Công nghệ sản xuất amylase và ứng dụng

SEMINAR CÔNG NGHỆ PROTEIN VÀ ENZYME
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT
ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG
DỤNG
TP.Hồ Chí Minh, tháng 01 năm 2014
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
I. TỔNG QUAN VỀ ENZYME AMYLASE:
1. Lịch sử phát triển
- Năm 1814: Kirchoff, Saint Petercburg chứng minh hạt lúa mạch nảy mầm có tác
dụng chuyển hóa tinh bột thành đường ở nhiệt độ từ 400
0
C-600
0
C.
- Năm 1833: Payen và Perso (Pháp) thêm cồn vào dịch chiết này, thu được kết tủa có
khả năng phân giải tinh bột thành đường, và đặt tên là Diastase (xuất phát từ tiếng Hy Lạp,
diastatics, có nghĩa là phân giải, đó là Amylase). Sau này theo đề nghị của Duclo, Enzyme
phân giải tinh bột được gọi là Amylase.
- Năm 1851: Leuchs đã phát hiện nước bọt cũng có khả năng phân giải tinh bột thành
đường. Sau đó, các Enzyme Amylase trong nước bọt, trong dịch tiêu hóa của người và động
vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn bắt đầu được quan tâm nghiên cứu.
- Năm 1862, Danilevxki đã tách được Amylase của tuyến tụy bằng phương pháp hấp
thụ chọn lọc.
- Năm 1949, Schwimmer đã xác định được số chu chuyển của α-Amylase là 19000.
- Năm 1950, Englard và Singer cho biết số chu chuyển của β-Amylase là 250000.
- Đến năm 1952, người ta đã thu được 72 Enzyme ở trạng thái kết tinh trong đó có 4
Enzyme α-Amylase.
- Năm 1971: Uxtinilov và cộng sự bằng phương pháp điện di trên gel poliacrylamid đã
xác định được sự có mặt của một lượng lớn α-Amylase và glucoAmylase trong canh trường
nấm mốc và một lượng nhỏ các phân đoạn có hoạt tính dextrinase và transglucosilase.
2. Amylase là gì?

Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật . Các enzyme này thuộc
nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide
với sự tham gia của nước:
RR’ + H-OH RH + R’OH
Seminar Công nghệ Protein & Enzyme Trang 2
Amylase
Exoamylase
β-Amylase γ-Amylase
Endoamylase
Enzym khử nhánh α-Amylase
Khử trực ếp
α-dextrin 6-glucanohydrolase
(pullulanase)
Khử gián ếp
oligo-1,6-glucosidase
(transglucosylase)
Và amylo 1,6-glucosidase
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và dextrin hạn
chế. Các Enzyme Amylase có trong nước bọt (còn được gọi là ptyalin), trong dịch tiêu hóa
của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm sợi, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn. Trong
nước bọt của người có ptyalin nhưng ở một số loại động vật có vú thì không có như ngựa,
chó, mèo Ptyalin bắt đầu thủy phân tinh bột từ miệng và quá trình này hoàn tất ở ruột non
nhờ Amylase của tuyến tụy (còn được gọi là amylopsin). Amylase của malt thủy phân tinh
bột lúa mạch thành disaccharide làm cơ chất cho quá trình lên men bởi nấm men.
Amylase là một trong những loại Enzyme được ứng dụng rộng rãi nhất trong công
nghiệp, y tế, và nhiều lĩnh vực kinh tế khác, đặc biệt là trong ngành công nghiệp thực phẩm.
3. Phân loại
Hiện nay, có 6 loại Enzyme Amylase được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase ( Enzyme
nội bào ) và Exoamylase ( Enzyme ngoại bào ).

- Endoamylase : gồm có α-Amylase (EC 3.2.1.1) và nhóm Enzyme khử nhánh. Nhóm
Enzyme khử nhánh này được chia thành hai loại: khử trực tiếp là pullulanase ( hay α-dextrin
6-glucanohydrolase) (EC 3.2.1.41); khử gián tiếp là transglucosylase (hay oligo-1,6-
glucosidase) (EC 3.2.1.20) và amylo-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.10). Các Enzyme này thủy
phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide.
- Exoamylase: Đây là những Enzyme thủy phân tinh bột tử đầu không khử của chuỗi
polysaccharide. Nhóm này gồm có:
+ β-Amylase (EC 3.2.1.2)
+ Amyloglucosidase (glucoamylase hay γ-Amylase) (EC 3.2.1.3)
Seminar Công nghệ Protein & Enzyme Trang 3
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
Hình 1. Các loại Enzyme endoAmylase và exoAmylase
3.1. Enzyme α-Amylase (α-1,4-glucanohydrolase) (EC 3.2.1.1):
a. Cấu tạo:
Enzyme α-Amylase là protein có phân tử lượng thấp, thường nằm trong khoảng
50.000 đến 60.000 Dal. Có một số trường hợp đặc biệt như α-Amylase từ loài vi khuẩn
Bacillus macerans có phân tử lượng lên đến 130.000 Dal. Đến nay người ta đã biết rất
rõ các chuỗi acid amin của 18 loại α-Amylase nhưng chỉ có 2 loại α-Amylase là taka-
Amylase từ Apergillus orysee và α-Amylase của tụy lợn được nghiên cứu kỹ về hình
thể không gian cấu trúc bậc 3. Mới đây các nghiên cứu về tính đồng nhất của chuỗi
mạch acid amin và về vùng kị nước cho thấy các chuỗi mạch acid amin của tất cả các
Enzyme α-Amylase đều có cấu trúc bậc 3 tương tự nhau.
Hình 2.Cấu trúc không gian của α-Amylase
Seminar Công nghệ Protein & Enzyme Trang 4
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
b. Cơ chế tác dụng của α-Amylase:
α-Amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều điềm rất giống nhau. α-Amylase có
khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất
( tinh bột hoặc glycogen) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả.
α-Amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột

nguyên song với tốc độ rất chậm.
Dưới tác dụng của α-Amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose,
glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường α-Amylase chỉ thủy phân
tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không cho màu với Iodine và một ít
maltose. Khả năng dextrin hóa cao của α-Amylase là tính chất đặc trưng của nó. Vì
vậy, người ta thường gọi loại Amylase này là Amylase dextrin hóa hay Amylase dịch
hóa.
Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của α-Amylase:
+ Giai đoạn dextrin hóa:
Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp
+ Giai đoạn đường hóa:
Dextrin tetra và trimaltose di & monosaccharide
Amylase oligosacharide poliglucose
Maltose maltotriose maltotetrose
c. Đặc tính α-Amylase
α-Amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi loại
α-Amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng. α-Amylase là một protein giàu
tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic. Điểm đẳng điện nằm trong vùng
pH=4,2 - 5,7 ( Bernfeld P, 1951 ).
α-Amylase là một metaloEnzyme. Mỗi phân tử α-Amylase đều có chứa 1-30
nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1 - 6 nguyên tử gam/mol Ca tham gia vào
sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của Enzyme, duy trì hoạt động của Enzyme
(Modolova, 1965).
Seminar Công nghệ Protein & Enzyme Trang 5
α-Amylase
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
α-Amylase của nấm sợi không tấn công liên kết α-1,6 glucoside của amylopectin, nên
khi thủy phân nó sẽ tạo thành các dextrin tới hạn phân nhánh. Đây là một cấu trúc phân tử
tinh bột do Enzyme α-Amylase phân cắt tạo thành dextrin tới hạn phân nhánh.
Hình 3. Cấu trúc mạng phân tử amylopectin

Sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinh bột dưới tác dụng của Amylase nấm sợi
chủ yếu là maltose, thứ đến là maltotriose. Nồng độ α-Amylase của VSV tương đối lớn
có thể chuyển hóa 70 - 85% tinh bột thành đường lên men. Còn các α-Amylase của
nấm mốc thì mức độ đường hóa đến glucose và maltose có thể lên tới 84 - 87%.
Điều kiện hoạt động của α-Amylase từ các nguồn khác nhau thường không
giống nhau. pH tối thích cho hoạt động của α-Amylase từ nấm sợi là 4,0 - 4,8 ( có thể
hoạt động tốt trong vùng pH từ 4,5 - 5,8 ).
Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-Amylase từ các nguồn khác nhau
cũng không đồng nhất, α-Amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác động nhiệt.
Nhiệt độ tối thích của nó là 50
0
C và bị vô hoạt ở 70
0
C (Kozmina, 1991 ).
3.2. Enzyme β-Amylase (β-1,4-glucan-maltohydrolase) (EC 3.2.1.2):
a. Cấu tạo:
β-Amylase hiện diện phổ biến ở thực vật, đặc biệt là hạt nảy mầm. Ở trong các
hạt ngũ cốc nảy mầm, β-Amylase xúc tác sự thuỷ phân các liên kết 1,4 α-glucan trong
tinh bột , glucogen và polysaccharide, phân cắt từng nhóm maltose từ đầu không khử
của mạch . Maltose được tạo thành do sự xúc tác của β-Amylase có cấu hình β.
Seminar Công nghệ Protein & Enzyme Trang 6
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
Ở ngũ cốc, β-Amylase tham gia vào sự phân giải của tinh bột trong quá trình
nảy mầm của hạt. Ở lúa, β-Amylase được tổng hợp trong suốt quá trình của hạt và hầu
như không được tổng hợp ở hạt khô. Ở lúa mạch, Enzyme có mặt ở trong hạt khô, nó
được tích lũy trong suốt quá trình phát triển của hạt, khi ở dạng liên kết, Enzyme này
là một phân tử có trọng lượng phân tử là 64.000 Da và khi bị phân cắt bởi một protease
sẽ được phóng thích dưới dạng tự do và có khối lượng phân tử là 59.000 Da .
b. Cơ chế tác dụng của β-Amylase:
β-Amylase là một Enzyme ngoại bào (exoenzyme). Tiến trình phân giải bắt đầu

từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng cơ chất . β-Amylase phân cắt các liên kết
α- 1,4glucoside nhưng khi gặp liên kết α-1,4 glucoside đứng kế cận liên kết α-
1,6glucoside thì nó sẽ ngừng tác dụng. Phần polysaccharide còn lại là dextrin phân tử
lớn có chứa rất nhiều liên kết α-1,6 glucoside và được gọi là β-dextrin.
Cơ chế tác dụng của β-Amylase lên tinh bột
Tinh bột
- amylase
β
→
maltose (54-58%)+ β-dextrin(42-46%) (glucogen)
Tinh bột bị thuỷ phân đồng thời bởi cả α và β-Amylase thì lượng tinh bột thuỷ phân tới 95%.
3.3. Enzyme γ-Amylase (glucoamylase) (EC 3.2.1.3):
a. Cấu tạo:
γ-Amylase ( glucoamylase hay α-1,4-glucan-glucohydrolase ) là những Enzyme có thể
thuỷ phân được cả hai kiểu liên kết của các mạch α-glucan để giải phóng ra ở dạng β.
Glucoamylase hay γ-Amylase chủ yếu được tạo ra bởi các vi sinh vật. Đặc biệt là kiểu nấm
mốc aspergillus, penicillium và Rhizopus
Amyloglucosidase từ nấm mốc là các protein có khối lượng phân tử lượng dao động
rất lớn từ 27.000 đến 112.000 Dal tuỳ thuộc vào nguồn gốc của Enzyme
Nói chung thì các amyloglucosidase đều chứa các gốc mêthioni, tritophan, và một nửa
gốc cystein. Tuy nhiên mối quan hệ giữa chuỗi acid amin, cấu trúc bậc 3 và hoạt động của
Enzyme vẫn chưa được làm sáng tỏ tất cả các amyloglucosidase từ nấm mốc đều là
glucoprotein chứa từ 5 - 20% gluxit trong đó chủ yếu là các mono saccharid glucose
mannose, galactose và glucosamin
Các amyloglucosidase chủ yếu được tạo nên từ hai isoEnzyme I và II khác nhau ở khả
năng thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn và bởi độ bền của chúng. Amyloglucosidase I tự hấp
Seminar Công nghệ Protein & Enzyme Trang 7
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
thụ và thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn, ngược lại amyloglucosidase II không có cả hai tinh
chất này .

b. Cơ chế hoạt động:
Amyloglucosidase có thể giải phóng ra β-D-glucose bằng cách thuỷ phân lặp lại nhiều
lần các liên kết α-1,4 của mạch α-glucan từ đầu không khử, chúng cũng thuỷ phân được các
liên kết α-1,6 và α-1,3 nhưng rất chậm (10 - 30 lần ). Tốc độ thuỷ phân cũng phụ thuộc vào
bản chất của các liên kết kề cận với các liên kết glucozit được thuỷ phân , cũng như kích
thuớc và cấu trúc của cơ chất bị thuỷ phân . Nhất là với các α-glucan mạch dài ( amylose và
amylopectin ) thì bị thuỷ phân nhanh hơn là với các maltodextrin và các oligosaccharit.
c. Tính chất:
Glucoamylase có khả năng thuỷ phân các liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucoside. Khi thuỷ
phân liên kết α-1,4-glucan trong chuỗi polysaccharide, glucoamylase tách lần lượt từng phân
tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch để tạo ra glucose.Ngoài các liên kết α-1,4 và α-
1,6 glucoside, glucoamylase còn có khả năng thuỷ phân các liên kết α-1,2 và α-1,3 glucoside .
Glucoamylase có khả năng thuỷ phân hoàn toàn tinh bột , glucogen , amylopectin ,
dextrin , panose , iso maltose và maltose thành glucose, mà không cần có sự tham gia cuả các
loại Enzyme khác. Glucoamylase thuỷ giải các polysaccharide có phân tử lớn nhanh hơn so
với các chất có phân tử nhỏ. Các polisaccharide có nhánh như amylopectin, glucogen, β-
dextrin bị glucoamylase thủy phân khá nhanh.
Đa số glucoamylase có hoạt lực cao nhất ở vùng có pH 3,5 – 5,5 và nhiệt độ 50
0
C . Nó
bền với acid hơn α-Amylase nhưng kém bền hơn trong rượu, acetone và không được bảo vệ
bởi Ca
2+
.
3.4. Oligo 1,6-glucosidase (dextrinase tới hạn) (EC 3.2.1.10)
Enzyme này có thể thuỷ phân liên kết α-1,6 – glucoside trong isomaltose , panose và
các dextrin tới hạn thành đường có thể lên men được. Enzyme này có ở VSV nhưng đồng thời
cũng có trong các hạt nảy mầm ( đại mạch, thóc nảy mầm ). Ngoài oligo–1,6–glucosidase, hệ
dextrinase của hạt ngũ cốc , hạt nảy mầm còn có amylopectin–1,6–glucosidase hay R–
Enzyme và dextrin–1,6–glucoside hay amylo–1,6–glucoside hay dextrin-6-

