Nghiên cứu mức độ tạo mô sẹo phôi hóa và khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh, phục vụ công tác chuyển gen ở sắn (manihot esculenta crantz) (manihot esculenta crantz)

1

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô giáo trong Khoa Sinh học,
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình giảng dạy, dìu dắt tôi trong thời gian
học tập tại Trường.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn Văn Đồng và TS. Lê
Hồng Điệp, những người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình
học tập, nghiên cứu khoa học và thực hiện luận văn.
Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể cán bộ và học viên
làm việc tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ Tế bào thực vật, Viện
Di truyền Nông nghiệp đã hết lòng giúp đỡ tôi thực hiện thành công luận văn này.
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên, giúp
đỡ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong quãng thời gian qua.
Luận văn được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí từ Bộ Khoa học Công nghệ
thông qua Hợp đồng Thực hiện nhiệm vụ hợp tác quốc tế về khoa học và công nghệ
theo nghị định thư số: 08/2013/HĐ-NĐT. Tôi xin chân thành biết ơn sự hỗ trợ đó.

Hà Nội, tháng 6 năm 2014
Học viên


Tống Thị Hường


i
MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG iv
DANH MỤC CÁC HÌNH v

DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Giới thiệu chung về cây sắn 3
1. 1. 1. Nguồn gốc và phân loại 3
1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây sắn 5
1.1.3. Giá trị của cây sắn 7
1.2. Tình hình sản xuất và sử dụng sắn trên thế giới và Việt Nam 8
1.2.1. Trên thế giới 8
1.2.2.Ở Việt Nam 9
1.3. Lịch sử phát triển của công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật 11
1.4. Nguyên lý và ứng dụng của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 14
1.4.1. Cơ sở lí thuyết 14
1.4.2. Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro 15
1.4.3. Các hướng ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 16
1.5. Môi trƣờng nuôi cấy tế bào mô thực vật 17
1.5.1. Các chất khoáng 17
1.5.2.Các vitamin 18
1.5.3. Các chất điều hoà sinh trưởng 19
1.6. Các phƣơng pháp chuyển gen ở thực vật 21

ii
1.6.1. Chuyển gen trƣc tiếp 21
a. Chuyển gen bằng xung điện 21
b. Chuyển gen bằng vi tiêm (microinjection) 22
c. Chuyển gen bằng vi tiêm qua ống phấn (pollen tube) 22
d. Chuyển gen bằng súng bắn gen (Microprojectile bombardment biolistics) 22
1.6.2. Chuyển gen gián tiếp 23
a. Chuyển gen gián tiếp nhờ virus 23
b. Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 23

1.7. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo phôi hóa tạo hệ thống tái sinh và
chuyển gen vào sắn 24
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27
2.1. Vật liệu nghiên cứu 27
2.1.1. Mẫu thực vật 27
2.1.2. Vi khuẩn và các vector 27
2.1.3. Môi trường nuôi cấy 28
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 28
2.2.1. Phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch 28
2.2.2. Phương pháp nhân giống trong ống nghiệm 29
2.2.3. Nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo phôi hóa 29
2.2.4. Nghiên cứu khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ mô sẹo phôi hóa
30
2.2.5. Phương pháp biến nạp 31
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33
3.1. Nghiên cứu tạo mẫu sạch 33
3.2. Nghiên cứu thí nghiệm tạo chồi, nhân cụm chồi và kéo dài chồi 36

iii
3.3. Nghiên cứu tạo mô sẹo phôi hóa từ chồi nách cây sắn 37
3.4. Kết quả tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ mô sẹo phôi hóa của giống TMS
60444 47
3.5. Kết quả chuyển gen vào mô sẹo phôi hóa của giống TMS 60444 49
KIẾN NGHỊ 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

