ứng dụng công nghệ sinh học trong lên men bia

Công nghệ sinh học thực phẩm
MỤC LỤC
I. Cơ sở lý thuyết của quá trình lên men 3
II. Cơ sở hóa sinh của quá trình lên men 3
1. Quá trình đường hóa 3
2. Quá trình lên men 4
III. Công nghệ sinh học trong lĩnh vực tạo chủng lên men 7
1. Định nghĩa công nghệ sinh học phân tử 7
2. Phương pháp thành lập ADN tái tổ hợp 8
3. Ứng dụng CNSHPT để tạo chủng cải tiến trong lên men etanol 9
IV. Quá trinh thực hiện nuôi cấy trong phòng thí nghiệm 13
1. Chủng giống 14
2. Nguyên liệu cấy 14
3. Nhân giống 14
4. Chuẩn bị môi trường lên men 15
5. Nồi lên men 15
6. Thu nhân sản phẩm và xử lý sau thu hoạch 15
V. Đưa giống ra quy mô công nghiệp 17
1. Lò phản ứng 18
2. Quá trình lên men 20
VI. Ứng dụng công nghệ sinh học trong tạo chủng sản xuát bia 28
1. Men bia 28
2. Nuôi cấy giống men bia 29
3. Sử dụng các chế phẩm enzyme trong sản xuất bia 30
Trang 1
Công nghệ sinh học thực phẩm
I. CƠ SƠ LÍ THUYẾT LÊN MEN
Trong quá trình sản xuất bia, có thể nói lên men là một trong những giai đoạn
quan trọng nhất. Nếu ta sử dụng loại vi sinh vật không thuần chủng thì trong quá
trình lên men sẽ có thể sinh ra một số chất không mong muốn, ảnh hưởng đến chất
lượng bia (như mùi, vị, màu sắc ). Bên cạnh việc đòi hỏi giống vi sinh vật lên

men phải thuần chủng, ta còn mong muốn các giống đó có thêm một số đặc tính
ưu việt như có thể lên men tốt khi nhiệt độ tăng cao Do đó, người ta áp dụng
công nghệ sinh học để tạo ra chủng vi sinh vật cải tiến, mang các ưu điểm để tối
ưu hóa quy trình sản xuất.
Quy trình lên men (hình 4.1)


Hình 4.1 Sơ đồ quá trình lên men êtanol
II. CƠ SỞ HÓA SINH QUÁ TRÌNH LÊN MEN
1.Quá trình đường hoá:
Tinh bột được thuỷ phân thành các thành phần có phân tử lượng thấp trước
khi chuyển hoá thành êtanol. Các ennzyme quan trọng để bẻ gãy và biến đổi là
Trang 2
Men giống
Êtanol
Axetaldehit
Phosphatglix
erin
Glixerin
-P
+ CO
2
CH
3
CH
2
OH
CH
3
CHO

CH
2
OP
CHOH
CHO
NADH
2
NAD
+
CH
2
OH
CHOH
CH
2
OH
CH
2
OP
CHOH
CH
2
OH
C
6
H
12
O
6
CH

2
OP
CHOH
COOH
NAD
+
NADH
2
Phosphatglixe
rin
Glixerin
-P
photphataza
NADH
2
NAD
+
NADH
2
NAD
+
CH
2
OP
CHOH
CH
2
OH
CH
2

OP
CHOH
CH
2
OH
CH
2
OP
CHOH
CH
2
OH
C
6
H
12
O
6
Glucomylaza
Nguyên liệu
đã sacarit
hoá
Làm nguội
α -Amylaza
Hơi nước
Hạt đã
nghiền
Lên men
Giống nuôi
trên máy lắc

Nhân giống trong
nồi nhân giống
Giống nuôi trên
thạch nghiêng
chuẩn bị môi
trường lên men
Khử trùng
môi trường
Thu hoạch tinh chế sau
lên men
Khử trùng thiết bị, hệ thống
đường ống,hệ lọc khí
Cung cấp khí vô
trùng
Công nghệ sinh học thực phẩm
amilaza, glucoamalaza và glucoza . Quá trình này xảy ra qua hai quá trình: thuỷ
phân tinh bột và đường hoá nhiều giai đoạn bao gồm các phản ứng enzym và
không enzyme như sau:
Quy trình bắt đầu bằng gelatin hoá các hạt đã nghiền. Việc xử lí này-hấp ở
áp suất cao-làm bộc lộ bề mặt tinh bột làm cho sự thuỷ phân bằng enzyme dễ dàng
hơn. Sản phẩm của quá trình có cấu trúc giống gel.
Tinh bột đã gelatin hoá được làm nguội đến 50-60
o
C và bổ sung enzyme
α-amylaza. Trong bước hoá lỏng này, tinh bột giống gel được phân giải bằng
enzyme thông qua thuỷ phân liên kết α-1,4 để tạo thành các polysacarit phân tử
lượng thấp. Nhiệt độ cao được dùng vì sự thuỷ phân enzyme nhanh hơn ở nhiệt độ
cao và enzyme không thể đi qua tinh bột đã gelatin hoá một cách hiệu quả ở nhiệt
độ thấp
Bước cuối cùng để giải phóng glucoza gồm bổ sung glucoamylaza và tiến hành

sacarit hoá-thuỷ phân hoàn toàn-các polysacarit còn lại, kể cả phân tử mạch thẳng
cũng như có liên kết chéo.
Trang 3
Êtanol
Axetaldehit
Phosphatglix
erin
Glixerin
-P
+ CO
2
CH
3
CH
2
OH
CH
3
CHO
CH
2
OP
CHOH
CHO
NADH
2
NAD
+
CH
2

OH
CHOH
CH
2
OH
CH
2
OP
CHOH
CH
2
OH
C
6
H
12
O
6
CH
2
OP
CHOH
COOH
NAD
+
NADH
2
Phosphatglixe
rin
Glixerin

-P
photphataza
NADH
2
NAD
+
NADH
2
NAD
+
CH
2
OP
CHOH
CH
2
OH
CH
2
OP
CHOH
CH
2
OH
CH
2
OP
CHOH
CH
2

OH
C
6
H
12
O
6
Glucomylaza
Nguyên liệu
đã sacarit
hoá
Làm nguội
α -Amylaza
Hơi nước
Hạt đã
nghiền
Lên men
Nguyên liệu đã galetin hoá
Nguyên liệu đã hoá lỏng
Hạt đã nghiền
Hơi nước
α -Amylaza
Làm nguội
Nguyên liệu đã sacarit hoá
Glucomylaza
Cơng nghệ sinh học thực phẩm
2.Q trình lên men
Bản chất sinh hố của q trình lên men gồm 2 thời kì:
+ Thời kì cảm ứng:
Ở giai đoạn này chất tiếp nhận H

