờ)
Tỷ lệ chết tích lũy (%)
ĐC 10^2 cfu/g 10^3 cfu/g
10^4 cfu/g 10^5 cfu/g
0
10
20
30
40
50
60
70
80

90
100
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240
Thời gian (giờ)
Tỷ lệ chết tích lũy (%)
ĐC 10^2 cfu/g 10^3 cfu/g
10^4 cfu/g 10^5 cfu/g

0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240
Thời gian (giờ)
Tỷ lệ chết tích lũy (%)
ĐC 10^2 cfu/g 10^3 cfu/g
10^4 cfu/g 10^5 cfu/g
a. LD
50
> 10
5
cfu/g
b. LD

50
= 2.14 x 10
4
cfu/g
d. LD
50
= 1,48 x 10
4
cfu/g
c. LD
50
= 1,78 x 10
3
cfu/g
Hình 3.5: Thành phần protein của các chủng vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus
Hình 3.6: Tỷ lệ chết tích lũy của cá mú chấm cam cảm nhiễm Vibrio
parahaemolyticus (a: Chủng V1; b: Chủng V2; c: Chủng V3; d: Chủng A)

12
3.2. Ảnh hưởng của β-glucan đến các thông số miễn dịch không
đặc hiệu và khả năng kháng bệnh do V. parahaemolyticus gây ra
ở cá mú chấm cam
3.2.1. Thành phần, đặc điểm hình thái và kích thƣớc các loại tế
bào máu cá mú chấm cam
Cá mú chấm cam có đầy đủ các loại tế bào máu tương tự như
nhiều loài cá xương khác. Thành phần, kích thước và hình ảnh của các
loại tế bào máu cá mú chấm cam thể hiện qua Bảng 3.2 và Hình 3.8.
Bảng 3.2: Kích thƣớc của các loại tế bào máu ở cá mú chấm cam
(n = 15, giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn)

Loại
tế bào máu
Kích thước tế bào
Kích thước nhân
Dài (µm)
Rộng
(µm)
Dài
(µm)
Rộng
(µm)
Hồng cầu
11,4 ± 1,1
7,1 ± 0,8
5,3 ± 0,5
4,3 ± 0,5
BC trung tính
9,3 ± 2,2
7,7 ± 1,3
6,8 ± 0,7
5,2 ± 0,7
BC ưa a xít
8,1 ± 1,1
6,4 ± 0,6
5,5 ± 0,6
4,6 ± 0,8
BC ưa kiềm
6,6 ± 0,9
5,8 ± 0,9
5,8 ± 0,7

3,9 ± 1,0
BC đơn nhân
9,9 ± 1,5
8,8 ± 1,3
7,1 ± 0,9
4,5 ± 0,9
Lympho bào
6,0 ± 0,9
5,1 ± 0,5


Tiểu cầu
7,6 ± 1,1
3,9 ± 0,9


Chú thích: BC- Bạch cầu






13

Hình 3.8: Các loại tế bào máu cá mú chấm cam (M-BC đơn nhân;
L-Lympho bào; T- Tiểu cầu; N-BC trung tính;E- BC ưa axít; B- BC
ưa kiềm; Er- Hồng cầu)
3.2.2. Ảnh hƣởng của β-glucan đến công thức bạch cầu (BC)
trong máu của cá mú chấm cam
Sau 2 tuần ăn thức ăn có bổ sung β-glucan, tỷ lệ BC tổng số,
BC trung tính và BC đơn nhân trong máu cá mú chấm cam đã tăng
lên và khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05) so với nhóm đối chứng.
Trong đó, tỷ lệ các loại BC này cao nhất ở nhóm cá được cho ăn β-
glucan ở nồng độ 1000 và 2000 ppm (Bảng 3.3).
Bảng 3.3: Sự biến đổi tỷ lệ các loại bạch cầu trong máu ở cá mú
chấm cam sau 2 tuần đƣợc cho ăn β-glucan (%, trung bình ± độ
lệch chuẩn, n = 6)
Loại bạch cầu
Các nghiệm thức thí nghiệm
ĐC
G500
G1000
G2000
BC tổng số
3,3 ± 0,6
a
4,2 ± 0,4
b
5,3 ± 0,4
c

6,0 ± 0,5
c
BC trung tính
21,5±2,8
a
23,6± 4,4
ab
27,9 ± 1,9
b
27,1 ± 3,3
b
BC đơn nhân
18,7± 8,0
a
26,4 ± 3,7
ab
26,5 ± 5,4
ab
27,6 ± 2,5
b
BC ưa a xít
4,9 ± 2,4
a
5,2 ± 1,3
a
4,9 ± 1,4
a
4,1 ± 0,7
a
BC ưa kiềm

