Luận án Tiến sĩ Y học Thực trạng lây nhiễm lao ở Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình, một số giải pháp can thiệp

1


ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh lao là một bệnh nhiều người mắc, tỷ lệ tử vong cao và có tính
chất dễ lây lan trong cộng đồng [02]. Tiếp xúc trực tiếp với người bệnh là
nguy cơ lây nhiễm bệnh cao nhất [25], [38].
Bệnh Lao được xếp vào một trong các bệnh lây truyền theo đường thở
cho nhân viên y tế [42], [129]. Nguy cơ bị nhiễm khuẩn liên quan đến nghề
nghiệp là một phần không thể tránh khỏ
i trong công tác tiếp xúc và chăm sóc
bệnh nhân hàng ngày.
Trong giai đoạn 1985 đến 1991, một số nghiên cứu tại Đan mạch, Ý và
Thụy sỹ đã chỉ ra các nguy cơ nhiễm lao của nhân viên y tế [37], [98], [57].
Ở Mỹ, tình hình nhiễm lao ở các nhân viên y tế đã được báo cáo trong nhiều
nghiên cứu [44], [110],[128] . Kết quả điều tra trong một số bệnh viện cho
thấy từ 18 đến 35% các nhân viên y tế có phản ứng Mantoux chuyển từ âm
tính sang dương tính [103], [34], [63]. Cho tới n
ăm 1995, ít nhất có 17 nhân
viên y tế (trong đó có 8 người nhiễm HIV) mắc lao do các chủng lao đa kháng
thuốc và 5 (4 nhiễm HIV) đã chết [126].
Tham khảo kết quả khám sức khỏe định kỳ của nhân viên y tế Bệnh
viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình năm 1998, có 58/65 người (89,2%) cho kết
quả phản ứng Mantoux dương tính. Một số nhân viên y tế của bệnh viện có
tiền sử điều trị bệnh lao.
Cơ quan An toàn và Sức kh
ỏe nghề nghiệp của Mỹ (OSHA -
Occupational Safety Health Administration) công nhận bệnh lao là một trong
những bệnh liên quan đến nghề nghiệp [39]. Ở Việt Nam, bệnh lao được xếp
vào nhóm các bệnh nhiễm khuẩn nghề nghiệp nằm trong danh mục 25 bệnh

nghề nghiệp được bảo hiểm [9].
2


Những năm gần đây, vấn đề kiểm soát lây nhiễm đã được Tổ chức Y tế
Thế giới (TCYTTG) ưu tiên quan tâm như một cấu phần cơ bản trong kiểm
soát bệnh lao nhất là lao đa kháng và siêu kháng thuốc, trong đó có vấn đề
kiểm soát và phòng ngừa lây nhiễm lao cho nhân viên y tế [05].
Kiểm soát lây nhiễm trong bệnh viện là vấn đề ưu tiên hiện nay của
Chương trình Chống lao Quốc gia. Tuy nhiên, ch
ưa có một nghiên cứu cụ thể
nào về vấn đề ô nhiễm vi khuẩn lao và nguy cơ lây nhiễm lao của nhân viên y
tế làm việc trong môi trường Bệnh viện Lao và Bệnh phổi tại Việt Nam.
Đề tài luận án “Thực trạng lây nhiễm lao ở Bệnh viện Lao và Bệnh
phổi Thái Bình, một số giải pháp can thiệp ” có các mục tiêu sau:
1. Xác định thực trạng nhiễm lao của nhân viên y tế tại Bệnh viện Lao và
B
ệnh phổi Thái Bình và cộng đồng dân cư xung quanh bệnh viện trước can
thiệp (năm 2002).
2. Mô tả kết quả xét nghiệm vi khuẩn lao tại một số vị trí trong Bệnh viện
Lao và Bệnh phổi Thái Bình trước can thiệp (năm 2002).
3. Đánh giá hiệu quả của một số biện pháp can thiệp kiểm soát lây nhiễm lao
trong môi trường Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình (năm 2006 và 2011).
3


CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TÌNH HÌNH BỆNH LAO HIỆN NAY
1.1.1. Tình hình bệnh lao trên thế giới

Bệnh lao là một trong những bệnh có tỷ lệ mắc và tử vong hàng đầu
trên thế giới [131]. Theo số liệu ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới
(TCYTTG), hiện nay trên thế giới có khoảng 1/3 dân số (2,2 tỷ người) đã
nhiễm lao và con số đó sẽ tăng 1% hàng năm [07] . Theo báo cáo năm 2010
của TCYTTG [133], ước tính n
ăm 2009 có thêm khoảng 9,4 triệu người
mắc lao mới (137/100.000 dân). Trong đó có khoảng 3,3 triệu phụ nữ
(chiếm 35%) và số người mắc lao/HIV là 1,1 triệu (chiếm 12%), số mắc lao/
HIV tập trung phần lớn ở Châu Phi (80%). Số liệu cụ thể tại các khu vực
được tổng hợp như sau:
Bảng 1.1: Ước tính số mới mắc và tử vong do lao trên thế giới năm
2009 [133].
Khu vực
Số mới mắc trong
n
ăm
Số chết trong năm
Số lượng Tỷ lệ (1) Số lượng (2) Tỷ lệ (1)
Đông Nam Á 3.300.000 185 480.000 27
Tây TBD 1.900.000 105 240.000 13
Châu Phi 2.800.000 339 430.000 52
Trung Cận Đông 660.000 110 99.000 17
Châu Mỹ 270.000 29 20.000 2
Châu Âu 420.000 47 62.000 7
Chung toàn cầu 9.400.000 137 1.300.000 19
(1) Tỷ lệ trên 100.000 dân
(2) Không bao gồm các trường hợp lao/HIV dương tính
4

