Công nghệ sản xuất Bacterial Cellulose

Bộ Công Thương
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Môn Học: Ứng Dụng CNSH trong
CNTP
ĐỀ TÀI: Công nghệ sản xuất Bacterial Cellulose
Giảng viên hướng dẫn: Nguyễn Thị Thu Sang
Nhóm thực hiện: Nhóm 17
Thứ 5, Tiết 7-8
Họ và tên MSSV
1. Trần Thị Kim Khánh 2005120393
2. Huỳnh Ngọc Mạnh 2005120349
3. Nguyễn Thị Mộng Tuyền 2005120454
4. Phạm Hải Triều 2005120337
Ứng dụng CNSH trong CNTP
Công nghệ sản xuất Bacterial Cellulose
Danh Sách Nhóm
STT Họ và Tên MSSV
1 Trần Thị Kim Khánh 2005120393
2 Huỳnh Ngọc Mạnh 2005120349
3 Nguyễn Thị Mộng Tuyền 2005120454
4 Phạm Hải Triều 2005120337
2
Ứng dụng CNSH trong CNTP
Công nghệ sản xuất Bacterial Cellulose
Mục Lục
3
Ứng dụng CNSH trong CNTP
Công nghệ sản xuất Bacterial Cellulose
Lời Mở Đầu
Cellulose là một hợp chất hóa học thường được biết đến với vai trò là bộ khung

xương quan trọng trong cơ thể thực vật. Không những cellulose được tổng hợp bởi
thực vật, mà cellulose còn được tổng hợp nên bởi vi sinh vật, với tên gọi là cellulose vi
khuẩn. Một trong những loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose rất tốt đó là A.
xylinum. Cellulose vi khuẩn ngày càng được quan tâm nhiều hơn bởi khả năng ứng
dụng rộng rãi trong nhiều ngành khoa học: công nghiệp thực phẩm, y học, mỹ phẩm,
khoa học vật liệu, âm thanh, xử lý nước thải, bảo vệ môi trường… Gần đây, khả năng
ứng dụng cellulose vi khuẩn không ngừng được nghiên cứu, cải tiến bởi các nhà khoa
học trên thế giới (Otomo et al., 2000).
Trong công nghệ đồ uống và thực phẩm, cellulose vi khuẩn đã được ứng dụng
làm nhiều sản phẩm như: nước trái cây, thực phẩm chức năng… Đặc biệt, một ứng
dụng của cellulose vi khuẩn mới được phát hiện gần đây là khả năng ứng dụng làm
màng bao thực phẩm chống vi sinh vật rất hiệu quả (Yoshinaga et al., 1997; Okiyama
et al., 1993). Từ những ứng dụng ưu việt trên của Bacterial Cellulose nhóm em đã tiến
hành tìm hiểu về công nghệ sản xuất Bacterial Cellulose trong cuốn tiểu luận này.
4
Ứng dụng CNSH trong CNTP
Công nghệ sản xuất Bacterial Cellulose
Công nghệ sản xuất Bacterial Cellulose
1 Tổng quan
Sự tổng hợp lớp màng cellulose ngoại bào của vi khuẩn A. xylinum lần đầu tiên
được báo cáo bởi Brown et al. (1986). Theo đó, khi nghiên cứu về vi khuẩn acetic,
Brown đã phát hiện và quan sát thấy một khối rắn mà theo ông lúc đó khối rắn này
không nằm trong các kết quả nghiên cứu ông dự định trước. Khối rắn này khó bị phân
hủy và giống với mô động vật. Hợp chất đó sau này được xác định là cellulose và vi
khuẩn tổng hợp ra nó là Bacterium xylinum (Brown et al., 1986). Đến nửa thế kỷ XX
các nhà khoa học mới thực sự nghiên cứu nhiều về cellulose vi khuẩn. Đầu tiên,
Hestrin et al. (1954) đã nghiên cứu về khả năng tổng hợp cellulose của vi khuẩn A.
xylinum. Ông đã chứng minh rằng vi khuẩn này có thể sử dụng đường để tổng hợp
cellulose. Sau đó, Next và Colvin (1957) chứng minh rằng cellulose được A. xylinum
tổng hợp trong môi trường có đường và ATP. Cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ

thuật, cấu trúc của cellulose vi khuẩn ngày càng được hiểu khá rõ, đó là các chuỗi
polymer do các glucopyranose nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucan. Saxena (1990)
đã giải thích cơ chế tổng hợp cellulose của A. xylinum bằng việc giải trình tự đoạn gen
tổng hợp cellulose. Ông đã tách chiết được đoạn polypeptide liên quan đến quá trình
tổng hợp cellulose tinh khiết dài 83kDa. Từ đó đến nay đã có nhiều công trình nghiên
cứu giúp hiểu rõ thêm cấu trúc, cơ chế tổng hợp, ứng dụng… của cellulose vi khuẩn.
1.1 Giới thiệu tổng quan về Bacterial cellulose
1.1.1 Cellulose vi khuẩn
Cellulose vi khuẩn là một chuỗi polymer do các glucopyranose nối với nhau
bằng liên kết β-1,4-glucan. Những chuỗi glucan được vi khuẩn tổng hợp nối lại với
nhau thành thớ sợi thứ cấp, có bề rộng 1,5 nm. Đây là những thớ sợi tự nhiên mảnh
nhất khi so sánh với sợi cellulose sơ cấp trong tượng tầng ở một vài loài thực vật. Các
thớ sợi thứ cấp kết lại thành những vi sợi, những vi sợi tạo thành bó sợi, những bó sợi
tạo thành dải. Dải có chiều dày 3 – 4 nm, và chiều dài 130 – 177 nm (Yamanaka et al.,
2000). Các dải siêu mịn của cellulose có chiều dài từ 1 µm đến 9 µm tạo thành cấu
5
Ứng dụng CNSH trong CNTP
Công nghệ sản xuất Bacterial Cellulose
trúc mắt lưới dày đặc, được ổn định nhờ các liên kết hydro, đó là lớp màng film
(Bielecki et al., 2001)
Hình 1. Cấu trúc của cellulose vi khuẩn (Yamanaka et al., 2000)
1.1.2 Mức độ polymer hoá (Degree of polymerization - DP)
Cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật tương tự nhau về mặt hóa học, cellulose
bao gồm các liên kết β-1,4-glucan, nhưng mức độ polymer hoá khác nhau. DP của
cellulose thực vật khoảng 13000 – 14000, và của cellulose vi khuẩn khoảng 2000 –
6000. Tuy nhiên, trong một số trường hợp DP của cellulose vi khuẩn có thể đạt 16000
đến 20000 phân tử glucose (Watanabe et al., 1998). Đường kính của bacterial cellulose
chỉ vào khoảng 1/100 đường kính của cellulose thực vật (Bielecki et al., 2001) (hình
2.2).
1.1.3 Cấu trúc kết tinh của cellulose vi khuẩn.

