Công nghệ sản xuất Bacteriocin và ứng dụng của Bacteriocin trong công nghệ thực phẩm

Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ thực phẩm Nhóm 19
MỤC LỤC
I. Tổng quan về bacteriocin
1.1 Lịch sử phát triển
Bacteriocin được khám phá năm 1925, khi Gratia quan sát khả năng ức chế của E.Coli
sinh ra một loại chất bền với nhiệt, với nồng độ rất nhỏ vẫn có thể ức chế sự phát triển
trong môi trường lỏng.
Năm 1948, loại chất này được đặt tên là Colicin và nó được chia thành 17 loại dựa trên
sự hấp phụ đặc hiệu của nó.
Năm 1953, Jacod và các đồng sự phát hiện ra rằng các chất kháng khuẩn thuộc tuyp
Colicin cũng có thể được sản sinh bởi các vi khuẩn không thuộc dạng trực khuẩn đường
ruột, thuật ngữ “bacteriocin” ra đời. Trong khi chất kháng sinh được định nghĩa là những
chất do vi khuẩn (prokariotes hay eukaryotes) sản sinh, ở nồng độ thấp có khả năng ức
chế những vi sinh vật khác thì bacteriocin được miêu tả là các ohân tử có chứa protein
trong cấu trúc có hoạt tính kháng khuẩn đối với các loài vi khuẩn khác, nhất là các chủng
trong cùng một loài.
Nhiều nghiên cứu cho thấy, bacteriocin có thể được sinh ra bởi cả hai loại vi khuẩn gram
dương và gram âm. Các nghiên cứu về bacteriocin do vi khuẫn gram dương ngày càng
nhiều nhờ tiềm năng rất lớn ứng dụng vào bảo quản thực phẩm hoặc ứng dụng để ngăn
ngừa và giải quyết vấn đề nhiễm khuẩn trong y học.
Trong bảo quản thực phẩm, đã có một số loại bacteriocin (Nisin, Natamysin) được chấp
nhận như chất bảo quản ở Hoa Kì và hơn 20 quốc gia trên thế giới. Như đã biết vi khuẩn
lactic đóng vai trò rất quan trọng trong các loại thực phẩm lên men. Một vài loại vi khuẩn
lactic có khả năng ức chế rộng rãi sự phát triển của nhiều loại vi sinh vật gây hư hỏng
thực phẩm.
1.2 Khái niệm Bacteriocin
Trong một quần thể, mỗi tế bào vi sinh vật đều có những cơ chế tự bảo vệ và cạnh tranh.
Hầu như tất cả các loại vi khuẩn trong quá trình sinh trưởng, phát triển, chúng đều có thể
GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang 1
Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ thực phẩm Nhóm 19
tổng hợp các hợp chất có khả năng ức chế các vi khuẩn khác nhau và đôi khi ngay cả bản

thân cũng bị ức chế. Các loại phân tử này bao gồm:
• Độc tố vi khuẩn (Ví dụ: diphtheria, tetanus, cholera…)
• Các enzyme làm tan tế bào vi khuẩn như: lysostaphin, phospholipase A,
• Các sản phẩm của quá trình trao đổi chất như acid hữu cơ, ammonia, diacetyl,
• Chất kháng sinh phổ rộng cổ điển như: glamicidin, valinomycin, bacitracin,…
• Bacteriocin và các hợp chất giống bacteriocin.
Bacteriocin là những chất có bản chất protein có hoạt tính kháng khuẩn được sinh tổng
hợp từ nhiều loại vi khuẩn. Tuy nhiên trong công nghiệp bacteriocin chủ yếu được sản
xuất từ vi khuẩn lactic nhờ tiềm năng sử dụng trong bảo quản thực phẩm như là chất bảo
quản tự nhiên.
So với các chất kháng sinh thì bacteriocin cũng có hoạt tính kháng khuẩn, nhưng khác
với kháng sinh ở chổ bacteriocin có tính đặc hiệu như enzyme, chỉ tác động lên một số vi
sinh vật, do đó khả năng kháng lai bacteriocin là rất cao.
1.3 Phân loại Bacteriocin
Cho tới nay có khoảng 200 loại bacteriocin được xác định, tuy nhiên việc phân loại
chúng vẫn chưa được xác định rõ ràng và nó đang là vấn đề tranh cãi.
Bacteriocin được phân loại với nhiều tiêu chí khác nhau như: họ vi khuẩn sản xuất, trọng
lượng phân tử của chúng và trình tự chuỗi amino acide. Bacteriocin được chia làm ba lớp.
Lớp I: Lantibiotics là những peptide nhỏ có trọng lượng phân tử (< 5kDa) ổn định nhiệt
hoạt động theo những cấu trúc màng tế bào. Lantibiotic bacteriocin lớp I được chia thành
hai lớp phụ.
Lớp Ia: bao gồm một cách tương đối hình thon dài, nói chung nó hoạt động bằng việc tạo
những lỗ trong màng tế bào chất của loài nhạy cảm. Nisin thuộc vào nhóm này.
Lớp phụ Ib: là những peptit đặc trưng hình cầu,không linh động, tích điện âm hoặc không
tích điện. chúng thể hiện hoạt động bằng cách gây nhiễu đối với những phân tử enzyme
thiết yếu của vi khuẩn nhạy cảm. Đại diện: Mersacidin…
GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang 2
Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ thực phẩm Nhóm 19
Bacteriocin lớp I. (a):Nisin; (b): Mersacidin
Lớp II: Non-Lantibiotics là những peptide có trọng lượng phân tử biến thiên, nhưng