Phần lớn bệnh nhân lao tập trung ở Châu Á (55%) và Châu Phi (30%),
Khu vực Trung Cận Đông, Châu Âu và Châu Mỹ là những khu vực có tỷ lệ
bệnh nhân lao thấp (7%, 4% và 3%) [133].
81% số bệnh nhân lao nằm ở 22 nước có gánh nặng bệnh lao cao trên
toàn cầu. Năm nước có số lượng bệnh nhân lao cao nhất là Ấn Độ
(2.000.000), Trung Quốc (1.300.000), Nam Phi (490.000), Nigeria (460.000)
và Indonesia (430.000). 35% số bệnh nhân lao tập trung ở Ấn Độ và Trung
Quốc. Hơn 33% số bệnh nhân lao toàn cầu tại khu vực
Đông-Nam Á [133].
Tổ chức Y tế Thế giới cũng ước tính năm trong 2008 có khoảng
440.000 bệnh nhân lao kháng thuốc, trong đó 86% thuộc 27 nước có gánh
nặng bệnh nhân lao kháng thuốc cao (bao gồm 15 nước Châu Âu). Bốn nước
ước tính có số lượng bệnh nhân lao kháng thuốc cao nhất là Trung Quốc, Ấn
Độ, Liên bang Nga và Nam Phi [133].
Đến tháng 7.2010 đã có 58 nước và vùng lãnh thổ báo cáo phát hiện
trường hợp lao kháng thuốc [133].
Năm 2009, TCYTTG ước tính có 1,7 triệu người tử vong do lao, trong
đó có 400 nghìn bệnh nhân lao/HIV và 380 nghìn phụ nữ
.
Hiện nay, tỷ lệ điều trị thành công trên toàn cầu đạt 86%, nhưng tỷ lệ
phát hiện chỉ đạt 63% số bệnh nhân ước tính. Như vậy, còn rất nhiều bệnh
nhân lao không được chữa trị đang tiếp tục lây bệnh cho cộng đồng, cũng
theo ước tính của TCYTTG, mỗi năm có thêm 1% dân số thế giới bị nhiễm
lao [133].
1.1.2. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam
Ở nước ta, bệnh lao còn ph
ổ biến và ở mức độ trung bình cao. Theo
báo cáo của TCYTTG năm 2010, TCYTTG ước tính Việt Nam đứng thứ 12
trong 22 nước có gánh nặng bệnh lao cao trên toàn cầu [133].
5

Một số số liệu chính về tình hình bệnh lao ở Việt Nam được thể hiện
ở bảng sau:
Bảng 1.2: Một vài số liệu về tình hình bệnh lao ở Việt Nam hiện nay
Dân số (2009) 88.000
Phân thứ tự gánh nặng bệnh lao toàn cầu 12
Tỷ lệ tử vong do lao (loại trừ HIV)/100.000 dân 36 (21 – 56)
Tỷ lệ lao hiện mắc các thể / 100.000 dân 333 (143 – 577)
Tỷ lệ lao mới mắc các thể / 100.000 dân 200 (150 – 256)
Tỷ lệ lao / HIV dương tính mới mắc 8,4 (5,3 – 12)
Tỷ lệ phát hiện, các thể (%) 54 (42 – 72)
Tỷ lệ lao kháng đa thuốc trong bệnh nhân mới (%) 2,7 (2 – 4)
Tỷ lệ lao kháng đa thuốc trong BN điều trị lại (%) 19 (15 – 25)
% bệnh nhân lao được xét nghiệm HIV 37%
% HIV dương tính trong số bệnh nhân lao được xét
nghiệm HIV
17%

Theo ước tính của TCYTTG, tỷ lệ tử vong do lao là 36/100.000 dân,
tương đương với khoảng 32.000 người tử vong do lao. Tỷ lệ lao hiện mắc
các thể là 333/100.000 dân, tương đương với khoảng 290.000 bệnh nhân. Tỷ
lệ lao mới mắc các thể hàng năm là 200/100.000 dân, tương đương với
khoảng 180.000 bệnh nhân. Tuy nhiên, ước tính tỷ lệ phát hiện bệnh lao các
thể của Việt Nam mới chỉ đạt 54% (45-72).
Năm 2009, có 34.907 bệnh nhân lao được xét nghiệm HIV, chi
ếm tỷ
lệ 37% tổng số bệnh nhân lao. Tỷ lệ HIV dương tính trong số bệnh nhân lao
xét nghiệm là 17%, cao hơn so với tỷ lệ nhiễm HIV ước tính trong số bệnh
nhân lao tại báo cáo năm 2009 của TCYTTG (8,1%). Đồng nhiễm lao/HIV

không chỉ làm tăng số bệnh nhân lao, mà còn làm giảm hiệu quả điều trị của
CTCLQG và tăng tỷ lệ tử vong do lao.[133], [10].
6


Tỷ lệ lao kháng đa thuốc là 2,7% trong số bệnh nhân lao mới và 19%
trong số bệnh nhân điều trị lại. Theo ước tính của CTCLQG, năm 2009 có
khoảng 3.952 (95% CI: 2.944 – 5226) bệnh nhân lao kháng đa thuốc trong
số bệnh nhân lao phổi được khám phát hiện. Trong đó, mới chỉ có 307 bệnh
nhân lao kháng đa thuốc được điều trị.
Theo kết quả điều tra tình hình nhiễm và mắc lao toàn quốc năm
2006-2007, nguy cơ nhiễm lao hàng nă
m ở Việt Nam là 1,67; tỷ lệ mắc lao
phổi AFB dương tính các thể ở Việt Nam là 145/100.000 dân và tỷ lệ hiện
mắc lao phổi AFB dương tính mới là 114/100.000 dân. Như vậy, còn một số
lượng lớn bệnh nhân lao phổi AFB dương tính trong cộng đồng vẫn chưa
được phát hiện và Chương trình chống lao cần có sự nỗ lực hơn nữa trong
công tác phát hiện, quản lý để hạn chế nguồn lây và giảm dịch t
ễ bệnh lao
trong cộng đồng.
1.1.3. Tình hình bệnh lao tại tỉnh Thái Bình.