glucocanhydrolase. Hai loại Enzyme này đều thuỷ phân dextrin triệt để hơn α-Amylase và
β-Amylase do đó trong dung dịch thuỷ phân có nhiều maltose hơn .
Nhiệt độ tối thích cho các hoạt động của các dextrinase là 40
0
C và pH tối thích là 5,1.
Seminar Công nghệ Protein & Enzyme Trang 8
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
3.5. Enzyme pullulanase (α-dextrin6-glucosidase) (EC 3.2.1.41)
Enzyme này có thể thuỷ phân các liên kết α-1,6 của tinh bột, glucogen, pululan và các
dextrin tới hạn. Điều đáng chú ý là sự định vị của các liên kết α-1,6 có ảnh hưởng lớn đến tác
động của Enzyme. Đặc biệt là sự có mặt của hai liên kết α-1,4 nằm liền kề bên liên kết α-1,6
là điều kiện cần thiết cho Enzyme phân cắt liên kết này
Pullulanase phân giải các liên kết α-1,6 glucoside bị bao quanh tứ phía bởi các liên kết
α-1,4. Nó còn có khả năng thủy phân cả những dextrin phân tử thấp chỉ gồm có hai gốc
maltose nối nhau bằng liên kết α-1,6 glucoside. Tác dụng hiệp đồng của α-Amylase và
pullulanase làm nó bị thủy phân hoàn toàn.
3.6. α-glucosidase hay maltase (α-D,glucoside-glucohydrolase) (EC 3.2.1.20)
Nhiều loại nấm sợi sản sinh Enzyme này. Giống như glucomylase, nó thủy phân
maltose thành glucose nhưng không thủy phân tinh bột. Maltase và glucozyltranferase là một
Enzyme đồng nhất vừa có khả năng thủy phân liên kết α-1,4, trong các glucopiranoside vừa
có khả năng chuyển các gốc glucoside sang đường và rượu.
4. Cơ chất tác dụng
Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen:
 Tinh bột: là nhóm Carbohydrate ở thực vật có chủ yếu trong các loại củ (như khoai lang,
khoai tây, khoai mì… ), trong các hạt ngũ cốc, các loại hạt và có công thức tổng quát là
(C6H12O6)n.Tinh bột từ mọi nguồn khác nhau đều có cấu tạo từ amylase và amylopectin
(Meyer, 1940). Các loại tinh bột đều có 20-30% amylase và 70-80% amylopectin. Trong thực
vật, tinh bột được xem là chất dự trữ năng lượng quan trọng:
• Amylase có trọng lượng phân tử 50.000 – 160.000 Da, được cấu tạo từ 200-1000 phân
tử D-glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4-glucoside tạo thành một mạch xoắn dài

không phân nhánh.
• Amylopectin có trọng lượng phân tử 400.000 đến hàng chục triệu Da, được cấu tạo từ
600-6000 phân tử D-glucose, nối với nhau bởi liên kết α-1,4-glucoside và α-1,6-
glucoside tạo thành mạch có nhiều nhánh. Tinh bột không tan trong nước lạnh nhưng khi
hỗn hợp gồm nước và tinh bột bị đun nóng (60-850C) thì tinh bột sẽ bị hồ hóa và được
gọi là hồ tinh bột .
Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thủy phân do các liên kết glucoside bị
phân cắt. Sự thủy phân tinh bột bởi enzyme amylase xảy ra theo 2 mức độ: Dịch hóa và
Seminar Công nghệ Protein & Enzyme Trang 9
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
đường hóa. Kết quả của sự dịch hóa là tạo ra sản phẩm trung gian dextrin và khi dextrin tiếp
tục bị đường hóa thì sản phẩm là maltose và glucose. Cabohydrate trong thực phẩm là nguồn
cung cấp năng lượng quan trọng cho cơ thể con người. Rau và quả cũng là nguồn cung cấp
tinh bột và tinh bột này một phần đã được chuyển hóa thành disaccharide và glucose.
Carbohydrate có mặt trong hầu hết các loại thực phẩm nhưng nguồn cung cấp chủ yếu là
đường và tinh bột.
 Glycogen: là một loại Cabohydrate dự trữ. Ở động vật được dự trữ trong cơ thể động vật và
được cơ thể chuyển hóa để sử dụng từ từ. Amylase có vai trò quan trọng trong sự chuyển hóa
glucid ở tế bào động vật, vi sinh vật. Glucogen được cấu tạo từ các glucose liên kết với nhau
bởi liên kết α-1,4-glycoside ở các vị trí phân nhánh, glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,6-
glycoside. Glycogen có số mạch nhiều hơn tinh bột, phân tử lượng ở trong khoảng 2 - 3 triệu
Da. Glycogen dễ tan trong nước, nếu như chúng ta ăn quá nhiều Carbohydrate thì cơ thể
chúng ta sẽ chuyển hóa chúng thành chất béo dự trữ. Ở động vật và người, glycogen tập trung
chủ yếu ở trong gan.
II. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH AMYLASE
1. Đơn vị đo hoạt tính
Mục đích xác định hoạt tính Enzyme là xác định số đơn vị hoạt tính. Có một số
cách định nghĩa như sau:
1.1. Đơn vị Enzyme quốc tế (UI) do hiệp hội hóa sinh quốc tế (IUB) định nghĩa
Một đơn vị Enzyme là lượng Enzyme có khả năng xúc tác chuyển hóa được 1