thông thường nhỏ (< 10 kDa), ổn định nhiệt, chứa những aminoaxít thông thường. Nhóm
này được chia cắt vào trong ba nhóm nhỏ:
Lớp IIa: là lớp lớn nhất gồm những peptide hoạt động chống Listeria, đại diện đặc
trưng cho nhóm này là pediocin PA-1 Leucocin A và Sakacin P. Các bacteriocin nhóm
này hứa hẹn có những ứng dụng nhiều trong công nghiệp nhờ vào hoạt động kháng
Listeria mạnh của chúng. Thậm chí chúng còn được chú ý hơn nhiều so với bacteriocin
lớp I (nisin) vì chúng không có phổ ức chế rộng vì vậy chúng không tiêu diệt các giống
khởi động.
Leucocin A
GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang 3
Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ thực phẩm Nhóm 19
Lớp IIb:được hình thành bởi phức hợp của hai peptide riêng biệt, những peptide
này ít hoặc không hoạt động. Bacteriocin đặc trưng cho nhóm này là: Lactococcin G,
Plantaricin EF và Plantaricin JK.
Plantaricin
Lớp IIc: là những peptide nhỏ, bền nhiệt, gồm những bacteriocin không đồng nhất
nên phương thức hoạt động của chúng cũng khác nhau.Trong phân lớp này chỉ tìm thấy
các bacteriocin như Divergicin A và Acidocin B.
Lớp III: lớp này bao gồm các peptide lớn có trọng lượng phân tử lớn > 30 kDa, không
tan, không bền nhiệt. Nhóm này bao gồm các enzyme ngoại bào kháng lại các vi khuẩn
có thể bắt chước các hoạt động sinh lí của bacteriocin. Các bacteriocin lớp III cho đến
nay chỉ được phân lập từ các thành viên giống Lactobacillus. Đại diện: Acidofilicin A và
Lactacins A,B.
1.4 Bản chất hóa học
Protein
Tất cả các bacteriocin đều có chứa protein hoặc các peptid trong phân tử. Protein hoặc
peptid đóng vai trò quan trọng trong chức năng diệt khuẩn của bacteriocin. Một số loại
bacteriocin chứa tổ hợp nhiều phân tử protein liên kết lại với nhau.
Các amino acid bất thường trong phân tử một số loại bacteriocin giúp tạo nên một cấu
trúc phân tử vững bền hơn, hoặc làm tăng hoạt tính sinh học của phân tử.

Một số loại bacteriocin còn có chứa các amino acid chưa bão hòa trong phân tữ như
didehydroalamine. Các amino acid này là sản phẩm của phản ứng dehydrate hóa các
hydroxyl amino serine và threonine.
Các thành phần khác
Một số bacteriocin không chỉ nhạy cảm vớ protease mà còn lipase, phospholipase,
amylase. Điều này chứng tỏ bacteriocin còn chứa nhiều thành phần khác như: lipid,
glucid, phospholipid. Ví dụ: Lactocin 27 được cấu tạo từ phức hợp lipocarbohydrate
protein. Caseicin LSH và Leuconocin 3 là các glycoprotein.
Sự hiện diện của cầu nối –S – S – hoặc thioether trong cầu trúc cũng ảnh hưởng đến độ
bền và hoạt tính của bacteriocin.
Đặc điểm
GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang 4
Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ thực phẩm Nhóm 19
o Bacteriocin thuộc nhóm các sản phẩm trao đổi chất bậc 2, do bacteriocin khi sinh ra
không tham gia vào quá trình trao đổi chất của chính tế bào sinh tổng hợp ra nó.
o Bacteriocin có khả năng chống lại một số vi khuẩn gram dương, là những tế bào có mối
quan hệ gần gũi hoặc cùng họ với loại tế bào đã sinh tổng hợp ra bacteriocin. Ngoài ra
còn có một số loại bacteriocin có khả năng chống lại các vi khuẩn gram âm như Listeria,
E.Coli hay Samonella…
o Bacteriocin là nhửng cấu trúc chịu nhiệt tốt có chứa protein và hoạt tính hoạt động tốt ở
pH acid hoặc trung tính, mất hoạt tính ở pH >8. Hầu hết bacteriocin mang điện dung kỵ
nước mạnh mẽ và điểm đẳng điện lớn.
o Bacteriocin có khả năng gắn đặc hiệu với cơ quan thụ cảm trên bề mặt tế bào.
o Khả năng tổng hợp bacteriocin hay khả năng miễn dịch của tế bào đối với bacteriocin của
chính nó được quyết định bởi các gen nằm trên plasmid, nhiễm sắc thể hoặc transposons.
o Nồng độ bacteriocin cao có thể giết chất chính tế bào vi khuẩn sản sinh ra nó.
o Bacteriocin bị mất hoạt tính bởi các enzyme như: trypsin, pepsin, …
1.5 Nisin - Một đại diện của Bacteriocin
1.5.1 Giới thiệu Nisin
- Nisin do Rogers phát hiện lần đầu tiên vào năm 1928.