Ngày nay nhờ vào các kỹ thuật công nghệ hiện đại người ta đã xác định được cấu
trúc của cellulose vi khuẩn. Chẳng hạn như kỹ thuật nhiễu xạ tia X giúp xác định được
kích thước và phân biệt cấu trúc cellulose vi khuẩn. Những kỹ thuật khác như phổ
hồng ngoại, phổ Raman, và phổ cộng hưởng từ hạt nhân giúp xác định các dạng kết
tinh của cellulose (Bielecki et al., 2001).
Như các cellulose tự nhiên khác, cellulose vi khuẩn được tạo thành bởi hai loại
cấu trúc tinh thể riêng biệt, cellulose I
α
và I
β
. Trong vi sợi cellulose đều có sự tham gia
6
Ứng dụng CNSH trong CNTP
Công nghệ sản xuất Bacterial Cellulose
của loại cấu trúc tinh thể này (Yamamoto & Horii, 1993). Trong khi hầu hết tinh thể I
β
tinh khiết thu được từ cellulose thực vật thì vẫn chưa có cách nào thu nhận được các
tinh thể I
α
tinh khiết từ nguồn này. Cấu trúc của cellulose được tổng hợp từ vi khuẩn A.
xylinum chứa nhiều tinh thể I
α
hơn cellulose thực vật, hàm lượng loại tinh thể này có
thể lên đến hơn 60%. Tỉ lệ này có thể dao động trong khoảng 64% đến 71% tuỳ vào
chủng vi sinh vật và nhiệt độ môi trường (Yamamoto & Horii, 1994). Ngược lại I
β
chủ
yếu có trong thành phần cellulose hình thành nên thành tế bào của một số loài thực vật
bậc cao như cotton và gai. Ở đó, cellulose I
α

chỉ chiếm khoảng 20%.
Nhìn chung, cấu trúc tinh thể được coi như là một yếu tố quan trọng trong việc
xác định các tính chất của cellulose mặc dù cho đến bây giờ vẫn có rất ít các nghiên
cứu về sự tương quan giữa cấu trúc tinh thể và những đặc tính riêng biệt của cellulose
được thực hiện.
1.1.4 Tính chất của cellulose vi khuẩn
- Cellulose vi khuẩn là cellulose rất trong suốt, cấu trúc mạng tinh thể mịn, thành
phần tỉ lệ Iα cao.
- Kích thước ổn định, sức căng và độ bền sinh học cao, đặc biệt là cellulose I.
- Khả năng giữ nước và hấp thụ nước cực tốt, tính xốp chọn lọc.
- Có độ tinh sạch cao so với các loại cellulose khác, không chứa ligin và
hemicellulose.
- Có thể bị phân hủy hoàn toàn bởi một số vi sinh vật, là nguồn tài nguyên có thể
phục hồi.
- Khả năng kết sợi, tạo tinh thể tốt.
- Tính bền cơ tốt, khả năng chịu nhiệt tốt: tinh thể cellulose vi khuẩn có độ bền
cao, ứng suất dài lớn, trọng lượng nhẹ, tính bền rất cao.
- Lớp màng cellulose được tổng hợp một cách trực tiếp, vì vậy việc sản xuất một
số sản phẩm từ cellulose vi khuẩn không cần qua bước trung gian. Đặc biệt vi khuẩn
7
Ứng dụng CNSH trong CNTP
Công nghệ sản xuất Bacterial Cellulose
có thể tổng hợp được cellulose dưới dạng màng mỏng hoặc dưới dạng các sợi chỉ cực
nhỏ
- Có thể kiểm soát được đặc điểm lý học của cellulose theo mong muốn bằng
cách tác động vào quá trình sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum. Từ đó có thể kiểm
soát các dạng kết tinh và trọng lượng phân tử cellulose.
Hình 2. Cellulose vi khuẩn (a) và cellulose thực vật (b) (Bielecki et al., 2001)
1.2 Vi sinh vật tổng hợp cellulose.
Cellulose vi khuẩn được nhiều loài vi sinh vật tổng hợp trong đó chủng A.