micromol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn.
1U = 1µmol sản phẩm = 1µmol cơ chất (10
-6
mol)/phút
1.2. Đơn vị Katal
Năm 1979, hội đồng danh pháp của IUB khuyến cáo sử dụng đơn vị Katal làm đơn vị
cơ bản của hoạt tính Enzyme.
Một Katal là lượng Enzyme xúc tác chuyển hóa được 1mol cơ chất sau 1giây ở điều
kiện tiêu chuẩn.
1Kat = 1mol cơ chất/giây = 60 mol/phút = 60.10
6
µmol/phút = 6.10
7
U
Seminar Công nghệ Protein & Enzyme Trang 10
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
2. Hoạt tính riêng của Enzyme
- Hoạt tính riêng của 1 chế phẩm Enzyme đặc trưng cho độ thuần khiết của chế phẩm
Enzyme. Hoạt tính riêng được biểu thị bằng số đơn vị Enzyme/mg protein (U/mg protein
hoặc Kat/kg protein).
- Hoạt tính phân tử của Enzyme là số phân tử cơ chất được chuyển hóa bởi 1 phân tử
Enzyme sau 1 phút.
- Hoạt tính của trung tâm xúc tác Enzyme là số cơ chất được chuyển hóa trên 1 trung
tâm hoạt tínhng sau 1 phút.
 Hoạt tính xúc tác của Enzyme càng mạnh thì lượng cơ chất bị chuyển hóa hoặc lượng sản
phẩm phản ứng tạo thành trên 1 đơn vị thời gian càng lớn.
3. Phương pháp xác dịnh
Bằng cách xác định tốc độ chuyển hóa của cơ chất hoặc tốc độ tích lũy sản phẩm phản
ứng ta có thể đánh giá hoạt tính xúc tác của Enzyme. Có 3 nhóm phương pháp:
- Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong 1 thời gian

nhất định ứng với 1 nồng độ Enzyme nhất định.
- Đo thời gian cần thiết để thu được 1 lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản
phẩm ứng với 1 nồng độ Enzyme nhất định.
- Chọn nồng độ Enzyme như thế nào để trong 1 thời gian nhất định thu được sự biến
thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm.
* Có nhiều phương pháp xác định hoạt tính Enzyme. Nhưng khi so sánh chất lượng giữa
các chế phẩm với nhau thì phải dùng 1 phương pháp thống nhất.
3.1. Xác định hoạt tính Enzyme α-Amylase theo Rukhliadeva
Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi Enzyme α-Amylase có trong dịch
chế phẩm nghiên cứu với các dextrin có phân tử lượng khác nhau. Đo cường độ màu tạo
thành giữa tinh bột và các sản phẩm thủy phân của nó với iodine bằng máy so màu quang
điện sẽ tính được hoạt tính Enzyme.
Đơn vị hoạt tính Amylase là lượng Enzyme chuyển hóa được 1g tinh bột tan thành các
dextrin có phân tử lượng khác nhau ở 30
0
C trong thời gian 1 giờ.
3.2. Xác định hoạt tính Enzyme γ-Amylase (glucoAmylase)
Phương pháp vi lượng của V.Y.Rodzevich, O.P.Korenbiakina
Seminar Công nghệ Protein & Enzyme Trang 11
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi Enzyme glucoamylase có trong chế
phẩm nghiên cứu. Xác định lượng glucose tạo thành sẽ tính được hoạt tính Enzyme.
Đơn vị hoạt tính glucoamylase là lượng Enzyme tác dụng lên dung dịch tinh bột tan
pH= 4.7 ở nhiệt độ 30
0
C trong 1 giờ giải phóng được 1 mg glucose.
3.3. Phương pháp sử dụng Enzyme glucosidase
Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi Enzyme glucoAmylase có trong
dịch chế phẩm nghiên cứu. Xác định lượng glucose tạo thành qua phản ứng xúc tác đặc hiệu
của Enzyme glucosidase sẽ xác định được hoạt tính Enzyme.

Đơn vị hoạt tính glucoAmylase là lượng Enzyme tác dụng lên dung dịch tinh bột tan
pH = 4.7 ở nhiệt độ 30
0
C trong thời gian 1 phút giải phóng được 1 μmol glucose.
III. ĐIỀU KIỆN CẦN VÀ ĐỦ ĐỂ THU NHẬN ENZYME AMYLASE
1. Chủng giống vi sinh vật
Muốn nhận chế phẩm Amylase có hoạt tính cao, trước hết phải tuyển chọn, nghiên cứu
xem chủng, giống nào có khả năng tích tụ nhiều Amylase.
Khi đã tuyển chọn được giống tốt tức là đã có được điều kiện cần thiết để tạo ra chế
phẩm Amylase có hoạt tính cao. Nhưng giống tốt chỉ có tính chất tương đối với thời gian và
điều kiện nhất định nào đó. Ta cần tìm cách phân lập và tạo ra các giống mới có hoạt tính
ngày càng cao hơn bằng nhiều biện pháp khác nhau như lai tạo, gây đột biến, tách và cấy gen.
Bằng con đường kết hợp giữa etylenimin và tia tử ngoại Ghendina đã tạo được chủng
Asp.awamori 78 - 2 và Asp.awamori 22 có hoạt tính Amylase cao hơn 2-3 lần so với ban đầu.
2. Môi trường dinh dưỡng:
Trong sản xuất chế phẩm Amylase theo phương pháp nuôi cấy bề mặt trên canh trường
rắn người ta hay dùng nhất là cám lúa mì. Đây là môi trường tự nhiên tốt nhất để sinh tổng
hợp Amylase.
Cám lúa mì thường chứa khoảng 20-30% tinh bột, 10-12% protit. Ngoài ra còn chứa
muối khoáng, các nguyên tố vi lượng, vitamin
Để tiết kiệm cám người ta còn trộn thêm các nguyên liệu khác vào môi trường như
trấu, mùn cưa, bã khoai tây, bã bia
Ở nước ta do không có cám lúa mì nên trong sản xuất người ta hay dùng nhất là bột
ngô vàng, cám gạo và trấu đem trộn lẫn với nhau.
Seminar Công nghệ Protein & Enzyme Trang 12
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
Thành phần tối ưu để thu được chế phẩm Amylase có hoạt tính cao từ Asp.awamori là
cám 75% (hàm lượng tinh bột 29%), bột ngô 6% (hàm lượng tinh bột 55%) và 19% trấu. Hàm
lượng tinh bột chung là 25%. Điều kiện tối ưu khi nuôi cấy là: t
o