Bảng 1.3: Tình hình phát hiện bệnh nhân lao các thể tỉnh Thái Bình
từ năm 2007 - 2011:

Năm
AFB
(+)
Mới
AFB

(+)
TP
AFB
(+) TB
ĐT lại
*
AFB
(-)
Ng.
Phổi
AFB(-)
&NgPh
khác
AFB
(+)
khác
Tổng
cộng
2007 883 85 04 490 312 0 0
1774
2008 834 73 02 551 345 0 0
1805
2009 779 97 04 520 349 06 01
1756
2010 653 78 05 464 266 07 0
1473
9
th

2011

543 79 04 370 255 08 01
1260

Tỷ lệ phát hiện bệnh nhân lao các thể và lao phổi dương tính mới có
xu hướng giảm, năm 2007, tỷ lệ bệnh nhân lao phổi AFB(+)/100.000 dân là
48,4; năm 2010 tỷ lệ này là 34,7.
7


Bệnh viện Lao và Bệnh phổi của tỉnh xây dựng từ năm 1975 tại xã Vũ
Chính là 1 xã ngoại thị (cách trung tâm thành phố 3-4 km) gồm 120 giường
có nhiệm vụ phát hiện và điều trị bệnh nhân lao chung của toàn tỉnh. Trung
bình 1 năm bệnh viện khám 15.000 lượt người và tiếp nhận điều trị 800 bệnh
nhân lao chủ yếu là bệnh nhân lao phổi dương tính mới và tái phát.
Bảng 1.4: Số bệnh nhân lao phổi AFB d
ương tính và số tiêu bản đờm xét nghiệm
tại bệnh viện từ năm 1998 – 2011

Năm Tiêu bản XN
dương tính
Tiêu bản XN
âm tính
Số BN lao phổi dương
tính
1998 621 7607 349
1999 681 7340 338
2000 612 7533 299
2001 739 17245 340
2002 602 8443 280
2003 517 8736 239

2004 565 9019 264
2005 721 10504 325
2006 901 10406 404
2007 739 12925 348
2008 759 13008 328
2009 847 12836 376
2010 713 12393 306
9
th
2011 645 9862 294

1.2. VI KHUẨN LAO VÀ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN
1.2.1. Vi khuẩn lao [20], [23], [59], [70].[151], [07]
Hình thể: Vi khuẩn lao hình que mảnh, không di động, có độ dài từ 3 đến 5
μm và đường kính từ 0,3 đến 0,5μm, hơi cong, hai đầu tròn. Trong bệnh phẩm
đứng riêng biệt hoặc thành đám nhỏ đôi khi xoắn thừng hoặc thành dây [02].
Đặc tính sinh hóa:
8


Hoạt độ Catalaza ở 22
0
C = (+++)
Hoạt độ Catalaza khi đun nóng 70
0
C trong 15 phút = 0
Hoạt độ Peroxydaza ở 22
0
C = (+++)
Hoạt độ Peroxydaza khi đun nóng 70

0
C trong 15 phút = 0
Thạch cận Lebek: trực khuẩn hoàn toàn ưa khí, mọc trên bề mặt
Test Niacin hoặc test Kono = (+++)
Test khử Nitrat = (+++)
Thành phần hóa học và cấu trúc cơ bản
Thành phần hóa học: gồm nước chiếm 85,9% trọng lượng các chất
đạm, đường, mỡ và chất khoáng.
Chất đạm (protid) gồm các tuberculoprotein khác nhau (chiếm 56%
trọng lượng khô của vi khuẩn). Các tuberculoprotein được cấu tạo từ các acid
amin và là cơ sở của các kháng nguyên của vi khuẩn lao, khi đưa vào cơ th
ể
động vật sẽ gây ra hiện tượng phản vệ.
Chất đường (glucid) chiếm khoảng 15% trọng lượng khô của vi khuẩn.
Phần lớn chúng ở dưới dạng Polysarcharid, hoặc liên kết với các protein hoặc
phophat. Các Polysarcharid không độc, ít có tính kháng nguyên, không gây
hiện tượng mẫn cảm, nhưng có hoạt tính trong các phản ứng huyết thanh như
tăng cường phản ứng liên kết.
Chất mỡ (lipid) chiếm 10 đến 40% trọ
ng lượng khô của vi khuẩn,
chúng tan trong cồn, ether và chloroform. Các chất lipid của vi khuẩn:
mycozit C, cord-factor và các chất sáp được nghiên cứu nhiều. Theo nhiều tác
giả, các lipid này của vi khuẩn có liên quan đến độc tính và khả năng gây
bệnh của chúng.
Cấu trúc hóa học cơ bản của vi khuẩn lao gồm:
Vỏ của vi khuẩn lao dầy từ 10-20 nm, gồm có 4 lớp khác nhau:
Lớp 1: Peptido-glycane
9

