công nghệ chế biến sữa và đồ uống

Công nghệ chế biến sữa và ñồ uống
1

Phần 1: GIỚI THIỆU CHUNG




1. ðỊNH NGHĨA VỀ PROBIOTIC:

Probiotic ñược ñịnh nghĩa khác nhau bởi nhiều nhà nghiên cứu. ðịnh nghĩa về
probiotic ñang ñược thay ñổi cùng với sự gia tăng kiến thức về chức năng của
probiotic. Probiotic ñược ñịnh nghĩa là một canh trường vi sinh vật còn sống ñược phát
triển trong miệng và sống sót khi di chuyển tới ruột già, nơi chúng ñịnh cư (Frost và
Sullivan, 2000; Saarela và cộng sự, 2000; Matilla-Sandholm và cộng sự, 2002; Betoret
và cộng sự, 2003). Schrezenmeir và de Vrese (2001) ñịnh nghĩa thuật ngữ probiotic
như là một chế phẩm chứa những vi sinh vật xác ñịnh còn sống với số lượng lớn có
khả năng thay thế vi sinh vật ñường ruột bằng cách ñịnh cư trong ruột của vật chủ và
ảnh hưởng có lợi ñến sức khỏe vật chủ. FAO/WHO, 2001, chấp nhận ñịnh nghĩa về
probiotic như sau: “vi sinh vật còn sống tồn tại với số lượng vừa ñủ và ảnh hưởng tốt
ñến sức khỏe của vật chủ” (Leahy và cộng sự, 2005).
Thực phẩm probiotic trở nên phổ biến nhờ vào ảnh hưởng tốt của chúng tới sức
khỏe con người (Desmond và cộng sự, 2002). Trong liệu pháp probiotic, những vi sinh
vật có lợi này ñược ñưa vào cơ thể qua ñường tiêu hóa và do ñó trở thành vi sinh vật
ñường ruột. ðiều này dẫn tới kết quả là một số lượng lớn vi khuẩn có lợi ñã ñược
khám phá và hạn chế những vi khuẩn gây hại (Mombelli và Gismondo, 2000).
Ảnh hưởng có lợi của những vi khuẩn probiotic có ñược là do những vi sinh vật này
bám chặt vào lớp biểu mô ruột (Sanminen và cộng sự, 1998). Sự hiện diện và bám chặt
của probiotic vào lớp niêm mạc của thành ruột ñã tạo nên một rào chắn sinh học tự
nhiên mạnh chống lại những vi khuẩn gây bệnh (Chen và Yao, 2002). Sự bám dính do
ñó là bước ñầu tiên ñể ñịnh cư của chúng. Sự bám dính vào lớp biểu mô ruột rất rõ

ràng bao gồm sự bám dính của vi khuẩn và phân tử nhận trên tế bào biểu mô hay
không rõ ràng dựa trên những nhân tố hóa lý. Có nhiều giống vi khuẩn lactic có nguốc
gốc từ sữa và cả từ người có khả năng bám dính hiệu quả vào tế bào người (Samninen
và cộng sự, 1998).
Một loài vi sinh vật xác ñịnh phải hội ñủ những ñặc ñiểm nhất ñịnh ñể ñược xem là
một probiotic. Những ñặc ñiểm này phụ thuộc vào mục ñích sử dụng cũng như vị trí
mà tại ñó những ñặc tính xác ñịnh ñược biểu thị. Những ñặc ñiểm quan trọng nhất của
probiotic bao gồm (Havenaar và Huis int’Veld, 1992):
− Sự sống sót của chúng trong ñiều kiện môi trường tại nơi chúng hoạt ñộng.
− Sự sinh sôi và/hoặc sự ñịnh cư của chúng tại nơi hoạt ñộng.
− Không có phản ứng miễn dịch chống lại probiotic từ cơ thể vật chủ.
− Không gây bệnh, không ñộc, không gây dị ứng, không gây ñột biến hoặc các phản
ứng gây ung thư sinh ra bởi bản thân giống probiotic, sản phẩm lên men hay do thành
phần tế bào sau khi chết của tế bào.

Quá trình lên men sản xuất Probiotic Lactobacilli

2

2. PHÂN BIỆT PROBIOTIC, PREBIOTIC VÀ SYNBIOTIC:

Thông tin về probiotic ñã ñược chúng tôi cung cấp trên ñây. Tuy nhiên cũng có
những thuật ngữ khác dễ gây nhầm lẫn ñó là prebiotic và symbiotic, sẽ ñược trình bày
bên dưới.

2.1. Prebiotic:

Prebiotic là những thành phần trong thức ăn không tiêu hóa ñược nhưng lại có ảnh
hưởng tốt tới con người bằng cách kích thích chọn lọc sự phát triển và/hoặc hoạt tính
của một hay một số lượng giới hạn vi sinh vật nào ñó trong ruột kết (Roberfroid, 1998;

Theuer và cộng sự, 1998; Young, 1998; Fermia và cộng sự, 2002). Chúng làm thay ñổi
hệ vi sinh vật trong ruột, tạo ñiều kiện thuận lợi cho sự phát triển của những vi khuẩn
có khả năng tăng cường sức khỏe cho con người, ñặc biệt là Lactobacilli và
Bifidobacteria, sao cho những vi khuẩn này chiếm ưu thế về số lượng (Roberfroid,
1998). ðiều này dẫn tới làm tăng cả số lượng vi khuẩn nội sinh trên trong phân
(Fermia và cộng sự, 2002; Losada và Olleros, 2002). Prebiotic cũng ñiều hòa quá trình
trao ñổi lipid thông qua quá trình lên men. Sự kích thích chọn lọc sự phát triển của
Bifidobacteria bởi prebiotic ñược cho thấy sự giảm ñáng kể số lượng vi khuẩn có nguy
cơ gây bệnh cho cơ thể (Losada và Olleros, 2002).
Carbohydrate ñược sử dụng ñể tăng sự phát triển của những vi khuẩn có lợi. Những
carbohydrate làm tăng sự phát triển của những vi khuẩn lactic ñược gọi là bifidogenic
oligosaccharide (Farmer, 2002). Bifidogenic oligosaccharide chứa
fructooligosaccharide (FOS) (inulin), glucooligosaccharide (GOS), những
oligosaccharide mạch dài của fructose và/hoặc glucose và trisaccharide, raffinose.
Chúng không dễ ñược tiêu hóa bởi những vi khuẩn gây bệnh (Annika và cộng sự,
2002; Farmer, 2002; Fermia và cộng sự, 2002).
Những carbohydrate không tiêu hóa ñược tìm thấy trong nhiều loại trái cây, rau
(artichoke, tỏi, tỏi tây và hành) và ngũ cốc (Fermia và cộng sự, 2002; Losada và
Olleros, 2002). Chúng là một hỗn hợp các chuỗi ñường hình thành bởi các phân tử
glucose và fructose. Sử dụng thực phẩm chứa prebiotic oligosaccharide vận chưa ñủ ñể
hoàn thiện hệ vi sinh vật ñường ruột và chúng chỉ chiếm một thành phần nhỏ trong
những thực phẩm trên. Thay vào ñó, prebiotic ñược khai thác từ những thực phẩm này
và ñược cho vào những thực phẩm thông thường dễ dàng ñược tiêu hóa hơn như bánh
biscuit hay những thực phẩm có nguồn gốc từ những carbohydrate khác (Taylor và
cộng sự, 1999). Những thành phần tự nhiên này có thể ñược sản xuất rẻ tiền hơn bằng
cách sử dụng enzyme β-D-fructofuranosidase hay fructosyltransferase ñể bổ sung thêm
các phân tử fructose theo cơ chế chuyển gốc frutosyl (tranfructosylation). Những
enzyme như α-amylase, saccharase và maltase không phân hủy ñược những
oligosaccharide này, ñặc biệt là trong cơ thể con người (Losada và Olleros, 2002).
Những nguyên liệu này tới ruột kết, nơi chúng có thể bị lên men hoàn toàn hay một

phần hay vẫn chưa ñược lên men. Không có phân tử glucose hay fructose nào hình
thành oligosaccharide hay inulin ngay tại tĩnh mạch cửa. Những nguyên liệu này ñược
lên men bởi hệ vi sinh vật trong ruột kết. Quá trình lên men prebiotic dẫn tới sự kích
thích chọn lọc sự phát triển của Bifidobacteria (Flamm và cộng sự, 2001). Trong ống
Công nghệ chế biến sữa và ñồ uống
3
tiêu hóa (GI tract), bifidogenic oligosaccharide ñược chuyển hóa chỉ bởi vi khuẩn
Lactobacillus và Bifidobacteria có sẵn trong ruột mà không phải bởi những vi sinh vật
có hại như Clostridia, Staphylococcus, Salmonella và Escherichia coli. Sử dụng
bifidogenic oligosaccharide cùng với vi khuẩn lactic tạo ra những ảnh hưởng tốt, vi
khuẩn probiotic phát triển và cạnh tranh với những vi sinh vật gây bệnh không mong
muốn trong ống tiêu hóa. Bifidogenic oligosaccharide làm tăng mức ñộ bổ sung dinh
dưỡng và tăng ñộ hòa tan các chất dinh dưỡng (Farmer, 2002). Không giống như
probiotic, prebiotic không phải là cơ thể sống và do ñó, chúng không có vấn ñề về sự
sống sót trong sản phẩm và cả trong ruột (Frost và Sullivan, 2000).

2.1.1. Oligosaccharide không tiêu hóa ñược (NDO):

Oligosacchride có trên thị trường ở dạng bột kết tinh hay sirup 75% (w/v).Sự chọn
lựa oligosaccharide bị ảnh hưởng bởi vài nhân tố như chi phí, ảnh hưởng tới tính chất
hóa lý của hực phẩm và ñộ bền của oligosaccharide trong ñiều kiện pH và nhiệt ñộ
biến ñổi có thể làm thủy phân NDO. Những nhân tố khác có thể ñược xem xét như ảnh
hưởng của NDO lên sinh lý và sức khỏe của con người. NDO có một số ảnh hưởng tới
sinh lý của con người. Chúng ñược sử dụng như chất thay thế chất béo và ít năng
lượng. Khả năng gây sâu răng thấp nên ngăn chặn ñược sự mài mòn của răng và
xương và chúng cũng là một dạng của xơ ăn kiêng. Tuy nhiên nếu dùng với một lượng
quá nhiều, chúng cũng gây ra một số triệu chứng như chướng bụng, ñầy hơi hay tiêu
chảy. ðiều này xảy ra do có sự thay ñổi thế thẩm thấu hay do sự lên men quá nhiều.
Những ảnh hưởng không mong muốn chỉ xảy ra khi sử dụng NDO quá liều (Holzapfel
và Schillinger, 2002).