2
của enzym ancolđehydrogenaza là
axetandehyt được tạo thành chưa đủ, do đó enzymn sẽ chuyển H
2
đến cho
andehytphotphatglicerinio. Dưới tác dụng của enzym photphataza,
photphatglicerin bò thuỷ phân để tạo thành glicerin. Như vậy trong môi trường
sẽ hình thành glicerin và CO
2
.
+Thời kì tónh (thời kì sinh rượu )
Đến lúc này lượng axetandehyt là cơ chất bình thường của enzym
ancoldehydrogenaza được tạo thành đã có nhiều, nên enzym sẽ chuyển H
2
đến
cho cơ chất của nó và rượu etylic được hình thành từ đo.ù
Trang 4
Êtanol
Axetaldehit
Phosphatglix
erin
Glixerin
-P
+ CO
2
CH
3
CH
2
OH

CH
3
CHO
CH
2
OP
CHOH
CHO
NADH
2
NAD
+
CH
2
OH
CHOH
CH
2
OH
CH
2
OP
CHOH
CH
2
OH
C
6
H
12

O
6
CH
2
OP
CHOH
COOH
NAD
+
NADH
2
Phosphatglixe
rin
Glixerin
-P
photphataza
NADH
2
NAD
+
NADH
2
NAD
+
CH
2
OP
CHOH
CH
2

OH
CH
2
OP
CHOH
CH
2
OH
CH
2
OP
CHOH
CH
2
OH
C
6
H
12
O
6
Glucomylaza
Ngun liệu
đã sacarit
hố
Làm nguội
α -Amylaza
Hơi nước
Hạt đã
nghiền

Lên men
C
6
H
12
O
6
CH
2
OP
CHOH
CH
2
OH
CH
2
OP
CHOH
CH
2
OH
CH
2
OP
CHOH
CH
2
OH
NAD
+

NADH
2
NAD
+
NADH
2
photphataza
-P
Phosphatglixerin Glixerin
Cơng nghệ sinh học thực phẩm
Glixerin chỉ được tạo nên trong giai đoạn cảm ứng nên chỉ là sản phẩm phụ
trong môi trường acid
Phương trình tổng quát của quá trình lên men:

Trang 5
C
6
H
12
O
6
+2ADP +2H
3
PO
4
= 2C
2
H
5
OH + CO

2
+2ATP +2H
2
O (28,3KCAL)
NADH
2
NAD
+
CH
2
OP
CHOH
COOH
C
6
H
12
O
6
CH
2
OP
CHOH
CH
2
OH
CH
2
OH
CHOH

CH
2
OH
NAD
+
NADH
2
CH
2
OP
CHOH
CHO
CH
3
CHO
CH
3
CH
2
OH
+ CO
2
-P
GlixerinPhosphatglixerin
Axetaldehit Êtanol
Công nghệ sinh học thực phẩm
III. CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG LĨNH VỰC TẠO
CHỦNG LÊN MEN
Trước đây, trong công nghiệp thực phẩm, các nghiên cứu công nghệ sinh học
được sử dụng chủ yếu để hoàn thiện các quy trình công nghệ lên men truyền

thống. Còn hiện nay, các nghiên cứu công nghệ sinh học chủ yếu liên quan đến
việc tạo ra các chủng mới có năng suất sinh học cao và việc áp dụng chúng vào
các công nghệ lên men hiện đại.
1.Định nghĩa công nghệ sinh học phân tử:
Sự kết hợp công nghệ ADN tái tổ hợp và công nghệ sinh học đã tạo ra một
lĩnh vực nghiên cứu có tính cạnh tranh cao, đầy triển vọng, được gọi là công nghệ
sinh học phân tử
Công nghệ sinh học: Có nền tảng chắc chắn dựa trên kinh nghiệm nghiên
cứu vi sinh vật học, hoá sinh học và kỹ thuật hoá học
Công nghệ ADN tái tổ hợp: Còn được gọi nhân dòng gen hay nhân dòng
phân tử, là một khái niệm bao quát, gồm một số quy trình thí nghiệm dẫn đến việc
chuyển thông tin di truyền (ADN) từ sinh vật này sang sinh vật khác.
Đây là một phương pháp hiệu quả trong việc tạo chủng trong lĩnh vực lên
men vì: Nhiều hoạt tính của các chủng sản xuất là do sai hỏng di truyền. Việc lựa
chọn các chủng sản xuất trước hết là theo kinh nghiệm. Những thành tựu của sinh
học phân tử như chủ động gây đột biến định hướng, chuyển gép gen tạo điều
kiện cho việc lựa chọn định hướng hơn và do đó có hiệu quả cao hơn.
2. Các phương pháp thành lập phân tử ADN tái tổ hợp để thực hiện
thao tác tạo chủng:
2.1. Phương pháp sử dụng các đầu dính
Bất kỳ đoạn AND
(1)
nào nếu được cắt bởi cùng một loại enzyme giới hạn (ví
dụ EcoRI) tạo các đầu dính thì có thể dính líp lại với nhau và được nối bởi ADN
Trang 6
Công nghệ sinh học thực phẩm
ligase (hình 3.4). Năm 1973, H. Boyer và tập thể của S. Cohen đã tạo ra được
phân tử ADN tái tổ hợp đầu tiên gồm vector là plasmid
(2)
nhỏ pSC101 của E. coli

và ADN “ngoại lai” là một plasmid khác. Chính sự kiện này đặt ra triển vọng to
lớn cho kỹ thuật ADN tái tổ hợp sau này.
2.2. Phương pháp nối trực tiếp hoặc tổng hợp các đầu bổ sung
Đối với các đoạn ADN được tạo ra bằng việc xử lý enzyme giới hạn
(5)
cắt
thẳng, như HindII chẳng hạn, thì việc nối các đoạn ADN đầu bằng được thực hiện
theo một trong hai cách sau:
(1) Nối trực tiếp nhờ ADN -ligase của phage
(11)
T
4

(2) Tổng hợp bổ sung các đầu dính vào các đầu 3’ một số nucleotid, ví dụ:
poly (dA) vào đầu 3’ của đoạn này và poly (dT) vào đầu 3’ của đoạn kia, nhờ
enzyme transferase đầu mút. Sau đó các đoạn này được nối lại nhờ xúc tác của
ADN-ligase vi khuẩn.
2.3. Tạo dòng ADN tái tổ hợp
Mục đích của việc tạo dòng
(4)
là nhằm thu được một số lượng lớn bản sao
của một đoạn ADN xác định.
Về nguyên tắc, một quy trình kỹ thuật ADN tái tổ hợp (tạo dòng) gồm các
bước cơ bản sau :
Bước 1: Tách ADN và plasmid ra khỏi tế bào, chọn lọc và xử lý ADN thuộc
các nguồn khác nhau, một làm vector và một cần cho tạo dòng.
Đối với vecto
(3)
, việc chọn lọc tùy thuộc nhiều yếu tố: kích thước đoạn cần
tạo dòng, mục đích tạo dòng Đối với ADN cần tạo dòng, cần chọn sơ khởi các