xylinum được biết đến nhiều nhất, đây cũng là loài vi khuẩn sinh tổng hợp cellulose
hiệu quả nhất và được tập trung nghiên cứu nhiều nhất. Cấu trúc của cellulose được
tổng hợp bởi các vi sinh vật khác nhau là khác nhau. Sau đây là bảng tổng quan về các
loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose.
8
Ứng dụng CNSH trong CNTP
Công nghệ sản xuất Bacterial Cellulose
Bảng Các vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose
Trong đó, Acetobacter được sử dụng rộng rãi và phổ biến nhất trong việc sản
xuất cellulose. Đặc biệt là A. xylinum vì những đặc điểm ưu việt của nó như: năng suất
tạo cellulose cao, cấu trúc cellulose phù hợp cho các mục đích sử dụng…
1.2.1 Phân loại A. Xylinum
A. xylinum là một vi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacteraceae, họ này bao gồm
các giống sau: Acetobacter, Acidomonas, Asaia, Gluconacetobacter, Gluconobacter và
Kozakia. Các loài vi khuẩn này trước đây được gọi với các tên gọi Acetobacter xylinus
hay Acetobacter xylinum, sau đó được xếp lại vào giống Gluconacetobacter với tên gọi
Gluconacetobacter xylynus.
A. xylinum có thể được phân lập từ các nguồn khác nhau như từ nước quả
(Kahlon & Vyas, 1971), hay từ một số loài thực vật như lá của cây cọ (Faparusi et al.,
1974), từ giấm (Passmore & Carr, 1975), từ thạch dừa (Bernado et al., 1998), từ nấm
Kombucha và trà (Hermann et al., 1928).
9
Ứng dụng CNSH trong CNTP
Công nghệ sản xuất Bacterial Cellulose
1.2.2 Đặc điểm hình thái của A. xylinum.
• A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hay không di
động, không sinh bào tử. Là vi khuẩn Gram âm, chúng có thể đứng riêng rẽ hay xếp
thành chuỗi.
• Nếu A. xylinum phát triển trên môi trường thiếu chất dinh dưỡng, chúng biến
đổi thành dạng có hình thái đặc biệt như: dạng tế bào phình to, kéo dài, phân nhánh

hoặc không phân nhánh và dần dần sẽ gây thoái hóa giống làm giảm hoạt tính một
cách đáng kể.
• Khuẩn lạc của A. xylinum có kích thước nhỏ, bề mặt nhầy và trơn, phần giữa
khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc
nhẵn.
Hình 3. SEM của A. Xylinum
1.2.3 Đặc điểm sinh lý của A. xylinum (Jonas et al., 1998)
• Oxy hóa ethanol thành acid acetic, CO2, H2O.
• Phản ứng catalase dương tính: tạo bọt khí trong dung dịch lên men.
• Không tăng trưởng trên môi trường Hoyer.
• Chuyển hóa glucose thành acid gluconic.
10
Ứng dụng CNSH trong CNTP
Công nghệ sản xuất Bacterial Cellulose
• Chuyển hóa glycerol thành dihydroxyaceton.
• Không sinh sắc tố nâu.
• Tổng hợp cellulose.
1.2.4 Đặc điểm sinh trưởng của A. Xylinum
Lớp màng cellulose tạo ra gây trở ngại đến khả năng biến dưỡng, vận chuyển
chất dinh dưỡng và oxi đến tế bào. Tuy nhiên lớp màng này có thể giữ nước nên giúp
vi khuẩn có thể phân hủy chất dinh dưỡng để sử dụng và giúp tế bào chống lại tia UV.
A.xylinum có thể sử dụng nhiều nguồn cacbon khác nhau và tùy thuộc vào chủng
vi khuẩn mà nguồn đường nào được sử dụng tốt nhất. Chẳng hạn chủng A. xylinum
BPR 2001 sử dụng fructose tốt nhất (Matsuoka et al., 1993) trong khi chủng A.
xylinum IFO 13693 sử dụng glucose hiệu quả hơn (Masaoka et al., 1993)… A.
xylinum có thể chuyển hóa glucose thành acid gluconic, điều này là nguyên nhân làm
cho pH của môi trường nuôi cấy giảm từ 1 đến 2 đơn vị trong quá trình nuôi cấy.
Nhiệt độ tối ưu để A. xylinum phát triển từ 25 0C đến 300C và pH từ 5,4 đến 6,3.
Theo Hestrin (1947) thì pH tối ưu để A. xylinum phát triển là 5,5 và không phát triển ở
nhiệt độ 37 0C ngay cả trong môi trường dinh dưỡng tối ưu. Theo Maccormide et al.

(1996) cho rằng A. xylinum có thể phát triển trong phạm vi pH từ 3 đến 8, nhiệt độ từ
12 0C đến 35 0C và có thể phát triển trong môi trường có nồng độ ethanol lên tới 10%.
Khi nuôi cấy trên môi trường thạch, lúc còn non khuẩn lạc mọc riêng lẻ, khuẩn
lạc nhầy và trong suốt, xuất hiện sau 3 đến 5 ngày. Khi già tế bào mọc dính thành cụm,
và chúng mọc theo đường cấy giống.
A. xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế người ta thường bổ sung thêm
acid acetic hay acid citric vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ và
tăng hiệu suất tổng hợp cellulose.
1.2.5 Vai trò của cellulose vi khuẩn đối với A. xylinum.
Màng cellulose được sản xuất bởi A. xylinum đóng nhiều vai trò cho sự phát
triển và tồn tại của vi sinh vật trong tự nhiên.
11
Ứng dụng CNSH trong CNTP
Công nghệ sản xuất Bacterial Cellulose
• Cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn trong điều kiện thiếu thức ăn (Bielecki
et al., 2001).
• Sự tổng hợp và tiết cellulose bởi A. xylinum giúp tế bào lơ lửng và tới được bề
mặt giàu khí oxy vì đây là vi khuẩn hiếu khí. Do đó chỉ những tế bào gần ranh giới
lỏng khí của môi trường mới sản xuất cellulose (Krystynowicz et al., 2002; Watanabe
et al., 1998)
• Màng cellulose xúc tiến sự hình thành tập đoàn của A. xylinum trên cơ chất và
bảo vệ vi khuẩn trước những đối thủ cạnh tranh sử dụng cùng cơ chất.
• Vì độ nhớt và đặc tính ưa nước của lớp cellulose nên khả năng chống chịu với
những thay đổi bất lợi (thay đổi pH, sự có mặt của chất độc và vi sinh vật gây bệnh…)
trong môi trường sống tăng lên.
• Sợi cellulose giúp chống ảnh hưởng gây chết của tia UV. 23% vi khuẩn acetic
được bao bọc bởi màng cellulose có thể sống sót hơn 1 giờ khi bị chiếu tia UV
(Bielecki et al., 2001).
1.3 Sinh tổng hợp cellulose từ vi khuẩn A. xylinum
1.3.1 Quá trình sinh tổng hợp cellulose ở A. Xylinum