2.1.2. Fructooligosaccharide (FOS):

FOS là oligosaccharide hình thành bởi 1 phân tử glucose liên kết với 1 – 3 phân tử
fructose. Chúng là polymer mà các ñơn phân là β-D-fructosyl mạch ngắn gồm 9 ñơn
phân (oligosaccharide) hay trung bình gồm 60 ñơn phân (inulin). FOS có trong các
loài thực vật như hành, rễ măng tây, thân cây Jerusalem artichoke và lúa mạch. Ngoài
ra còn có trong chuối, bia, cây ngưu bàng, hẹ, các cây graminae, mật ong, yến mạch,
thông, lúa mạch ñen, rau diếp xoăn và ngay cả trong vi khuẩn và nấm men (Ziemer và
Gibson, 1998; Bengmark và cộng sự, 2001). FOS mạch ngắn là một hỗn hợp
oligosaccharide chứa glucose liên kết với fructose qua liên kết β-(1,2)-glucoside.
Chúng không ñược tiêu háo hiệu quả trong ruột non người nhưng ñược lên men trong
ruột kết nhờ hệ vi sinh vật ở ñây (Bounik và cộng sự, 1999). Những ñơn phân ñược
nối với nhau bằng cầu nối ñặc biệt có thể chịu ñược sự tấn công của enzyme ñộng vật
có vú (Ziemer và Gibson, 1998). Hầu hết các loài Bifidobacteria ñều có khả năng lên
men ñược FOS. Bifidobacteria có hoạt tính enzyme β-fructosidase tương ñối cao ñặc
hiệu cho liên kết β-(1,2)-glucoside có mặt trong FOS. Fructose, sản phẩm của quá
trình thủy phân FOS, là nguồn cơ chất quan trọng cho quá trình lên men hầu như chỉ
xảy ra với Bifidobacteria (Theuer và Cool, 1998). Chúng ảnh hưởng tốt lên cholesterol
máu, triglyceride và áp suất máu ở những người lớn tuổi mắc bệnh tăng lipid máu
(Bengmark và cộng sự, 2001).
Quá trình lên men sản xuất Probiotic Lactobacilli

4

FOS ñại diện cho nguồn dinh dưỡng ñặc hiệu của những vi sinh vật có lợi và do ñó
có tiềm năng ñể tăng sự hiệu quả của các sản phẩm probiotic hiện tại. Những nghiên
cứu khoa học tại Nhật Bản cho thấy rằng sự tiêu thụ FOS thay ñổi sự cân bằng của hệ
vi sinh vật ñường ruột theo chiều hướng gia tăng số lượng Bifidobacteria và các vi
sinh vật có lợi khác ngay cả khi thiêu probiotic khi ăn kiêng (Losada và Olleros,

2002).
Chúng ñược sản xuất trong công nghiệp bằng cách sử dụng 2 kỹ thuật sản xuất khác
nhau nhưng thành phẩm lại không khác nhau nhiều. Trong phương pháp 1, FOS ñược
tổng hợp từ nguyên liệu sucrose nhờ enzyme tranfructosylase còn trong phương pháp
2, inulin từ rau diếp xoăn ñược chuyển hóa. Polysaccharide sau ñó bị tác ñông bởi một
enzyme thủy phân có kiểm soát (Frost và Sullivan, 2000). 2 FOS ñược sản xuất có cấu
trúc tương tự nhau và có kích thước gần bằng nhau, do ñó chúng có sự khác nhau nhỏ
trong chức năng là prebiotic. FOS ñược sử dụng an toàn và hiệu quả ñối với người và
ñộng vật. Chúng không ảnh hưởng ñến AND, không có các chất gây ung thư và không
có ñộc tính. FOS không chỉ ảnh hưởng tốt cho sức khỏe mà còn góp phần tạo nên kết
cấu và hình dạng cho thực phẩm chứa chúng (Frost và Sullivan, 2000). Tuy nhiên,
chúng khá nhuận tràng và gây ñầy hơi khi dùng với liều cao (Losada và Olleros,
2002).

2.1.3. Galactooligosaccharide (GOS):

ðược tổng hợp từ ryrup lactose sử dụng enzyme β-galactosidase (Frost và Sullivan,
2000; Gibson, 2004). Chúng không bị thủy phân và hấp thu trong ruột người và chỉ
ñóng vai trò là cơ chất cho Bifidobacteria (Frost và Sullivan, 2000).

2.1.4. Ngũ cốc:

Ngũ cốc, các loại hạt, ñậu và dầu hạt là nguồn cung cấp xơ ăn kiêng. Acid phytic là
ñường bị hexaphosphoryl hóa và chiếm 1 – 5% khối lượng các loại thực phẩm trên.
Acid phytic tạo phức với sắt do ñó ngăn chặn những sản phẩm của quá trình oxy hóa
như các gốc tự do. ðiều này có thể giải thích cho những ảnh hưởng bảo vệ của xơ ăn
kiêng (Taylor và cộng sự, 1999). Ngũ cốc có thể sử dụng như là cơ chất cho quá trình
lên men của vi sinh vật probiotic (Charalampopoulos và cộng sự, 2002). Quá trình lên
men xơ ăn kiêng bởi vi khuẩn trong ruột kết tạo thàh sản phẩm là các acid béo mạch
ngắn (Taylor và cộng sự, 1999; Ridlon và cộng sự, 2006).

Butyrate là một acid béo mạch ngắn sản xuất bởi quá trình lên men xơ ăn kiêng.
Những cuộc thí nghiệm trên ñộng vật cho thấy butyrate tăng sự sinh sôi và chuyên hóa
của tế bào ruột kết. Sự chết theo chương trình (apoptoxis) của những tế bào trong ruột
kết cũng bị giảm ñi bởi butyrate (Kailasapathy và Chin, 2000). Quá trình lên men chất
xơ tạo thành acid béo mạch ngắn bởi vi khuẩn trong ruột kết làm giảm pH trong ruột.
ðiều này làm giảm sự chuyển hóa từ acid mật bậc 1 thành acid mật bậc 2 ñộc hơn
(Taylor và cộng sự, 1999). Muối mật bậc 1 kích thích tiêu hóa và tăng hấp thu lipid và
những vitamin tan trong dầu tại ruột. Tuy nhiên, khi chuyển thành muối bậc 2, chúng
gây ra những bệnh trong ñường tiêu hóa như ung thư ruột kết hay sỏi mật (Ridlon và
cộng sự, 2006).
Công nghệ chế biến sữa và ñồ uống
5
Ngoài ra, chúng còn ñược sử dụng như là nguồng carbohydrate không tiêu hóa ñược
làm tăng một số ảnh hưởng sinh lý có lợi cho cơ thể cũng như kích thích chọn lọc sự
phát triển của Lactobacillus và Bifidobacteria có mặt trong ruột kết, do ñó ñóng vai trò
như là prebiotic. Chúng chứa các xơ tan trong nước như glucan và arabinoxylan,
oligosaccharide như GOS và FOS, tinh bột bền (resistant starch). Tất cả ñều có tính
chất của prebiotic. Tinh bột cũng có thể ñược sử dụng ñể làm lớp vỏ bao probiotic ñể
làm tăng tính bền trong quá trình bảo quản và làm tăng số lượng sống sót khi di
chuyển qua môi trường bất lợi trong ống tiêu hóa (Charalampopoulos và cộng sự,
2002).

2.2. Synbiotic:

Synbiotic là sản phẩm chứa một probiotic và một prebiotic (Holzapfel và
Schillinger, 2002; Touhy và cộng sự,2003). Chúng ñược ñịnh nghĩa như là một hỗn
hợp của một probiotic và một prebiotic ảnh hưởng tốt ñến vật chủ nhờ việc tăng sự
sống sót và ñịnh cư của các vi sinh vật sống bổ sung trong ống tiêu hóa, bằng cách
kích thích chọn lọc và/hoặc kích hoạt sự trao ñổi chất của một hoặc một số lượng giới
hạn vi sinh vật làm tăng sức khỏe cho vật chủ (Kailasapathy và Chin, 2000; Touhy và

cộng sự,2003). Do ñó, synbiotic có thể làm tăng sự sống sót của probiotic bằng cách
cung cấp cơ chất xác ñịnh cho tế bào probiotic cần thiết cho quá trình lên men
(Gallaher và Khil, 1999). Sự bổ sung synbiotic là sự kết hợp Bifidobacteria và FOS,
Lactobacillus GG và inulin và Bifidobacteria, Lactobacilli và FOS hay inulin. Sữa lên
men chứa vi sinh vật sống có lợi (probiotic) cũng như kích thích hệ vi sinh vật ñường
ruột (prebiotic). Do ñó, chúng ñược xem là synbiotic. Nghiên cứu chỉ ra tiềm năng của
sữa lên men làm giảm nguy cơ bệnh tật như ung thư ruột kết (Kiebling và cộng sự,
2002; Saikali và cộng sự, 2004). Synbiotic có khả năng kháng vi sinh vật, chống ung
thư, ñiều hòa miễn dịch, kháng tiêu chảy, chống dị ứng, giảm lipid trong máu, giảm
glucose máu, tăng hấp thu va cân bằng khoáng, chống bệnh giòn xương
(antiosteoporotic) (Gallaher và Khil, 1999).


