cong nghẹ san xuat ínulin

Insulin và công nghệ sản xuất insulin trên thế giới
Người ta đã nhận thấy rằng bệnh tiểu đường là một trong những căn bệnh đe dọa nghiêm
trọng tới sức khoẻ của con người.Trên thế giới, con số những người mắc bệnh tiểu đường
ước tính khoảng từ 151 triệu đến 171 triệu (năm 2000), và dự kiến con số này sẽ là 221
triệu (năm 2010), năm 2030 sẽ lên đến 366 triệu người. Và đương nhiên, việc gia tăng
con số những người mắc bệnh tiểu đường sẽ kéo theo sự gia tăng các biến chứng của căn
bệnh này như thần kinh, xơ vữa động mạch… Theo ước tính, số người tử vong trên thế
giới do bệnh tiểu đường trong năm 2000 là 2,9 triệu và con số này sẽ còn tiếp tục gia
tăng. Trong đó, tiểu đường type 2 chiếm khoảng hơn 90% tổng số ca bệnh. Điều đó đòi
hỏi phải tìm ra những hướng tiệp cận mới cho việc ngăn ngừa và điều trị căn bệnh này.
Bệnh tiểu đường là một căn bệnh chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố. Tiểu đường gây ra do
tác động phức tạp giữa gene và các yếu tố môi trường, từ đó dẫn tới sự bất bình thường
trong quá trình điều hoà lượng glucose trong cơ thể liên quan tới những vấn đề về
hormone insulin.
Insulin là một hormone được tiết ra bởi tế bào beta trong đảo Langerhans của tuyến tụy
khi động vật tiêu ăn thức ăn, đây là hormone quan trọng nhất cho quá trình lưu trữ, sử
dụng đường, acid amin và acid béo và duy trì lượng đường trong máu. Hàm lượng đường
trong máu (hay còn gọi là hàm lượng glucose trong máu) là nguồn năng lượng thiết yếu
cho cơ thể. Nếu lượng đường trong máu không duy trì ở mức bình thường có thể gây ra
những căn bệnh nguy hiểm. Hàm lượng đường trong máu tăng có thể gây ra sự bài tiết
đường qua nước tiểu, kết quả là bị mất glucose, hiện tượng này còn gọi là bệnh tiểu
đường. Nếu tình trạng này tiếp diễn trong thời gian dài, sẽ gây ra những biến chứng nguy
hiểm trong mô, các cơ quan của cơ thể. Mặt khác, hàm lượng đường trong máu giảm dẫn
đến năng lượng cung cấp cho cơ thể bị thiếu hụt gây nguy hiểm cho sự duy trì cơ thể
sống.
Hàm lượng đường trong máu được duy trì ở mức bình thường là do sự cân bằng giữa các
yếu tố làm tăng lượng đường trong máu (như glucagon, hormone, cortisol,
catecholamine) với các yếu tố làm giảm lượng đường trong máu. Insulin là hormone duy
nhất có thể làm giảm lượng đường trong máu. Do đó, khi khả năng tiết hormone này
giảm đi (do một số nguyên nhân) thì insulin không cung cấp đủ cho cơ thể gây ra bệnh
tiểu đường phụ thuộc insulin (Insulin-Dependent Diabetes Mellitus - IDDM), còn gọi là

tiểu đường type I. Với những bệnh nhân mắc tiểu đường type I thì insulin là phương
thuốc điều trị duy nhất.
Insulin người là một polypeptide bao gồm một chuỗi A với 21 acid amin và một chuỗi B
với 30 acid amin, có một cầu nối disulfur trong chuỗi A và 2 cầu nối disufur nối giữa hai
chuỗi A và B. Insulin ban đầu được tổng hợp ở dạng “preproinsulin” (tiền insulin) trên
ribosome trong tế bào beta trong đảo Langerhans của tuyến tụy. Preproinsulin là một
1
phân tử dạng thẳng bao gồm: một peptide tín hiệu chứa 24 acid amin (SP), chuỗi B,
peptide C với 31 acid amin (C) và chuỗi A nối với nhau theo thứ tự SP-B-C-A. Khi vận
chuyển qua lưới nội chất, peptide tín hiệu bị phân cắt tạo ra proinsulin (B-C-A).