Lớp 2 và 3: Mycolate arabino galactane
Lớp 4: glycolipide với 3 chất: sáp D, yếu tố thừng và micoside
Vỏ của vi khuẩn lao chi phối 3 đặc tính của vi khuẩn lao: khả năng gây
bệnh, tạo ra tính mẫn cảm, tạo ra tính kháng cồn, kháng toan. Cấu trúc vỏ tế
bào của vi khuẩn lao tạo ra các tính chất nhuộm. Khi nhuộm Gram,vi khuẩn
bắt mầu của vi khuẩn Gram dương. Cấu trúc mycolic acid tạo ra khả năng
kháng lại các chất tẩy aniline là cồn acid.
Tính ch
ất nuôi cấy và khả năng đề kháng:
Vi khuẩn lao hiếu khí bắt buộc, nhiệt độ thích nghi 37
o
C, pH thích
nghi 6,7 - 7.Vi khuẩn được nuôi cấy ở môi trường giàu chất dinh dưỡng như
môi trường đặc Loeweinstein - Jensen, Ogawa Mark, môi trường lỏng Sauton.
Ở môi trường Loeweinstein- Jensen khuẩn lạc xuất hiện khoảng sau một
tháng, khô nhăn nheo giống như hoa súp lơ, màu trắng ngà. Ở môi trường
lỏng Sauton vi khuẩn mọc nhiều ở bề mặt chất lỏng thành những mảng nhăn
nheo, khô và dính vào thành ống.
Vi khuẩn lao phát triển chậm, thời gian nhân đôi là 12-24 giờ trong khi
c
ủa E.coli là 20 phút. Những chủng độc lực tạo thành những khuẩn lạc R.
Những chủng độc lực kém tạo thành những khuẩn lạc ít nhăn nheo hơn và
phát triển ít có trật tự hơn.
Khả năng gây bệnh
Khả năng gây bệnh của vi khuẩn lao phụ thuộc vào độc lực của vi
khuẩn và sức đề kháng của cơ thể.
Sự bền vững của vi khuẩ
n lao với môi trường bên ngoài [02].
Ở điều kiện tự nhiên, vi khuẩn có thể tồn tại 3-4 tháng. Trong phòng thí
nghiệm người ta có thể bảo quản vi khuẩn trong nhiều năm. Dưới ánh nắng

mặt trời, vi khuẩn bị chết sau 1,5 giờ. Khi chiếu tia cực tím chúng chỉ tồn tại
được 2-3 phút. Ở 42
0
C vi khuẩn ngừng phát triển và chết sau 10 phút ở 80
0
C.
10


Đờm của bệnh nhân lao trong phòng tối, ẩm sau 3 tháng vi khuẩn vẫn tồn tại
và giữ được độc lực; nhưng khi đun sôi đờm trong 5 phút chúng đã bị chết.
Với cồn 90
0
vi khuẩn lao tồn tại được 3 phút, trong acid phenic 5% vi khuẩn
chết ngay sau 1 phút.
Đặc điểm kháng thuốc của vi khuẩn lao[25], [70].
Vi khuẩn lao trong quá trình sinh sản có thể xuất hiện những loại đột
biến kháng thuốc. Những vi khuẩn lao kháng thuốc này là loại kháng thuốc
trong nhiễm sắc thể. Cơ chế là do chọn lọc tự nhiên, có thể từ một quần thể vi
khuẩn đa số chịu thuốc trở thành một quần thể vi khuẩn kháng thuốc hoàn
toàn kháng một hoặc nhiều loại thuốc. Các chủng vi khuẩn chưa bao giờ ti
ếp
xúc với một loại thuốc chống lao nào được gọi là “Chủng hoang dại”. Một
chủng kháng thuốc tự nhiên là một chủng hoang dại kháng với một thuốc mà
vi khuẩn chưa bao giờ tiếp xúc. Như vậy, cả vi khuẩn kháng thuốc tự nhiên và
bệnh nhân có vi khuẩn này đều chưa bao giờ tiếp xúc với thuốc chống lao.
Kháng thuốc tự nhiên xảy ra ở những nơi thuốc chống lao ch
ưa bao giờ được sử
dụng. Nguyên nhân của kháng thuốc tự nhiên là do đột biến gien. Tần xuất
những đột biến kháng thuốc tự nhiên phụ thuộc vào nguồn gốc của chủng,

loại thuốc, nồng độ thuốc và tổng số vi khuẩn. Số lượng vi khuẩn giảm sẽ
giảm đột biến kháng thuốc.
1.2.2. Một số phương pháp chẩn đoán vi khuẩn lao.
1.2.2.1. Các phương pháp cổ
điển
Soi trực tiếp
Nhuộm Ziehl – Neelsen và soi kính cho đến nay vẫn là một phương
pháp đơn giản, rẻ tiền và cho kết quả nhanh. Tuy nhiên, soi kính chỉ cho phép
phát hiện được trực khuẩn lao ở nồng độ 10
5
trực khuẩn/ml trở lên, vì vậy độ
nhậy của phương pháp thấp, từ 40% - 60% (bệnh phẩm của bệnh nhân lao
11


người lớn) và chỉ đạt từ 10% - 20% (bệnh phẩm của bệnh nhân lao ngoài
phổi). [25], [69], [83].
Soi kính không cho phép định danh vi khuẩn lao ở mức độ loài, chỉ xác
định được hình thể, không phân biệt được vi khuẩn sống hay chết và không có
hiệu quả trong việc xác định vi khuẩn lao kháng thuốc. Hơn nữa, kết quả soi
kính cần phải được khẳng định bằng nuôi cấy và các thử nghiệm chẩn đoán
xác định khi có d
ấu hiệu nghi ngờ nhiễm khuẩn gây ra bởi vi khuẩn lao thuộc
nhóm không điển hình hoặc khi cần xác định độ nhạy cảm đối với kháng sinh
điều trị [83], [97].
Tuy nhiên soi kính là phương pháp duy nhất để xác định nguồn lây
chính: những người có ho khạc ra nhiều vi khuẩn lao có kết quả soi AFB(+)
Nuôi cấy.
Là những phương pháp phát hiện sự có mặt của vi khuẩn lao trên môi
trường nuôi cấy in vitro. Hiện nay có rất nhiều loạ

i môi trường để nuôi cấy vi
khuẩn lao, được chia làm hai loại: môi trường đặc và môi trường lỏng. Cho
đến nay, nuôi cấy trên môi trường đặc vẫn là một phương pháp kinh điển
được sử dụng rộng rãi trong hầu hết các phòng thí nghiệm lâm sàng [119].
Môi trường rắn có thể là môi trường trứng (Egg-Base Medium) Loeweinstein-
Jensen, American Trudeau Society (AST) hoặc môi trường agar (Agar-Base
Medium) như Middlebrook 7H10 và Middlebrook 7H11.
1.2.2.2. Một số kỹ thuật hiện đại.
Sử dụng Hệ Bactec
Nguyên lý: Người ta gắn cacbon phóng xạ vào acid palmitric và acid
formic trong môi tr
ường nuôi cấy vi khuẩn lao. Khi vi khuẩn chuyển hoá sẽ
lấy các acid béo này và giải phóng ra CO
2
(chứa cacbon phóng xạ) được đo
bằng máy Bactec 460 [30], [02].
12