3. KHÓA PHÂN LOẠI PROBIOTIC:

3.1. Vi khuẩn:

Các probiotic vi khuẩn là Gam dương thuộc ngành Firmicutes (hệ gen có lượng
base nitơ Guanine – Cytosine (G – C) thấp) và Actinobacteria (hệ gen có lượng G-C
cao). Bên cạnh ñó cũng có probiotic là Gram âm, ví dụ Escherichia coli thuộc ngành
Proteobacteria.
Vi khuẩn probiotic bao gồm các giống sau ñây:
− Vi khuẩn Acid lactic (Lactic Acid Bacteria – LAB):

Nhóm vi khuẩn rất ña dạng này có khả năng lên men cacbohydrate ñể tạo thành
acid lactic. ðiển hình của probiotic thuộc nhóm này phải kể ñến Lactobacillus và
Bifidobacterium. ðiểm khác biệt giữa Lactobacillus và Bifidobacterium là trong cơ thể
Quá trình lên men sản xuất Probiotic Lactobacilli

6

người, nếu Lactobacillus chủ yếu ñịnh cư ở ruột non thì Bifidobacterium chủ yếu sinh
sống ở ruột già. Bên cạnh ñó còn có Pediococcus, Enterococcus và Lactococcus.
− Vi khuẩn không phải vi khuẩn lactic (Non – LAB):
nhóm này gồm có:
Propionibacterium, Bacillus, Brevibacillus, Sporolactobacillus, Escherichia…

3.2. Nấm men:

Nấm men ñược sử dụng như probiotic là Saccharomyces. Theo Kurtzman và Fell
(1999), giống Saccharomyces gồm có 14 loài. Còn theo nghiên cứu mới hơn của
Kurtzman (2003), giống này chỉ gồm 7 trong số 14 loài ñã công bố trước ñó (gồm:
Saccharomyces cariocanus, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus,
Saccharomyces mikatae, Saccharomyces kudriavzevii, Saccharomyces paradoxus, và
Saccharomyces pastorianus). Các loài còn lại thì thuộc giống mới có tên là
Kazachstania. ðiển hình của nấm men ñược sử dụng như probiotic là Saccharomyces
cerevisiae.
Saccharomyces cerevisiae sinh sản vô tính bằng cách nẩy chồi, sau ñó chồi sẽ
chuyển trực tiếp thành thể nang, bên trong thể nang có chứa các nang bào tử, ñược
quan sát khi nuôi cấy chúng trên acetate agar. Một ñiểm dễ dàng nhận thấy ở nấm men
này là khả năng lên men ñường rất mạnh ñược ứng dụng rất nhiều trong sản xuất thực
phẩm từ sản xuất bánh mì ñến thức uống có cồn từ nguồn nguyên liệu thô ban ñầu rất
ña dạng.
Ngoài ra, một số nấm mốc (một số chủng Aspergillus), trực khuẩn sinh bào tử khác
(Wolfson, 1999; Mombelli và Gismondo, 2000; Fuller, 2003) cũng có tính chất
probiotic.
Công nghệ chế biến sữa và ñồ uống
7

Phần 2: PROBIOTIC LACTOBACILLI

1. LACTOBACILLI:

1.1. Khóa phân loại:

Lactobacillus thuộc ngành Firmicutes, lớp Bacilli, bộ Lactobacillales, họ
Lactobacillaceae. Cùng họ với chúng là Paralactobacillus và Pediococcus (Garrity và
cộng sự, 2007).


Hình 1:
Cây phân nhánh Lactobacilli

Quá trình lên men sản xuất Probiotic Lactobacilli

8

Lactobacilli là giống (genus) chiếm lượng ñông ñảo nhất trong số các vi khuẩn
LAB. Giống này có tính không ñồng nhất (heterogeneous), rất ña dạng về kiểu hình,
tính chất hóa sinh và sinh lý. Sự không ñồng nhất này ñược phản ánh bởi hàm lượng
các base nitơ G-C trong hệ gen của chúng (tính theo % số mol). Orla-Jensen (1919) ñã
phân Lactobacillus thành 3 nhóm phụ là Thermobacterium, Streptobacterium, và
Betabacterium. Bảng 1 ñã tổng kết lại các ñặc tính dung ñể phân biệt 3 nhóm này và
cũng minh họa một vài loài tiêu biểu của từng nhóm. Sự phân chia dựa trên những ñặc
tính sinh lý cơ bản là sự có mặt hay vắng mặt lần lượt enzyme tiết ra cho quá trình lên
men ñồng hình và dị hình, fructose-1,6-diphospate aldolase và phosphocetolase.

Bảng 1:
Sự phân chia nhóm phụ của Lactobacilli

Tính chất
Nhóm 1, lên men
ñồng hình bắt
buộc
Nhóm 2, lên men
dị hình tùy tiện
Nhóm 3, lên men
dị hình bắt buộc
Lên men pentose
Tạo CO
2
từ
glucose
Tạo CO
2
từ
gluconate
Sự có mặt của
FDP aldolase
Sự có mặt của
phosphocetolase
-
-

-

+

-


L. acidophilus
L. delbruckii
L. helveticus
L. salivarius


+
-

+
a


+

+
b


L. casei
L. curvatus
L. plantarum
L. sakei

-
+

+
a


-

+


L. brevis
L. buchneri
L. fermentum
L. reuteri

(
a
: khi ñược lên men,
b
: cảm ứng bởi pentose)

Cách cổ ñiển nhất ñể phân biệt các loài Lactobacilli là dựa vào quy luật lên men
carbohydrate, cấu hình của acid lactic ñược tạo thành, khả năng thủy phân arginine,
ñiều kiện sinh trưởng, nhiệt ñộ sinh trưởng nhất ñịnh. Những tính chất này ñến nay
vẫn còn là một công cụ rất hữu dụng nhưng ñể có ñược khóa phân loại thích hợp thì
cần phải dựa vào kết quả phân tích peptidoglican, dùng phép thử LDH (Lactate
Dehydrogenase Test), % mol G + C của DNA, nghiên cứu về tính tương ñồng DNA-
DNA (DNA-DNA Homology). Ngoài ra người ta cũng sử dụng phân tích FAME (Fatty
Acid Methyl Ester) ñể nhận diện Lactobacilli từ sữa và các nguồn chứa probiotic. Tuy
nhiên phương pháp FAME cũng bộc lộ khuyết ñiểm là khó khăn trong việc ñưa ra các

lời giải thích và phải lệ thuộc vào phương pháp xử lý toán học. Một công cụ giúp phân
loại ñơn giản hơn ñó là sử dụng ñầu dò oligonucleotide ñặc trưng cho loài (Species-
specific oligonucleotide probes) (là một dẫn xuất từ chuỗi rRNA). Các kĩ thuật PCR
Công nghệ chế biến sữa và ñồ uống
9
khác nhau và các chuỗi trực tiếp của các phân ñoạn PCR (chẳng hạn, của rRNA) cũng
giúp nhanh chóng nhận diện và phân loại Lactobacilli nói riêng và các LAB nói chung.

1.2. ðặc ñiểm hình thái, cấu trúc tế bào và trao ñổi chất:

Lactobacilli phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên và ñược sử dụng rất rộng rãi trong
công nghiệp thực phẩm. Lactobacilli gồm có 116 loài (tính ñến tháng 9/2008), là nhóm
vi khuẩn Gram dương, kích thước khá nhỏ (<1.5µm), một số khác có thể có chiều dài
5µm, thậm chí 10µm, không có khả năng sinh bào tử, thường không chuyển ñộng, ñôi
khi sử dụng ñược nitrate. Hình dạng của các vi khuẩn này thường là hình que hoặc trực
cầu khuẩn với hệ gen có hàm lượng G – C thấp hơn 50% (dao ñộng từ 32 – 55%).
Chúng ñòi hỏi một môi trường giàu chất dinh dưỡng ñể phát triển và là các vi khuẩn vi
hiếu khí. Chúng không có enzyme catalase (Catalase (-)) cho dù hoạt tính
pseudocatalase có thể hiện diện trong một vài giống và trong sự có mặt của nhóm
heme.
Lactobacillus có thể kị khí hay hiếu khí, dung nạp acid (aciduric) hay ưa acid
(acidophilic), một số loài có khả năng chịu ñược nồng ñộ muối cao, áp suất thẩm thấu
và hoạt tính nước thấp, một số có thể chịu ñược ethanol và chịu ñược muối mật.
Chúng lên men ñồng hình (ñồng hình bắt buộc hay ñồng hình tùy tiện) hay dị hình,
không có khả năng phân giải protein và lipid ñòi hỏi phải có một phức hợp các chất
dinh dưỡng ñể sinh trưởng như carbohydrate, amino acid, peptide, các ester của acid
béo, các muối, dẫn xuất của acid nucleic, vitamin… ðối với nguồn carbohydrate,
chúng không những sử dụng ñược glucose, fructose, lactose mà còn có khả năng lên
men carbohydrate có nguồn gốc thực vật như cellibiose, amygladin, trehalose, thậm
chí một số loài có khả năng lên men tinh bột.

Khả năng lên men của một số Lactobacilli ñược ñề cập trong bảng dưới ñây:

Bảng 2:
ðặc tính lên men của Lactobacillus
1


Lên men

Giống ñại diện
%
G + C
Sinh
trưởng
ở 15
o
C
Cel

Fru

Gal

Lac

Mal

Sta

Suc

Thủy
phân
Arg
Nhóm 1:
Lên men ñồng
hình bắt buộc
L. acidophilus
L. delbrueckii
L. helveticus
L. amylophilus
L. amylovorus
L. cryspatus
L. gasseri
L. jensenii



34-37
49-51
38-40
44-46
40-41
35-38
33-35
35-37



−

−
−
+
−
−
−
−



+
±
4
+
−
+
+
+
+



+
+
±
+
+
+
+
+

+
−
+
+
+
+
+
+



+
+
+
−
−
+
±
−



+
±
±
+
+

+
±
±



?
3

?
?
+
+
?
?
?