Theo Ross et al. (1991), con đường sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn từ glucose
thành các sợi kết tinh đòi hỏi phải có sự tổng hợp uridine diphosphoglucose (UDP –
glucose), sau đó là một phản ứng tổng hợp cellulose và cuối cùng là sự tập hợp lại
thành sợi cellulose nhỏ để hình thành nên các dải tinh thể cellulose.
UDP-Glucose là một nucleotide tiền thân của sự tổng hợp cellulose trong A.
xylinum. Như sơ đồ dưới đây, quá trình sinh tổng hợp UDP-Glucose từ glucose là một
quá tình trải qua 3 bước có sự tham gia của 3 loại enzyme. Những bước này là sự
phosphoryl hóa của glucose bởi xúc tác của enzyme glucokinase thành glucose-6-
phosphate, sự izomer hóa của glucose-6-phosphate thành glucose-1-phosphate bởi
phosphoglucomutase và sự tổng hợp UDP-Glucose bởi UDP-Glucose
pyrophosphorylase. UDP-Glucose phosphorylase đóng vai trò then chốt trong sự sinh
tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum trong khi các chủng A. xylinum đột biến
12
Ứng dụng CNSH trong CNTP
Công nghệ sản xuất Bacterial Cellulose
không có khả năng tổng hợp cellulose bị thiếu enzyme này (Valla & Kjosbakken,
1981).
Hình 4. Con đường tổng hợp cellulose trong A.xylinum
1.3.2 Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn
Quá trình sinh tổng hợp cellulose từ A. xylinum trên được chia thành hai giai
đoạn chính: giai đoạn polymer hóa và giai đoạn kết tinh.
1.3.2.1 Giai đoạn polymer hóa
Đầu tiên enzyme glucokinase (GK) xúc tác phản ứng phosphoryl hóa chuyển
glucose thành glucose-6-phosphate (Glc-6-P). Sau đó enzyme phosphoglucomutase
(PGM) tiếp tục chuyển hóa glucose-6-phosphate thành glucose-1-phosphate (Glc-1-P)
thông qua phản ứng isomer hóa. Glucose-1-phosphate được enzyme UDP-Glucose
pyrophosphorylase chuyển hóa thành UDP-Glucose. Cuối cùng, UDP-Glucose được
polymer hóa thành cellulose và cellulose được tiết ra môi trường ngoại bào nhờ một
phức hợp protein màng là cellulose synthase (Iguchi et al., 2000).
13

Ứng dụng CNSH trong CNTP
Công nghệ sản xuất Bacterial Cellulose
Một số vi khuẩn có khả năng sử dụng đường fructose hiệu quả hơn sẽ tạo
cellulose theo con đường sau: lúc này hệ thống enzyme phosphotransferase sẽ chuyển
fructose thành fructose-1-phosphate. Sau đó fructose-1-phosphate sẽ được chuyển hóa
thành fructose-1,6-biphosphate nhờ enzyme fructose-1-phosphatekinase. Sau đó,
enzyme phosphoglucose isomerase có hoạt tính cao, sẽ giúp chuyển hóa fructose-6-
phosphate thành glucose-6-phosphate. Tiếp theo glucose-6-phosphate lại tham gia vào
quá trình chuyển hóa tương tự như trên để tạo ra cellulose (Iguchi et al., 2000).
Hình 5. Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn
1.3.2.2 Giai đoạn kết tinh
Các chuỗi glucan được nối với nhau nhờ liên kết β-1,4-glucan. Các chuỗi glucan
kết hợp với nhau tạo thành lớp chuỗi glucan nhờ lực liên kết yếu Van Der Waals. Lớp
chuỗi glucan này chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn, sau đó chúng kết hợp với nhau
bằng liên kết hydro tạo thành các sợi cơ bản gồm 16 chuỗi glucan. Các sợi cơ bản tiếp
tục kết hợp với nhau tạo thành các vi sợi, sau đó các vi sợi tiếp tục kết hợp với nhau
14
Ứng dụng CNSH trong CNTP
Công nghệ sản xuất Bacterial Cellulose
tạo thành các bó sợi và được phun ra ngoài môi trường thông qua các lỗ trên bề mặt vi
khuẩn (hình 2.6). Ảnh chụp kính hiển vi điện tử bề mặt tế bào cho thấy có khoảng 50 –
80 lỗ sắp xếp thành hang dọc chiều dài của tế bào (Ross et al., 1991). Các lỗ này chính
là các vị trí sinh tổng hợp cellulose trên bề mặt tế bào. Đây là những lỗ có đường kính
khoảng 3,5 nm sắp xếp song song theo đường thẳng dọc trục vi khuẩn. Mỗi lỗ bao phủ
một tiểu phần 10 nm chứa enzyme tổng hợp cellulose. Mỗi tiểu phần 10 nm tạo ra các
chuỗi glucan hình thành vi sợi 1,5 nm.
Hình 6. Sự giải phóng callulose ra môi trường ngoài từ A.xylinum
1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp cellulose
1.3.3.1 Kiểu nuôi cấy
Có hai kiểu nuôi cấy thường được sử dụng để sản xuất cellulose vi khuẩn, đó là

nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy có khuấy đảo.
a.Nuôi cấy tĩnh
15
Ứng dụng CNSH trong CNTP
Công nghệ sản xuất Bacterial Cellulose
Đối với nuôi cấy tĩnh, người ta chuẩn bị những khay nhựa đã chuẩn bị môi
trường và tiến hành nuôi cấy chủng A. xylinum ở điều kiện tĩnh.
Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, những thớ sợi thứ cấp liên tục được lộ ra từ lỗ sắp
xếp thẳng hàng trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết thành những vi sợi, lắng sâu
xuống môi trường sinh trưởng, sau đó dải cellulose chồng chập và xoắn với nhau tạo
thành tấm cellulose trên bề mặt canh trường dinh dưỡng, ngay mặt phân cách pha lỏng
khí giàu oxy.
Dù vẫn được sử dụng để sản xuất cellulose nhưng nuôi cấy tĩnh cho sản lượng
thấp và mang tính thủ công. Do đó, để sản xuất công nghiệp, cần thiết để thiết lập hệ
thống sản xuất hàng loạt sử dụng kĩ thuật nuôi cấy hiệu quả hơn (Edwards, 1995).
b.Nuôi cấy có khuấy đảo
Tiến hành nuôi cấy trong thiết bị lên men chứa dung dịch môi trường, có cánh
khuấy, thổi khí oxy hoặc lắc . Vi khuẩn phân bố đều trong toàn dung dịch và phát triển
theo chiều sâu của môi trường. Cellulose được tạo ra có dạng viên hình cầu, elip,…
Đây là kỹ thuật nuôi cấy mong đợi sẽ đem lại hiệu quả tạo cellulose cao, có thể
ứng dụng trong sản xuất cellulose vi khuẩn thương mại nhưng hiện nay cellulose vi
khuẩn chỉ mới được sản xuất với sản lượng thấp. Sản xuất cellulose từ A. xylinum
bằng phương pháp nuôi cấy có khuấy đảo gặp phải một số trở ngại, trở ngại lớn nhất
cho đến nay là tính không ổn định khi nuôi cấy. Tính không ổn định được thể hiện bởi
sự mất khả năng sản xuất cellulose và thay thế dần tế bào sản xuất cellulose bằng
chủng đột biến không có khả năng sản xuất cellulose (Hai-Peng et al., 2002; Chao et
al., 1997).
Từ việc quan sát thấy rằng cellulose tổng hợp nhanh khi tế bào A. xylinum được
gắn vào những phần tĩnh trong bình lên men như điện cực, cánh khuấy, màng ngăn,
Vandamme et al. (1998) đã giới thiệu “điểm dính đa chức năng” trong bình nuôi cấy

bằng cách cung cấp vào môi trường những phần tử nhỏ không tan như diatonit,
silicagel, cát biển, những hạt thủy tinh nhỏ, đất mùn, cellulose thực vật được giã nhỏ,
… Nồng độ phần tử nhỏ đưa vào được tối ưu tùy theo mức độ khuấy, cũng như mức
độ lắc của khay (Yoshinaga et al., 1997).
16
Ứng dụng CNSH trong CNTP
Công nghệ sản xuất Bacterial Cellulose
Sự lựa chọn kỹ thuật nuôi cấy phụ thuộc vào mục đích thương mại của polymer
sinh học, hơn nữa cấu trúc cellulose và đặc tính cơ lý của nó bị ảnh hưởng rất lớn của
phương pháp nuôi cấy (Hai-Peng et al., 2002). Trong điều kiện nuôi cấy bề mặt, màng
cellulose dày được tạo thành trên bề mặt môi trường nuôi cấy. Trong khi dưới điều
kiện nuôi cấy chìm, cellulose lại được sản xuất dưới dạng huyền phù thớ sợi, những
khối không đều, dạng viên kết hay dạng cầu kích thước từ 10 µm đến 1000 µm.
Hình 7. Cellulose được tạo thành trong điều kiện nuôi cấy thủy tĩnh (trái) và có
khuấy đảo (phải)
Hình 8 thể hiện sự khác biệt về cấu trúc của cellulose khi nuôi cấy tĩnh và nuôi
cấy có khuấy đảo.
Những phần tử hình cầu mịn của cellulose nuôi cấy chìm (Agitated bacterial
cellulose – Ag-BC) có cấu trúc mắt lưới tương tự cấu trúc mắt lưới của màng mỏng
cellulose thu được khi nuôi cấy bề mặt (Static bacterial cellulose – St-BC). Tuy nhiên
có vài sự khác biệt về hình thái trong những sợi nhỏ và trong cấu trúc này giữa St-BC
và Ag-BC. Sợi cellulose của St-BC duỗi thẳng trong khi sợi của Ag-BC cong và rối,
làm cấu trúc mắt lưới dày hơn so với cấu trúc St-BC. Bên cạnh đó, chiều rông sợi Ag-
BC mỏng hơn so với St-BC, mặc dù rất khó xác định chính xác kích thước của mỗi
sợi. Hình thái này có được có thể do dòng chảy rối loạn và áp lực do dịch chuyển
17
Ứng dụng CNSH trong CNTP
Công nghệ sản xuất Bacterial Cellulose
không ngừng của môi trường khi nuôi cấy dưới điều kiện có khuấy đảo. Những thay
đổi về hình thái học có liên quan đến những thay đổi trong cấu trúc vi mô như trọng