- Năm 1959 mới được sử dụng như một chất bảo quản thực phẩm ở Anh.
- Năm 1969 FAO, WHO đã công nhận nisin là một phụ gia thực phẩm an toàn và
được phép sử dụng cho người ở 50 quốc gia trên thế giới bao gồm các nước trong
liên minh Châu Âu và một số nước ở Châu Á, Châu Phi.
- Ở Mỹ, nisin cũng đã được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm (FDA) công
nhận là an toàn, được coi là chất bảo quản có nguồn gốc sinh học và dùng như một
phụ gia thực phẩm từ năm 1988 cho đến nay.
- Với khả năng kháng khuẩn tốt, khi bổ sung vào thực phẩm nisin không làm làm
ảnh hưởng đến các chất dinh dưỡng cũng như màu, mùi vị, hay trạng thái của thực
phẩm đồng thời lại an toàn với sức khỏe cong người nên nisin được sử dụng rộng
rãi như một phụ gia bảo quản.
- Trong công nghiệp, nisin được thu bằng cách nuôi Lactoccus lactis trong sữa, hoặc
trong dung dịch đường dextrose. Quá trình sản xuất được tuân theo các điều kiện
vệ sinh rất nghiêm ngặt và đáp ứng được các tiêu chuẩn khắt khe nhất đối với thực
phẩm.
1.5.2 Cấu tạo Nisin
GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang 5
Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ thực phẩm Nhóm 19
- Nisin là đại diện điển hình lớp Ia của các bacteriocin, là một peptide có khả năng
kiềm hãm nhiều loại vi khuẩn Gram dương, chúng dễ bị phân hủy bởi các enzyme
đường tiêu hóa và không độc với người.
- Nisin có hoạt tính kháng vi sinh vật, là một tác nhân kháng khuẩn tự nhiên và
không thể tổng hợp nhân tạo.
- Nisin là một peptit kháng khuẩn đa vòng, được cấu tạo từ 34 gốc axit amin do các
chủng vi khuẩn lactic sinh ra (Lactococcus lactic, Steptococcus).
- Trong thành phần của nisin có chứa các axit amin như: Leucin, Valin, Alanin,
Methionin, Glycin, Prolin, Histidin, Lyzin, acid Glutamic, acid Aspartic, Serin,
Lanthionine (Lan), Methyllanthionin (MeLan), Didehydrolanine (DHA) và acid
didehydroaminobutyric (Dhb).
Cấu tạo của nisin

1.5.3 Tính kháng khuẩn của Nisin
Nisin có hiệu quả trong việc kiểm sóat một loạt các vi khuẩn gram dương và các bào
tử của chúng bao gồm: Listeria, Enterococus và Clotridium (gây ngộ độc thực phẩm
bằng cách sinh độc tố). Nếu các vi khuẩn này hiện diện với số lượng lớn hay khi
chúng phát triển mạnh trong thực phẩm, sẽ sản sinh lượng độc tố đủ mạnh có thể gây
ra ngộ độc thực phẩm cấp tính. Với các biểu hiện nôn mửa, tiêu chảy, đau quặn bụng,
nhức đầu xảy ra sau khi ăn thực phẩm bị ô nhiễm khoảng 2 - 48 giờ, nặng hơn có
thể dẫn đến tử vong, đặc biệt ở nhóm đối tượng có sức đề kháng yếu, phụ nữ mang
thai, người già và trẻ em.
GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang 6
Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ thực phẩm Nhóm 19
Khi sử dụng riêng lẻ nisin không có hiệu quả trên vi khuẩn gram âm (như E.coli),
nấm men và nấm mốc. Trong trường hợp bình thường, các vi khuẩn gram âm có khả
năng kháng nisin chủ yếu là do màng không thấm nước bên ngoài của chúng. Tuy
nhiên, nisin có thể được hiệu quả chống lại các vi khuẩn gram âm nếu được sử dụng
kết hợp với các tác nhân gây mất ổn định màng tế bào bên ngoài như khi xử lý ở các
điều kiện làm lạnh, nhiệt độ cao, trong môi trường pH thấp (pH 2-6), hay khi sử dụng
kết hợp với chất bảo quản khác như lysozyme (từ lòng trắng trứng), enterocin (một
chất kháng khuẩn mới được phân lập từ Enterococcus faecium)…
1.5.4 Cơ chế hoạt động
Nisin có thể bám dính lên thành tế bào vi khuẩn mà không cần các thụ thể (khả năng
bám dính phụ thuộc vào pH môi trường do độ bền và độ hòa tan của nisin biến đổi
phụ thuộc vào pH của môi trường: chúng tan tốt ở pH axit, tan kém ở pH trung tính và
không tan ở pH kiềm). Sau đó, nisin tại các lỗ tạm thời làm mất áp suất thẩm thấu, các
ion di chuyển qua màng tế bào một cách tự do dẫn đến sự rối loạn trong việc vận
chuyển các chất dinh dưỡng qua màng tế bào, ảnh hưởng đến sự tổng hợp ATP. Ngoài
ra, nisin còn ức chế quá trình tổng hợp peptidoglycan nên chỉ có tác động lên vi khuẩn
Gram dương. Nisin có hiệu quả trong việc kiểm sóat một loạt các vi khuẩn gram
dương và các bào tử của chúng bao gồm: Listeria, Enterococus và Clotridium .
1.5.4 Nisin trong chế biến và bảo quản thực phẩm