Hệ thống đo phóng xạ BATEC ra đời cho phép phát hiện sớm quá
trình mọc của vi khuẩn trên môi trường bằng việc tự động phát hiện lượng
14
CO
2
do vi khuẩn giải phóng ra trong quá trình trao đổi chất và carboxi hoá
cơ chất có đánh dấu phóng xạ
14
C. Kỹ thuật này có ưu điểm là cho kết quả
nhanh (5 - 7 ngày) và cũng phát hiện được chủng vi khuẩn kháng thuốc. [30], [02].
Phương pháp MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tubes)

Người ta sử dụng biện pháp đặc biệt để kích thích vi khuẩn lao sinh sản
nhanh, vi khuẩn lao khi phát triển sẽ sử dụng oxy (O
2
) và thải CO
2
. Bằng bộ
phận nhận cảm có phát quang có thể nhận biết được CO
2
(chuyển môi trường
từ màu xanh lục sang màu vàng). Phương pháp này cũng cho kết quả nhanh
trong vòng từ 3-10 ngày [02].
Nguyên lý: Một phức hợp huỳnh quang được gắn ở đáy týp nuôi cấy.
Phức hợp này nhậy cảm với sự có mặt của O
2
hoà tan trong môi trường. Đầu
tiên, do lượng O
2
hoà tan lớn nên kìm chế sự phát quang từ phức hợp, khi đó
chỉ một lượng nhỏ ánh sáng huỳnh quang có thể được phát hiện. Sau đó, khi
có mặt vi khuẩn trong môi trường, do hoạt động của vi khuẩn trong quá trình
trao đổi chất, đã tiêu thụ bớt O
2
dẫn đến việc phát sáng của chất huỳnh quang,
phát hiện được ở bước sóng 365 nm. Sự phát triển của vi khuẩn cũng có thể
được phát hiện bởi sự xuất hiện độ đục không đồng nhất hoặc những hạt nhỏ
hay mảnh vụn trong môi trường nuôi cấy [25],[20].
Phản ứng chuỗi polymeraza (PCR)
Một phát minh quan trọng của sinh học phân tử trong những năm g
ần
đây là kỹ thuật khuyếch đại acid nucleic (ADN và ARN). Kỹ thuật hiện nay

được sử dụng ở nhiều nước là phản ứng chuỗi polymeraza (PCR). Ra đời vào
năm 1986, kỹ thuật PCR đã nhanh chóng cung cấp những ứng dụng mạnh mẽ
trong nhiều lĩnh vực công nghệ sinh, y học [81]. Việc áp dụng PCR trong
chẩn đoán bệnh truyền nhiễm, đặc biệt là bệnh lao đã cung cấp một công cụ
13


đầy triển vọng, đáp ứng với nhu cầu cấp thiết, đã cho ra đời một phương pháp
chẩn đoán nhanh, hiệu quả và an toàn khi mà đa số các phương pháp chẩn
đoán bệnh lao cổ điển đều còn nhiều bất cập. Kỹ thuật PCR cho phép xác
định vi khuẩn lao trực tiếp trong bệnh phẩm nhờ khả năng sao chép để
khuyếch đại về mặt số lượng
đoạn trình tự đặc hiệu trên gienom của vi khuẩn
[81], [84], [86].
Cũng giống như phương pháp soi kính, phương pháp PCR có thể cho
kết quả nhanh trong vòng 1 ngày nhưng độ nhạy và độ đặc hiệu lại cao hơn
nhiều. Trong một số nghiên cứu khi nuôi cấy được coi là tiêu chuẩn vàng, độ
nhạy của PCR đạt tới 71% đến 91%, độ đặc hiệu từ 95% - 100% [83].
Cho tới nay hầu hết các phòng thí nghiệm trên thế giới khi sử dụ
ng
phương pháp PCR trong chẩn đoán bệnh lao đều phát hiện các thường quy
riêng. Đoạn khuôn mẫu được sử dụng nhiều nhất là đoạn trình tự acid nucleic
nằm trên gien nhảy IS 6110. IS 6110 chỉ có mặt trong nhóm Mycobacterium
tuberculosis và các Mycobacteria khác thuộc nhóm M.complex và thường có
độ lặp lại cao trong hệ gien của vi khuẩn lao do vậy là một trình tự lý tưởng
để đóng vai trò đoạn ADN đích. Sự phân biệt giữa M. tuberculosis và M. Bovis
cũ
ng có thể bằng đoạn IS 6110 vì M. Bovis chỉ có một đoạn IS 6110 [123].
Người ta cũng sử dụng nhiều trình tự khác nhau như IS 986, P36 (đây
là các gien nhảy có đặc điểm tương tự như IS 6110), rARN 16S, các gien mã

hoá cho protein 65 kD và 38 Kd [82].
Ngoài ra sự khác nhau về trình tự acid nucleic đích, phương pháp tách
chiết ADN, số chu kỳ nhân gien và các phương pháp phát hiện sản phẩm sao
chép của PCR cũng khác nhau ở mỗi phòng thí nghiệm. Kỹ thuật điện di trên
gel agarose hoặc lai ghép v
ới các đoạn mồi đặc hiệu có đánh dấu phóng xạ là
các kỹ thuật phổ biến để phát hiện sản phẩm sao chép, tuy nhiên một số tác
giả cũng đã sử dụng các đoạn mồi đánh dấu với chất không phóng xạ [82].
Bên cạnh những ưu điểm, kỹ thuật PCR cũng có những mặt hạn chế:
14