Proinsulin hình thành cầu nối disulfur trong lưới nội chất, hình thành cấu trúc bậc ba.
Proinsulin bị phân cắt bởi enzyme PC1/3 tại liên kết giữa chuỗi B và peptide C và sau đó
bị phân cắt bởi enzyme PC2 ngay vị trí liên kết giữa chuỗi A và peptide C. Hai acid amin
đầu N của peptide nối với đầu C của chuỗi B khi bị phân cắt bởi PC1/3 sẽ được phân cắt
ra khỏi chuỗi B bởi enzyme carboxypeptidase H. Kết quả cuối cùng của quá trình phân
cắt tạo thành insulin.
Hình 1. Cấu trúc của phân tử insulin
Trong năm 2005, nhu cầu insulin dùng trong trị bệnh tiểu đường ước tính khoảng 4.000
đến 5.000 kg và dự kiến năm 2010 là 16.000 kg. Nhu cầu về insulin của thế giới vượt qua
con số vài tấn/năm và vì thế nguồn cung cấp insulin cho trị bệnh tiểu đường đang thiếu
hụt. Từ những thập niên 1920 cho đến những năm đầu của thập niên 1980, insulin được
tạo ra bằng cách cô lập từ tuyến tụy của động vật như heo và bò. Tuy nhiên, insulin người
có sự khác biệt trong thành phần acid amin so với insulin bò (hai vị trí trong chuỗi A và
một vị trí trong chuỗi B) và insulin heo (một vị trí trong chuỗi B). Do đó gây ra những tác
dụng không mong muốn (như dị ứng) khi sử dụng insulin có nguồn gốc từ heo hay bò.
Ngoài ra, quá trình sản xuất và tinh sạch insulin từ động vật còn gặp nhiều khó khăn. Sau
đó, các phương pháp bán tổng hợp insulin người từ insulin heo và bò đã được phát triển
bằng các sử dụng phản ứng chuyển peptide (transpeptidation) sử dụng trypsin. Tuy nhiên,
insulin tái tổ hợp được sản xuất bằng công nghệ tái tổ hợp di truyền hiện đang được sử
dụng chủ yếu do chi phí sản xuất thấp và hiệu quả sản xuất cao. Insulin người được sản

xuất bằng kỹ thuật di truyền đầu tiên tạiCông ty Genetech (Hoa Kỳ) và sản phẩm này
được đưa ra thị trường vào năm 1982. Trong lịch sử, đây cũng là lần đầu tiên các nhà
nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học vào dược phẩm thành công.
2
Về sau, nhiều phương pháp sản xuất insulin tái tổ hợp đã được phát triển. Ví dụ: phương
pháp sản xuất của Tập đoàn Eli Lilly: phương pháp sản xuất này biểu hiện chuỗi A và
chuỗi B riêng biệt bằng cách sử dụng Escherichia coli, sau đó thu chuỗi A và chuỗi B,
trộn với nhau in vitro tạo cầu nối disulfur. Phương pháp này có hiệu quả sản xuất thấp.
Do đó, Eli Lilly phát triển một phương pháp cải tiến hơn, phương pháp này biểu hiện
proinsulin thay vì biểu hiện chuỗi A và B riêng biệt như phương pháp cũ, tạo cầu nối
disulfur in vitro, sau đó phân cắt peptide C khỏi hai chuỗi A và B bằng trypsin và
carboxypeptidase, tạo thành insulin.