lượng phân tử, độ kết tinh, thành phần I
α
, bảng 2.2 cho thấy rõ điều này.
Hình 8. Cấu trúc trong điều kiện nuôi cấy tĩnh (a) và nuôi cấy có khuấy đảo (b)
Do những khác biệt về cấu trúc mà St-BC và Ag-BC có những tính chất có liên
quan tới những ứng dụng thương mại cũng khác nhau như trình bày ở bảng 2.3.
18
Ứng dụng CNSH trong CNTP
Công nghệ sản xuất Bacterial Cellulose
Khả năng giữ nước của cellulose vi khuẩn là khối lượng nước được giữ lại trên
một đơn vị khối lượng của sợi cellulose, lượng nước này được giữ trên bề mặt và trong
những phần tử tạo nên sợi cellulose.
Giá trị của chức năng duy trì lọc được định nghĩa là lượng phân tử CaCO
3
bị giữ
trên tờ giấy cellulose. Phân tử nhỏ hơn và phân tán hơn của Ag-BC bị phân hủy có
hiệu quả hơn phân tử của St-BC trong việc giữ lại các hột nhỏ vì phân tử của Ag-BC bị
phân hủy có bề mặt hiệu dụng rộng hơn suốt quá trình lọc trong sản xuất giấy. Trong
trường hợp của chất ổn định nhũ tương, phân tử Ag-BC bao phủ bề mặt của những giọt
dầu rộng hơn và nhũ tương chứa trong Ag-BC ổn định hơn.
Do đó, Ag-BC thể hiện nhiều đặc tính phù hợp hơn cho những ứng dụng công
nghiệp hơn St-BC (Watanabe et al., 1998).
1.3.3.2 Ảnh hưởng của thiết bị đến năng suất tạo thành cellulose vi khuẩn
Phương pháp sản xuất cellulose vi khuẩn truyền thống là nuôi cấy tĩnh, nhưng
phương pháp này đòi hỏi phải có diện tích lên men lớn và thời gian lên men dài. Do đó
một số phương pháp khác được khảo sát để thay thế cho phương pháp nuôi cấy tĩnh.
Thùng lên men khuấy trộn được dùng rộng rãi trong sản xuất cellulose vi khuẩn,
nuôi cấy liên tục có bổ sung ethanol làm tăng tốc độ tổng hợp cellulose gấp 2 lần so
với nuôi cấy mẻ. Hơn nữa trong điều kiện nuôi cấy có khuấy đảo, dễ dàng kiểm soát
các yếu tố môi trường. Tuy nhiên, khó khăn của quá trình nuôi cấy lắc là cellulose sinh

ra tích lũy trong môi trường làm cho môi trường có độ nhớt cao dẫn đến khó kiểm soát
19
Ứng dụng CNSH trong CNTP
Công nghệ sản xuất Bacterial Cellulose
quá trình khuấy trộn và sục khí. Các viên huyền phù cellulose có độ giữ nước cao,
nhanh chóng choáng hết thể tích môi trường, gây khó khăn cho vi sinh vật phát triển
tạo cellulose (Klemm et al., 2001; Yoshinaga et al., 1997).
Một số thiết bị lên men sản xuất cellulose vi khuẩn:
a.Ajinomoto
Được đặt tên theo tên một công ty, phương pháp này sử dụng môi trường bề mặt
nhằm cải thiện sự tổng hợp của cellulose. Các tế bào đầu tiên được nhân giống trong
thiết bị có sục khí trước khi được cho vào các khay tĩnh. Sau 3 ngày trong thiết bị sục
khí, mật độ tế bào vào khoảng 2x10
7
(tế bào/ml). Lúc này, dịch lên men được chuyển
vào các khay có sục khí. So sánh với quá trình lên men thông thường tạo cellulose thì
thiết bị này cho năng suất cao hơn 140%. Sản phẩm có khả năng giữ nước thấp và
chứa khoảng 10% lượng sucrose ban đầu (Okiyama et al., 1992)
b. Weyerhauser
Được đặt tên theo tên của một công ty Mỹ phát minh ra, một quá trình được phát
triển để sản xuất sợi có kích thước nhỏ, khoảng 1/300 kích thước của bột gỗ. Sử dụng
các chất gây đột biến đổi hóa học để thay đổi các mức độ tác động của enzyme, chủng
A.xylium được phân lập để làm giảm lượng chất phụ sinh ra trong quá trình sản xuất,
bao gồm gluconic acid với việc điều chỉnh pH thấp hơn. Rõ ràng hơn, chủng vi sinh
vật được phân lập để sản xuất cellulose khi khuấy đảo. Trước đây, khuấy đảo một dịch
lên men để cung cấp oxy, và sự trao đổi chất, tổng hợp cellulose không ngừng. Tuy
nhiên, sản phẩm tạo ra từ phương pháp này là một dịch huyền phù sệt, nhớt, tên
thương mại là Cellulon (Black et al., 1990)
c. ICI
ICI (Imperial Chemical Industry) bao gồm 4 bước và sản xuất một chất sệt giống