đoạn có kích thước gần nhau và tương ứng với loại vector. Sau đó, xử lý cả hai
loại ADN trên bởi cùng một loại enzyme giới hạn (ví dụ: EcoRI) để tạo ra các đầu
(dính) so le.
Trang 7
Công nghệ sinh học thực phẩm
Bước 2: Kiến tạo phân tử ADN tái tổ hợp trong ống nghiệm
Hình 3.4: Sơ đồ minh họa các bước cơ bản của kỹ thuật di truyền
Trộn chung vector và ADN cần tạo dòng đã được xử lý theo một tỷ lệ nhất
định với sự có mặt của ligase. Nhờ sự xúc tác của ADN-ligase mà vector tái tổ hợp
sẽ được tạo thành; sau đó được tinh sạch qua tách chiết và tủa.
Bước 3: Đưa vector tái tổ hợp vào tế bào chủ.
Có hai loại tế bào chủ thông dụng nhất là: (1) Tế bào vi khuẩn, thường là E.
coli; (2) Tế bào sinh vật nhân chuẩn, ví dụ nấm men S. cerevisiae hoặc tế bào
động-thực vật nuôi cấy. Tùy loại tế bào chủ mà sử dụng kỹ thuật biến nạp
(8)
thích
hợp. Nói chung, mục đích của bước này là lợi dụng đặc tính sinh sôi nẩy nở nhanh
của tế bào chủ và sử dụng bộ máy tế bào chủ để tái bản vector tái tổ hợp thành một
số lượng lớn bản sao hoặc có thể cho biểu hiện gen (protein) mong muốn.
Bước 4: Phát hiện dòng ADN tái tổ hợp đặc hiệu.
Trang 8
Công nghệ sinh học thực phẩm
Để phát hiện dòng cần tìm, người ta có thể sử dụng công cụ là mẫu dò
(probe). Mẫu dò có thể là một kháng thể đặc trưng cho protein được mã hóa bởi
gen cần tìm hoặc một đoạn ADN hoặc ARN bổ sung cho gen cần tìm.
3. Ứng dụng công nghệ sinh học phân tử trong tạo chủng cải tiến sản
xuất lên men êtanol:
Những nghiên cứu sau đây sẽ cho ta hiểu rõ hơn quá trình áp dụng công
nghệ sinh học để tạo ra chủng mới tối ưu hoá sản xuất
Các khả năng có thể xảy ra:

 Các dạng khác nhau của α-amylaza tự nhiên hoặc đã biến đổi gen có thể
được dùng để hoạt động có hiệu quả tại 80-90
o
C và cho phép bước hoá lỏng
được thực hiện tại nhiệt độ này.
 α-amylaza bền nhiệt sẽ đẩy nhanh quá trình thuỷ phân tinh bột đã gelatin
hoá đồng thời làm giảm năng lượng cần để làm nguội tinh bột đã làm
gelatin hoá đến nhiệt độ thích hợp cho quá trình thuỷ phân tinh bột
 Các gen α-amylaza và glucoamylaza có thể được thay đổi sao cho các
enzyme sẽ có cùng nhiệt độ và pH tối ưu, do vậy có thể tiến hành quá trình
lỏng hoá và sacarit ở cùng các điều kiện.
 Một enzyme phân huỷ hiệu quả tinh bột có thể được tìm thấy hoặc được cải
biến gen để có thể bỏ qua bước gelatin hoá và do vậy tiết kiệm được nhiều
năng lượng
 Sinh vật lên men có thể tổng hợp và tiết ra glucoamylaza có thể được phát
triển để không cần bổ sung enzyme này trong quá trình lên men
Một loạt nghiên cứu đã được bắt đầu nhằm xác định xem các khả năng trên có khả
thi không.
Trang 9
Công nghệ sinh học thực phẩm
3.1. Đối với quá trình đường hoá:
Các gen mã hoá α-amylaza đã được phân lập từ
một số vi sinh vật khác nhau, gồm B.amyloliquefacient
và vi khuẩn chịu nhiệt Bacillus stearothermophilus.
Tóm lại AND nhiễm sắc thể được phân lập, cắt một
phần bằng enzyme giới hạn Sau3AI, sau đó nối vào
AND pUB110 đã được cắt bởi BamHI. Plasmit này có vị
trí BamHI và mang gen kháng kanammyxin. Ngân hàng
clon được biến nạp vào Bacillus Subtilis, không có hoạt
tính

α-amylaza và các thể biến nạp được chọn dựa trên tính kháng kamakyxin.
Mọi biến thể nạp đã tạo khuẩn lạc tại 65
o
C trên môi trường rắn chứa tinh bột, các
đĩa cho tiếp xúc với hơi iot. Các khuẩn lạc sinh α-amylaza được bao quanh bởi
vùng trong suốt, dễ phân biệt, chứng tỏ tinh bột ở vùng lân cận với tế bào đó đã bị
thuỷ phân. Kết quả dương tính của thử nghiệm iot-tinh bột đã xác nhận rằng tế bào
đã biến nạp có gen
α-amylaza được phiên mã từ promoto của chính nó vì vectơ không mang
promoto. Ngoài ra, tín hiệu tiết cũng xuất hiện vì cơ chất lớn không thể xâm nhập
vào tế bào và do vậy vùng trong suốt phải do hoạt tính của α-amylaza được tiết ra.
Sự có sẵn các gen α-amylaza từ các nguồn khác nhau cho phép các nhà nghiên cứu
thực hiện các biến đổi gen đặc hiệu để đáp ứng nhu cầu của các quy trình công
nghiệp cụ thể.
3.2. Đối với quá trình lên men:
Với mục đích bỏ qua bước sacarit hoá trong quá trình sản xuất alcohol từ
tinh bột trong quá trình sản xuất alcohol từ tinh bột, các nhà nghiên cứu đã phân
lập AND bổ sung (ADNbs) có chiều dài đầy đủ của glucoamylaza từ nấm
Aspergillus awamori vào nhân dòng plasmit Saccharomyces cerevisae dưới sự
Trang 10
Hình 13.15. Phát hiện clon B.subtilus
biểu hiện gen α-amylaza .Vùng trong
là kết quả của sự phân huỷ tinh bột
trong môi trường ở xung quanh clon
bởi α-amylaza được tiết ra
Công nghệ sinh học thực phẩm
kiếm soát của promoto và các tín hiệu điều hoà kết thúc phiên mã từ gen enolaza
(ENOI) của nấm men. Chủng S.cerevisae phòng thí nghiệm đã biến nạp với
plasmit mang ADNbs glucoamylaza có thể biểu hiện hoạt tính đó và lên men tinh
bột hoà tan thành alcohol, do đó đã chứng tỏ cách tiếp cận này là khả thi