- Do phân tử ADN có thể được phát hiện ngay cả khi vi khuẩn đã bị chết nên
kỹ thuật PCR không cho biết vi khuẩn lao còn sống hay đã chết mà điều này
rất cần thiết cho việc theo dõi kết quả điều trị.
- Có thể có dương tính giả, âm tính giả.
Chống nhiễm:

Do PCR có độ nhạy cao, khả năng dương tính giả có thể xảy ra nếu
trong quá trình thực hiện, bệnh phẩm hoặc vật liệu sử dụng bị nhiễm một
lượng nhỏ ADN vi khuẩn lao có trong môi trường, hoặc từ các bệnh phẩm có
chứa vi khuẩn, hoặc bị nhiễm các đoạn ADN là sản phẩm sao chép của những
lần chạy PCR trước. Sản phẩm sao chép của PCR có thể
trở thành một mối đe
doạ nếu không có biện pháp xử lý hiệu quả. Một ống phản ứng sau 40 chu kỳ
nhân gien có thể chứa tới 10
12
bản sao, và chỉ cần một bản sao lọt vào ống
mới cũng đủ để phản ứng cho kết quả dương tính giả đối với ống đó [84].
Tuy nhiên ngày nay người ta đã có thể loại bỏ khả năng dương tính giả

do nhiễm các đoạn ADN bản sao bằng việc sử dụng ezyme uracil DNA
glycosylase (UNG) kết hợp với dUTP thay vì dTTP trong hỗn dịch phản ứng.
UNG đượ
c hoạt hoá ở 40
0
C trước khi phản ứng xảy ra phá huỷ toàn bộ các
bản sao nếu do sơ xuất bị nhiễm vào hỗn dịch phản ứng. UNG phá huỷ các
bản sao bằng cách cắt tại các vị trí Uraxin trên trình tự phân tử của nó vì vậy
chỉ loại bỏ các bản sao do chúng có chứa Uraxin trong khi trình tự ADN đích
tách chiết từ vi khuẩn thì vẫn được bảo vệ. UNG sẽ bị bất hoạt ở nhiệt độ cao
hơ
n khi quá trình nhân gien xảy ra vì vậy không ảnh hưởng đến sản phẩm của
phản ứng [87].
Ngoài ra để chống nhiễm chéo, các nguyên tắc ngặt nghèo về vô trùng
phải được tuân thủ trong suốt quá trình thực hiện. Phòng thí nghiệm phải
được sắp xếp sao cho các bước thực hiện kỹ thuật được tiến hành trong các
khu vực riêng biệt, dụng cụ, hoá chất phải tuyệt đối vô khuẩn.
15


Chất ức chế PCR:
Bên cạnh dương tính giả, PCR cũng có thể cho âm tính giả khi có sự
can thiệp của các chất ức chế hoặc kìm hãm phản ứng. Các chất này thường là
một trong những thành phần có trong bệnh phẩm có khả năng ức chế hoặc
làm giảm hoạt tính enzyme ADN polymeraza, khiến cho phản ứng khuyếch
đại gien xảy ra hoặc không xảy ra [82].
Tỷ lệ chất ức ch
ế phản ứng PCR trong một số nghiên cứu dao động từ
3% đến 52% đối với bệnh phẩm đường hô hấp [86]. Người ta đã tìm cách
phát hiện sự có mặt của chất ức chế bằng cách khuyếch đại ADN tách chiết từ

mỗi bệnh phẩm trong 2 ống phản ứng trong đó một lượng nhỏ ADN của vi
khuẩn lao được thêm vào một ống. Kết quả âm tính củ
a ống này sẽ cho phép
khẳng định sự có mặt của chất ức chế trong bệnh phẩm.
Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi số ống phản ứng tăng lên đáng kể
khi làm với một số lượng mẫu lớn. Để khắc phục người ta sử dụng ADN của
M. smegmatis thay thế cho ADN của M. tuberculosis. Do trình tự nhận biết
trên IS 6110 của M. smegmatis nhưng bị s
ửa đổi bằng cách thêm vào 56 đôi
bazơ. Sản phẩm PCR được nhân từ trình tự trên M. smegmatis sẽ được phân
biệt với sản phẩm nhân từ trình tự trên vi khuẩn lao nhờ sự khác nhau về độ
dài phân tử của chúng.
M. smegmatis có thể được sử dụng như một nội chứng ngay trong bệnh
phẩm. Một lượng xác định vi khuẩn M. smegmatis được cho vào trong bệnh
ph
ẩm trước khi tiến hành xử lý mẫu và tách chiết ADN sẽ kiểm tra được hiệu
quả tách chiết ADN đồng thời đánh giá được sự có mặt của chất ức chế nếu
có trong bệnh phẩm và định lượng một cách tương đối vi khuẩn vi khuẩn lao
có trong bệnh phẩm [82].
Các kỹ thuật tách chiết ADN từ bệnh phẩm ít nhiều đều đã cố gắng để lo
ại bỏ
các chất ức chế. Tuy vậy khi so sánh phương pháp của Boom và cộng sự với
16


phương pháp truyền thống dùng phenol để xử lý các bệnh phẩm có chất ức
chế PCR, kết quả nghiên cứu của A.Kolk cho thấy phương pháp của Boom sử
dụng đơn giản và hiệu quả hơn do cùng một lúc vừa tách chiết, vừa tinh sạch
được ADN lại không sử dụng phenol [82].
Phát hiện vi khuẩn lao sống bằng phương pháp RT – PCR, ELISA