5,0 ± 0,9
b
3,3 ± 0,6
a
3,0 ± 0,8
a
2,4 ± 0,8
a
Lympho bào
49,9 ± 7,0
b
41,5 ± 5,8
ab
37,7 ± 4,3
a
38,8 ± 6,5
a
Ghi chú: Các ký hiệu số mũ khác nhau trên cùng một hàng biểu thị
sự sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05)
14
3.2.3. Ảnh hƣởng của β-glucan đến chỉ số thực bào của tế bào
bạch cầu tiền thận cá mú chấm cam
Chỉ số thực bào BC tiền thận của cá mú chấm cam ở nhóm ăn
bổ sung β-glucan trong 2 tuần đã tăng lên và khác biệt có ý nghĩa
thống kê so với nhóm đối chứng, và chỉ số này suy giảm sau khi
ngừng cho ăn 15 ngày. Trong đó, nhóm cá được ăn β-glucan nồng độ
1000 ppm đạt hiệu quả cao nhất (Bảng 3.4).
Bảng 3.4: Hoạt tính thực bào của tế bào bạch cầu tiền thận cá mú
chấm cam khi đƣợc bổ sung β-glucan vào thức ăn ở các nồng độ
khác nhau

Thời gian
Nghiệm
thức
Tỷ lệ tế bào
BC tham gia
thực bào (%)
Cƣờng độ thực bào của tế bào bạch
cầu mô thận ( %, n = 6, TB ± SD )
1 hạt
2 hạt
> 3 hạt
Ngày thứ 1
sau khi
ngừng cho ăn
β-glucan
ĐC
13,3 ± 2,3
a
6,3 ± 1,6
a
4,4 ± 0,3
a
2,6 ± 0,5
a
G500
6,0 ± 2,1
ab
7,3 ± 0,5
ab
5,0 ± 0,9

ab
3,7 ± 1,0
a
G1000
26,0 ± 7,1
c
12,1 ± 2,6
c
6,9 ± 2,4
b
7,0 ± 3,3
b
G2000
20,7 ± 1,2
bc
9,1 ± 1,2
b
6,2 ± 0,7
ab
5,3 ± 1,4
ab
Ngày thứ 15
sau khi ngừng
cho ăn β-
glucan
ĐC
13,5 ± 0,9
a

6,2 ± 1,0

a
4,9 ± 0,6
a
2,4 ± 0,3
b
G500
13,8 ± 0,8
a

7,4 ± 0,8
a
4,5 ± 0,9
a
2,0 ± 0,2
a
G1000
13,3 ± 0,4
a

7,1 ± 0,4
a
4,0 ± 0,6
a
2,2 ± 0,2
ab
G2000
13,5 ± 1,1
a
7,2 ± 0,8
a

4,2 ± 0,4
a
2,0 ± 0,2
a
Ghi chú: Các ký hiệu số mũ khác nhau trên cùng một cột biểu thị sự
sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05)
3.2.4. Ảnh hƣởng của β-glucan đến hoạt tính bùng nổ hô hấp của
tế bào bạch cầu tiền thận cá mú chấm cam
Hoạt tính bùng nổ hô hấp (Respiratory Burst - RB) của tế bào
BC tiền thận cá mú chấm cam được cho ăn β-glucan nồng độ 1000 và
15
2000 ppm trong 2 tuần đã tăng cao và khác biệt có ý nghĩa thống kê
so với nhóm cho ăn nồng độ 500 ppm và đối chứng. Tuy nhiên, chỉ
số này không khác biệt giữa các nhóm cá thí nghiệm sau khi ngưng
cho ăn 15 ngày (Hình 3.11).