+
±
−
−
+
+
+
+

−
±
−
?
?
−
−
+
Nhóm 2:
Lên men dị hình
tùy tiện

Quá trình lên men sản xuất Probiotic Lactobacilli

10

L. paracasei
L. curvatus
L. plantarum
L. sakei
L. bavaricus
L. homobiochii
L. coryniformis
L. alimentarius
46
43
45
43
43
36
36

36
?
?
+
?
?
+
+
?
+
+
+
+
+
±
−
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

−
+
+
±
±
+
+
+
−
±
−
+
+
+
+
+
+
+
+
?
?
?
?
?
?
?
?
+
−
+

+
+
−
+
+
−
−
−
−
−
−
−
−
Nhóm 3:
Lên men dị hình
bắt buộc
L. fermantum
L.
sanfranciscensis
L. reuteri
L. buchneri
L. brevis
L. kimchii
L. kefiri
L. divergens



53
37

41
45
45
35
41
34



+
?

?
?
?
+
?
+



±
−

−
−
−
+
−

+



+
−

+
+
+
+
+
+



+
+

+
±
±
w
5

−
±

+
−

+
±
±
−
+
−



+
+

+
+
+
+
+
+



?
?

?
?
?

V
?
?



+
−

+
±
±
+
−
+



+
−

+
+
+
−
+
+
1
ðiều chỉnh từ Manual of Systematic Bacteriology – Volume 2, Bergey (1986)
2

Cel – Cellulose; Fru – Fructose; Gal – Galactose; Lac – Lactose; Mal – Maltose; Suc
– Sucrose; Star – Starch
3
Không xác ñịnh ñược
4
Phản ứng khác nhau tùy thuộc vào giống hay loài phụ
5
Phản ứng dương tính yếu

Nhiệt ñộ tối ưu ñể sinh trưởng khá rộng (30 – 45
o
C).

1.3. Phân bố:

Các vi khuẩn này hầu như có mặt ở khắp nơi và vì thế có thể tìm thấy chúng ở hầu
hết các môi trường, nơi có nguồn cacbohydrate, chẳng hạn như thực phẩm (các sản
phẩm từ sữa, thịt lên men, bột nhào chua (sourdoughs), rau quả, ñồ uống giải khát ), hệ
hô hấp, hệ tiêu hóa (GIT) (trong ruột non), cơ quan sinh dục của người và ñộng vật,
nước thải và cả ñất trồng. ðối với hệ tiêu hóa và hệ sinh dụng niệu, ñây chính là môi
trường ñịnh cư tự nhiên của Lactobacilli mặc dù số lượng của chúng không nhiều bằng
Bifidobacterium. Vì thế, không có gì ngạc nhiên khi một lượng lớn các giống trong số
chúng ñược ứng dụng như những probiotic trong suốt 70 năm trở lại ñây.


2. HỆ GEN CỦA PROBIOTIC LACTOBACILLI:

Công nghệ chế biến sữa và ñồ uống
11
2.1. Giới thiệu:

Hiện nay, xu hướng và việc ứng dụng vi khuẩn acid lactic như là probiotic ñang rất
phát triển trên thế giới. Trong ñó, vi khuẩn probiotic từ LAB nhận ñược sự chú ý ñặc
biệt của các nhà khoa học và người tiêu dùng, nhất là sự thành lập của Lactic Acid
Bacteria Genome Consortium (LABGC) tại Mĩ ñã gây ảnh hưởng mạnh ñến ngành
công nghiệp sản xuất sản phẩm probiotic LAB. Do ñó, vấn ñề nghiên cứu hệ gen của
probiotic LAB cũng như những tác ñộng của chúng ñối với sức khỏe con người là ñiều
rất cần thiết.

2.2. Những ñặc ñiểm chung về di truyền của probiotic Lactobacilli:

Gần ñây, những bước tiến lớn trong việc mô tả di truyền của probiotic Lactobacilli
ñã cho phép việc nghiên cứu, so sánh hệ gen của những vi sinh vật này và cung cấp cái
nhìn sâu hơn về sự tiến hóa, sinh lý, trao ñổi chất và những tác ñộng lẫn nhau với mô
tế bào vật chủ. 14 giống Lactobacillus bao gồm: L. acidophilus, L. casei, L. gasseri, L.
johnsonii, L. salivarius, L. plantarum và L. reuteri ñang ñược xem như là probiotic
(Bảng 4). Lượng G + C của những vi sinh vật này trải dài từ 33% ñối với L. salivarius
cho ñến 46% ñối với L. casei. Hầu hết chúng ñều có bộ gen có kích thước khoảng 2Mb
trong khi L. plantarum và L. casei ñược sử dụng như là probiotic và canh trường khởi
ñộng ñều có những nhiễm sắc thể lớn hơn tương ứng là 3.31 và 2.89Mb (Bảng 4). Một
ñặc ñiểm di truyền chung nữa của những giống này là sự có mặt của những gen giả
(pseudogene). Lactobacilli sử dụng như là canh trường khởi ñộng trong sữa như L.
delbrueckii subsp.bulgaricus (L. bulgaricus) và L. helveticus chứa nhiều gen giả trong
bộ máy di truyền hơn là khi ñược sử dụng như là canh trường probiotic (Bảng 4).
Trong trường hợp của L. salivarius, gần 1/3 gen giả của chúng ñược ñặt trong
megaplasmid ñầu tiên ở tế bào LAB, pMP118 (Claesson và cộng sự, 2006).
Megaplasmid này mã hóa một số ñặc ñiểm quan trọng như là locus ñể sản xuất
bacteriocin, enzyme hydrolase muối mật và 2 gen ñể hoàn thành chu trình
phosphoketolase (PKP). 2 gen này giúp chính thức phân loại những vi sinh vật này là
nhóm lên men dị hình tùy tiện (Claesson và cộng sự, 2006). Thực tế, plasmid chiếm

15% trong bộ máy di truyền của L. salivarius, giống khác với những probiotic khác
(Bảng 4). Tất cả những giống probiotic ñều chứa dấu vết của prophage hay phage
trong khi L. helveticus và L. bulgaricus sử dụng trong ngành sữa là những giống duy
nhất không chứa dấu vết của prophage hay phage mặc dù môi trường sản xuất chứa rất
nhiều bacteriophage (Bảng 4).

Bảng 3:
Một vài dự án về di truyền của probiotic Lactobacilli

Loài Giống
Kích
thước
(Mb)
Số ñăng
ký
Viện nghiên
cứu
Nguồn
L.
acidophilus
NCFM
1.99 CP000033
NC State
University,
California
Poly. State
Altermann và
cộng sự
(2005)
Quá trình lên men sản xuất Probiotic Lactobacilli

12

University,
USA
L. casei
BL23
2.6 FM177140

INRA/CNRS,
Caen
University,
France
Liu và cộng
sự (2005)
L. casei
Shirota
3.04
Yakult, Japan Liu và cộng
sự (2005)
L. casei
DN-114 001
3.14
Danone
Vitapole,
INRA,
France
Liu và cộng
sự (2005)
L.

delbrueckii
subsp.
bulgaricus
DN-100 107
2.13
Danone
Vitapole,
France
Liu và cộng
sự (2005)
L. gasseri
ATCC33323
1.89 CP000413
JGI.,
LABGC,
Fidelity
Systems Inc.,
USA
Azcarate-
Peril và cộng
sự (2008)
L. johnsonii
NCC533
1.99 AE017198

Nestle
Research
Center,
Switzerland
Pridmore và

cộng sự
(2004)
L. plantarum

WCFS1
3.31 AL935263

Wageningen
Centre for
Food
Sciences, The
Netherlands
Kleerebezem
và cộng sự
(2003)
L. reuteri
ATCC55730
20
BioGaia,
Swedish
University of
Agricultural
Science,
Sweden
Liu và cộng
sự (2005)
L. salivarius
subsp.
salivarius
UCC118

1.83 CP000233
University
College
Cork, Ireland
Claesson và
cộng sự
(2006)

Công nghệ chế biến sữa và ñồ uống
13

Bảng 4:
Những ñặc ñiểm di truyền chung của một số Lactobacilli thông dụng

Giống
Số
ñăng
ký
Kíc
h
thư
ớc
(M
b)
%
G
C
Prot
ein
Plas

mid
Prophage/
phage
remnant
Pseudo
gene
Ứng
dụng
Nguồn
L.
acidoph
ilus
NCFM
CP000
033
1.9
9
34
.7
1864

0 0/3 10
a

Probi
otic
Alterma
nn và
cộng sự
(2005)

L. casei
ATCC
334
CP000
423
2.8
9
46
.6
2776

1 1/0 82
Canh
trườn
g
khởi
ñộng,
probi
otic
Makaro
va và
cộng sự
(2006)
L. casei
BL23
(ATCC
393)
FM177
140
3.1

46
.3
3044


Probi
otic
NCBI
L.
gasseri
ATCC
33323
CP000
413
1.8
9
35
.3
1755

0 1/1 48
Probi
otic
Azcarate
-Peril và
cộng sự
(2008)
L.
johnson
ii NCC

533
AE017
198
1.9
9
34
.6
1821

0 2/1 0
Probi
otic
Pridmor
e và
cộng sự
(2004)
L.
plantar
um
WCFS1

AL935
263
3.3
1
44
.5
3009

3 2/2 42

Canh
trườn
g
khởi
ñộng,
probi
otic
Kleereb
ezem và
cộng sự
(2003)
L.
reuteri
F275
CP000
705
2 38

1900

0 2/0 39
Probi
otic
Morita
và cộng
sự
(2008)
L.
salivari
us

CP000
233
1.8
3
33

1717

3 2/2 49
Probi
otic
Claesso
n và
cộng sự
Quá trình lên men sản xuất Probiotic Lactobacilli

14

subsp.
salivari
us
UCC11
8
(2006)
L.
ferment
um IFO
3956
AP008
937

2.1
51
.5
1843

0
Morita
và cộng
sự
(2008)
L.
brevis
ATCC
367
CP000
416
2.3
46
.1
2185

2 1/0 50
Canh
trườn
g
khởi
ñộng
Makaro
va và
cộng sự

(2006)
L.
delbrue
ckii
bulgari
cus
ATCC
11842
CR954
253
1.8
6
49
.7
1562

0 0/0 270
Canh
trườn
g
khởi
ñộng
van de
Guchte
và cộng
sự
(2006)
L.
delbrue
ckii

subsp.
bulgari
cus
ATCC
BAA-
365
CP000
412
1.8
6
49
.7
1721

0 0/0 192
Canh
trườn
g
khởi
ñộng
Makaro
va và
cộng sự
(2006)
L.
helvetic
us
DPC45
71
CP000