Hình 2. Sản xuất insulin tái tổ hợp với chuỗi A và chuỗi B riêng biệt
Một phương pháp khác được phát triển bởi tập đoàn Novo Nordisk, phương pháp này
biểu hiện miniproinsulin bao gồm chuỗi B và chuỗi A nối với nhau bằng 2 acid amin,
được biểu hiện trong nấm men, sau đó xử lý miniproinsulin in vitro bằng trypsin tạo
thành insulin. Phương pháp này có nhiều thuận lợi như cầu nối disulfur được hình thành
trong quá trình biểu hiện và quá trình tiết miniproinsulin, và miniproinsulin này được
tách chiết và tinh sạch dễ dàng do được tiết thẳng ra môi trường nuôi cấy.
Hiện tại, người ta vẫn tiếp tục phát triển những phương pháp sản xuất insulin tái tổ hợp.
Công ty Hoechst đã đưa ra một phuơng pháp sản xuất insulin bao gồm: biểu hiện một
dạng dẫn xuất mới của insulin hoặc biểu hiện preproinsulin trong E. coli; tạo các cầu nối
disulfur invitro; sau đó, xử lý bằng lysylendopeptidase hoặc clostripain/carboxypeptidase
B; cuối cùng tạo ra insulin.
3
Mới đây nhất, Công ty Bio-Technology General đã đưa ra một phương pháp mới. Trong
phương pháp này, một dạng protein dung hợp (fusion protein) bao gồm superoxide
dismutase (SOD) gắn với proinsulin được biểu hiện trong tế bào E. coli. Bằng cách này,
hiệu suất của quá trình biểu hiện protein và hiệu quả của quá trình hình thành các cầu
nốii. Sau đó, proinsulin được chuyển thành insulin nhờ xử lý với trypsin và

carboxypeptidase B. Bằng những cách tương tự như thế, người ta đã đưa ra ngày càng
nhiều các phuơng pháp sản xuất insulin tái tổ hợp và cải tiến nhièu hơn để nâng cao hiệu
quả của các quá trình biểu hiện protein, hình thành cầu nối disulfur, chuyển proinsulin
thành insulin.
Hình 3. Sản xuất insulin tái tổ hợp trên vi khuẩn
Hiện nay, hầu hết những phương pháp sản xuất insulin thương mại đều dựa trên các
chủng nấm men (Saccharomyces cerevisiae) hoặc vi khuẩn (E. coli) kết hợp với các kỹ
thuật gene để sản xuất insulin người tổng hợp. Người ta nuôi cấy các chủng này trên quy
mô lớn, trong những bồn lên men bằng thép đặt tiền, sau đó, insulin được ly trích ra, tinh
sạch để được sản phẩm cuối cùng.
Nói về các hệ thống tế bào dùng để biểu hiện insulin tái tổ hợp, người ta sử dụng rất đa
dạng từ vi sinh vật tới tế bào động vật và cả thực vật. Trong số đó, tế bào vi sinh vật được
sử dụng nhiều nhất do chúng dễ thao tác, dễ đưa vào áp dụng ở quy mô sản xuất công
nghiệp, nhiều nhất là E. coli và nấm men. Gần đây, người ta đưa ra một hệ thống biểu
4
hiện khác cho các loại protein tái tổ hợp – đó là Bacillus brevis.
Mục đích của những nghiên cứu, phát minh hiện tại là muốn phát triển một hệ thống biểu
hiện và 1 phương pháp sản xuất insulin có năng suất cao và hiệu quả sản xuất phải ngang
bằng hay vuợt trội hơn so với những hệ thống sản xuất insulin đã từ trước tới nay. Hay
nói cách khác, các nghiên cứu trong giai đoạn này nhằm cải tiến phương pháp cổ điển
chuyển các tiền chất của insulin thành insulin; nghiên cứu tìm ra môi trường tối ưu cho
việc hình thành các cầu nối cần thiết cho việc biểu hiện hoạt tính của insulin; tìm ra một
hệ thống biểu hiện insulin cho năng suất, sản luợng cao.
5