Hình 3.11: Hoạt tính RB của tế bào bạch cầu tiền thận cá mú
chấm cam Epinephelus coioides (A: Ngày thứ 1 sau khi ngừng cho
ăn β-glucan; B: Ngày thứ 15 sau khi ngừng cho ăn β-glucan; Các
chữ cái khác nhau trên các cột biểu hiện sự sai khác có ý nghĩa thống
kê (P<0,05)
3.2.5. Ảnh hƣởng của β-glucan đến khả năng kháng bệnh do vi

khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra ở cá mú chấm cam
Cá mú chấm cam sau khi ăn thức ăn có β-glucan trong 2 tuần
và cảm nhiễm với vi khuẩn độc, kết quả cho thấy tỷ lệ chết tích lũy
(%) của các nhóm cá được ăn β-glucan thấp hơn có ý nghĩa thống kê
so với nhóm đối chứng. Tuy nhiên, tỷ lệ này không khác biệt sau khi
ngừng cho ăn 15 ngày (Hình 3.12).

a
b
b
a
a
a
a
a
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
Hoạt tính RB (OD 630 nm)
ĐC G2000 G1000 G500
A B
16

3.3. Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu ở cá mú chấm cam đối với vi
khuẩn Vibrio parahaemolyticus
3.3.1. Đặc điểm phân tử kháng thể IgM của cá mú chấm cam
Đơn vị cấu trúc phân tử kháng thể IgM cá mú chấm cam gồm
chuỗi nặng và chuỗi nhẹ có khối lượng lần lượt là 78 kDa và 25 kDa.
Ngoài ra, phân tử này còn có một polypeptide có khối lượng 23 kDa
chưa được biết rõ chức năng trong cấu trúc phân tử IgM (Hình 3.13).








97.4
66.2
31.0
21.5
14.4
kDa 1 2 3 4 5

H
L
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Ngày
Tỷ lệ chết tích lũy ( %)
G-500 ppm G-1000 ppm G-2000 ppm ĐC
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Ngày

Tỷ lệ chết tích lũy (%)
G-500 ppm G-1000 ppm G-2000 ppm ĐC
a
b
Hình 3.13: Kết quả phân tích phân tử globulin miễn dịch
(IgM) của cá mú chấm cam bằng các kỹ thuật SDS-PAGE và
Western Blot (1: Marker; 2, 3: IgM cá mú trên SDS-PAGE; 4, 5:
Liên kết giữa IgM cá mú và huyết thanh thỏ kháng IgM cá mú trên
Western blot; H: Chuỗi nặng; L: Chuỗi nhẹ)
Hình 3.12: Tỷ lệ chết tích lũy của cá mú chấm cam cảm
nhiễm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ở ngày thứ nhất (a)
và ngày thứ 15 (b) sau khi ngừng cho ăn β-glucan

17
3.3.2. Đáp ứng tạo kháng thể ở cá mú chấm cam đối với 4 chủng vi
khuẩn Vibrio parahaemolyticus bất hoạt formalin không có FIA
Đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu ở cá mú chấm cam sau
30 và 45 ngày được gây miễn dịch bởi các chủng vi khuẩn V.
parahaemolyticus bất hoạt cao hơn có ý nghĩa thống kê so với các
nhóm đối chứng ( P< 0,05). Trong đó, chủng V3 đã kích thích cá mú
tạo kháng thể cao nhất. Đáp ứng này không có sự khác biệt giữa các
nhóm cá thí nghiệm sau khi gây miễn dịch 60 (Hình 3.14).

Hình 3.14: Biến động hiệu giá kháng thể ở cá mú chấm cam sau khi
gây miễn dịch bằng 4 chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bất
hoạt bằng formalin đƣợc xác định bằng kỹ thuật ELISA đo ở bƣớc
sóng 490 nm (Ký tự trên mỗi cột trong cùng thời điểm chỉ sự khác
nhau có ý nghĩa (P< 0,05) với kiểm định Tukey, n=10)

30 45 60
Thời gian sau khi gây miễn dịch (Ngày)
c
b
b
d
a
c
b
b
d
a
a
a
a
a
a
0,00
0,05
0,10

0,15
0,20
0,25
0,30
A V1 V2 V3 ĐC
Mật độ quang (OD 490nm)
18
3.3.3. Đáp ứng miễn dịch dịch thể và khả năng kháng bệnh của
cá mú chấm cam sau khi gây miễn dịch bằng V. parahaemolyticus
V3 bất hoạt bằng formalin có bổ sung chất bổ trợ FIA
3.3.3.1. Phát hiện kháng thể ở cá thí nghiệm sau khi gây miễn dịch
Sau khi gây miễn dịch bằng kháng nguyên vi khuẩn V.
parahaemolyticus V3 bất hoạt, huyết thanh của các nhóm cá thí
nghiệm đều cho thấy có các vạch liên kết đặc hiệu giữa kháng thể với
các loại protein của vi khuẩn, trong khi nhóm đối chứng không thể
hiện vạch liên kết đặc hiệu tương ứng. Trong đó, số lượng vạch liên
kết nhiều hơn và mức độ phản ứng rõ nét hơn ở nhóm cá gây miễn
dịch có bổ sung FIA; và các biểu hiện này có xu hướng giảm dần
theo thời gian sau khi gây miễn dịch ( Hình 3.15).