Thật không may, chủng S.cerevisae phòng thí nghiệm này có một số đặc tính
làm nó kém thích hợp cho các quá trình thương mại, đó là không có khả năng
chống chịu nồng độ alcohol cao, biểu hiện không hiệu quả ADNbs glucoamylaza
và mất plasmit dưới các điều kiện đặc biệt ( áp lực chọn lọc) được dùng để bảo
quản chúng. Tuy nhiên, các vấn đề này không phải là không thể vượt qua:
 Thứ nhất, mức biểu hiện glucoamylaza tăng gấp năm lần bằng cách loại bỏ
vùng điều hoà âm 175 bp khỏi promoto ENOI trên plasmit.
 Thứ hai, plasmit được cải biến bằng loại bỏ gốc sao chép của nấm men và
bổ sung đoạn ADN tương đồng với vị trí trên nhiễm sắc thể nấm men và do
đó chuyển thành vectơ cài nhập. Với dạng plasmit này, cấu trúc
glucoamylaza hoàn chỉnh được kết hợp vào vị trí trên nhiễm sắc thể và
được duy trì bền vững.
 Thứ ba, một chủng S.cerevisae khác (nấm men bia) kháng với nồng độ
alcohol cao được dùng như tế bào vật chủ. Vectơ cài nhập được dùng để
biến nạp chủng nấm men này
Kết quả của những thay đổi này là các nhà nghiên cứu đã tạo ra hai chủng
nấm men mới hoạt động tốt hơn so với nấm men tự nhiên trong thuỷ phân tinh bột,
Saccharomyces diastaticus rất gần giống với S.cerevisae và có thể thuỷ phân và
lên men tinh bột hoà tan.Chủng lên men bia, có gen glucoamylaza cài nhập, có
hiệu suất vượt trội so với chủng phòng thí nghiệm có cùng gen trên một plasmit có
nhiều bản sao. Sự khác biệt này có lẽ phản ánh sự không ổn định của plasmit cùng
sự thải loại gen glucoamylaza được đưa vào. Không một chủng S.cerevisae nào
trong số các chủng phòng thí nghiệm cũng như chủng lên men bia có khả năng sử
dụng tinh bột hoà tan nếu không được biên nạp với glucoamylaza nhân dòng. Ở cả
dạng hoà plasmit lẫn cài nhập, ADNs glucoamylaza A.awamori được đặt dưới sự
Trang 11
Công nghệ sinh học thực phẩm
kiểm soát của tín hiệu điều hoà ENOI mà từ đó vùng điều hoà âm 157 bị loại bỏ.
Plasmit được duy trì dưới áp lực chọn lọc
Trang 12

Công nghệ sinh học thực phẩm
IV. QUÁ TRÌNH THỰC HIỆN NUÔI CẤY TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM
1) Chủng giống
Để chọn được giống vi sinh vật thuần chủng, bước đầu tiên phải phân lập
chúng từ các nguồn tự nhiên như nước, không khí, đất, các vật liệu hữu cơ, vô cơ
đã bị phân hủy Từ những kĩ thuật vi sinh vật học cổ điển từ thời L. Pasteur và R.
Koch đề ra, nhiều phương pháp đặc biệt dùng để phân lập chủng giống thuần khiết
dùng cho công nghiệp đã được phát triển, nhất là trong việc tìm chủng sản xuất
những chất kháng sinh mới. Từ những ổ sinh thái tự nhiên sẽ phân lập được các
chủng hoang dại. Các chủng này có một số hoạt tính sinh enzyme, tích tụ các chất
trao đổi bậc 1, bậc 2 nhưng thường cho năng suất thấp.
2) Nguyên liệu cấy
Giống sản xuất thường được bảo quản để tránh giảm hoạt tính. Do đó, việc
cấy giống trên môi trường thạch nghiêng trước khi nhân giống là việc làm rất cần
thiết. Có thể coi đây là việc “đánh thức” chủng giống đồng thời để kiểm tra hoạt
tính của giống sau một thời gian bảo quản ở nhiệt độ thấp. Từ những những tế bào
hoặc bào tử riêng rẽ của chủng bảo quản, cấy ra một số tế bào hoặc bào tử đặc
trưng, những tế bào hoặc bào tử đặc trưng này được nhân giống trong phòng thí
nghiệm và được kiểm tra hoạt tính. Nếu có sự khác nhau thì dùng những bào tử
hoặc tế bào có hoạt tính mạnh nhất để gây nguyên liệu cấy và tạo thành chủng
mới.
3) Nhân giống
Cũng giống như trong phòng thí nghiệm, muốn thực hiện một quá trình lên
men ở qui mô công nghiệp phải tiến hành nhân giống, đảm bảo số lượng tế bào
với tuổi sinh lí đang ở thời kỳ hoạt động mạnh nhất để cấy vào môi trường lên
men. Nhân giống ở đây có thể phải qua 2-3 bước, ta thường gọi là nhân giống cấp
1, cấp 2, cấp 3 v.v tuỳ thuộc vào quy mô sản xuất. Việc nhân giống thường diễn
Trang 13
Công nghệ sinh học thực phẩm
ra bằng cách nuôi chìm. Các điều kiện nuôi được lựa chọn sao cho chỉ xảy ra sự

sinh trưởng chứ không xảy ra sự tạo thành sản phẩm. Nhân giống cấp 1 được tiến
hành trên máy lắc với nhiệt độ và thời gian tuỳ thuộc vào nồi nhân giống (tương tự
nồi lên men) có sục khí và ổn nhiệt. Tỷ lệ nhân giống từ ống nghiệm vào bình tam
giác có thể chỉ một vòng que cấy hoặc cả dịch huyền phù của một ống giống. Từ
nhân giống cấp 1 sang cấp 2 (hoặc từ cấp 2 sang cấp 3) tỉ lệ giống thường là 1-
10% thể tích dịch lên men hoặc là cao hơn, từ dịch nhân giống cuối cùng vào nồi
lên men khoảng 0,5-10% tuỳ thuộc vào đặc tính từng chủng vi sinh vật.
Thành phần môi trường nhân giống và môi trường lên men gần giống
nhau. Thông thường thì hàm lượng carbon ở môi trường nhân giống thấp hơn môi
trường lên men, nhưng các thành phần khác thì giàu hơn, đặc biệt là các chất sinh
trưởng để phục vụ cho sinh sản và phát triển của giống vi sinh vật
Chế độ nuôi đặc biệt là nhiệt độ giữa nhân giống và lên men cũng khác
nhau (nếu cùng chế độ nhiệt độ thì không cần phải quan tâm lắm). Nhưng nếu
nhiệt độ lên men thấp (như lên men bia) thì cần phải nhân giống với nhiệt độ giảm
dần để khi vào lên men, giống không bị choáng sốc. Chế độ sục khí ở các công
đoạn này cũng khác nhau, thường thì trong thời gian nhân giống nhu cầu về ôxy
cao như trong pha sinh trưởng của lên men hoặc cao hơn.
Nói chung một chủng vi sinh vật nhân giống để đưa vào lên men đảm bảo
các yêu cầu công nghệ như sau:
- Dịch giống không được tạp nhiễm, đặc biệt là thực khuẩn thể
(Bacteriophage).
- Các tế bào đảm bảo ở độ tuổi sinh lí ở thời gian sinh trưởng tốt nhất, có
hoạt tính cao nhất, thường là nữa sau của pha chỉ số.
- Các thông số kĩ thuật như OD, pH, màu sắc, mùi vị đúng như quy định
của từng dây chuyền công nghệ.
Trang 14
Công nghệ sinh học thực phẩm
4) Chuẩn bị môi trường lên men:
Khi lên men êtanol từ tinh bột của hạt hoặc củ thì trước hết cần phải chuyển các
gluxit phức tạp của nguyên liệu đó thành các đường đơn giản thông qua quá trình