iv
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. Diện tích trồng sắn tại Việt Nam (x1000 ha) từ năm 1995 – 2012 [66] 9
Bảng 2. Sản lượng sắn (x 1000 tấn) trồng tại Việt Nam từ 1995 – 2012 [66] 10
Bảng 3.Các nhà máy sản xuất Ethanol và rượu từ sắn của Việt Nam năm 2012 [67] . 11
Bảng 4: Khái quát các bước tạo mô sẹo phôi hóa ở sắn 30
Bảng 5. Hệ số của các thí nghiệm tạo cụm chồi, thí nghiệm nhân cụm chồi và thí
nghiệm kéo dài chồi 36
Bảng 6. Kết quả tạo mô sẹo từ chồi nách trên môi trường CIM 38
Bảng 7.Đánh giá chất lượng mô sẹo sau 2 tuần nuôi cấy trong môi trường DKW 40
Bảng 8: Đánh giá tỷ lệ mô sẹo phát sinh phôi ở giai đoạn 28 ngày tuổi tại môi trường
DKW 41
Bảng 9. Đánh giá khả năng tạo mô sẹo phôi hóa ở môi trường MMS 43
Bảng 10. Tỷ lệ tạo mô sẹo phôi hóa của các giống sắn nghiên cứu 46
Bảng 11. Đánh giá khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ mô sẹo phôi hóa 48
Bảng 12. Ảnh hưởng của Cefotaxime đến tỉ lệ sống và khả năng tái sinh từ mô sẹo
phôi hóa của TMS 60444 (theo dõi sau 8 tuần) 55
Bảng 13. Ảnh hưởng của nồng độ OD
600

đến khả năng tiếp nhận gen của mô sẹo phôi
hóa 51







v
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. Hình thái cây sắn [47] 3
Hình 2. Diện tích, năng suất và sản lượng sắn của thế giới từ năm 1995 – 2012 [66] 8
Hình 3. Sản lượng sắn (năm 2008) của các nước trên thế giới [65] 9
Hình 4. Các hệ thống đang được sử dụng để thu cây sắn biến đổi gen [59] 24
Hình 5: Tỷ lệ mẫu sống của các giống sắn nghiên cứu ở các nồng độ NaClO khác nhau
33
Hình 6: Tỷ lệ mẫu sạch của các giống sắn nghiên cứu ở các nồng độ NaClO khác nhau
34
Hình 7. Kết quả thí nghiệm tạo cụm chồi của giống HL 2004-28 sau 28 ngày nuôi cấy
37
Hình 8. Các cụm mô sẹo 2 tuần tuổi trong môi trường CIM 40
Hình 9. Khối mô sẹo của các giống trong môi trường DKW sau 2 tuần nuôi cấy 42
Hình 10. Khối mô sẹo HL 2004-28 (A); KM 140 (B); KM 419 (C) và TMS 60444 (D)
ở giai đoạn 8 tuần tuổi tại môi trường MMS 45
Hình 11. Cụm mô sẹo phôi hóa tái sinh 48
Hình 12: Sơ đồ quy trình chuyển gen vào sắn thông qua A. tumefaciens 50
Hình 13: Chồi tái sinh của cụm mô sẹo phôi hóa ngâm trong dịch khuẩn có OD
600
=

0,5 biểu hiện gen GFP. 53
Hình 14: Chồi tái sinh của cụm mô sẹo phôi hóa ngâm trong dịch khuẩn có OD
600
=
0,7 biểu hiện gen GFP. 53
Hình 15: Chồi tái sinh của cụm mô sẹo phôi hóa ngâm trong dịch khuẩn có OD
600
=
0,25 biểu hiện gen GFP. 54


vi

DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu/viết tắt
Tên đầy đủ
AS
Acetosyringone
BAP
6-Benzyl amino purin
GFP
Green Flourescen Protein
EC
Embryogenic Callus
FAO
Food and Agriculture Organization of the United Nations
IAA
Acid-β-indolacetic
NAA

Napthanele acetic acid
2,4D
Axit 2,4 Diclorophenoxiaxetic
ADN
Acid deoxiribonucleic
Picloram
4-Amino-3,5,6-trichloro-2-pyridinecarboxylic
Glufosinate
(RS)-2-Amino-4 (hydroxy(methyl)phosphonoyl)butanoic acid
MS
Murashige and Skoog
OD
Optical Density
w/v
Weight per volume