Hình 3.15: Biểu hiện liên kết giữa kháng thể của cá mú chấm cam
với protein của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus V3 bằng kỹ thuật
Western Blot (Cột 1: Marker; Cột 2,3 và 4: Kháng nguyên có bổ sung
FIA sau 30, 45 và 60 ngày; Cột 5,6 và 7: Kháng nguyên không bổ sung
FIA sau 30, 45 và 60 ngày; Cột 8: nhóm đối chứng được tiêm PBS)
19
3.3.3.2. Hàm lƣợng kháng thể của cá mú chấm cam sau khi gây
miễn dịch bằng V. parahaemolyticus V3 bất hoạt bằng formalin ở
các thời điểm khác nhau
Hàm lượng kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh cá được gây
miễn dịch bằng chủng V3 kết hợp FIA cao nhất và khác biệt có ý
nghĩa thống kê tại các thời điểm 30, 45 và 60 ngày sau khi gây miễn
dịch (Hình 3.16).










Hình 3.16: Biến động hiệu giá kháng thể ở cá mú chấm cam sau
khi gây miễn dịch bằng V. parahaemolyticus V3 đã bất hoạt bằng
formalin đƣợc xác định bằng kỹ thuật ELISA đo ở bƣớc sóng 490
nm (V3+ FIA: Cá được gây miễn dịch bằng chủng V3 có chất bổ trợ
FIA; V3: Cá được gây miễn dịch bằng chủng V3; PBS-C: Cá đối chứng
tiêm dung dịch PBS và C: Cá đối chứng không tiêm; Ký tự trên mỗi cột
trong cùng thời điểm chỉ sự khác nhau có ý nghĩa (P< 0,05) với kiểm

định Tukey, n=10)
a
b
c
d
a
b
c
d
a
b
b
b
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
30 45 60
Mật độ quang (OD 490nm)
V3 + FIA V3 PBS-C C
Thời gian sau khi gây miễn dịch (ngày)
20
3.3.3.4 Khả năng kháng bệnh xuất huyết lở loét ở cá mú chấm
cam đã đƣợc gây miễn dịch khi bị thử thách bởi vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus V3 độc
a. Khả năng kháng bệnh của cá ở thời điểm 30 ngày sau khi gây
miễn dịch
Sau khi gây miễn dịch 30 ngày, khả năng kháng bệnh của cá

được gây miễn dịch cao hơn so với nhóm đối chứng (Hình 3.17). Hệ
số bảo hộ (RPS) cao nhất ở nhóm cá gây miễn dịch bằng vi khuẩn có
bổ sung FIA là 87,5%, trong khi ở nhóm không bổ sung FIA chỉ đạt
50%.










Hình 3.17: Tỷ lệ chết tích lũy ở cá mú chấm cam gây nhiễm thực
nghiệm ở thời điểm 30 ngày sau khi gây miễn dịch (V3+FIA:
kháng nguyên bổ sung FIA; V3: kháng nguyên không có FIA; PBS-
C: đối chứng tiêm PBS; C: đối chứng không tiêm)



0
10
20
30
40
50
60
70
80

90
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Ngày
Tỷ lệ chết tích lũy (%)
V3+FIA V3 PBS-C C
21
b. Khả năng kháng bệnh của cá ở thời điểm 60 ngày sau khi gây
miễn dịch
Ở thời điểm 60 ngày sau khi gây miễn dịch, kháng nguyên không
còn khả năng bảo hộ cá mú kháng lại vi khuẩn gây bệnh (Hình 3.18).
Hệ số bảo hộ (RPS) chỉ đạt 41,1 % ở nhóm được tiêm vi khuẩn có bổ
sung FIA và 10,9 % ở nhóm không bổ sung FIA.