Bằng các kỹ thuật sinh học phân tử, người ta đ
ã chứng minh được rằng
sự có mặt của ARN chính là một dấu hiệu để đánh giá mức độ sống của vi
khuẩn. Chỉ những vi khuẩn còn sống mới được phát hiện bằng cách sử dụng
mARN làm khuôn trong phản ứng RT – PCR (Reverse transcriptase PCR).
Hầu hết các phân tử mARN đều rất dễ bị phân huỷ và có vòng đời ngắn. Do
vậy sự có mặt của mARN thường biểu thị quá trình sao chép liên tục của gien.
Patel và các c
ộng sự đã sử dụng phản ứng RT – PCR để xác định khả năng
sống sót của M. leprae bị giết bằng nhiệt và ông đã phát hiện dnaK mARN
chỉ tồn tại trong các tế bào sống. Gần đây, Hellyer và các cộng sự đã nhận
thấy rằng lượng fobB ( 85B, entigien) mARN của vi khuẩn lao giảm từ <4 và
0,01% sau 24 giờ điều trị Isoniazid và Rifampixin. Một nghiên cứu mới đây
c
ũng chỉ ra rằng mARN chỉ tồn tại trong vi khuẩn lao sống. Tương tự như
vậy, ở các vi khuẩn khác, mARN không phát hiện thấy trong các tế bào bị giết
bằng nhiệt hoặc bằng các điều trị hoá học. Do có vòng đời ngắn, nên mARN
bị phân huỷ rất nhanh trong các tế bào chết, vì vậy, nó được coi là một dấu
hiệu lý tưởng cho việc phát hiện vi khuẩn sống.
1.2.3. Phát hiện vi khuẩn lao trong môi trường
Sự lây truyền lao trong các khu vực đặc biệt như nhà dưỡng lão, nhà tù,
trung tâm cai nghiện, bệnh viện được phát tán rất nhanh. Khả năng nhiễm lao
sau khi hít phải những giọt khí dung chứa vi khuẩn lao có kích thước nhỏ hơn
5 µm do bệnh nhân lao giải phóng ra không khí trong phòng khi ho hoặc nói
chuyện [35]. Vì vậy việc kiểm soát không khí trong các khu vực kín có bệnh
17


nhân lao là cần thiết và được thực hiện với các lý do chính sau: kiểm tra mức
độ nhiễm vi khuẩn trong không khí để có biện pháp kiểm soát không khí đúng

theo quy định về an toàn, để thu thập các số liệu dịch tễ liên quan đến giới hạn
về mức độ phơi nhiễm của nhân viên y tế và cho các mục đích chung của
khoa học và nghiên cứu.
Việc kiểm soát không khí trong các vùng ô nhiễm lao có hiệu quả phụ
thuộc vào kỹ thu
ật thu thập vi khuẩn từ không khí và môi trường và các kỹ
thuật phát hiện vi khuẩn lao trong các mẫu đó. Một cách truyền thống là tập
trung vào việc phân tích mẫu là đếm vi khuẩn có trong mẫu dựa trên nuôi cấy
với một số hạn chế liên quan đến việc vi khuẩn lao có thời gian phát triển chậm và
chỉ mọc trên các môi trường chọn lọc với các điều kiện thuận lợi [78], [41], [77].
Do vậy, những kỹ thuật nhanh và chính xác
để phát hiện vi khuẩn lao trong môi
trường cần được áp dụng để khắc phục các nhược điểm trên [29].
Thu thập mẫu môi trường
Một nghiên cứu năm 1962 do Ridley và cộng sự tiến hành đã cho hàng
trăm chuột lang được thở không khí trực tiếp từ bệnh phòng có bệnh nhân lao.
Số chuột lang bị nhiễm lao sẽ được thử nghiệm da, mổ tử thi và phát hiện các
hạch lao trong phổi là kết quả củ
a việc hít các hạt khí dung có chứa vi khuẩn
lao trong không khí từ buồng bệnh nhân lao. Vi khuẩn lao sẽ được nuôi cấy
từ phổi bị nhiễm, thời gian nhiễm và số lượng chuột bị nhiễm lao cũng được
xác định [112]. Đây là một phương pháp rất tốn thời gian và phải có máy hút
trực tiếp không khí từ phòng bệnh tới lồng kín nhốt hàng trăm chuột lang làm
cho việc áp dụng trong những nghiên cứu khác bị hạn chế
[112]. Một nghiên
cứu khác sử dụng mô hình chuột lang cũng được tiến hành tại Châu Phi khi
một bệnh viện lao được xây dựng để có thể nối trực tiếp với phòng kín nhốt
chuột lang. Nhưng nhược điểm của nghiên cứu này là môi trường sống của
chuột lang bị nhốt không tự nhiên gây căng thẳng cho chuột tham gia thí
18

nghiệm, hơn nữa hệ thống thải nước tiểu và phân chuột cũng cần được thiết
kế để đảm bảo vệ sinh môi trường cho chuột [101].
Trong những năm gần đây, việc phát hiện vi khuẩn lao trong không khí
dựa trên các kỹ thuật sinh học phân tử, xác định ADN của vi khuẩn lao với
đầu dò đặc hiệu gắn với enzym tạo mầu khi phản ứng với cơ ch
ất [114]. Máy
hút được sử dụng để thu không khí nhiễm vi khuẩn lao, sử dụng các màng lọc
(polytetrafluoroethylene) PTFE và polycarbonate (PC). Năm 1999, kỹ thuật
PCR được sử dụng để phát hiện vi khuẩn lao trong hầm mỏ [88] và phòng áp
lực âm sử dụng để thu thập vi khuẩn lao trong không khí [94]. Vào năm 2004,
các nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao trong không khí tại các bệnh viện lao
được tiến hành, sử dụng máy hút không khí và phương pháp PCR [73], [65].
1.3. NHIỄM LAO VÀ BỆNH LAO
1.3.1. Nguồn lây
Tất cả các bệnh nhân lao đều có th
ể là nguồn lây, nhưng mức độ lây
rất khác nhau [07]. Đối với các thể lao ngoài phổi (lao màng não, màng
bụng, hạch, xương khớp…) là các thể lao ít có khả năng đào thải vi khuẩn
lao ra bên ngoài môi trường. Lao phổi là thể bệnh dễ đưa vi khuẩn ra môi
trường bên ngoài (lượng không khí lưu thông trong một chu kỳ hô hấp trung
bình là 500ml), vì vậy bệnh nhân lao phổi là nguồn lây quan trọng nhất.
Nhưng ngay đối với lao phổi thì mức độ lây cũng khác nhau. Những bệ
nh
nhân lao phổi trong đờm có nhiều vi khuẩn lao có thể phát hiện bằng phương
pháp nhuộm soi trực tiếp thì khả năng lây cho người khác gấp 2 đến 10 lần
các bệnh nhân lao phổi phải nuôi cấy mới phát hiện được vi khuẩn [07].
Như vậy, bệnh nhân lao phổi có vi khuẩn trong đờm phát hiện được
bằng phương pháp soi trực tiếp là nguồn lây nguy hiểm nhất (còn gọi là

nguồn lây chính). Trẻ em bị bệnh lao không phải là nguồn lây quan tr
ọng vì
có tới 95% bệnh lao ở trẻ em không tìm thấy vi khuẩn trong các bệnh phẩm.
19