517
2.0
8
37
.7
1610

0 0/0 217
Canh
trườn
g
khởi
ñộng
Callanan
và cộng
sự
(2008)
L. sakei
subsp.
sakei
23K
CR936
503
1.8
8
41
.3
1879

0 0/1 30

Canh
trườn
g
khởi
ñộng
Chaillou
vcs
(2005)

Nguồn chủ yếu ñể sản xuất năng lượng trong Lactobacilli là quá trình lên men
carbohydrate thông qua chu trình ñường phân (EMP) và/hoặc PKP. Những phân tích
di truyền ñược tiến hành trên máy tính (in silico) khẳng ñịnh rằng tất cả các loài ngoại
trừ những loài lên men dị hình bắt buộc như L. brevis ATCC367 và L. reuteri F275
mới có chu trình ñường phân hoàn chỉnh (Goh và Klaenhammer, 2008). Hơn nữa, L.
Công nghệ chế biến sữa và ñồ uống
15
salivarius có tất cả những enzyme quan trọng ñể hình thành glucose. Những enzyme
này có thể hoạt hóa trong giai ñoạn thiếu glucose tạo nên sự thuận lợi khi cạnh tranh
của L. salivarius trong hệ tiêu hóa (Claesson và cộng sự, 2006). Thêm vào ñó, tất cả
các loài ñều thiếu những enzyme quan trọng ñể sinh tổng hợp hầu hết vitamin và
cofactor. Tuy nhiên, trong số các loài Lactobacilli thì duy nhất L. reuteri CRL1098 có
khả năng tổng hợp cobalamin (vitamin B12) (Morita và cộng sự, 2008). Khác với
Bifidobacteria, hầu hết Lactobacilli ñều thiếu khả năng tổng hợp lại một số amino acid
ngoại trừ L. plantarum là loài có chu trình sinh tổng hợp ñầy ñủ tất cả các amino acid
không có nhánh (Kleerebezem và cộng sự, 2003). ðể thay thế cho sự thiếu sót này, bộ
máy di truyền của probiotic mã hóa cho một chuỗi rộng hệ thống hấp thu các amino
acid/peptide và peptidase (thường ñược sắp xếp trong operon) ñể sử dụng ñược nguồn
nitrogen bên ngoài này (Goh và Klaenhammer, 2008). Bộ máy di truyền của L.
jonhsonii mã hóa cho một cặp aminopeptidase (LJ0176/LJ0178) với tính tương ñồng
ñặc trưng có khả năng tương tự như những enzyme trong Lactobacilli hệ tiêu hóa,

Streptococci, B. longum và Bacteroides fragilis cho thấy rằng sự tiến hóa thích nghi ñể
sử dụng cấu trúc peptide là thường xuyên gặp phải trong hệ tiêu hóa (Pridmore và
cộng sự, 2004). Ngoài ra, L. acidophilus và L. johnsonii ñược cho là sở hữu proteinase
gắn với thành tế bào có khả năng làm thoái hóa polypeptide từ cơ chất là chất dinh
dưỡng từ thức ăn của cơ thể vật chủ và/hoặc glycoprotein như là mucin của vật chủ
(Pridmore và cộng sự, 2004). ða số các loài probiotic có tỷ lệ lớn các gen ñể vận
chuyển và chuyển hóa carbohydrate và amino acid (Bảng 5). Lactobacilli trong hệ tiêu
hóa sử dụng hệ thống chuyển phospho không cần phosphoenolpyruvate (The
phosphoenolpyruvate (PEP)-dependent phosphotransferase systems – PTS) với trung
bình 20 – 30 phần tử vận chuyển ñược mã hóa trong mỗi gen, bổ sung thêm permease
(một protein vận chuyển) vào hệ thống vận chuyển trên màng tế bào (The major
facilitator superfamily) cũng như là hệ thống vận chuyển ñường không cần ATP (ATP-
dependent binding cassettes (ABC) sugar transporter) (Goh và Klaenhammer, 2008).
Quá trình lên men sản xuất Probiotic Lactobacilli

16


Bảng 5:
Chức năng COG của gen mã hóa protein từ probiotic



Công nghệ chế biến sữa và ñồ uống
17

2.3. Từ nghiên cứu hệ gen ñến ñặc ñiểm probiotic Lactobacilli:

2.3.1. Sự trao ñổi chất prebiotic và carbohydrate:

Khả năng của hệ vi sinh vật ñường ruột có thể sử dụng polysaccharide dinh dưỡng
từ thực vật nhưng không bị tiêu hóa bởi cơ thể vật chủ tạo nên một lợi thế cạnh tranh
cho sự ổn ñịnh và ñịnh cư của chúng trong ruột già. ðường prebiotic như FOS và
raffinose ñược sử dụng như là một thành phần thực phẩm chức năng không tiêu hóa
ñược ñể làm thúc ñẩy chọn lọc sự phát triển của Lactobacilli và Bifidobacteria, những
vi sinh vật ñược xem là vi khuẩn có lợi cho sức khỏe trong số những vi sinh vật ñường
ruột. Gần ñây, những nghiên cứu dựa trên nền tảng gen của sự tiêu thụ FOS bởi
Lactobacilli ñã khám phá ra nhiều con ñường dị hóa ña dạng giữa nhiều loài khác nhau
(Barrangou và cộng sự, 2003; Goh và cộng sự, 2006; Saunier và cộng sự, 2007).
Operon L. acidophilus msm mã hóa hệ thống vận chuyển ABC và β-fructofuranosidase
tế bào chất làm trung gian cho quá trình hấp thu và thủy phân nội bào FOS. ðối với L.
plantarum, con ñường tiêu thụ FOS ñược mã hóa bởi một nhóm gen chứa 1 sucrose
PTS và 1 enzyme β-fructofuranosidase nội bào. L. casei cũng có một operon ñường
tương tự như cấu trúc cùa fos operon trong L. paracasei. Dựa trên những phân tích
chức năng của fos operon trong L. paracasei, con ñường tiêu thụ FOS của L. casei
ñược tiên ñoán bao gồm một enzyme β-fructosidase bám trên bề mặt tế bào và một
fructose/mannose PTS làm trung gian cho quá trình thoái hóa FOS ngoại bào và sử
dụng fructose sau ñó. L. acidophilus, L. plantarum và L. johnsonii cũng có khả năng
sử dụng ñường raffinose (Klaenhammer và cộng sự, 2005). Quá trình phân tích vi
chuỗi quá trình sao mã (Microarray transcriptional analysis) của L. acidophilus sinh
trưởng trên raffinose cho thấy có sự tham gia của một operon raffinose mã hóa hệ
thống vận chuyển ABC và một α-galactosidase trong quá trình dị hóa raffinose
(Barrangou và cộng sự, 2006).
Ngoại trừ L. reuteri, L. brevis, L. bulgaricus, L. sakei và L. fermentum thì bộ di
truyền của tất cả các loài Lactobacillus khác mã hóa ít nhất một neopullulanase có khả
năng thủy phân pullulan, một polysaccharide mạch thẳng bao gồm những ñơn vị
maltotriose liên kết với nhau bằng liên kết α-1,6 glucoside.

2.3.2. Nhóm gen sinh tổng hợp polysaccharide:

Nhóm gen sinh tổng hợp polysaccharide có mặt ở hầu hết các giống Lactobacillus
ngoại trừ L. reuteri, L. fermentum và L. brevis. Những nhóm gen sinh tổng hợp
polysaccharide ngoại bào nằm trên bề mặt tế bào có mối quan hệ gần gũi với hệ gen
của L. acidophilus, L. johnsonii và L. gasseri có mức duy trì cao mặc dù tổ chức gen
trong L. gasseri ñã ñược chuyển hóa do quá trình ñảo ñoạn nhiễm sắc thể (Azcarate-
Peril và cộng sự, 2008; Klaenhammer và cộng sự, 2005). Cả 3 nhóm gen eps ñều ñược
ñặt trong khu vực có lượng G + C thấp với một gen transposase ñặt trong khu vực
downstream cho thấy rằng nhóm gen eps có ñược thông qua quá trình chuyển gen
ngang (horizontal gene transfer – HGT) từ một nguồn chung. Một vài nhân gen eps tỏ
ra khá yếu hoặc không tương ñồng với nhau mặc dù có hức năng giống nhau chỉ ra sự
biến ñổi ña dạng của các ecopolysaccharide ñược sản xuất tạo nên một ñiểm duy nhất
Quá trình lên men sản xuất Probiotic Lactobacilli

18

trên bề mặt của những giống này (Klaenhammer và cộng sự, 2005; Pridmore và cộng
sự, 2004). ðáng chú ý, hệ gen của L. gasseri cũng mã hóa một số lượng lớn
glycosyltransferases không thông thường tạo nên sự ña dạng của các
exopolysaccharide ñược tổng hợp (Azcarate-Peril và cộng sự, 2008).
Hệ gen của L. salivarius, L. sakei và L. bulgaricus ñều chứa 2 nhóm gen eps khác
biệt trong khi L. plantarum lại chứa 4 nhóm gen tổng hợp polysaccharide bề mặt khác
(Chaillou và cộng sự, 2005; Claesson và cộng sự, 2006; Kleerebezem và cộng sự,
2003; van de Guchte và cộng sự, 2006). Sturme và cộng sự (2005) mới ñây mô tả một
trong những locus tổng hợp polysaccharide của L. plantarum, cps2 (lp_1197 ñến
lp_1211) ñược ñiều hòa bởi hệ thống ñiều hòa gồm 2 thành phần giống arg (two-
component regulatory system – 2CRS) ký hiệu là lam trong Lactobacillus. ðối với L.
salivarius, nhóm gen eps 1 (LSL_0977 ñến LSL_0997) ít có sự tương ñồng với các
eps khác trong khi nhóm gen 2 (LSL_1547 ñến LSL_1574) lại có sự tương ñồng cao
với nhóm gen polysaccharide bề mặt trong L. plantarum với lượng GC thấp (Claesson
và cộng sự, 2006). 2 nhóm gen polysaccharide bề mặt có mặt trong gen của L. sakei