32
O
C, độ ẩm 57% và nuôi
trong 42 giờ.
Ngoài tinh bột, môi trường cần chứa maltose và dextrin. Sự có mặt của glucose,
fructose và saccarose có tác dụng giúp cho sự phát triển của nấm mốc nhưng lại hạn chế sự
tích tụ Amylase. Ngược lại khi thêm lactose và MgO vào môi trường lỏng thì nấm mốc phát
triển kém nhưng lại tạo nhiều Amylase.
Ngoài gluxit, để tổng hợp Enzyme, vi sinh vật nói chung và nấm mốc nói riêng đều
cần đến chất chứa nitơ. Tốt nhất là nguồn đạm vô cơ vì:
+ Nguồn nitơ có thể có sẵn trong cám, bột ngô, khi cần thiết có thể bổ sung thêm từ
khô lạc, khô đậu tương hoặc từ các muối amin hoặc ure. Khi đó lượng Enzyme được tổng hợp
nhiều hơn.
Ví dụ: Theo kết quả nghiên cứu của giáo sư Phenicxôva, nấm mốc Asp.awamori có thể
phát triển tốt trong môi trường chứa 0,05% đạm vô cơ nhưng để tạo α-Amylose thì cần tăng
nồng độ tới 0,15%, để tạo glucoamylase cần tăng tới 0,4%.
+ Nguồn đạm hữu cơ cũng có tác dụng tốt đến sinh trưởng và phát triển của nấm mốc
nhưng ít có hiệu quả về phương diện tích tụ Enzyme.
Ví dụ: Khi bổ sung gelatin casein và ngay cả cao ngô vào canh trường thì việc tích tụ
Enzyme vẫn thua kém so với nguồn đạm vô cơ. Ngược lại, nếu ta thêm mầm, rễ của hạt ươm
mầm vào canh trường lại có tác dụng tốt đến tích tụ Enzyme.
Sự tạo thành và tích tụ Amylase còn gắn với sự có mặt của các ion Mg
2+
, Ca
2+
và
photpho, đặc biệt là magie. Trong môi trường thiếu Mg
2+
, Amylase hầu như không được tạo
thành, hàm lượng chỉ vào khoảng 0,05%. Sau Mg

2+
là photpho, ion P đóng vai trò quan trọng
trong việc tạo thành acid nucleic. Hàm lượng của muối KH
2
PO
4
vào khoảng 0,1 - 0,2%.
Canxi có trong thành phần của α-Amylase. Tính chịu nhiệt của Enzyme này phụ thuộc
số ion canxi có trong phân tử.
Lưu huỳnh cũng đóng vai trò quan trọng không kém. Hoạt tính Amylase gắn liền với
sự có mặt của nhóm –SH. Hàm lượng lưu huỳnh trong canh trường chứa 0,04g/100ml đảm
bảo cho hoạt tính Amylase đạt cực đại và bằng 360 đv/100ml. Nếu giảm tới 0,004% hoạt tính
Amylase của Asp.orysee chỉ còn 50% và bằng 180 đv/100ml.
Seminar Công nghệ Protein & Enzyme Trang 13
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
Bảng 1. Hoạt tính của một số chủng nuôi trên môi trường cám lúa mì theo phương pháp
bề mặt
Chủng Vi sinh vật
Hoạt tính dv/g chất khô
Hoạt tính
Amylase
Hoạt tính D Hoạt tính
Glu
Hoạt tính
Pr
Asp.oryae KC 70.0 450.0 30.0 50.0
Asp.oryae U476 85.0 665.0 80.0 40.0
Asp.niger S4-10-
111
0.65 437.0 70.0 0.5

Asp.awamori 14.5 850.0 30.0 0
3. Điều kiện nuôi cấy
Chủng giống và môi trường nuôi cấy là tiền đề quan trọng, bên cạnh đó ta còn phải chú
ý đến những điều kiện tối ưu cho nấm mốc phát triển và tích tụ Enzyme. Bao gồm:
3.1. Nhiệt độ
Duy trì và ổn định nhiệt độ canh trường bằng cách quạt không khí lạnh và ẩm vào canh
trường. Nếu nuôi cấy trong môi trường lỏng thì cần làm lạnh đồng thời kết hợp với sục khí.
Nhiệt độ không khí trước khi đưa vào phòng nuôi phải vào khoảng 22-25
0
C, còn độ ẩm
tương đối của không khí là 98-100%.
3.2. Độ ẩm canh trường
Trong điều kiện vô trùng ở phòng thí nghiệm, độ ẩm tối ưu để nấm mốc phát triển nằm
trong giới hạn 65-70%.
Trong thực tế sản xuất, mức độ vô trùng không thể đạt được như trong phòng thí
nghiệm vì vậy nên thường nuôi cấy trong canh trường có độ ẩm thấp hơn, nhằm hạn chế sự
Seminar Công nghệ Protein & Enzyme Trang 14
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
phát triển của tạp khuẩn.Tùy theo điều kiện trang thiết bị ở mỗi nơi mà độ ẩm có thể khống
chế ở 50- 60%.
Độ ẩm canh trường thấp thì hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn, nhưng nấm mốc
cũng phát triển chậm dẫn đến tích tụ Enzyme ít và phải kéo dài thời gian. Do đó phải thực
hiện tốt công việc vệ sinh.
3.3. pH môi trường
pH ít ảnh hưởng tới sinh trưởng và phát triển của nấm mốc, thường pH tự nhiên của
môi trường vào khoảng 5,5-6,0. Nhưng lại có ảnh hưởng nhiều tới tích tụ Enzyme, nên cần
sử dụng acid hoặc amoniac để điều chỉnh, giữ cho pH luôn trong giới hạn tối ưu.
pH thấp thì hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn nhưng sẽ ảnh hưởng tới tích tụ
Enzyme.
3.4. Cung cấp oxy

Oxy rất cần cho sự phát triển và tích tụ Enzyme. Nếu thiếu oxy xảy ra hô hấp yếm khí,
ảnh hưởng đến sự tích tụ oxy. Cần phải tạo môi trường thích hợp cho sự hấp thu oxy.
Ví dụ: Đối với môi trường rắn, nấm mốc dễ dàng tiếp xúc với oxy của không khí qua
sợi nấm và mixen. Vì thế canh trường phải xốp, giúp cho nấm mốc tạo nhiều sợi và tích tụ
Enzyme, tránh làm môi trường dính bẹp.
Trong môi trường lỏng có những khác biệt. Trong canh trường lỏng tế bào nấm mốc
phân tán trong dịch thể, sự tiếp xúc của chúng với oxy phải thông qua canh trường , vì vậy
khuấy và sục khí là biện pháp tốt để oxy có thể hòa tan vào dung dịch.dùng phổ biến nhất.
IV. THU NHẬN ENZYME AMYLASE:
1. Nguồn thu nhận:
- Để thu nhận Amylase người ta thường dùng các giống nấm sợi Aspergillus (Asp.
oryzae, Asp. niger, Asp. usamii, Asp. awamo-ri, Asp. batatae) và Rhizopus (Rh. delemar, Rh.
lonnesis, Rh. neveus, Rh. joponicum, Rh. fokinesis, Rh. lopninen-sis).
- Nấm men và giả nấm men thuộc giống Candida, Saccharomyces, Endomycopsis,
Endomyces cũng tạo Amylase. Đặc biệt người ta đã tuyển chọn được giống Endomycopsis
specise 20-9 có khả năng tổng hợp mạnh mẽ glucoAmylase.
- Nhiều vi khuẩn cũng có khả năng tạo một lượng lớn Amylase như: Bac.polymyxa,
Bac.cassavanum, Phytomonas destructans, Clostridium acetobutulicum, Pseudomanas
Seminar Công nghệ Protein & Enzyme Trang 15
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
saccharophila,…Các vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng tăng trưởng nhanh (4-6 lần vi khuẩn ưa
ẩm), đặc biệt là Bac.circulans được phân lập từ đất sinh trưởng tốt ở 65-70
o
C và tạo Amylase
mạnh nhất ở 50
o
C. Trong số các vi khuẩn ưa ẩm tạo Amylase mạnh, thì Bac.subtilis được
nghiên cứu nhiều hơn cả và được sử dụng rộng rãi nhất. Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của
Bac.subtilis là ở 37
o