đường hoá
5) Nồi lên men
Các nồi lên men được thiết kế và chế tạo sao cho có thể tạo được những điều
kiện tối ưu cho từng quá trình lên men. Những yêu cầu có thể đạt được hoạt tính
tối đa của vi sinh vật được thực hiện thông qua một số nguyên tắc kĩ thuật.
Nồi lên men chứa môi trường nuôi có khả năng tạo thành sản phẩm với năng
suất cao. Trong qúa trình lên men cần theo dõi liên tục sự tạo thành sản phẩm và
trạng thái vô trùng để dừng quá trình đúng vào thời điểm thu hoạch tốt nhất.
6) Thu nhận sản phẩm và xử lí sau thu hoạch
Việc thu nhận sản phẩm được bắt đầu bằng cách tách riêng tế bào ra khỏi
môi trường dinh dưỡng. Nếu là những cơ thể có dạng hệ sợi thì người ta thường
lọc, còn đối với vi khuẩn và nấm men thì li tâm. Việc xử lý tiếp theo là tuỳ theo
sản phẩm được tiết ra môi trường dinh dưỡng hay tồn tại trong tế bào.
Bản chất hoá học của sản phẩm quy định các biện pháp xử lý tiếp theo. Các
biện pháp được sử dụng là chiết rút, hấp phụ, sàng phân tử và kết tủa. Các bước
tinh chế tiếp theo được tiến hành kế tiếp ngay sau bước tách sản phẩm thường phải
qua nhiều cấp, trước khi sản phẩm cuối cùng được đóng gói.
Việc thu nhận sản phẩm với hiệu suất cao có ý nghĩa quyết định đối với tính kinh
tế của một phương pháp. Bởi vậy, vấn đề tách và cô lập sản phẩm phải được chú ý
ngay từ khi chọn chủng và chọn dịch dinh dưỡng. Việc tối ưu hoá phương pháp có
liên quan đến tất cả các bước. Việc loại bỏ và sử dụng các phế và phụ phẩm cũng
cần được chú ý tránh gây ô nhiễm môi trường
Trang 15
Công nghệ sinh học thực phẩm
V. ĐƯA GIỐNG VÀO QUY MÔ CÔNG NGHIỆP:
Các công nghệ ADN tái tổ hợp được dung hợp tế bào được khởi đầu bởi
những nghiên cứu thuần túy và các kết quả cuối cùng có thể phát triển thành tế bào
mới có thể sản xuất sản phẩm với một lượng ít ỏi ở quy mô phòng thí nghiệm. Tuy
nhiên, kết quả của nó thì lại rất có ý nghĩa thương mại và vì thế nó được phát triển
trong quy mô công nghiệp với một công nghệ khả thi và có hiệu quả kinh tế. Để

phát triển thành quy trình công nghiệp lớn, chúng ta không thể đơn thuần tăng
kích thước của bình nuôi cấy (vessel) lên.
Ví dụ: ở quy mô phòng thí nghiệm là 100ml, một bình tam giác nhỏ nuôi
trên một máy lắc là phương thức lý tưởng để nuôi cấy tế bào. Nhưng đối với hoạt
động ở quy mô lớn 2000L, chúng ta không thể sử dụng bình nuôi khác có thể tích
lớn hơn và lắc nó, mà cấn phải thiết kế một hệ lên men (fermenter) hay còn gọi là
nồi phản ứng sinh học (bioreactor) hiệu quả để nuôi cấy tế bào trong những điều
kiện tối ưu nhất.
Để minh họa cho điều này, có thể xem một quá trình sinh học đặc trưng bao
gồm các tế bào vi khuẩn. Các nguyên liệu thô (thường là sinh khối) được xử lý và
trộn với các thành phần cần thiết khác để tế bào có thể sinh trưởng tốt trong một
hỗn hợp dịch lỏng, môi trường nuôi cấy được khử trùng để có thể loại bỏ tất cả các
cơ thể sống và đưa vào bình nuôi cấy hình trụ lớn, thiết bị đặc trưng với cánh
khuấy, vách ngăn, hệ thống thông khí và các bộ phận cảm biến để điều khiển các
điều kiện lên men. Một chủng vi sinh vật cần thiết sẽ được đưa vào bình nuôi cấy.
Các tế bào khởi đầu sinh sản theo hàm mũ sau một thời gian nhất định của pha log
và đạt tới nồng độ tế bào cực đại của môi trường đã được sử dụng hết. Sự lên men
sẽ được hình thành và các thành phần sẽ được thoát ra để thu hồi sản phẩm và để
tinh sạch chúng. Quá trình này sẽ được thực hiện theo kiểu lên men theo mẻ (batch
culture) hoặc liên tục (continuous culture)
Khi tiến hành một quá trình sinh học (bioprocessing) trên quy mô công
nghiệp cần lưu ý:
Trang 16
Công nghệ sinh học thực phẩm
• Phải thu được các chất xúc tác sinh học tốt nhất (vi sinh vật, tế bào động
vật, tế bào thực vật hoặc enzyme) cho một quá trình mong muốn. Vấn đề
này đã được đề cập ở phần trên.
• Tạo ra môi trường tốt nhất có thể cho sự xúc tác bằng cách thiết kế các
bioreactor/fermenter thích hợp và cho nó hoạt động theo một phương thức
tối ưu.

• Phân tách các sản phẩm mong muốn từ hỗn hợp phản ứng trong một
phương thức kinh tế mới nhất.
1. Lò phản ứng sinh học:
Lò phản ứng sinh học được chia thành ba nhóm cơ bản:
• Lò phản ứng bể khuấy có cánh khuấy cơ học bên trong.
• Cột sục khí, dựa vào việc đưa không khí hoặc các khí khác đẻ tạo ra sự
khuấy trộn.
• Lò phản ứng khí nén, có cả một vòng trong và một vòng ngoài; sự trọn và
tuần hoàn dung dịch nuôi cấy trong các lò phản ứng này là kết quả của sự
chuyển động khí (thường là không khí) gây ra sự khác biệt mật độ giữa các
phần khác nhau của lò phản ứng sinh học.
Lò phản ứng sinh học cổ truyền và được phổ biến rộng rãi nhất là lò phản
ứng bể khuấy. Kiểu lò phản ứng sinh học này có một số ưu điểm so với các cấu
hình lò phản ứng khác:
• Có các điều kiện hoạt động linh hoạt cao.
• Đã có sẵn ở dạng thương phẩm.
• Cho sự vận chuyển khí hiệu quả đến các tế bào vi sinh vật đang phát triển.
Hoặc theo cách nói của kĩ sư lên men, hệ số chuyển sinh khối về thể tích,
k
L
a, của STR cao.
• Được sử dụng rộng rãi bởi các kĩ sư lên men và các nhà vi sinh vật để nuôi
nhiều loại vi sinh vật khác nhau.
Trang 17
Công nghệ sinh học thực phẩm
Ở một STR, khí, thường là không khí, được bổ sung vào môi trường nuôi
cấy dưới áp suất qua thiết bị gọi là máy sục khí, có thể là một vòng với nhiều lỗ
nhỏ hoặc một ống với một vòi phun duy nhất. Mặc dù các vòng sục khí tạo ra bọt
khí nhỏ hơn và do vậy tạo sự phân phối khí ban đầu tốt hơn, nhưng các ống sục
khí thường được ưa chuộng trong sử dụng ở quy mô nhỏ (<20 lít) vì chúng ít bị tắc