Cũng như bất kỳ chuỗi axit amin và các protein khác, nó được phân hủy trong quá
trình tiêu hóa trong ruột và không gây ra ảnh hưởng cho sức khỏe. Thêm vào đó, các
công trình nghiên cứu ứng dụng nisin cho thấy nisin có khả năng tiêu diệt một số loại
vi khuẩn bằng cách tấn công vào thành tế bào của vi khuẩn có hại nhưng lại không
gây ảnh hưởng đến nhiều loại vi khuẩn có lợi dùng trong công nghệ lên men và trong
hệ tiêu hóa của người và không độc đối với người.
Với khả năng kháng khuẩn tốt, khi bổ sung vào thực phẩm nisin không làm làm ảnh
hưởng đến các chất dinh dưỡng cũng như màu, mùi vị, hay trạng thái của thực phẩm
đồng thời lại an toàn với sức khỏe cong người nên nisin được sử dụng rộng rãi như
một phụ gia bảo quản.
2 Công nghệ sản xuất Bacteriocin
Những năm gần đây, mối quan tâm về tính an toàn và chất lượng của thực phẩm đã
thôi thúc các nhà khoa học khám phá và phát triển phương pháp mới trong bảo quản thực
phẩm, đặc biệt là các bacteriocin. Tuy nhiên đến nay, tác dụng của các bacteriocin trong
thực phẩm chủ yếu là trên thí nghiệm.
Hiện nay, chỉ có hai bacteriocin được thương mại là nisin từ Lactococcus lactis và
pediocin PA-1/AcH từ Pediococcus acidilactici, chúng đều được sử dụng trong công
GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang 7
Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ thực phẩm Nhóm 19
nghiệp thực phẩm. Nisin và pediocin PA-1/AcH có tên thương mại tương ứng là Nisaplin,
ALTA.
Tại Việt Nam, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam là cơ quan đầu tiên khởi
xướng những nghiên cứu về nisin. Trong khuôn khổ đề tài cấp Viện KHCNVN, các nhà
khoa học Viện Công nghệ Sinh học đã tiến hành nghiên cứu công nghệ lên men và thu
hồi nisin từ vi khuẩn Lactococcus lactis. Nội dung nghiên cứu bao gồm: lựa chọn môi
trường, thành phần môi trường, tác động của pH đối với sinh trưởng và tổng hợp nisin
của chủng Lactococcus lactis 145, nghiên cứu thiết lập mô hình lên men và công nghệ
thu hồi nisin. Kết quả đã thiết lập được quy trình lên men điều khiển và quy trình thu hồi
bằng hấp phụ tế bào, nhờ đó năng suất tổng hợp nisin của chủng tăng lên gần hai lần và
sản phẩm nisin thu được có độ tinh sạch rất cao.