C.
- Trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loài có khả năng tổng hợp Amylase mạnh mẽ, tuy
nhiên, cũng có một số, chẳng hạn như xạ khuẩn ưa nhiệt.
Trong công nghiệp, các biến chủng được tạo bằng cách gây đột biến là những chủng hoạt
tínhng rất có khả năng sinh tổng hợp nhiều Amylase. Đáng chú ý là những biến chủng của
nấm mốc : Asp.niger S, Asp.niger S-4, Asp.niger S-4-10, Asp.usamii 3758-45, Asp.batatae
217-61, Asp.awamori 78-2, …
Hình 4. Quy trình công nghệ chung
Seminar Công nghệ Protein & Enzyme Trang 16
Chuẩn bị môi trường
Phá vỡ tế bào
N
u
Enzyme ngoại bào
Enzyme nội bào
Lọc hoặc ly
tâm
Enzyme thô
Cô đặc
Enzyme tinh
khiết
Sấy
Tinh chế
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
2. Giải thích quy trình
2.1. Nuôi cấy vi sinh vật giống
- Muốn thu nhận các Enzyme Amylase với hiệu suất cao cần phải tiến hành phân
lập và chọn giống vi sinh vật để tuyển lấy những chủng hoạt tínhng mạnh, đồng thời phải tiến
hành lựa chọn cơ chất cảm ứng và thành phần môi trường tối thích cũng như tiêu chuẩn hoá
các điều kiện nuôi. Như vậy sự tổng hợp Enzyme Amylase không những phụ thuộc vào tính

chất di truyền của vi sinh vật mà còn phụ thuộc vào việc tuyển chọn các điều kiện nuôi đặc
hiệu.
- Ngoài các yếu tố hoá học (thành phần môi trường) ra, thì các điều kiện lý hoá của
quá trình nuôi cấy cũng có một ý nghĩa rất lớn đối với sinh tổng hợp Enzyme Amylase. Trong
các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp các Enzyme Amylase trong quá trình nuôi vi sinh vật
thì thành phần môi trường, tính chất cơ lý của môi trường, độ tiệt trùng, độ ẩm ban đầu, độ
thoáng khí, nhiệt độ nuôi và pH môi trường… là những yếu tố cơ bản tối quan trọng.
a. Nuôi vi sinh vật tạo Amylase bằng phương pháp bề mặt:
- Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển
trên bề mặt môi trường. Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt là:
+ Nuôi cấy bề mặt rất dễ thực hiện. Quy trình công nghệ không phức tạp.
+ Lượng Enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với
nuôi cấy chìm. Đây là đặc điểm ưu việt rất quan trọng trong giải thích tại sao phương pháp
nuôi cấy bề mặt hiện nay lại phát triển mạnh.
+ Chế phẩm Enzyme thô (bao gồm thành phần môi trường sinh khối vi sinh vật,
Enzyme và nước). Sau khi thu nhận sẽ rất dễ sấy khô và dễ bảo quản.
+ Nuôi cấy bề mặt không cần nhiều sử dụng các thiết bị phức tạp, do vậy mà việc
vận hành công nghệ cả việc đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn kém.
+ Trường hợp nhiễm các vi sinh vật lạ, ta thường dễ dàng xử lý. Môi trường đăc là
môi trường tĩnh, không bị xáo trộn nên khi khu vực nào bị nhiễm ta chỉ loại bỏ khu vực đó ra
khỏi khối nuôi cấy. Khu vực khác sẽ hoàn toàn được an toàn.
- Nhược điểm lớn nhất và dễ nhận thấy nhất đó là: phương pháp này tốn khá lớn diện tích
nuôi cấy. Phương pháp này vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường (môi trường lỏng hay
môi trường đặc) nên rất cần diện tích lớn.
 Yêu cầu đối với môi trường thành phần dinh dưỡng
• Yêu cầu cơ bản đối với thành phần của môi trường nuôi vi sinh vật tạo Amylase cũng giống
như yêu cầu đối với môi trường nuôi vi sinh vật tạo Enzyme khác.
Seminar Công nghệ Protein & Enzyme Trang 17
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
• Cấu tử chính của môi trường vi sinh vật tạo Amylase bằng phương pháp lên men bề mặt là

cám mì, cám gạo. Cám mì, cám gạo là nguyên liệu hoàn hảo và có thể là một cấu tử duy nhất
của môi trường để nuôi vi sinh vật không cần bổ sung thêm các chất khác nữa.
• Cám mì có 16-22% tinh bột, 10-12% protein, trong đó các amino acid quan trọng như
methionine (0.19%), cystine (0.3%), arginine (1%), lysine (6%), tryptophan (0.3%), 3- 4%
chất béo, 10.3% celulose, các nguyên tố trơ (Na-0.09% , K-1% , Ca-0.16% , P-0.94% ) và các
nguyên tố vi lượng cùng các chất khác. Cám gạo có khoảng 20% tinh bột, 10-15% chất béo,
10-14% protein, 8-16% celulose, các chất hoà tan không chứa nitơ (37-5 9 %).
• Chất lượng của cám gạo, cám mì có ảnh hưởng lớn tới hoạt tính của Enzyme. Cám không
được chứa tinh bột dưới 20-30%. Nên dùng cám tốt, cám mới không có vị chua hay vị đắng,
không hôi mùi mốc. Độ ẩm của cám không quá 15%, tạp chất độc không quá 0.05%.
 Độ ẩm tối thích cuả môi trường
• Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối thích của môi trường là 58-60% và phải giữ cho
môi trường có độ ẩm đó trong suốt quá trình nuôi. Độ ẩm mà tăng quá 55-70% sẽ làm giảm
độ thoáng khí, còn thấp hơn 50-55% thì kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật
cũng như sự tạo Enzyme Amylase.
Bảng 2: Ảnh hưởng của việc giữ độ ẩm trong quá trình sinh trưởng tới sự tạo α-
Amylase của Asp.Ozyrae nuôi bằng phương pháp bề mặt
Phương án thí
Nghiệm
20 giờ 34 giờ 42 giờ
Độ
ẩm
%
Hoạt tính của
Amylase dv/g
Canh trường khô
Độ
ẩm
%
Hoạt tính của