với hệ thống Weyerhauser. Bước đầu tiên là bước tích lũy. Khi đó vi khuẩn được phép
phát triển trong một thiết bị phản ứng có khuấy đảo đến khi nguồn carbon được tiêu
thụ hết. Sau đó bổ sung nguồn carbon với tốc độ phù hợp cho sự tổng hợp cellulose.
20
Ứng dụng CNSH trong CNTP
Công nghệ sản xuất Bacterial Cellulose
Bước cuối cùng là loại đi các huyền phù từ thiết bị phản ứng và say đó tách các tế bào
vi sinh vật ra khỏi sản phẩm (Serafica et al., 1998).
d. Gengiflex®, Biofill® và BASYC®
Chủng A. xylinum thích hợp được đưa vào một thiết bị, trong đó tạo điều kiện tối
ưu cho chúng phát triển. Các điều kiện tối ưu cho sự sản xuất cellulose sau đó được áp
dụng cho dịch lên men. Tất cả các quy trình đều được phát triển trên môi trường cơ
bản của Schramm và Hestrin (1954).
Gengiflex® được áp dụng trong công nghiệp nha khoa, cụ thể là được áp dụng để
giúp hồi phục lại mô bao quanh răng (Novaes et al., 1997).
Biofill®, được sử dụng như là một dãy băng, có thể được ứng dụng băng các vết
thương trong trường hợp bị phỏng hay bị loét. Biofill® được sử dụng như da nhân tạo
cho con người. Mặt hạn chế lớn nhất của sản phẩm là bị giới hạn bởi tính co giãn khi
ứng dụng để làm các vết băng tai những vùng có cường độ vận động cao. Ngược lại,
ưu điểm của nó là giúp hồi phục nhanh chóng vết thương, và khả năng chống nhiễm
trùng tốt. Cellulose trong suốt cho phép kiểm tra, theo dõi vết thương dễ dàng trong
khi Biofill® sẽ tách ra khi vết thương hổi phục. Với việc rút ngắn thời gian và chi phí
điều trị, Biofill® được đánh giá rất cao (Fontana et al., 1990).
Một nhóm các nhà hóa học, sinh vật học và giải phẫu học đã phát triển một sản
phẩm gọi là BASYC® (Bacterial Synthesised Cellulose). BASYC® là một sản phẩm
dạng ống dùng thay cho các mạch máu. Các ống có đường kính trong khoảng 1mm và
dài 5mm, được sử dụng thay thế cho mạch máu. Công dụng khác của loại sản phẩm
này là bề mặt trong của ống BASYC® nhẵn và trơn hơn các vật liệu tổng hợp khác khi
sử dụng cùng mục đích (Klemm et al,. 2001).
e. Thiết bị thu nhận cellulose liên tục

Thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm. Sử dụng một dụng cụ có độ sâu
không lớn để lượng môi trường cần thiết là tối thiểu, các sợi cellulose được thu bởi
một trục quay liên tục với tốc độ 35mmh
-1
. Sau một thời gian thu nhận cellulose thì
đem cellulose đi xử lý. Ưu điểm lớn nhất của dạng thiết bị này là cellulose có thể được
21
Ứng dụng CNSH trong CNTP
Công nghệ sản xuất Bacterial Cellulose
thu nhận liên tục và môi trường mới được bổ sung sau mỗi 12 giờ (Sakairi et al.,
1997).
f. Thiết bị phản ứng có sục khí tuần hoàn và khuấy đảo
Trong một trường tĩnh, thời gian nhân đôi số lượng tế bào là từ 8 – 10 giờ, trong
khi trong điều kiện có lắc đảo, thời gian này là 4 – 6 giờ (Canon và Anderson, 1991).
Bằng cách tăng khuấy đảo và cung cấp oxy cho môi trường nuôi cấy, tốc độ sinh
trưởng tế bào cũng tăng lên. Do đó, khả năng sản xuất với tỷ lệ lớn là có thể, thiết bị
lên men có khuấy đảo và có sục khí được nghiên cứu và mong muốn tạo ra cellulose
dạng II. Độ nhớt cao của môi trường và sức cản mạnh là trở ngại của phương pháp.
Với phương pháp này thì sợi cellulose tạo ra có cấu trúc không bình thường (Kouda et
al., 1997).
1.3.3.3 Ảnh hưởng của áp suất O
2
đến quá trình tổng hợp cellulose vi khuẩn
Sự hình thành cellulose diễn ra tại vị trí mặt phân cách giữa không khí và lớp
màng cellulose chứ không phải tại mặt phân cách giữa môi trường và cellulose. Do đó
oxy là nhân tố quan trọng cho quá trình tổng hợp cellulose (Borzano & Desouza et al.,
1995).
Watanabe và Yamanaka (1995) phát hiện ra áp suất oxy ảnh hưởng đến cả sự
hình thành cellulose cũng như sức sản xuất màng. Cellulose tăng trưởng dưới áp suất
oxy thấp có sự phân nhánh nhiều hơn so với cellulose tăng trưởng trong điều kiện áp