hơn. Muốn phân phối khí tốt trong lò phản ứng sinh học ngoài máy sục khí còn
cần phải có một hoặc nhiều cánh khuấy (máy khuấy). Sự khuấy cơ học môi trường
nuôi cấy bằng cánh khuấy làm phá vỡ các bọt khí lớn thành bọt nhỏ hơn, phân bổ
các bọt khí đến mọi nơi trong môi trường và kéo dài thời gian tồn tại của bọt khí
trong lò phản ứng. Với mức khuấy cao, kích thước trung bình của của phản ứng
trong lò phản ứng sinh học lớn không bị phụ thuộc với kích thước các lỗ trên máy
sục khí. Kiểu cánh khuấy, tốc độ quay và các đặc tính lí hóa của pha lỏng là các
yếu tố quan trọng làm tăng hiệu quả phân bố khí. Tuy nhiên, ở các lò phản ứng
sinh học lớn, nếu sự phân bố khí ban đầu từ máy sục khí không đồng nhất trong
bể, thì sự khuấy kĩ lưỡng cũng không thể tạo một trường khí đồng nhất.
Do bản chất ăn mòn hoặc mài mòn của nhiều môi trường nuôi cấy và quy
trình khử trùng, STR thường được làm bằng thép không gỉ hoặc thủy tinh. Các bộ
phận thủy tinh thường chỉ được dùng trong các lò phản ứng sinh học ở quy mô
phòng thí nghiệm < 50 lít.
Một số hạn chế về kích thước lò phản ứng sinh học là khả năng hệ thống
loại bỏ hiệu quả nhiệt tạo thành do sự trao đổi chất của tế bào đang sinh trưởng
hoặc năng lượng tạo ra từ cánh khuấy. Nhiều nhiệt quá sẽ làm tăng nhiệt độ và
thay đổi trạng thái sinh lí của tế bào và giảm năng suất sản phẩm. Nhiệt có thể
được loại bỏ bằng lớp áo lạnh xung quanh lò phản ứng hoặc bằng các lõi bên
trong. Mặc dù các vòng làm lạnh bên trong hiệu quả hơn so với lớp áo bên ngoài
trong việc giữ cho phản ứng lên men ở nhiệt độ gần với nhiệt độ mong muốn,
nhưng các vòng làm lạnh đều bị phủ bởi vi sinh vật ngăn trở việc làm lạnh và
chúng đôi khi cản trở việc khuấy trộn dung dịch lên men.
Trang 18
Công nghệ sinh học thực phẩm
Sự nhiễm nấm hoặc vi khuẩn trong qua trình lên men thường rất nguy hại.
Do vậy, các lò phản ứng sinh học được thiết kế sao cho có thể khử trùng được,
thường là bằng hơi áp lực, phải không có khoảng không hoặc bề mặt chết bên
trong mà hơi nước không thể đến trong quá trình khử trùng. Mọt vết hàn, đầu dò
và các van cũng là loại khử trùng hơi nước được. Khi thiết kế một lò phản ứng,

cần tính toán sao cho có thể lặp một bộ đầy đủ các đầu dò – để giám sát mội thông
số có thể của quá trình lên men – nhưng lại chỉ tạo ít lỗ cho đầu dò nhất. Với thiết
kế ít lỗ việc duy trì vô trùng sẽ dễ dàng hơn.
Khuấy mạnh môi trường nuôi trong quá trình phản ứng lên men thường gây
tạo nhiều bọt. Quá nhiều bọt có thể làm ướt lưới lọc ở các cửa mà làm thoát không
khí ra khỏi lò phản ứng, do đó vừa giảm lưu thông khí của dung dịch lên men vừa
tạo con đường để các tế bào lây nhiễm đi vào. Các yếu tố chống tạo bọt hóa học
hoặc cơ học có thể được dùng để kiểm soát việc tạo bọt. Tuy nhiên, các yếu tố hóa
học có thể làm giảm sự sinh trưởng vi sinh vật bằng cách ngăn cản sự vận chuyển
oxy hoặc trong một số trường hợp kìm hãm enzym tế bào. Hơn nữa, nếu hợp chất
chống tạo bọt không bị loại bỏ trước khi chế biến sản phẩm, nó có thể nhiễm vào
sản phẩm cuối cùng. Sự tạo bọt cũng có thể kiểm soát bằng cung cấp “ khoảng
trống bên trên dung dịch mà bọt khí có thể tan. Trong thực té trong khi đó, “ thể
tích làm việc” hoặc thể tích thực của môi trường nuôi trong một STR thường chỉ
khoảng 75% thể tích tổng số của lò phản ứng sinh học.
Trang 19
Công nghệ sinh học thực phẩm
2. Quá trình lên men:
2.1. Lên men theo mẻ
Trong quá trình lên men theo mẻ, thành phần môi trường nuôi, nồng độ vi
sinh vật (nồng độ sinh khối), thành phần hóa học bên trong của vi sinh vật, hàm
lượng protein hoặc chất chuyển hóa đích, tất cả đều thay đổi do kết quả của các
giai đoạn sinh trưởng của tế bào, chuyển hóa tế bào, và sự có mặt của các chất
dinh dưỡng. Dưới những sự kiện đó, người ta thường quan sát thấy 6 pha điển
hình của quá trình sinh trưởng: pha thích nghi, pha tăng tốc, pha loga hoặc pha
hàm mũ, pha chậm dần, pha ổn định và pha chết.
Thông thường không có sự tăng lập tức số lượng tế bào sau khi cấy chủng
vào môi trường nuôi đã khử trùng. Giai đoạn khởi đầu được gọi là pha thích nghi.
Trong giai đoạn thích nghi, tế bào vi sinh vật thích nghi với các điều kiện môi
trường mới. Các tế bào có thể phải điều chỉnh tới một pH khác hoặc tới một nồng