Amylase dv/g
Canh trường khô
Độ
ẩm
%
Hoạt tính của
Amylase dv/g
Canh trường khô
Khay để hở
27.
8
15.0 23.8 18.0 22.0 20.5
Khay đậy nắp
26.
4
20.4 42.4 32.9 42.4 36.7
 Nhiệt độ nuôi :
• Thời kỳ trương và nảy mầm của bào tử đính (đối với nấm mốc 10-11 giờ đầu tiên, đối với vi
khuẩn 3-4 giờ). Trong thời kỳ này phải đốt nóng không khí phòng nuôi và giữ cho nhiệt độ
phòng nuôi không thấp hơn 23-30
0
C đối với nấm mốc và duy trì nhiệt độ 32-38
0
C cho vi
khuẩn. Độ ẩm tương đối của không khí là 96-100% .
• Thời kỳ sinh trưởng nhanh của hệ sợi (kéo dài trong vòng 4-18 giờ). Ở giai đoạn này nấm
mốc hô hấp rất mạnh và tạo ra một lượng nhiệt sinh lý rất lớn. Kết quả là trong lớp sợi nấm
Seminar Công nghệ Protein & Enzyme Trang 18
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
đang mọc nhiệt độ tăng lên đến 37-40

0
C , đôi khi cao hơn tới 47
0
C. Vì vậy cần phải hạ nhiệt
độ phòng nuôi giúp cho sợi nấm mọc đều và đẹp. Ở nhà máy người ta thổi không khí vô trùng
có nhiệt độ 28-29
0
C và độ ẩm cao vào phòng nuôi.
• Thời kỳ tạo Enzyme Amylase mạnh mẽ (kéo dài từ 10-20 giờ). Trong thời kỳ này các quá
trình trao đổi chất dần dần yếu đi, sự toả nhiệt giảm mạnh. Các Enzyme Amylase được tổng
hợp mạnh mẽ. Đối với đa số vi sinh vật ở giai đoạn này nên hạ nhiệt độ xuống 3-4
0
C so với
giai đoạn đầu. Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng của đa số nấm mốc trên môi trường rắn là
28-30
0
C , cho Bac.subtilis là 35– 37
0
C.
• Thời gian nuôi để có được lượng Amylase cực lớn thường được xác định bằng thực nghiệm.
Sự tạo bào tử là một hiện tượng không mong muốn vì thường làm giảm hoạt tính của
Enzyme. Đối với đa số nấm mốc Aspergillus, sự tạo Amylase cực đại thường kết thúc khi
nấm mốc bắt đầu sinh đính bào tử. Trong điều kiện sản xuất thoáng khí tốt thì thời gian nuôi
để có thể tích lũy lượng Amylase cực đại đối với từng loại nấm mốc và vi khuẩn như sau:
b. Nuôi vi sinh vật tạo Amylase bằng phương pháp bề sâu
 Môi trường dinh dưỡng
• Đặc điểm chung cho mọi môi trường nuôi vi sinh vật tạo Enzyme Amylase là có chất cảm
ứng: tinh bột, dextrin hay maltose. Nguồn nitơ dinh dưỡng thường dùng là nitơ vô
cơ (NaNO
3

).
• Đối với sinh trưởng của một số nấm sợi tạo maltase và oligo-1,6-glucoamylase hoạt tính lại
rất cần có sự có mặt của Mg trong môi trường. Để tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển tốt
và sinh nhiều Amylase người ta cho thêm vào môi trường các loại nước chiết như nước chiết
mầm mạch, nước chiết ngô, nước chiết đậu nành.
 Sục khí và khuấy trộn :
• Phần lớn vi sinh vật tạo Amylase là những vi sinh vật hiếu khí. Vì vậy sinh trưởng của chúng
phụ thuộc vào lượng oxy phân tử hoà tan trong dịch nuôi cấy.
• Việc sục khí và khuấy đảo môi trường có tác dụng tốt tới quá trình sinh trưởng và tích luỹ
sinh khối cũng như sinh tổng hợp các Enzyme của vi sinh vật. Việc khuấy đảo có thể tiến
hành bằng các cách:
 Sục không khí vô trùng vào thiết bị nuôi.
 Bằng máy móc chuyên dùng.
 Bằng tác dụng hiệp đồng của cả sục khí lẫn máy khuấy.
 Bằng tác dụng của các khí sinh ra khi lên men.
Seminar Công nghệ Protein & Enzyme Trang 19
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
• Đối với nấm sợi, chế độ sục khí thích hợp là 10-12m
3
không khí vô trùng trên 1m
3
môi trường
trong 1 giờ với thời gian nuôi trong khoảng 68-72 giờ.
Bảng 3. Nhiệt độ và pH của một số Enzyme Amylase do vi sinh vật tổng hợp
Vi sinh vật Enzyme pH
opt
T
opt
Asp.Awamori
α-Amylase 4,5-6,2 40

β-Amylase 3,5-7,0 50
GlucoAmylase 4,5-4,7 55-75
Asp.Niger
α-Amylase 4,7- 6,0 65
GlucoAmylase 3,8 50
Asp.Asami
α-Amylase 3,8 50
GlucoAmylase 5,0 55
Asp.Oryzae
α-Amylase 5,5-5,9 50-57
β-Amylase 4,8 30
GlucoAmylase 4,8 50
Bac.amyloliquefacien
s
α-Amylase 5,7-6,0 55-60
Bac.diastaticus α-Amylase 5,8 70
Bac.subtilis α-Amylase 4,6-5,1 37
Endomyces sp GlucoAmylase 4,8 55
Phizopase doleamar GlucoAmylase 5,5 45
2.2. Thu dịch Enzyme
a. Đối với Enzyme nội bào nuôi bằng phương pháp bề mặt
• Giải phóng Enzyme bằng cách phá vỡ tế bào bằng nhiều cách như:
 Nghiền nhỏ với cát, thủy tinh.
 Để tế bào tự phân hủy.
 Dùng tác dụng của siêu âm hoặc tạo áp suất thẩm thấu cao, trích ly bằng dung dịch muối
trung tính, dung môi hữu cơ.
 Kết tủa Enzyme bằng các chất điện ly thích hợp.
b. Đối với Enzyme ngoại bào nuôi theo phương pháp chìm
• Tách sinh khối và bã bằng cách lọc li tâm, lọc ép có sử dụng tác nhân trợ lọc (diatomit, đất
hoạt tính) hoặc các tác nhân trợ kết tủa (CaCl