suất cao hơn. Điều này có thể ảnh hưởng trực tiếp đến tính dai của lớp màng. Hơn nữa,
với áp suất oxy là 10% tính sản xuất cellulose cao hơn 25% mà không ảnh hưởng đến
sự tăng trưởng của tế bào. Sự tổng hợp cellulose tại áp suất 10% và 15% cao hơn so
với đều kiện áp suất khí quyển. Tuy nhiên, hàm lượng oxy cao trên 50% lại hạn chế
khả năng tổng hợp cellulose của vi sinh vật. (Yamanaka & Watanabe et al., 1995).
1.3.3.4 Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến sản phẩm cellulose vi khuẩn
a. Ảnh hưởng của pH
Sự chuyển hóa glucose thành acid gluconictrong quá trình tổng hợp cellulose là
nguyên nhân chính của sự giảm pH của môi trường lên men. pH ảnh hưởng rất lớn đến
sự phát triển của tế bào và sự hình thành cellulose (Hwang, J.W et al., 1999). Các báo
22
Ứng dụng CNSH trong CNTP
Công nghệ sản xuất Bacterial Cellulose
cáo trước đây đã đưa ra các kết luận cho thấy pH tối ưu cho sự tổng hợp cellulose từ
A. xylinum là trong khoảng 4 – 7. Trong khi đó, trong báo cáo của mình, Fiedler et al.
(1989) đưa ra khoảng pH tối ưu là 5 – 7. Masaoka et al. (1993) thì thấy rằng khoảng
này là 4 – 6. Qua các kết quả nghiên cứu đó cho chúng ta kết luận rằng pH thấp hơn 7
là thích hợp cho sự tổng hợp cellulose và sự phát triển của tế bào vi sinh vật A.
xylinum.
A. xylinum đồng thời tổng hợp cả cellulose và cellulase. Cellulase ít được tổng
hợp ở pH thấp (pH < 5) và được tổng hợp nhiều hơn ở pH cao. Độ bền cơ học của tấm
cellulose nuôi cấy tại pH 4 cao hơn độ bền của tấm cellulose nuôi cấy ở pH 6 (Toda et
al., 1997).
b. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Sự tổng hợp cellulose phụ thuộc khá nhiều vào nhiệt độ. Nhiệt độ từ 25 – 30
0
C là
thích hợp cho sự tổng hợp cellulose (Canon & Anderson, 1991). Hầu hết các nghiên
cứu đều sử dụng khoảng nhiệt độ từ 25 – 30
0

C.
Sự thay đổi nhiệt độ không những chỉ thay đổi hiệu suất tổng hợp cellulose mà
còn thay đổi cả cấu trúc của cellulose, đặc biệt là khả năng giữ nước và mức độ
polymer hóa. Cellulose được sản xuất ở 30
0
C có mức độ polymer hóa thấp hơn và khả
năng giữ nước cao hơn so với cellulose được sản xuất ở nhiệt độ thấp hơn (Geyer et
al., 1994).
Nhiệt độ cao (khoảng 100
0
C trong 3 giờ) không gây ảnh hưởng cho cấu trúc
cellulose nhưng nhiệt độ thấp (-20
0
C) sẽ làm tăng tính mềm dẻo của cellulose vi khuẩn
(Zou et al., 2006).
1.3.3.5 Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy
a. Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Môi trường cơ bản cho các nghiên cứu về quá trình tổng hợp cellulsoe của chủng
A. xylinum là môi trường do Hestrin và Schramm (1954) thiết lập, có nguồn nitơ là
dịch chiết nấm men và peptone với tỉ lệ tương ứng là 5:3. Từ khi thành phần môi
trường này được đưa ra, nó đã trở thành môi trường cơ bản cho hầu hết các nghiên cứu
23
Ứng dụng CNSH trong CNTP
Công nghệ sản xuất Bacterial Cellulose
về sản xuất cellulose vi khuẩn. Nhiều nhóm nghiên cứu khác nhau đã có sự thay đổi
thành phần môi trường liên quan đến phần trăm của nitơ từ các nguồn khác nhau như
dịch chiết nấm men, CSL (corn steep liquor), peptone, trypton, cao thịt,
proteopeptone… Tất cả các nguồn nitơ này đều được ứng dụng, trong đó CSL là
nguồn nito được cho là có hiệu quả nhất, tác động tăng trưởng tế bào và tốc độ tạo
cellulose cao so với các nguồn nito khác và đây cũng là nguồn nito có giá thành tương

đối rẻ (Klemm et al., 2001; Jonas et al., 1998; Toda et al., 1997).
Một vài amino acid bắt buộc phải có là methionine và glutamate. Masaoka et al.
(1993) đã chứng minh methionine có tác dụng quan trọng đến sự tăng trưởng tế bào và
tăng hiệu suất tạo cellulose so với môi trường không có amino acid này.
Các vitamin pyridoxine, nicotinic acid, p-aminobezoic và biotin được xác định là
cần thiết cho sự tăng trưởng và tổng hợp cellulose, trong khi pantothanate và
riboflavin cho kết quả ngược lại (Yang et al., 1998).
b. Ảnh hưởng của nguồn carbon
Rất nhiều cơ chất được sử dụng làm nguồn carbon cho sự hình thành cellulose
bởi vi khuẩn A. xylinum. Các chủng vi khuẩn khác nhau tổng hợp cellulose với những
lượng khác nhau đối với các cơ chất khác nhau.
Glucose được xem làm nguồn carbon tốt nhất cho A.xylinum IFO 13693 tổng
hớp cellulose, lượng cellulose có thể đạt được lên tới 0,6 g/g glucose/ngày sau 2-4
ngày lên men (Masaoka et al.,1993). Tuy nhiên, hàm lượng cellulose được tổng hợp
bởi A.xylinum Ku-1 khi sử dụng nguồn cơ chất là manitol và arabitol cao hơn 3 lần so
với khi sử dụng cơ chất là glucose (Oikawa et al.,1995). Bên cạnh đó, fructose lại là
nguồn cơ chất thích hợp nhất cho A.xylinum BPR2001 tổng hợp cellulose (Matsuoka
et al.,1996).
Jonas & Farah (1998) đã so sánh lượng cellulose tổng hợp bởi vi khaaunr
A.xylinum IFO 13693 khi sử dụng các nguồn carbon khác nhau, glucose được chọn
làm nguồn carbon để đối chứng bảng (bảng 2.4).
24
Ứng dụng CNSH trong CNTP
Công nghệ sản xuất Bacterial Cellulose
25