1
MỞ ĐẦU

Biến đổi khí hậu làm nhiệt độ trái đất tăng lên, dẫn đến các hiện tượng hạn hán,
lũ lụt xảy ra thường xuyên hơn, cùng với dịch bệnh, gây ảnh hưởng không nhỏ đến sự
sinh trưởng và phát triển cũng như năng suất cây trồng. Điều này ảnh hưởng trực tiếp
đến đời sống của con người, đặc biệt là vấn đề an ninh lương thực, nhất là đối với con
người ở những khu vực thường xảy ra thiên tai hoặc có điều kiện tự nhiên không thuận
lợi. Trước tình hình đó, việc tạo ra các nguồn giống cây mới, nhất là cây lương thực có
năng suất cao, phẩm chất tốt, thích nghi rộng với các điều kiện môi trường, càng trở
nên cấp thiết. Công nghệ chọn giống trước đây chủ yếu được tiến hành bằng phép lai
giữa các giống có các tính trạng khác nhau để thu được thế hệ con lai có tính trạng
mong muốn. Tuy nhiên phương pháp này có những hạn chế nhất định khiến tiềm năng

của nó bị giảm sút, chẳng hạn như thế hệ con lai bất thụ, hoặc chỉ giới hạn ở các cá thể
cùng loài. Chọn tạo giống sắn bằng phương pháp đột biến cũng được xem là một trong
các phương pháp nhằm khắc phục các hạn chế của phương pháp lai tạo nói trên. Hơn
thế nữa, trong những năm gần đây, công nghệ sinh học thực vật đã đạt được một số
thành tựu khả quan, cho phép các nhà chọn giống tạo ra giống mới có nhiều phẩm chất
tốt từ những nguồn gốc khác nhau. Đặc biệt, công nghệ nuôi cấy mô sẹo phôi hóa (ký
hiệu EC – embryogenic callus) không những có thể tạo ra những giống cây sạch bệnh,
mà còn có thể nghiên cứu phát sinh hình thái phôi vô tính, nhân sinh khối tế bào dịch
lỏng, nuôi cấy và dung hợp tế bào trần để tạo giống lai tứ bội thể, tạo cây trồng chuyển
gen và bảo quản nguồn gen.
Trong lĩnh vực cây lương thực, bên cạnh lúa, ngô và đậu tương, sắn là một loài
đóng vai trò quan trọng góp phần ổn định nhu cầu lương thực của con người và giải
quyết vấn đề an ninh lương thực trên thế giới, sắn cũng là nguồn nguyên liệu quan
trọng cho các ngành công nghiệp thực phẩm và nhiên liệu sinh học. Sắn được trồng
nhiều nơi trên thế giới, cũng như ở Việt Nam. Tuy nhiên, do kĩ thuật thâm canh không
đồng bộ dẫn đến tình trạng đất đai bị xói mòn, rửa trôi, kết hợp với các điều kiện môi
trường không thuận lợi, sâu bệnh ngày càng nhiều, nên sắn có sản lượng thấp và chất
lượng suy giảm. Vì vậy, để sản xuất cây sắn một cách bền vững thì cần phải tạo ra

2
được giống sắn sạch bệnh, năng suất cao và phải mang các đặc điểm thích hợp với
điều kiện môi trường hiện tại.
Nhu cầu về sản lượng sắn ngày càng tăng cao trong khi diện tích trồng sắn ngày
càng giới hạn, khiến cho việc tạo giống tăng năng suất, sản lượng và chất lượng sắn củ
càng trở nên cấp thiết. Việc sản xuất sắn bằng các giải pháp công nghệ sinh học chính
là một trong các phương pháp hiệu quả nhất để giải quyết vấn đề này. Chính vì thế,
chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu mức độ tạo mô sẹo phôi hóa và khả năng
tái sinh cây hoàn chỉnh, phục vụ công tác chuyển gen ở sắn (Manihot esculenta
Crantz)” với mục đích nghiên cứu như sau:
MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI

- Tạo được lượng lớn nguồn nguyên liệu sắn vô trùng, phục vụ cho việc tạo mô
sẹo phôi hóa.
- Xác định được mức độ tạo mô sẹo phôi hóa và khả năng tái sinh từ mô sẹo
phôi hóa.
- Thăm dò khả năng chuyển gen vào mô sẹo phôi hóa thông qua Agrobacterium
tumefaciens.
Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
Ý nghĩa khoa học: Kết quả của đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học về
mức độ tạo mô sẹo phôi hóa, khả năng tái sinh, khả năng tiếp nhận gen từ
Agrobacterium tumefaciens vào mô sẹo phôi hóa của sắn (Manihot esculenta Crantz).
Ý nghĩa thực tiễn: Là cơ sở ứng dụng để chuyển gen quan tâm vào cây sắn (M.
esculenta Crantz) nhằm tạo ra giống sắn mới có tính trạng mong muốn.

Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực
vật – Viện Di truyền Nông nghiệp, với sự hỗ trợ kinh phí từ Bộ Khoa học Công nghệ
thông qua Hợp đồng Thực hiện nhiệm vụ hợp tác quốc tế về khoa học và công nghệ
theo nghị định thư số: 08/2013/HĐ-NĐT.




3

CHƢƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung về cây sắn
1. 1. 1. Nguồn gốc và phân loại
Cây sắn (Manihot esculanta Crantz) là cây đóng vai trò quan trọng trong kinh tế
nông nghiệp của nước ta. Nó không chỉ đóng vai trò cung cấp nguồn thực phẩm cho con
người, nguồn thức ăn cho chăn nuôi mà còn là mặt hàng nông sản xuất khẩu chủ chốt,

thu về nguồn ngoại tệ đáng kể cho đất nước [31].

Hình 1. Hình thái cây sắn [47]

Tất cả 98 loài thuộc chi Manihot đều sống ở vùng nhiệt đới và đã được di canh
đến nhiều khu vực khác nhau trên thế giới. Nguồn gốc thực sự của cây sắn vẫn chưa rõ
ràng [14]. Sắn thuộc họ Euphorbiaceae bao gồm 7200 loài, được đặc trưng bởi các hệ
thống tuyến mủ do các tế bào tiết mủ tạo thành. Hình thái của họ này rất đa dạng, từ
nhóm thân cao như cao su đến nhóm thân bụi, cũng như các nhóm thực vật có giá trị
kinh tế cao, như thầu dầu [19].

4
Sắn sống tự nhiên ở vùng nhiệt đới, phân bố phổ biến từ 33° vĩ bắc đến 33° vĩ
nam. Trong số 98 loài đã được mô tả, chỉ có sắn được trồng trên diện rộng vì giá trị
kinh tế của chúng. Sắn được biết đến với hơn 100 tên gọi khác nhau, phụ thuộc vào địa
lý nơi chúng được trồng. Ở Mỹ Latinh, sắn có tên gọi là yuca (theo tiếng Tây Ban
Nha) hoặc mandioca (tiếng Bồ Đào Nha), trong khi tại Brazin, chúng được chia thành
2 loại, sắn ngọt (sweet cassava) hay sắn đắng (bitter cassava) theo người trồng [19].
Về nguồn gốc của sắn vẫn chưa khẳng định được chính xác, tuy nhiên, với
những bằng chứng khảo cổ, có thể khẳng định rằng sắn có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới
của châu Mỹ La-Tinh, thuộc khu vực sông Amazon, được loài người trồng cách đây
5000 năm. Trung tâm phát sinh sắn ở Đông Bắc Brazin và một trung tâm khác ở Trung
Mỹ và Mexico. Nghiên cứu khảo cổ học cho thấy, một số di vật củ sắn đã được tìm
thấy có niên đại khoảng 2700 năm trước công nguyên ở Venezuela, và khoảng 2000
năm trước công nguyên ở vùng ven biển Peru. Trong khi đó, những lò nướng bánh sắn
phức hệ Ualabo có niên đại 1200 năm trước công nguyên đã được tìm thấy ở phía Bắc
Colombia và những hạt tinh bột có tuổi khoảng năm 900-200 trước công nguyên trong
những phần hóa thạch được phát hiện tại Mexico cùng một số di tích khảo cổ học
khác chứng tỏ cây sắn đã xuất hiện và được trồng như một loại cây nông nghiệp từ rất
lâu đời [52], [53].

Sắn được người Bồ Đào Nha đưa vào châu Phi lần đầu tiên vào giữa thế kỷ 16.
Trải qua thế kỷ 17 phát triển chậm chạp, sắn được du nhập vào đảo Bourbon và Ilede
(Pháp) vào các năm 1738-1739, và đưa sang Madagasca vào năm 1875, Xri lanca
(1786), Calcutta (1794) và một số nước phía đông châu Phi như Zambiar (1799),
Uganda (1878). Ở châu Á, sắn được du nhập vào Ấn Độ khoảng thế kỷ 17, Việt Nam
và một số nước khác trong khu vực Đông Nam Á vào thế kỷ 18 [2].Tuy nhiên, mãi đến
thế kỷ 19, nghề trồng sắn và tiêu thụ mới thực sự phát triển với sự du nhập các kỹ thuật
chế biến ở Brazin bởi các nô lệ được phóng thích. Từ đó đến nay, diện tích, năng suất
và sản lượng sắn ngày một tăng [8].