(LSA1571 ñến LSA1585; LSA1510 ñến LSA1513) mã hóa cho protein cần thiết cho
sự sinh tổng hợp acid techoic liên kết polysaccharide và sự chuyển vị trí của
polysaccharide tới một thành phần trên bề mặt khác. Những nhóm gen polysaccharide
này ñược dự ñoán là có khả năng tăng sự bám dính của L. sakei lên bề mặt thịt hay
niêm mạc ruột (Chaillou và cộng sự, 2005). ðối với L. bulgaricus, eps 1 và 2 rất gần
giống nhau (Makarova và cộng sự, 2006; van de Guchte và cộng sự, 2006). Nhóm gen
eps 1 của ATCC 11842 (Ldb1937 ñến Ldb1957) và ATCC BAA-365 (LBUL_1800
ñến LBUL1815) tương tự nhau trong khi nhóm 2 thì lại rất ña dạng. Makino và cộng
sự (2006) gần ñây công bố rằng những phân ñoạn polysaccharide ngoại bào có tính
acid và phân tử lượng lớn phân lập từ L. delbrueckii subsp. bulgaricus OLL1073R-1
có khả năng cảm ứng sản xuất interferon-gamma in vitro và tăng hoạt tính tiêu diệt tế
bào tự nhiên in vivo. Do ñó, sự ña dạng của eps trong L. bulgaricus có thể ñóng góp
vào những ñặc tính lưu biến cũng như ñặc tính kích thích miễn dịch của
polysaccharide ngoại bào. Tương tự, L. casei Shirota có nhóm gen cps mã hóa cho sự
sinh tổng hợp polysaccharide phân tử lượng lớn (PS-1) (Yasuda và cộng sự, 2008). Sự
tiếp xúc của tế bào ñột biến cps dễ bị tiêu diệt bởi nhiệt với ñại thực bào chuột và tế
bào lá lách tạo nên sự cảm ứng nhiều hơn của TNF-α, IL-12, IL-10 và IL-6 khi ñược
so sánh với giống bố mẹ. Thêm vào ñó, giống ñột biến thiếu CPS làm tăng sự sản xuất
IL-6 kích thích LPS bởi những tế bào giống ñại thực bào chuột trong khi ñiều này lại
bị ngăn chặn trong những giống bố mẹ. Do ñó, PS-1 liên kết với thành tế bào của L.
casei Shirota có khả năng ñiều biến những ñáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ bằng
cách giảm những ñáp ứng miễn dịch từ monocyte và ñại thực bào cũng như những
chất gây cảm ứng khác.

2.3.3. Phản ứng chống lại stress:

2.3.3.1. Acid:

Một số lượng ña dạng các cơ chế ñể ñiều chỉnh pH nội bào xuất hiện trong cơ thể vi
khuẩn Gram (+) bao gồm bơm proton F

1
F
0
-ATPase, phản ứng decarboxyl amino acid,
sinh tổng hợp các protein chống lại tress và chaperone ñể sữa chữa hay làm thoái hóa
Công nghệ chế biến sữa và ñồ uống
19
những sai sót trong DNA hay trong các protein khác. Những cơ chế khác bao gổm sự
sản xuất các thành phần có tính kiềm, ñiều chỉnh thành phần màng tế bào, ñiều hóa
quá trình sao mã thông qua các nhân tố sigma và 2-CRS. Hệ gen của L. plantarum mã
hóa 1 F
1
F
0
-ATPase, 10 protein vận chuyển (antiporter) Na-proton và 3 protein chống
shock kiềm ñể duy trì sự cân bằng pH nội bào (Kleerebezem và cộng sự, 2003). Một
nghiên cứu quá trình sao mã gần ñây của L. plantarum cho thấy acid lactic gây ra hiện
tượng cảm ứng một cách ñặc biệt lên một vài protein bề mạt tế bào có chức năng chưa
xác ñịnh rõ, Clp protease, catalase, excinuclease, squalene synthase và phytoene
synthase (Pieterse và cộng sự, 2005). Các tác giả cho rằng một vài protein này có thể
chịu trách nhiệm sữa chữa bề mặt tế bào, làm tăng dộ bền vững của màng tế bào ñể có
thể chịu ñựng ñiều kiện acid. Một vài nghiên cứu khác gần ñây về những ñáp ứng tổng
thể lên shock acid trong giai ñoạn cuối pha log của L. reuteri ATCC 55730 cho thấy
rằng sự cảm ứng của gen mã hóa ClpL chaperone, một esterase và một
phosphatidylglycerophosphatase xuất hiện trong quá trình sinh tổng hợp peptidoglycan
và màng tế bào. Gen phage mã hóa cho protein làm thoái hóa thành tế bào cũng ñược
cảm ứng (Wall và cộng sự, 2007). Kết quả phân tích chức năng của ClpL và esterase
ñột biến cho thấy tầm quan trọng của những gen này trong những ñáp ứng ban ñầu ñối
với shock gây ra bởi acid và ảnh hưởng tới sự sống sót của tế bào khi di chuyển qua hệ
tiêu hóa. ðối với L. acidophilus, operon atp mã hóa F

1
F
0
-ATPase ñược cảm ứng khi tế
bào ở pha log có thể chịu ñược stress acid khi pH ở 3.5 với acid hypocloric (Kullen và
Klaenhammer, 1999). Thêm vào ñó, những nghiên cứu về gen in silico ñã ñịnh dạng
một vài enzyme amino acid decarboxylase, một ATPase vận chuyển cation và
chaperone Ffh nằm trong hệ thống ñiều chỉnh pH nội bào của L. acidophilus
(Altermann và cộng sự, 2005). Azcarate-Peril và cộng sự (2004) gần ñây ñã khẳng
ñịnh rằng gen mã hóa cho sự decarboxyl amino acid bao gồm 1 antiporter vận chuyển
amino acid, 1 permease vận chuyển amino acid, 1 enzyme ornithine decarboxylase và
1 bộ ñiều hòa quá trình sao mã có liên quan tới khả năng chịu acid của L. acidophilus.
ðáng ngạc nhiên hơn nữa, sự thích nghi ban ñầu trong ñiều kiện pH 5.5 trong 1h của 4
giống ñột biến mẫn cảm với acid cho thấy sự hồi phục khả năng sống sót của chúng
khi pH ở 3.5 cho thấy rằng những gen này có vai trò gián tiếp trong việc thích nghi với
ñiều kiện acid.

2.3.3.2. Áp suất thẩm thấu:

Những kết quả phân tích di truyền in silico ñã khám phá ra rằng L. plantarum có ít
nhất 3 hệ thống ñể tiêu thụ và sinh tổng hợp các chất bảo vệ khỏi áp suất thẩm thấu
(osmoprotectant) glycine-betaine/carnitine/choline (Kleerebezem và cộng sự, 2003).
Locus cho việc sử dụng trehalose (tre) ở gen giống L. acidophilus mã hóa 1 PTS
(treB) và 1 enzyme trehalose-6-phosphate hydrolase (treC) có chức năng bảo vệ tế bào
trong ñiều kiện lạnh ñông (cryoprotection) với sự tiêu thụ và thủy phân trehalose
(Duong và cộng sự, 2006). Hơn nũa, sự vô hoạt treB hay treC làm cho tế bào không
còn khả năng sử dụng trehalose như là nguồn carbon hay cryoprotectant trong quá
trình lạnh hay rã ñông. Dựa trên những quan sát trên, người ta cho rằng lượng tiêu thu
trehalose cũng như những sản phẩm thủy phân kế tiếp hay chất trung gian trong quá
trình trao ñổi chất ñều ñóng góp vào khả năng chịu ñựng lạnh ñông của tế bào.

Quá trình lên men sản xuất Probiotic Lactobacilli

20

2.3.3.3. Oxy hóa:

Gen của L. plantarum mã hóa một số lượng lớn protein có khả năng chống lại quá
trình oxy hóa bao gồm catalase, peroxidase, thioredoxin, NADH oxidase và
glutathione reductase. Việc tăng tổng hợp thioredoxin có khả năng tăng khả năng chịu
ñựng (Serrano và cộng sự, 2007). Việc mô tả sâu hơn quá trình chuyển gen (gene
expression – là quá trình bao gồm sao mã và dịch mã ñể chuyển thông tin từ gen vào
sản phẩm như protein) cho thấy rằng quá trình chuyển gen tạo nhiều thioredoxin làm
khởi ñộng quá trình sao mã của 16 gen mã hóa cho các protein tham gia vào quá trình
trao ñổi chất purine, tổng hợp protein, ñáp ứng lại với stress và vận chuyển mangan.
Quá trình trên cũng ñược cảm ứng dưới ñiều kiện có hydrogen peroxide cho thấy
thioredoxin ñóng một vai trò trong quá trình chuyển tín hiệu trong quá trình ñáp ứng
lại stress oxy hóa. Thêm vào ñó, ít nhất 5 hệ thống vận chuyển mangan ñược tìm thấy
trong gen của L. plantarum cho thấy Mn
2+
ñược xem như là chất bắt gốc tự do oxy
quan trọng cũng như là cofactor cho enzyme catalase.