Nhóm chúng em xin trình bày về quy trình này:
2.5 Quy trình sản xuất Nisin
GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang 8
Giống vi sinh vật
Tế bào L.Lactis
Lên men
Nisin
Hấp phụ tế bào
Thu hồi Nisin
Dịch sau lên men
Xử lí
Môi trường lên men
Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ thực phẩm Nhóm 19
2.6 Môi trường lên men
Môi trường CM có nguồn cacbon là sacaroza cho năng suất sinh tổng hợp nisin của
chủng tốt hơn so với các môi trường MRS và M17. Trong công thức môi trường CM,
hàm lượng sacaroza 40g/l, K
2
HPO4 10g/l đựơc xác định là có ảnh hưởng rất mạnh, trong
khi nguồn thay thế cho pepton và cao malt là sữa đậu nành 20% cũng rất thích hợp để
lựa chọn cho lên men ở thể tích lớn.
Thành phần môi trường CM (g/l): Sacaroza 40g/l, cao nấm men 10 g/l, peptn (soy)
10g/l, K2HPO4 10g/l, NaCl 2g/l, MgSO
4
.7H
2
O 0.2 g/l, pH 6.5-6.8.
2.7 Vi sinh vật sử dụng
Chủng vi sinh vật: Chủng Lactococcus lactis 145 có đặc tính sử dụng sacaroza làm
nguồn cacbon là một đặc điểm quan trọng được lựa chọn.

2.8 pH
pH là một yếu tố có ảnh hưởng quan trọng đặc biệt đối với lên men vi khuẩn lactic
nói chung và tổng hợp nisin nói riêng. Việc giảm pH trong các quá trình lên men lactic là
một quy luật và có tác động đặc biệt đến sinh tổng hợp nisin của chủng L.lactis 145.
Động thái sinh trưởng và sinh tổng hợp của chủng 145 phản ánh những biến diễn cũng
như tác động của việc giảm pH đối với quá trình sử dụng cơ chất sacaroza, sinh trưởng
và tổng hợp nisin.
2.9 Mô hình lên men cố định pH và bổ sung Cacbon
Mô hình lên men cố định pH và bổ sung nguồn cacbon
Trong mô hình lên men cố định pH và bổ sung nguồn cacbon, quá trình sinh tổng
hợp nisin đạt cực đại ở mức cao hơn rất nhiều so với hai mô hình trước. Hoạt tính tổng
hợp nisin đạt cực đại là 3450 IU/ml ở giờ thứ 10 so với 1960 IU/ml ở lên men thông
thường và 2750 IU/ml ở lên men cố định pH. Thời gian tổng hợp nisin ở mức cao, từ
3100 đến 3500- 3450 -3200 IU/ml diễn ra từ giờ thứ 8 đến giờ thứ 18 của quá trình lên
men. Bằng việc bổ sung thành phần dinh dưỡng liên tục kết hợp điều khiển cố định pH =
6.5 không chỉ nâng cao năng suất sinh tổng hợp nisin lên 179% mà còn kéo dài thời gian
đạt năng suất cực đại.
GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang 9
Sơ đồ quy trình sản xuất Nisin
Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ thực phẩm Nhóm 19
Kết quả: Quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp Nisin ở chủng Lactococcus lactis
145 bị ảnh hưởng rất nhiều bởi sự thay đổi pH, giảm nguồn dinh dưỡng và nguồn năng
lượng trong môi trường. Lên men theo mẻ (batch fementation) là mô hình thường được
lựa chọn để sản xuất Nisin. Tuy nhiên mô hình này bị tác động do sự biến đổi pH cũng
như suy giảm dinh dưỡng. Thiết lập mô hình lên men theo đó pH được điều khiển cố
định tại 6.5 và nguồn cacbon sacaroza được cung cấp liên tục đạt nồng độ 40g/l trong
suốt quấ trình đã cải thiện đáng kể hoạt tính tổng hợp nisin của chúng. Trong mô hình
lên men điều khiển này năng suất đã tăng lên 179% và thời gian đạt năng suất cực đại
cũng kéo dài hơn so với mô hình thường.
GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang 10

Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ thực phẩm Nhóm 19
2.6 Thu hồi nisin
Hiện nay có một số phương pháp thu hồi nisin đang được sử dụng, trong đó kết tủa
bằng sunphat amon là phổ biến. Bên cạnh đó phương pháp hấp phụ-phản hấp bằng sinh
khối L.lactis là một phát hiện mới trong thời gian gần đây.
Phương pháp kết tủa bằng sunphat amon là một phương pháp thông thường sử
dụng để thu hồi các sản phẩm protein. Kết quả nghiên cứu cho thấy nồng độ sunphat
amon 45%, pH=4.5, nhiệt độ sấy 60
0
C là các giá trị có ảnh hưởng tốt nhất tới hiệu suất
thu hồi nisin. Tuy nhiên, với phương pháp này, do kết tủa không có tính chọn lọc cao,
nên sản phẩm thường không sạch.
Thu hồi nisin theo phương pháp hấp phụ-phản hấp bằng sinh khối L.lactis là quá
trình phụ thuộc hàng loạt các yếu tố như pH, trạng thái tế bào, nhiệt độ, thời gian và sự
tiếp xúc, trong đó pH là yếu tố có ảnh hưởng mạnh. Tại pH=6.0, quá trình hấp phụ nisin
của sinh khối tế bào L.lactis đạt cao nhất là 92.1%, cao hơn tất cả các phương án thí
nghiệm khác. Tế bào L.lactis ở giai đoạn sinh trưởng mạnh có khả năng hấp phụ nisin
tốt hơn, nhưng khi bị xử lý nhiệt lại giảm. Nhiệt độ từ 4-30
0
C và thời gian từ 1-5h không
có sự khác biệt đáng kể giữa các phương án thí nghiệm, trong khi sự khuấy, trộn làm gia
tăng sự hấp phụ nisin. Sản phẩm nisin thu được từ quy trình hấp phụ-phản hấp phụ sử
dụng sinh khối tế bào có độ sạch gấp gần 20 lần so với phương pháp kết tủa sunphat
amon.

GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang 11
Thiết bị lên men theo mẻ
Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ thực phẩm Nhóm 19
Phổ điện di các dạng sản phẩm nisin, 1: nisin chuẩn (Sigma), 2: nisin thu được từ
quy trình hấp phụ-phản hấp phụ,

3: nisin sản phẩm từ quy trình kết tủa sunphat amon
2.7 Yêu cầu sản phẩm
Những năm gần đây, mối quan tâm về tính an toàn và chất lượng của thực phẩm
đã thôi thúc các nhà khoa học khám phá và phát triển phương pháp mới trong bảo quản
thực phẩm, đặc biệt là các bacteriocin. Tuy nhiên đến nay, tác dụng của các bacteriocin
trong thực phẩm chủ yếu là trên thí nghiệm. Có thể do yêu cầu khắt khe đối với một sản
phẩm bảo quản sinh học an toàn cũng như những quan điểm trái ngược về những giống
khởi động cải biến di truyền trong thực phẩm. Tuy nhiên, khi người tiêu dùng cần những
sản phẩm được bảo quản, thiết bị chế biến, việc sử dụng bacteriocin có thể trở nên phổ
biến hơn, như là một phương tiện giúp bảo quản thực phẩm “tự nhiên”. Dưới đây là một
số tiêu chuẩn đặt ra cho sản phẩm bacteiocin ứng dụng trong công nghệ thực phẩm:
Về tiêu chuẩn an toàn: Chủng sản xuất phải có dạng GRAS (Generally
regarded as safe - được đánh giá là những vi sinh vật an toàn), phải được thử nghiệm
tính độc, không có rủi ro về sức khỏe qua quá trình xác định các mặt như ảnh hưởng tích
lũy, điều phối và tiềm tàng.
Tính hiệu quả: Bacteriocin phải ức chế sự sinh trưởng lên phổ rộng các
mầm bệnh và vi khuẩn gây kháng như L. monocytogenes và C. botulinum có hoạt tính
chống lại một mầm bệnh đặc hiệu. Bacteriocin phải bền nhiệt và có hoạt tính cao khi kết
hợp trong thực phẩm. Tất nhiên, bacteriocin cũng không được ức chế sinh trưởng của
các giống khởi động khác.
2.8 Hàm lượng sử dụng và hạn chế
- ADI ( Acceptable Daily Intake) là 0,13 mg/kg thể trọng - Các sản phẩm từ ngũ
cốc và tinh bột dùng làm bánh, hàm lượng nisin cao nhất được dùng là 3 mg/kg nguyên
liệu - Phô mai cho phép sử dụng nisin với hàm lượng 12 mg/kg.
2.9 Chế phẩm của Nisin
Thành phần chế phẩm nisin là nisin (2,5%), clorua natri (lớn hơn 50%) ,
protein (23,8%) và độ ẩm (dưới 3%). Dạng bột trắng hoặc xám ít hòa tan trong nước,
trong môi trường acide độ hòa tan tăng lên (khi pH = 4,2 tan được 12g/l). Rất ổn
định trong phòng nhiệt độ. Ở pH 2.0 ở 121oC 30 phút, sản phẩm vẫn ổn định. Ở pH cao
hơn độ ổn định giảm. Nisin bị phá hủy ở pH = 8,0 nhiệt độ 37oC từ 15 - 30 phút. Bột