độ dinh dưỡng mới. Như một phần của đáp ứng thích nghi, một số con đường
chuyển hóa chưa biểu hiện trước đó có thể được cảm ứng. Pha thích nghi của tế
bào thường xuất hiện khi tế bào của dung dịch cấy được lấy từ môi trường đã
ngừng sinh trưởng (tức là bước vào pha ổn định) do sự hạn chế của cơ chất hay sự
kìm hãm của sản phẩm. Các tế bào này cần thời gian để khởi động lại các hệ thống
chuyển hóa để phù hợp với môi trường mới. Độ dài của pha thích nghi tương ứng
với thời gian mà các tế bào cấy đã ở pha ổn định và các thông số mà môi trường
nuôi cấy trước đó của tế bào khởi đầu khác với môi trường nuôi cấy mới. Trái lại
khi dung dịch cấy là môi trường tế bào của quần thể tế bào đang sinh trưởng ở pha
loga, thì gần như không xảy ra pha thích nghi và sự tăng trưởng có thể bắt đầu
ngay lập tức. Sau pha thích nghi là giai đoạn ngắn khi tốc độ sinh trưởng tế bào
tăng cho đến khi đạt được sự tăng trưởng pha loga được gọi là pha tăng tốc.
Trong pha sinh trưởng loga, sinh khối tế bào trải qua vài lần nhân đôi và tốc
độ sinh trưởng đặc hiệu của môi trường là không đổi. Với cơ chất (nguồn dinh
dưỡng) dư và không có sự kìm hãm sinh trưởng bởi một hợp chất có trong môi
trường nuôi, tốc độ tăng trưởng riêng độc lập với nồng độ cơ chất. Những thay đổi
Trang 20
Công nghệ sinh học thực phẩm
này và các bước liên quan khác có thể được biểu diễn dưới dạng toán học. Trong
trường hợp này, tốc độ tăng sinh khối tế bào theo thời gian,
dt
dX
, là tích số của tốc
độ tăng trưởng riêng,
µ
, và nồng độ cơ chất, X:
X
dt
dX
µ

=
Tương tự, tốc độ tăng trưởng tế bào,
dt
dN
, là tích số của tốc độ sinh trưởng
riêng,
µ
, và số lượng tế bào, N:
N
dt
dN
µ
=
Tốc độ sinh trưởng riêng,
µ
, là hàm của nồng độ cơ chất giới hạn (tức
nguồn cacbon hoặc nitơ), S, tốc độ sinh trưởng tối đa,
max
µ
, và hằng số cơ chất đặc
hiệu,
K
S
, cả S và
K
S
được biểu diễn theo nồng độ, tức gam hoặc mol/L.
S
S
K

S
+
=
max
µ
µ
Đôi khi, các nhà khoa học quan tâm đến thời gian nhân đôi hay thời gian
thế hệ, t, của vi sinh vật nuôi cấy hơn là tốc độ sinh trưởng riêng
µ
của chúng, với
=t
µ
2
ln
. Thời gian thế hệ nuôi cấy là thời gian, dưới các điều kiện xác định, để số
lượng tế bào hay sinh khối tế bào tăng gấp đôi. Đối với vi sinh vật thường nuôi
trong môi trường nuôi cấy, giá trị của
max
µ
thay đổi từ 2.1 đến 0.086 h
1−
(số
nghịch đảo của giờ), tương ứng với khả năng nhân đôi khoảng 20phút đến 8 giờ.
Khi có dư cơ chất (tức là khi S >> K
S
) thì
µ
=
max
µ

và ta có tốc độ sinh
trưởng pha loga tối đa của nuôi cấy. Trong thực tế, giá tị của K
S
thường thấp nên
nồng độ cơ chất tương đương với K
S
hiếm khi gặp trong sinh trưởng pha loga. Ví
dụ, đối với Escherichia Coli, trong khi K
S
đối với glucoza khoảng 1 mg/L, thì
Trang 21
Công nghệ sinh học thực phẩm
nồng độ glucosa ban đầu thường khoảng 10000mg/L. Tuy nhiên khi nuôi cấy tiến
dần đến cuối pha loga, nồng độ còn lại của cơ chất, S, thấp và có thể thậm chí
xuống đến dưới giá trị K
S
. Dưới điều kiện mà S<K
S
, vi sinh vật nhanh chóng
bước vào pha chậm dần. Tuy nhiên vì quần thể tế bào ở cuối pha loga lớn, cơ chất
có thể bị sử dụng một cách nhanh chóng làm cho pha chậm dần bị ngắn lại và
không thể quan sát được.
Sau khi sử dụng hết cơ chất sinh trưởng chủ yếu, như nguồn cacbon, trong
môi trường hoặc sự tích tụ của các sản phẩm trao đổi chất cuối kìm hãm sự sinh
trưởng, sự tăng sinh khối tế bào thậm chí dừng lại và tế bào bước vào pha ổn định.
Trong pha này, mặc dù số lượng sinh khối không đủ nhưng sự chuyển hóa tế bào
thường thay đổi mạnh; trong một trường hợp, các hợp chất (chất chuyển hóa thứ
cấp) được tổng hợp có thể là các sản phẩm thương mại trung tâm. Ví dụ, các
kháng sinh thường được sản sinh trong pha ổn định của chu trinh sinh trưởng vi
sinh vật. Độ dài của pha ổn định phụ thuộc vào sinh vật cụ thể và các điều kiện

sinh trưởng.
Ở pha chất, năng lượng dự trữ của tế bào bị cạn kiệt và các hoạt động trao
đổi chất dừng lại. Đối với đa số các quy trình thương mại, phản ứng lên men dừng
lại, tế bào được thu hồi trước khi pha chết bắt đầu.
2.2. Lên men theo mẻ có bổ sung
Trong lên men theo mẻ có bổ sung, cơ chất được thêm vào tại một số thời
điểm khác nhau của quá trình phản ứng. Sự bổ sung này kéo dài cả 2 pha loga và
pha ổn định, do đó làm tăng sinh khối và hàm lượng các chất chuyển hóa được
tổng hợp ở pha ổn định như kháng sinh. Tuy nhiên vi sinh vật ở pha ổn định
thường sinh các enzyme phân giải protein (proteaza) và các enzyme này có thể
phân hủy các protein được tổng hợp bởi một vi sinh vật biến đổi gen. Do đó khi
sản xuất protein bằng vi sinh vật tái tổ hợp, quan trọng là phản ứng lên men không
được phép thực hiện đến phần này của chu trình sinh trưởng. Vì thường khó mà đo
được hàm lượng cơ chất một cách trực tiếp trong phản ứng lên men, các chất chỉ
Trang 22
Công nghệ sinh học thực phẩm
thị khác có liên quan đến việc sử dụng các cơ chất như sinh các acid hữu cơ; thay
đổi về pH, hoặc sinh CO
2
, có thể được dùng để đánh giá khi nào cần bổ sung.
Thông thường lên men có bổ sung đòi hỏi phải được theo dõi sát sao hơn và kiểm
soát kỹ càng hơn lên men theo mẻ và do đó ít được sử dụng hơn. Tuy nhiên, do có
các ưu thế trong phát triển các hệ thống để sản xuất protein từ vi sinh vật tái tổ
hợp, nên lên men theo mẻ dần trở nên phổ biến hơn.
Việc bổ sung có chu kỳ cơ chất vào môi trường nuôi vi sinh vật làm kéo dài
pha sinh trưởng loga và làm chậm đạt đến pha ổn định thường khởi động các đáp
ứng stress tế bào, sinh proteaza và làm thay đổi các chuyển hóa khác ảnh hưởng
đến năng suất protein tái tổ hợp . Tuy vậy với sự sinh trưởng tế bào diễn ra liên
tục, hàm lượng cơ chất đưa vào tăng là điều kiện cần thiết để duy trì chuyển hóa tế
bào chủ. Điều này có nghĩa là nguồn tế bào được sử dụng ít hơn để tổng hợp các