2
+ (NH
4
)
2
SO
4
CaSO
4
, lắng cặn kéo theo sinh
khối giúp lọc dễ hơn).
2.3. Cô đặc thu chế phẩm Enzyme thô
 Chế phẩm Enzyme thô chưa được tinh chế có thể chứa 1 vài loại Enzyme chủ yếu, một số loại
protein không phải Enzyme, các chất ổn định và các tạp chất khác. Dịch Enzyme thu được
Seminar Công nghệ Protein & Enzyme Trang 20
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
thường có nồng độ chất khô thấp 4-6 g/l, bước đầu cần cô đặc chân không ở nhiệt độ 35
0
C
đến nồng độ 15-20 g/l rồi tiếp tục xử lý như sau :
- Tiếp tục cô đặc chân không ở nhiệt độ 40-45
0
C để đạt nồng độ chất khô 30-35 g/l,
bổ sung thêm chất bảo quản như NaCl, glycerin, sorbitol, benzoat…ta sẽ thu được
Enzyme thô ở dạng có thể bảo quản ở nhiệt độ thường được 1-2 năm.
- Bổ sung thêm các chất ổn định để đạt nồng độ chất khô 30-40 g/l rồi sấy phun ở
nhiệt độ 120
0
C, chế phẩm kỹ thuật thu được ở dạng bột.
- Kết tủa Enzyme bằng các dung môi thích hợp như: dung môi hữu cơ (ethanol,

izopropanol, aceton) hoặc muối trung tính phổ biến nhất là (NH
4
)
2
SO
4
. Sau khi li
tâm tách kết tủa có thể trộn thêm các chất ổn định rồi sấy khô và nghiền mịn để thu
được chế phẩm dạng bột.
Hình 5. Máy cô đặc chân không
2.4. Thu chế phẩm Enzyme tinh khiết
a. Tinh chế Enzyme :
- Hòa tan Enzyme thô dạng bột vào nước hoặc dung dịch muối CaCl
2
ở nồng độ
thích hợp hoặc dung dịch đệm, kết tủa trở lại bằng ethanol, aceton hay (NH
4
)
2
SO
4
.
Quá trình này cần tiến hành nhanh chóng ở nhiệt độ thấp để tránh sự vô hoạt
Seminar Công nghệ Protein & Enzyme Trang 21
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
Enzyme. Sau khi kết tủa các muối vô cơ được loại đi bằng phương pháp thẩm tích,
thẩm thấu ngược hoặc lọc gel.
- Tách Enzyme bằng phương pháp hấp phụ chọn lọc: cho dịch Enzyme chảy từ từ
qua cột chất hấp phụ (thường là oxit nhôm, silicagel) các Enzyme khác nhau sẽ
được hấp phụ với khả năng khác nhau, sau đó dùng các dung dịch đệm thích hợp

để chiết rút Enzyme ra khỏi cột.
- Tách Enzyme bằng phương pháp trao đổi ion: dựa vào sự trao đổi ion giữa Enzyme
có điện tích trái dấu với các ion của chất nhựa. Sau khi cột đã no, cho dung dịch
rửa (dung dịch chất điện giải) có nồng độ tăng dần chảy qua cột để đẩy ra khỏi
nhựa các Enzyme vừa liên kết với chúng. Khi đó Enzyme nào có áp lực liên kết với
nhựa kém nhất sẽ bị đẩy ra khỏi cột nhựa trước. Như vậy các Enzyme khác nhau sẽ
được chiết ra khỏi cột theo từng phần khác nhau trong đó chứa phần chiết có
Enzyme cần thu với nồng độ cao nhất.
b. Sấy khô thu Enzyme tinh khiết :
Sau khi làm sạch cần sấy khô chân không ở nhiệt độ thấp hoặc sấy thăng hoa,
thu Enzyme tinh khiết có hoạt tính cao hơn nhiều lần so với chế phẩm Enzyme thô.
V. THU NHẬN ENZYME AMYLASE TỪ ASPERGILLUS ORYZAE
1. Giới thiệu về chủng nấm mốc Aspergillus Oryzae:
Asp.oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp Ascomycetes (nang
khuẩn). Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang 5-
7 µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang, chia sợi thành nhiều bao tế bào (nấm đa bào).
Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi đứng thằng gọi là cuống đính bào tử, ở đó
có cơ quan sinh sản vô tính. Cuống đính bào tử của Asp.oryzae thường dài 1-2 mm nên có thể
nhìn thấy bằng mắt thường. Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng. Từ bọng này
phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là những tế bào hình chai. Đầu các tế bào
hình chai phân chia thành những bào tử đính vào nhau, nên gọi là đính bào tử. Đính bào tử
của Asp.oryzae có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau…
Seminar Công nghệ Protein & Enzyme Trang 22
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
Hình 6. Nấm mốc Aspergillus Oryzae
Đặc điểm của giống Asp.oryzae: giàu các Enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào
(Amylase, protease, pectinasa,…). Ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các
thùng chứa đựng bột, gạo… đã hết nhưng không được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lỏi
ngô, ở bã sắn… Chúng mọc và phát triển có khi thành lớp mốc, có màu sắc đen ,vàng…, do
các bào tử già có màu sắc. Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và phát tán khắp nơi, khi gặp

điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới.
 Chọn giống nấm mốc Aspergillus oryzae có các ưu điểm sau:
- Không sinh tổng hợp độc tố.
- Khả năng sinh tổng hợp sản phẩm chính cao.
- Khả năng thích nghi nhanh và tốc độ sinh trưởng mạnh.
- Điều kiện nuôi cấy: đơn giản.
- Môi trường nuôi cấy: rẻ tiền, dễ tìm.
- Dễ dàng tách được khỏi môi trường nuôi cấy lỏng để thu nhận enzyme ngoại bào.
Seminar Công nghệ Protein & Enzyme Trang 23
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
2. Quy trình len men và thu nhận Amylase theo phương pháp lên men bề mặt:
2.1. Quy mô phòng thí nghiệm:
Hình 6. Quy trình thu nhận amylase trong phòng thí nghiệm
2.2. Quy mô công nghiệp :
Seminar Công nghệ Protein & Enzyme Trang 24
Nguyên liệu
Xử lý nguyên liệu
GiốngVi sinh vật
Hấp thanh trùng
Nhân giống
Làm nguội
Trộn giống VSV
Giống cho sản xuất
Nuôi cấy
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
Hình 7. Quy trình sản xuất Amylase trên quy mô công nghiệp
2.3. Nhân giống vi sinh vật
Giống sản xuất thường được bảo quản để tránh giảm hoạt tính. Do đó, việc cấy giống
trên môi trường thạch nghiêng trước khi nhân giống là việc làm rất cần thiết. Có thể coi đây là
việc “đánh thức” chủng giống, đồng thời để kiểm tra hoạt tính của giống sau một thời gian

bảo quản ở nhiệt độ thấp. Từ những những tế bào hoặc bào tử riêng rẽ của chủng bảo quản,
cấy ra một số canh trường, những canh trường này được nhân giống trong phòng thí nghiệm
và được kiểm tra hoạt tính. Nếu có sự khác nhau thì dùng canh trường có hoạt tính mạnh nhất
để gây nguyên liệu cấy và tạo thành chủng mới.
a. Môi trường nhân giống
- 3% saccharose
- 0.3% NaNO3
Seminar Công nghệ Protein & Enzyme Trang 25
Thu nhận phế phẩm
Enzyme thô
Lọc
Nghiền mịn Sấy
Trích ly
Lọc
Bã
Cồn hoặc Sulfat
amon
Kết tủa Enzyme
Sấy kết tủa
Thu nhận kết
tủa
chế phẩm Enzyme
bán tinh khiết
Hoà tan trong
dịch đệm
Tách rửaSắc ký trao đổi
ion
Chế phẩm Enzyme
tinh khiết
Siêu lọc Thu Enzyme Sấy khô