này dùng bảo quản ở dạng khô qua nhiều năm ở nhiệt độ bình thường hoạt tính kháng
sinh của nó không giảm sút bao nhiêu.
GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang 12
Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ thực phẩm Nhóm 19
III. Ứng dụng của Bacteriocin trong công nghệ thực phẩm
Hiện nay, hầu hết các loại nông sản và thực phẩm chế biến, đóng hộp ở Việt Nam và
nhiều nước trên thế giới thường được bảo quản bằng các hoá chất hay các loại phụ gia có
tính chất bảo quản. Tuy nhiên, những phương pháp này chưa đáp ứng được yêu cầu về an
toàn vệ sinh thực phẩm. Vì vậy, việc ứng dụng những chất bảo quản có nguồn gốc tự
nhiên, không làm ảnh hưởng đến sức khỏe con người rất được quan tâm và đang được
nghiên cứu sử dụng rộng trong công nghệ thực phẩm và một trong số đó là “Nisin”.
- Nisin sử dụng trong sữa, thịt, các sản phẩm từ sữa và thịt (bổ sung trực tiếp nisin
hoặc phối hợp sử dụng các chủng sinh nisin).
- Sản phẩm thủy sản
- Đồ uống lên men như bia, nước ép trái cây, các loại nước sốt…
- Với các sản phẩm đồ hộp, nisin được dùng để giảm khả năng bền nhiệt của vi
khuẩn và ngăn chặn quá trình thối rửa của sản phẩm.
Nisin có hoạt tính diệt khuẩn thích hợp cho các loại thực phẩm bảo quản ở nhiệt độ
thấp và nhiệt độ phòng.
GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang 13
Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ thực phẩm Nhóm 19
IV. Sản phẩm Bacteriocin
Đối với vi sinh vật, bacteriocin là phương thức để cạnh tranh dinh dưỡng và không gian
sống giữa các loài, giúp cân bằng sinh thái vi sinh vật. Đối với con người, bacterioncin có
vai trò quan trọng. Những ứng dụng tiềm năng của bacteriocin gồm:
6.1 Bảo quản sinh học thực phẩm
Bacteriocin có đặc điểm lý tưởng trong bảo quản sinh học thực phẩm. Nhiều bacteriocin
bền trong điều kiện nhiệt độ chế biến cao và hoạt động trong phạm vi pH rộng. Các
bacteriocin được xem là hợp chất an toàn do bị phân giải như những protein khác trong
thức ăn. Bacteriocin không mùi, không màu, không vị, ảnh hưởng không đáng kể lên khu

hệ vi sinh vật đường ruột, có phổ kháng khuẩn tương đối rộng lên nhiều mầm bệnh và vi
khuẩn gây hỏng thực phẩm. Một số bacteriocin cho thấy hiệu quả bổ trợ khi sử dụng phối
hợp với các yếu tố kháng khuẩn khác như hợp chất phenolic tự nhiên cũng như những
protein kháng khuẩn khác. Sự kết hợp các bacteriocin khác nhau có thể giúp ngăn ngừa
sự phát triển của những chủng kháng.
Các bacteriocin được sử dụng trong bảo quản sinh học thực phẩm dưới 3 dạng chính:
GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang 14
Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ thực phẩm Nhóm 19
- Ủ thực phẩm với giống bảo vệ (thường là vi khuẩn lactic - LAB: Lactic acide bacteria)
để tạo bacteriocin in situ. Trong trường hợp này, khả năng LAB sinh trưởng và tạo
bateriocin trong sản phẩm là quyết định.
- Bổ sung bacterocin tinh chế hay bán tinh chế như là các chất bảo quản thực phẩm.
- Sử dụng bán thành phẩm lên men trước đó với một chủng sinh bacteriocin như là một
thành phần trong quá trình chế biến thực phẩm.
6.2 Các sản phẩm chăm sóc sức khỏe
Do nisin có khả năng ức chế phổ rộng các vi khuẩn gram dương nên được sử dụng trong
ngăn ngừa chứng viêm vú ở gia súc. Hiện nay, mutacin từ cầu khuẩn thuộc các chủng của
Streptococcus mutans biến đổi di truyền được sử dụng trong sản phẩm chăm sóc sức khỏe
răng miệng như kem đánh răng, nước súc miệng để ức chế sâu răng và cao răng.
Bacteriocin có trong xà phòng, mỹ phẩm giúp loại trừ mụn trứng cá.
Các loại bacteriocin gần đây cũng được ứng dụng trong lĩnh vực y tế. Do vi sinh vật đang
tăng dần tính kháng kháng sinh nên các liệu pháp trong điều trị chống lại bệnh nhiễm
trùng sẽ trở nên vô hiệu. Bacteriocin có thể là một giải pháp cho tính trạng này, giúp điều
trị nhiễm trùng da cục bộ hay nhiễm trùng kháng đa thuốc. Chúng có thể ức chế sự sinh
trưởng của vi khuẩn của vi khuẩn với ưu điểm: Sản phẩm tự nhiên, từ “vi khuẩn tốt” và
không có rủi ro nhiễm bệnh hay các vấn đề khác. Các chủng probiotic và các chủng tạo
bacteriocin có khả năng bảo vệ đường tiêu hóa chống lại vi khuẩn gây bệnh.
GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang 15
Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ thực phẩm Nhóm 19
6.3 Các giống khởi động