2.3.3.4. Muối mật:

Enzyme hydrolase muối mật (bile salt hydrolase – BSH) hay choloylglycine
hydrolase chỉ ñược phân lập từ người hay từ những loài chịu ñược muối mật trong môi
trường cộng sinh như Lactobacillus, Bifidobacteria, L. monocytogenes, Enterococcus
faecalis và Bacteroides (Begley và cộng sự, 2006; Elkins và cộng sự, 2001). Tuy
nhiên, không có gen mã hóa BSH nào ñược tìm thấy trong chuỗi gen của L.

bulgaricus, L. helveticus và L. fermentum. Những giống còn lại sở hữu ít nhất một gen
mã hóa BSH như L. plantarum, L. acidophilus, L. johnsonii và L. brevis có 2 gen mã
hóa BSH hay hơn nữa. Mặc dù L. plantarum có 4 gen bsh nhưng kết quả phân tích ñột
biến tổ hợp lại cho rằng chỉ có gen bsh1 mới mã hóa cho BSH chức năng trong khi
những gen bsh còn lại lại mã hóa cho protein thể hiện hoạt tính penicillin acylase
(Lambert và cộng sự, 2008). Sự có mặt của BSH phức tạp có thể làm rộng tính ñặc
hiệu với muối mật hay tạo nên sự khác biệt trong những chế ñộ hoạt ñộng của enzyme
phụ thuộc vào sự thích nghi với muối mật cơ bản làm tăng sự sống sót của vi khuẩn
trong môi trường không ổn ñịnh của vật chủ (Begley và cộng sự, 2006). Ví dụ, kết quả
phân tích chức năng của BshA và BshB của L. acidophilus cho thấy rằng mỗi BSH có
tính ñặc hiệu khác nhau với mỗi loại muối mật dựa trên nhân steroid của muối mật hay
chuỗi amino acid có mặt trong phân tử muối mật (McAuliffe và cộng sự, 2005). Nói
chung, gen BSH của L. acidophilus và L. reuteri ñều có chung nguồn gốc (ortholog
gene) với các Lactobacilli khác (Goh và Klaenhammer, 2008). Trong lúc ñó, gen BSH
từ L. plantarum (Bsh1), L. casei (LSEI_0412) và BSH mã hóa pMP118 trong L.
salivarius (LSL_1801) có tính tương ñồng với BSH ortholog từ L. monocytogenes và
Enterococcus faecium. Thực tế, không có sự tương ñồng giữa các BSH ñã ñược xác
ñịnh từ L. casei (LSEI_0412) với các BSH từ các loài Lactobacilli khác tại thời ñiểm
phân tích. Những quan sát trên cho thấy rằng việc chuyển gen mã hóa BSH có thể là
khuynh hướng chung ñối với các vi sinh vật trong hệ tiêu hóa (Goh và Klaenhammer,
2008).
Những nghiên cứu gen gần ñây về ñáp ứng ñối với muối mật của L. acidophilus, L.
plantarum và L. reuteri dựa trên môi trường in vitro (Bron và cộng sự, 2004; Bron và
Công nghệ chế biến sữa và ñồ uống
21
cộng sự, 2006; Pfeiler và cộng sự, 2007) ñã mở rộng cái nhìn về cơ chế ở mức ñộ phân
tử của sự dung nạp muối mật ở các Lactobacilli trong hệ tiêu hóa. Nghiên cứu bởi
Bron và cộng sự (2004, 2006) sử dụng alr (mã hóa alanine racemase) và phương pháp
phân tích sao mã vi chuỗi cho thấy rằng gen mã hóa cho việc tổng hợp vỏ tế bào, hệ
thống dẫn truyền muối mật và protein liên kết với acid và ñáp ứng với stress oxy hóa

ñược cảm ứng bởi dịch mật của lợn. ðáng chú ý, 2 trong số các gen ñáp ứng muối mật
ñược cảm ứng trong quá trình di chuyển in vivo qua hệ tiêu hóa chuột (Bron và cộng
sự, 2004). Tương tự, những nghiên cứu về quá trình chuyển gen của L. reuteri ATCC
55730 khi ñược tiếp xúc với dịch mật bò cho thấy sự cảm ứng của gen liên kết với
những stress xảy ra trên vỏ tế bào, stress oxy hóa, biến tính protein và tổn thương
DNA trong khi gen vận chuyển cơ chất và trao ñổi chất bị giảm số lượng (Whitehead
và cộng sự, 2008). Sự hư hỏng của gen ñáp ứng lại stress gây ra bởi dich mật mã hoá
ClpL, một esterase hay một protein chưa biết càng tăng thì tính mẫn cảm của giống ñột
biến càng tăng. ðối với L. acidophilus, kết quả phân tích quá trình chuyển gen của
toàn bộ gen khi ñáp ứng lại dịch mật bò ñã khám phá ra rằng sự tăng số lượng operon
7 Kb bao gồm 8 gen mã hóa cho 1 2CRS, 1 protein vận chuyển, 1 enzyme
oxidoreductase và 4 protein giả ñịnh khác (hypothetical protein) (Pfeiler và cộng sự,
2007). Sự ñột biến 2CRS, protein vận chuyển và một trong số các protein giả ñịnh có
thể phá hủy khả năng chịu ñựng dịch mật trong khi ñột biến enzyme oxidoreductase và
các protein giả ñịnh còn lại thì lại làm tăng khả năng chịu dịch mật. ðiều này cho thấy
vai trò song song của operon này ñối với khả năng dung nạp cũng như tính mẫn cảm
với dịch mật của tế bào. Thật thú vị là gen bao gồm khả năng sử dụng lactose và
galactose và các yếu tố bám dính bề mặt tế bào cũng ñược xác ñịnh như là regulon ñáp
ứng lại stress từ dịch mật (Pfeiler và cộng sự, 2007). Những quan sát trên dẫn tới
những suy luận rằng dịch mật có thể ñóng vai trò như một tín hiệu từ môi trường và
chất chỉ thị vị trí khởi ñộng quá trình chuyển gen có vẻ quan trọng trong việc tiêu thụ
các chất dinh dưỡng từ sữa và làm tăng tác ñộng hỗ trợ với biểu mô ruột trong vật chủ.

2.3.4. Các nhân tố bề mặt tế bào:

Do sự quan trọng của probiotic cũng như là tác ñộng cộng sinh với hệ tiêu hóa vật
chủ ñã ñược nhận ra nên những nỗ lực ñã ñược ñặt ra nhằm tập trung vào nhận diện
những nhân tố bề mặt tế bào tiềm năng (Hình 2). Những tác ñộng hỗ trợ tới cơ thể vật
chủ ñược trung gian bởi yếu tố bám dính có thể làm tăng khả năng loại trừ những vi
sinh vật gây bệnh, tính bền của lớp niêm mạc ruột cũng như là khả năng kích thích

miễn dịch trong cơ thể vật chủ. Những nhân tố bám dính ñiển hình là protein hay
polysaccharide thể hiện trên bề mặt tế bào. Số lượng protein với các peptide tín hiệu
và/hay transmembrane domain (là những chuỗi xoắn α của protein xuyên màng tế bào
(transmembrane)) cho mỗi loài probiotic ñược thể hiện trong Hình 4. Vai trò của
protein bám vào màng nhầy (mucus-binding proteins – Mub) có tác dụng bám dính
vào lớp màng nhầy của ruột lần ñầu tiên ñược mô tả ñối với L. reuteri 1063 khi Roos
và Jonsson (2002) xác ñịnh ñược Mub có kích thước 358 kDa bám dính chọn lọc vào
glycoprotein của lớp nhầy trong ruột. Sự phát hiện Mub in silico ñược mã hóa trong
gen của Lactobacillus cho thấy rõ ràng sự hiện diện chiếm ưu thế của chúng trong hệ
tiêu hóa (Boekhorst và cộng sự, 2006). Mub chỉ ñược tìm thấy ñộc nhất trong
Quá trình lên men sản xuất Probiotic Lactobacilli

22

Lactobacilli ở ruột cho thấy rằng những protein này làm trung gian trong quá trình tác
ñộng lẫn nhau hay chức năng giữa vi khuẩn và vật chủ.
L. acidophilus có 13 protein chứa một hay nhiều hơn protein Mub nhưng chỉ 3
protein có cả chuỗi peptide tín hiệu và hệ thống bám vào bề mặt tế bào LPxTG (Tallon
and Klaenhammer, dữ liệu chưa công bố). Một trong những protein Mub này mã hóa
bởi LBA1392 gồm 4326 amino acid (residue) và là protein lớn nhất ñược mã hóa
trong gen (Hình 2) (Altermann và cộng sự, 2005). Kỹ thuật làm mất hoạt tính gen bằng
cách thêm ñoạn (insertional inactivation) áp dụng cho locus gen LBA1392 gây ra sự
giảm nghiêm trọng tới khả năng bám dính vào tế bào biểu mô Caco-2 in vitro (Buck và
cộng sự, 2005). Trong số các Lactobacilli bám vào hệ tiêu hóa thì L. gasseri có số
lượng lớn nhất protein Mub (14) (Alcarate-Peril và cộng sự, 2008). Những Mub này
chứa 6 – 12 chuỗi xoắn và có tính tương ñồng với Mub từ L. reuteri 1063 và L.
acidophilus (mã hóa bởi LBA1392). ðối với L. plantarum, một trong số Mub dự ñoán
của chúng ñược nhận biết như là chất bám dính vào mannose có bản chất giống lectin
(mannose-specific adhesin – Msa) (Pretzer và cộng sự, 2005). Protein bám vào bề mặt
tế bào Msa có 2 chuỗi xoắn giống như Mub của L. reuteri 1063 và 1 chuỗi lectin giống