protein tái tổ hợp hoặc các chất chuyển hóa thương mại. Để đảm bảo rằng việc
tổng hợp và sự ổn định của protein tái tổ hợp không bị phá vỡ, hàm lượng chất
dinh dưỡng phải được bổ sung vào môi trường nuôi ngày càng tăng. Điều này có
thể được thực hiện bằng việc giám sát cẩn thận phẩn ứng lên men và bổ sung cơ
chất (nguồn cacbon, nitơ và các nguyên tố vi lượng khác) với hàm lượng ngày
càng tăng khi cần. Tùy từng loại vi sinh vật, bản chất di truyền và bản chất của
protein tái tổ hợp, mà phương pháp lên men theo mẻ có bổ sung có thể tăng năng
suất từ 25% đến hơn 1000% so với lên men theo mẻ.
Quá trình lên men theo mẻ có bổ sung không chỉ giới hạn ở tế bào vi sinh
vật mà còn được dùng với các tế bào của động vật có vú và côn trùng nuôi cấy.
Điều này quan trọng là vì các hệ thống tế bào nuôi cấy này ngày càng được sử
dụng nhiều hơn để sản xuất các protein điều trị cho người và thiếu sự bổ sung, các
tế bào động vật trong nuôi cấy theo mẻ không đủ điều kiện để sản xuất protein
ngoại lai.
2.3. Lên men liên tục:
Trang 23
Công nghệ sinh học thực phẩm
Trong lên men liên tục, điều kiện ổn định, khi
dt
dX
= 0 , đạt được khi tổng
số tế bào và tổng thể tích trong lò phản ứng sinh học giữ ở mức không đổi. Nói
cách khác, dưới các điệu kiện đó, sự mất tế bào do dòng ra (lấy sản phẩm) cân
bằng chính xác với sự thu được tế bào mới bằng cân bằng sinh trưởng (phân chia).
Đối với quá trình lên men liên tục ổn định, tốc độ pha loãng, D, được xác định
bằng tốc độ dòng chảy, theo thể tích, F, chia cho thể tích dung dịch cố định, V,
trong lò phản ứng sinh học:
V
F
D =

Khi D bằng tốc độ sinh trưởng riêng,
µ
:
µ
=×=
Xdt
dX
D
1
Để thu được nuôi cấy liên tục ổn định về thủy động học, tốc độ sinh trưởng
riêng,
µ
của quá trinh nuôi cấy phải thấp hơn tốc độ tăng trưởng riêng tối đa có
thể có được, F, trong khi giữ cho thể tích nuôi cấy trong lò phản ứng sinh học, V,
cố định.
Mục tiêu cơ bản của lên men công nghiệp là giảm thiểu tối đa chi phí và tối
đa hóa hiệu suất. Mục tiêu này có thể đạt được bằng phát triển kiểu lên men cụ thể
nhất đối với mỗi quy trình cụ thể. Mặc dù lên men liên tục không được sử dụng
phổ biến trong công nghiệp, nhưng vì với nhiều kinh ghiệm mà các nhà khoa học
đã có với tế bào sinh trưởng ở kiểu lên men theo mẻ, chi phí sản xuất một lượng
sinh khối tế bào cụ thể bằng nuôi cấy liên tục chắc chắn thấp hơn nhiều so với sản
xuất cùng lượng đó bằng lên men theo mẻ. Các yếu tố sau đây liên quan đến sự
tiết kiệm chi phí:
• Lên men liên tục dùng lò phản ứng nhỏ hơn lên men theo mẻ để sản xuất
cùng một lượng sản phẩm
• Sau khi một mẻ lên men lớn hoàn tất, cấn một thiết bị quy mô lớn để thu
hoạch tế bào, phá vỡ tế bào, chế biến tiếp (tinh sạch) các protein hoặc sản
Trang 24
Công nghệ sinh học thực phẩm
phẩm chuyển hóa được vi sinh vật sản xuất ra. Tế bào sinh trưởng liên tục

tuy nhiên sản xuất “mỗi lúc một ít” cho nên thiết bị cần để thu hoạch tế bào,
phá vỡ tế bào và chế biến đầu ra có thể nhỏ hơn nhiều.
• Lên men liên tục, như định nghĩa, tránh được thời gian chết giữa các mẻ, là
thời gian để lò phản ứng được chuẩn bị để sử dụng lại. Một trong những
điểm yếu của công nghiệp lên men hiệu quả là mất sản lượng do thời gian
ngừng để sữa chữa, làm sạch hay khử trùng lò phản ứng được chuẩn bị để
sử dụng lại. Lên men liên tục giảm thời gian vì một phản ứng có thể được
duy trì trong khoảng thời gian dài hơn nhiều.
• Trạng thái sinh lý của tế bào trong quá trình lên men liên tục đồng nhất
hơn, nên sản lượng ổn định hơn nhiều. Trong lên men theo mẻ, sai khác
nhỏ trong thời gian thu hoạch tế bào trùng với giữa hoặc cưối pha sinh
trưởng loga, có thể dẫn đến những sai khác sinh lý đáng kể.
Lên men liên tục được dùng để sản xuất thương mại protein , kháng sinh và các
dung môi hữu cơ đơn bào.
Bên cạnh các ưu điểm, lên men liên tục có những nhược điểm tiềm tàng cần phải
được giải quyết trước khi được sử dụng rộng rãi.
• Thời gian lên men liên tục có thể lên đến 500 đến 1000 giờ và do vậy một
số tế bào có thể mất cấu trúc plasmit do tái tổ hợp. Các tế bào mất plasmit
thường sử dụng ít năng lượng hơn và phân chia nhanh hơn các vi sinh vật
mang plasmit, do đó năng lượng giảm theo thời gian vì số tế bào tổng hợp
protein nhỏ hơn. Sự hợp nhất gen nhân dòng vào bộ gen của sinh vật chủ sẽ
tránh được vấn đề này.
• Sự duy trì các điều kiện vô trùng trên quy mô công nghiệp trong thời gian
dài là rất khó khăn. Hơn nữa, các quá trình liên tục cần thiết bị vô trùng dự
phòng, đây là yêu cầu có thể làm tăng chi phí đầu tư ban đầu lên rất nhiều.
• Thành phần môi trường nuôi cấy được dùng cho quy mô công nghiệp
không cùng loại về mặt chất lượng như các thành phần dùng trong phòng
Trang 25