Giống khởi động (Starter cultures) là các sản phẩm công nghiệp mà bản thân tế bào vi
sinh vật được sử dụng làm nguyên liệu cấy. Thông thường giống khởi động là hỗn hợp
các loài vi sinh vật có vai trò tạo màu, tạo mùi thơm đặc trưng, làm giảm độ pH, ngăn cản
sự phát triển của vi khuẩn có hại trong thực phẩm. Khi sử dụng như là một giống khởi
động, chủng sinh bacteriocin phải thực hiện lên men tối ưu, ngoài ra phải tạo lượng
bacteriocin đủ khả năng bảo vệ. Ví dụ: Sự nuôi cấy một chủng Enterococcus sinh
enterocin SA-48 như là giống đồng nuôi cấy kết hợp với một giống khởi động thương
mại trong sản xuất phomat không ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của giống khởi động hay
đặc tính sinh hóa của phomat tạo ra. Đồng thời bacteriocin được tạo ra trong phomat đủ
đảm bảo ức chế Bacillus cereus.
Kỹ thuật ADN tái tổ hợp đã tạo ra các giống khởi động tái tổ hợp chứa gen miễn dịch và
gen tạo bacteriocin. Các gen này nằm trên một ADN cụ thể, được cài vào vector nhân
dạng và chuyển vào các giống khởi động. Chúng có thể được đưa vào trong giống khởi
động trong sữa và trong sản xuất các thực phẩm lên men khác để ức chế sự sinh trưởng
của mầm bệnh in situ và tăng thời hạn sử dụng; vào nấm men để ức chế các vi khuẩn gây
kháng lactic
6.4 Các probiotic
Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về probiotic tăng lên nhanh chóng. Nhiều sản
phẩm probiotic đã xuất hiện trên thị trường dưới dạng các loại sản phẩm đa dạng như
GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang 16
Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ thực phẩm Nhóm 19
viên bọc, bột, sữa chua làm giàu và nhiều loại thực phẩm khác. Vi sinh vật sử dụng cho
các sản phẩm probiotic là nấm men, vi khuẩn (đặc biệt là nhóm LAB). Ví dụ:
Lactobacillus acidophilus là LAB lên men đồng hình được tìm thấy trong đường tiêu hóa
của người và động vật. Chúng được bổ sung vào các sản phẩm sữa lên men thương mại
như sữa chua acidophilus. Những vi khuẩn này có ảnh hưởng tích cực lên sức khỏe con
người nhờ khả năng sinh bacteriocin - giúp ức chế hay tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh.
Các bacteriocin từ L. Acidophilus và L. Gasseri có tác dụng kích thích hoạt động của hệ
thống miễn dịch, bất hoạt các hợp chất gây đột biến và ung thư tiềm năng, giảm
cholesterol trong máu. Probiotic từ LAB hiệu quả trong ngăn ngừa sự rối loạn đường ruột

và điều trị tiêu chảy do các nguyên nhân khác nhau. Bacteriocin giúp vi sinh vật có lợi
cạnh tranh với vi sinh vật bản xứ cũng như hệ vi khuẩn đường ruột gây bệnh.
6.5 Các dấu chuẩn tạo vector tác dụng trong thực phẩm
Các gen kháng kháng sinh (kanamycin. Erythromycin, tetracyclin, ) được sử dụng phổ
biến nhất là dấu chuẩn chọn lọc trong vector tác dụng. Với mục đích khoa học, các gen
kháng kháng sinh dùng là dấu chuẩn hữu hiệu cho chọn lọc những thể biến nạp. Tuy
nhiên, các dấu chuẩn này không được chấp nhận trong thao tác với giống khởi động bởi
lo ngại chúng có thể truyền tính kháng kháng sinh vào hệ vi khuẩn đường ruột. Do đó,
các gen kháng bacteriocin có thể được sử dụng như là dấu chuẩn chọn lọc thay thế, tạo
vector tác dụng an toàn trog thực phẩm. Tương tự như dấu chuẩn chọn lọc kháng sinh,
chúng có thể được truyền và chọn lọc trong tế bào nhạy cảm với các yếu tố chọn lọc
(bacteriocin) hay thiếu khả năng chuyển hóa yếu tố sử dụng chọn lọc (khả năng sử dụng
hydrat caacbon). Ví dụ: gen miễn dịch lafI kháng lactacin F dùng cho các chủng
Lactobacillus - nhạy cảm với Lactin F. Gen miễn dịch ltn kháng lacticin 3147 từ L.lactis,
gen kháng nisin
6.6 Các bacteriocin thương mại
Hiện nay, chỉ có hai bacteriocin được thương mại là nisin từ Lactococcus lactis và
pediocin PA-1/AcH từ Pediococcus acidilactici, chúng đều được sử dụng trong công
GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang 17
Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ thực phẩm Nhóm 19
nghiệp thực phẩm. Nisin và pediocin PA-1/AcH có tên thương mại tương ứng là Nisaplin,
ALTA.
GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang 18
Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ thực phẩm Nhóm 19
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] />ngh-len-men-va-thu-h-i-nisin-t-vi-khu-n-lactococcus-lactis
[2] />[3] />nisin-o-vi-khuan-lactococcus-lactis 1543282.html
[4] />khuan-lactic-phan-lap-tren-nem-chua-23881/
[5] />[6] />02022012.html
GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang 19