Hình 3.18: Tỷ lệ chết tích lũy ở cá mú chấm cam gây nhiễm thực
nghiệm ở thời điểm 60 ngày sau khi gây miễn dịch (V3+FIA:
kháng nguyên bổ sung FIA; V3: kháng nguyên không có FIA; PBS-
C: đối chứng tiêm PBS; C: đối chứng không tiêm)


0

10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Ngày
Tỷ lệ chết tích lũy (%)
V3+FIA V3 PBS-C C
22
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN
Kết luận
1. Chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus V3 có đặc điểm hình
thái, sinh lý, sinh hóa tương tự với chủng chuẩn ATCC 17802 và gây
bệnh xuất huyết lở loét cho cá mú chấm cam E. coioides trong điều
kiện thí nghiệm với các biểu hiện bệnh tương tự như trong tự nhiên,
với liều gây chết 50 % (LD
50
) là 1,78 x 10
3
cfu/g.
2. Thành phần protein của vi khuẩn V. parahaemolyticus V3
gồm các protein có khối lượng phân tử trong khoảng từ 97,4 đến thấp
hơn 14,4 kDa. Trong đó, các protein có khối lượng 66, 47, 31, 28, 21
kDa có tính sinh miễn dịch cao, có ý nghĩa ứng dụng trong sản xuất

vaccine tiểu phần.
3. Khả năng đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cá mú
chấm cam E. coioides tăng lên sau khi được ăn thức ăn có bổ sung β-
glucan ở các mức 500, 1000 và 2000 ppm trong 2 tuần, thể hiện ở sự
gia tăng số lượng tế bào bạch cầu tham gia thực bào trong máu, chỉ
số thực bào và hoạt tính RB của tế bào BC phân lập từ tiền thận.
Trong đó, liều bổ sung β-glucan 1000 ppm vào thức ăn mang lại hiệu
quả cao nhất. Tuy nhiên, các thông số đáp ứng miễn dịch không đặc
hiệu và hiệu quả bảo vệ kháng lại V. parahaemolyticus ở cá thí
nghiệm đều suy giảm và không có sự sai khác so với nhóm cá đối
chứng khi kiểm tra vào ngày thứ 15 sau khi ngừng cho ăn thức ăn bổ
sung β-glucan.
4. Cá mú chấm cam E. coioides sau khi gây miễn dịch bằng 4
chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus bị bất hoạt bằng formalin đều có
biểu hiện tăng hàm lượng kháng thể trong huyết thanh. Trong đó, chủng
V3 có khả năng kích thích cá mú chấm cam sinh kháng thể mạnh nhất.
23
5. Kháng nguyên vi khuẩn V. parahaemolyticus V3 bất hoạt
bằng formalin kết hợp chất bổ trợ FIA đã kích thích cá mú E.
coioides sinh kháng thể đặc hiệu cao hơn có ý nghĩa so với nhóm cá
được tiêm kháng nguyên không bổ sung FIA và cá đối chứng sau 30
và 45 ngày tiêm gây miễn dịch (P < 0,05). Xu thế này tương ứng với
số lượng vạch phản ứng kháng nguyên-kháng thể ở nhóm cá tiêm
kháng nguyên có FIA nhiều hơn so với nhóm cá tiêm kháng nguyên
không có FIA và đối chứng ở 2 thời điểm trên. Tuy nhiên, hàm lượng
kháng thể trong huyết thanh của cá thí nghiệm giảm và không có sự
khác biệt giữa các nghiệm thức sau 60 ngày tiêm gây miễn dịch.
6. Kháng nguyên từ vi khuẩn V. parahaemolyticus V3 bất
hoạt bằng formalin có bổ sung FIA tạo hiệu quả bảo vệ cá mú E.
coioides kháng bệnh do vi khuẩn này gây ra khi công cường độc ở

thời điểm 30 ngày sau khi gây miễn dịch với giá trị RPS là 87,5 %.
Tuy nhiên, hiệu quả bảo vệ này suy giảm sau 60 ngày gây miễn dịch.
7. Đơn vị cấu trúc phân tử kháng thể IgM của cá mú chấm
cam E. coioides gồm một chuỗi nặng 78 kDa và một chuỗi nhẹ 25
kDa, ngoài ra, còn có một polypeptide có khối lượng 23 kDa hiện
chưa rõ vai trò của nó trong cấu trúc phân tử này.
Đề xuất ý kiến
1. β-glucan bổ sung vào thức ăn có tác dụng kích thích đáp ứng
miễn dịch không đặc hiệu ở cá mú E. coioides sau khi ăn liên tục
trong 2 tuần. Tuy nhiên, hiệu quả này giảm mạnh sau 15 ngày ngừng
cho ăn. Vì vậy, cần tiếp tục nghiên cứu xác định thời gian cho ăn bổ
sung β-glucan thích hợp cũng như thời gian duy trì tác dụng của nó
trên cá sẽ góp phần tạo cơ sở khoa học cho việc đưa ra khuyến cáo về
việc sử dụng β-glucan hiệu quả và ít tốn kém nhất cho người nuôi.