ConA ñều có tác dụng bám vào chất nhận có chứa mannose trên bề mặt lớp niêm mạc.
Kết quả phân tích tin học công nghệ sinh học của những secretome (một tập hợp các
proteome có hoạt tính) dự ñoán trong L. salivarius ñược nhận dạng là 3 Mub tương
ñồng ñi kèm sortase, Mbp-1, LspA và LspC (van Pijkeren và cộng sự, 2006). LspA
ñột biến cho thấy sự giảm khả năng bám dính vào tế bào biểu mô HT29. Trong khi ñó,
mpb-1 xuất hiện như một gen giả, ngược lại, không có quá trình sao mã nào của lspC
ñược phát hiện trong ñiều kiện in vitro. Theo như van Pijkeren và cộng sự (2006), lspA
có thể ñạt ñược thông qua việc chuyển gen phụ do có hàm lượng GC cao (40%). Hệ
gen của L. johnsonii mã hóa 3 protein bề mặt có chứa chuỗi Mub giống như Mub của
L. reuteri 1063 (Pridmore và cộng sự, 2004). ðiều ñáng ngạc nhiên là vùng lặp amino
acid của 2 Mub, LJ0047 và LJ1839, khá giống protein SP18 bám trên bề mặt tế bào
tinh trùng bò nằm trong vùng gần ñầu gốc amino tự do của chuỗi protein hay HR44 ở
Homo sapiens.
Gen mã hóa protein bám vào fibronectin (fibronectin-binding protein – Fbp) ñược
duy trì trong tất cả các gen của Lactobacillus (Goh và Klaenhammer, 2008). L. brevis
cũng có một phiên bản thêm của gen fbp (LVIS_0267) trong ñó các protein tương tự
như các protein giả thiết trong L. plantarum và Fbp từ Enterococcus và Listeria. Kết
quả phân tích BlastB cho thấy Fbp từ nhóm L. acidophilus có tính ñồng nhất cao (77 –
88% chuỗi ñồng nhất) hơn là Fbp từ các loài khác cùng phả hệ (Goh và Klaenhammer,
2008). Buck và cộng sự (2005) cho thấy rằng FbpA từ L. acidophilus tham gia vào khả
năng bám dính của vi khuẩn vào tế bào biểu mô Caco-2 in vitro. L. plantarum cũng có
một protein bề mặt lớn gồm 3360 amino acid, Sdr, có ñộ lặp lại gần hoàn hảo Ser-Asp
khoảng 1600 gốc (Boekhorst và cộng sự, 2006; Kleerebezem và cộng sự, 2003). Sự
lặp lại Ser-Asp tương tự cũng ñược tìm thấy trong protein ClfB của Staphylococcus
aureus có khả năng bám vào fibrinogen (Hartford và cộng sự, 1997). 3 gen
glycosyltransferase xuất hiện ở vùng lân cận của clfB ñược dự ñoán có khả năng tổng
hợp ñược những cấu trúc giống màng nhầy mucin bao phủ bề mặt tế bào hay là trung
gian của những tác ñộng hỗ trợ lên vật chủ.
Công nghệ chế biến sữa và ñồ uống
23

Hình 2:
Những nhân tố bám dính ñược mô tả trong Lactobacilli. Những protein ñược
mô tả dựa trên những dữ liệu của Pfam


Quá trình lên men sản xuất Probiotic Lactobacilli

24



Hình 3:
Tỷ lệ gen mã hóa protein với peptide tín hiệu hay transmembrane domain

Cấu trúc bề mặt tế bào chủ yếu như lớp protein bề mặt (surface layer protein –
SLP), acid techoic (TA) và acid lipotechoic (LTA) cũng ñược xem như là chất trung
gian của quá trình bám dính và kích thích miễn dịch. Lớp S là những chuổi kết tinh
của những tiểu phần protein có rất nhiều trên bề mặt tế bào của ña số Eubacteria và
Archaebacteria. SlpA của L. brevis ATCC 8287 có thể bám vào rất nhiều loại tế bào
của người, fibronectin và laminin thông qua những vùng xác ñịnh chứa các hệ thống
nhận (de Leeuw và cộng sự, 2006). Cũng có kết quả cho rằng lớp S chiếm ưu thế trong
tế bào L. acidophilus mã hóa bởi slpA cũng tham gia tạo nên khả năng kết dính của tế
bào vào lớp biểu mô ruột (Buck và cộng sự, 2005). Sự ñột biến SlpA
-
không những
làm thay ñổi hình thái của tế bào mà còn làm giảm ñáng kể khả năng bám vào tế bào
Caco-2. Tuy nhiên, sự giảm khả năng bám dính cũng có thể là do mất những nhân tố
bám dính tiềm năng bám trên lớp S. Bằng cách sử dụng kháng thể ñơn dòng
(monoclonal antibodies), Granato và cộng sự (1999) nhận ra rằng LTA là một thành

phần không phải là portein trên bề mặt tế bào L. johnsonii tham gia vào khả năng bám
dính vào tế bào Caco-2. Một nghiên cứu gần ñây cũng cho thấy rằng ñột biến dltB của
L. plantarum với sự thay thế LTA bằng gốc D-ananyl làm tăng ñáng kể sự cảm ứng
của IL-10 và làm giảm ñáp ứng tăng hiện tượng viêm ở mẫu chuột viêm ruột kết
(Grangette và cộng sự, 2005). Trong một nghiên cứu về công nghệ chuyển gen in vivo
(in vivo expression technology – IVET), Walter và cộng sự (2005) cho rằng một trong
những gen cảm ứng ñặc hiệu bởi L. reuteri 100-23 trong ruột chuột mã hóa một
protein bề mặt có kích thước 300 kDa, Lsp. Sự làm vô hoạt gen lsp làm giảm khả năng
của giống ñột biến ñể bám vào tế bào biểu mô dạ dày trước của chuột in vivo và ex
vivo cũng như thay ñổi ñặc trưng sinh thái trong ruột chuột.
Có thể một trong những phát hiện thú vị nhất là yếu tố kéo dài Tu (EF-Tu) và
GroEL trong khả năng bám dính và kích thích miễn dịch của L. johnsonii (Bergonzelli
và cộng sự, 2006; Granato và cộng sự, 2004). Những nghiên cứu này mô tả sự khu trú
trên bề mặt tế bào LAB của EF-Tu và GroEL. Cả 2 EF-Tu và GroEL ñều ưu tiên bám
dính vào tế bào biểu mô và lớp nhầy ruột ở pH 5.5, giá trị pH rất gần với ñiều kiện
Công nghệ chế biến sữa và ñồ uống
25
sinh lý trong ruột non (Blum và cộng sự, 2000). Hơn nữa, sự tái kết hợp EF-Tu và
GroEL có khả năng gây ra ñáp ứng tăng viêm bằng cách cảm ứng việc tiết CD-14 ñi
kèm IL-8 tan trong tế bào biểu mô ruột HT29. GroEL tái tổ hợp chuyển từ L. johnsonii
sang một vi khuẩn Gram (+) khác cũng có khả năng thúc ñẩy ñặc hiệu sự kết chùm của
Helicobacter pylori. Ngoài những nhân tố bề mặt tế bào ñã ñược mô tả theo chức năng
ở trên, gen của L. johnsonii cũng mã hóa một danh mục ña dạng các nhân tố bám dính
khác, một vài trong số chúng ít gặp trong LAB (Pridmore và cộng sự, 2004). 2 trong
số 42 lipoprotein dự ñoán trên bề mặt tế bào có ñộ tương ñồng thấp so với kháng thể
kích thích tế bào T CD
4+
của L. monocytogenes và một protein gắn với nước bọt từ S.
sanguinis. Thêm vào ñó, 2 bộ gen tương tự như operon rìa (fimbrial operon) của
Streptococcus gordonii có thể mã hóa cho việc tổng hợp những protein nhung mao

liên kết với ñường trên bề mặt tế bào tương tự như Fap1 của Streptococcus
parasanguis và protein bám vào tiểu cầu GspB của S. gordonii. Kết quả phân tích gen
cũng khám phá ra một protein trên bề mặt tế bào khác tương tự như protease IgA của
Streptococci gây bệnh. L. johnsonii cũng có gen mã hóa fructosyltransferase ñược duy
trì giữa các giống L. johnsonii và L. gasseri cho thây rằng những loài này có khả năng
sản xuất polysaccharide fructan ñể bám dính vào tế bào biểu mô.

2.3.5. Sinh tổng hợp bacteriocin và sự miễn dịch:

Bacteriocin sản xuất bới LAB rất ña dạng dựa trên cấu tạo của vi khuẩn và chế ñộ
hoạt ñộng của chúng ñược phân loại thành bậc I, II, III và IV (Klaenhammer, 1993).
Khả năng của Lactobacilli sản xuất bacteriocin có thể góp phần tạo nên khả năng thích
nghi cạnh tranh của chúng trong môi trường sống. Hơn nữa, quá trình tổng hợp
bacteriocin là một ñặc ñiểm mong muốn trong việc chọn giống như là một cơ chế quan
trọng ñể loại trừ những yếu tố gây bệnh trong thực phẩm lên men cũng như là trong hệ
tiêu hóa. Nhóm gen tổng hợp bacteriocin ñược tìm thấy ở các loài LAB trong hệ tiêu
hóa cũng như là trong công nghiệp bao gồm L. brevis, L. casei và L. bulgaricus. L.
johnsonii NCC533 có một operon (LJ0763b ñến LJ0775) mã hóa sự sản xuất lactacin
F, một bacteriocin bậc II gồm 2 thành phần (Pridmore và cộng sự, 2004). Operon
lactacin F này tương ñồng với operon lactacin F của L. johnsonii VPI11088 (Allison
và cộng sự, 1994). Operon lactacin F ñược tạo thành từ các gen mã hóa phức hợp nhân
peptide của bacteriocin (lafAX), một thành phần miễn dịch (lafI), một 2CRS và hai hệ
thống vận chuyển ABC. Tuy nhiên, operon lactacin F trong NCC533 lại không có
chức năng do sự có mặt của thành phần IS trong gen histidine kinase của 2CRS gây trở
ngại sự sản xuất cũng như ñiều hòa quá trình sinh tổng hợp bacteriocin (Pridmore và
cộng sự, 2004).
Hệ thống ñảo gen (genomic island) pdu-cbi-cob-hem gồm 58 gen gần ñây ñược phát
hiện trong L. reuteri JCM1112
T
mã hóa sự sinh tổng hợp reuterin (mã hóa bởi pdu

operon) và cofactor cobalamin (mã hóa bởi nhóm operon cbi-cob-hem) (Morita và
cộng sự, 2008). Nhóm gen gupCDE trong operon pdu mã hóa enzyme glycerol
dehydratase xúc tác quá trình chuyển hóa glycerol thành reuterin. Sử dụng phương
pháp cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều (2D-NMR) với glycerol ñánh dấu
13
C
3
, Morita và
cộng sự (2008) cho thấy rằng reuterin ñược tổng hợp in vivo trong những con chuột thí
nghiệm có liên quan tới những giống hoang dại chứ không phải với giống ñột biến