1.3.2. Đường xâm nhập của vi khuẩn vào cơ thể.
Vi khuẩn lao vào cơ thể qua đường hô hấp là phổ biến nhất. Khi bệnh
nhân lao phổi ho, khạc, hắt hơi hay nói chuyện tạo ra những hạt nước bọt rất
nhỏ chứa đầy vi khuẩn lao lơ lửng trong không khí, người lành có thể hít
phải những hạt này vào phổi và mắc bệnh [07]. Những người sống càng gần
gũi bệnh nhân, s
ố lượng vi khuẩn có thể hít vào càng lớn.
Bệnh lao cũng có thể lây theo đường ăn uống khi uống sữa bò tươi
của các con bò bị lao mà sữa chưa tiệt khuẩn, khi ăn các thức ăn bị lây
nhiễm trực khuẩn lao (không phải trực khuẩn lao người, đây là lao bò M.
bovis) , có thể bị lao khi trực khuẩn lao qua các vùng cơ thể bị tổn thương
(da, mắt v.v ) lọt vào cơ thể, nhưng các con đường này rất ít g
ặp. Vi khuẩn
cũng có thể lây nhiễm qua thai nhi bằng đường máu qua tĩnh mạch rốn, nếu
mẹ bị lao cấp tính (như lao kê), hoặc qua nước ối (khi chuyển dạ), nếu mẹ bị
lao niêm mạc tử cung, âm đạo. Trong thực tế con đường truyền bệnh này
càng hiếm gặp. Như vậy con đường truyền bệnh quan trọng nhất với bệnh
lao là đường hô hấp[02], [07].
1.3.3. Nhiễm lao.
Quá trình nhiễm bệnh lao

Có 5 giai đoạn trong việc vi khuẩn lao thâm nhập và gây nhiễm trong cơ thể [124]:
1. Bệnh lao bắt đầu khi vi khuẩn lao có mặt trong các hạt khí dung thâm
nhập các phế nang, ở nơi bắt đầu sự nhiễm lao.

2. Sự lan truyền bệnh bắt đầu từ 7 đến 21 ngày sau khi vi khuẩn lao xâm
nhiễm đại thực bào và nhân lên trong đó. Mặc dù đại thực bào đã nuốt
vi khuẩn lao nhưng không tiêu diệt được chúng vì đã bị b
ất hoạt.
3. Trong giai đoạn này các hạch lao được hình thành. Vi khuẩn lao bên
trong các hạch này sẽ không nhân lên được do pH thấp và thiếu oxy
nhưng có thể sống sót trong các hạch này dài ngày (lao tiềm ẩn).
20


4. Vi khuẩn lao có thể sử dụng các đại thực bào đã bị bất hoạt để tiếp tục
nhân lên dẫn đến việc phát triển các u hạt và xâm chiếm phế quản. Từ
đây vi khuẩn lao có thể xâm nhiễm các phần khác của phổi.
5. Cùng với thời gian, phế quản sẽ bị hoại tử và vỡ ra, cho phép vi khuẩn
lao xâm nhập các vùng khác của phổi.
Trong đa số trườ
ng hợp tổn thương có thể tự khỏi (có hiện tượng lắng
đọng calci, hình thành nốt vôi) và không có biểu hiện lâm sàng. Phản ứng da
với Tuberculin bắt đầu dương tính ở tuần lễ thứ ba sau khi vi khuẩn xâm nhập
vào cơ thể , nhưng miễn dịch đầy đủ của cơ thể chống lại bệnh lao phải sau 2
– 3 tháng [02], [07].
Như vậy, nhiễm lao là giai đoạn đầu tiên khi vi khuẩn vào cơ thể gây
tổn thương đặc hiệu (thường là ở phổi). Đa số trường hợp không có biểu hiện
lâm sàng, cơ thể hình thành dị ứng và miễn dịch chống lao. Khi chưa có đại
dịch HIV/AIDS thì chỉ có khoảng 10%
Bệnh lao chỉ thực sự xảy ra khi số lượng và độc tính của trực khuẩn lao
vượt quá sức đề kháng của cơ thể. Những người bị nhiễm lao chuyển thành
bệ
nh lao. Khi nhiễm lao phối hợp với nhiễm HIV thì khả năng từ nhiễm lao
chuyển sang bệnh lao ít nhất cũng gấp 3 lần những trường hợp chỉ có nhiễm

lao [02]. Khả năng nhiễm lao trở thành bệnh lao phụ thuộc vào hai yếu tố:
mức độ nhiễm nhiều hay ít và sức đề kháng của cơ thể.
1.3.4. Bệnh lao.
Bệnh lao có thể xảy ra rất sớm ngay trong giai đoạn nhiễm lao, trẻ
càng
nhỏ thì bệnh lao càng dễ xảy ra. Ở giai đoạn nhiễm lao vi khuẩn đã vào máu
lan tràn tới các cơ quan gây tổn thương như màng não, xương khớp, hạch…Vì
vậy ở trẻ nhỏ hay gặp bệnh cảnh lao kê phổi kèm theo lao nhiều bộ phận khác
trong cơ thể [07].