5


1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây sắn
Rễ sắn
Rễ sắn có thể mọc ra từ hạt hoặc từ hom (đoạn thân cây được lựa chọn giữ lại
làm giống cho vụ kế tiếp). Rễ mọc từ hạt bắt đầu là một rễ cọc mọc thẳng cắm xuống
đất sau đó các rễ phụ mọc ra. Cả rễ cọc và rễ phụ đều có khả năng phát triển thành củ.
Rễ mọc ra từ hom thì đầu tiên mọc ngang sau đó cũng cắm thẳng xuống đất.
Rễ sắn có hai chức năng chính là đồng hóa và dự trữ. Rễ đồng hóa thường cắm
sâu trong lòng đất có thể dài tới 30 cm để hút nước, chất dinh dưỡng và giúp cho cây
vững chắc. Rễ dự trữ (rễ củ) do các rễ con tập trung dinh dưỡng mà thành. Khi cây
mới ra rễ thì có rất nhiều rễ con nhưng sau đó chỉ một số rễ con được tập trung dinh
dưỡng phát triển thành củ. Củ sắn thường có dạng hình trụ có thể dài tới 30 cm, có thể
có hoặc không có cuống củ [19].
Thân cây
Cây sắn thuộc loại thân gỗ, cao từ 1-3 m. Chiều cao của cây phụ thuộc vào
giống, điều kiện chiếu sáng, mức độ thâm canh, mật độ và thời vụ trồng. Thân sắn có
khả năng phân cành, tuy sự phân cành có ảnh hưởng đến khả năng ra hoa của cây.
Thân và cành già đã hóa gỗ có màu trắng bạc, xám, nâu hoặc hơi vàng. Số lượng thân

phụ thuộc vào cách đặt hom và số mắt trên hom. Về mặt cấu tạo, lớp cắt ngang thân
sắn có bốn lớp: trong cùng là lõi xốp, tế bào rất lớn; tiếp đến là tầng gỗ; mô mềm của
vỏ và ngoài cùng là lớp biểu bìrất mỏng. Khi nhân vô tính sắn người ta sử dụng các
đoạn hom lấy từ thân cây, vì vậy ngoài việc lựa chọn các đoạn hom đẹp, sạch bệnh
phải giữ cho lớp biểu bì không bị sây sát vì lớp này có chức năng bảo vệ cho hom
không bị mất nước [19], [62].
Lá sắn
Lá sắn là loại lá đơn mọc xen kẽ trên thân, gồm hai phần cuống lá và phiến lá.
Cuống lá dài từ 3-30 cm với nhiều màu sắc khác nhau tùy theo giống (màu vàng, xanh
vàng, hồng, đỏ tươi ). Phiến lá thường chia 5-7 thùy nhưng cũng có khi không chia

6
thùy. Lá của những cây sắn mọc từ hạt thì phiến lá thường nguyên vẹn hoặc chia thùy
không đều. Các cây mọc từ hom, từ chỗ phân cành số thùy của phiến lá thường giảm.
Cấu tạo phiến lá gồm một lớp biểu bì phía trên có tầng cutin dày, tầng mô dậu, tầng
mô hổng và biểu bì. Mặt dưới có rất nhiều khí khổng đường kính khoảng 30 µm và có
khoảng 700 lỗ/mm
2
[8], [62].
Hoa sắn
Hoa sắn là hoa đơn tính cùng gốc, mọc thành cụm, có cuống mọc ra từ chỗ phân
cành, ngọn thân. Một số giống sắn không có hoa do không có sự phân hóa hoa hoặc do
mầm hoa rụng đi. Những cụm sinh ra từ những cành thấp thường rụng sớm. Cụm hoa
gồm một trục dài 2-10 cm và các trục bên hợp lại thành chùy [8], [19].
Hoa cái có năm lá đài và có màu sặc sỡ, ngoài rìa có lông. Giữa hoa cái có một
bầu hoa có 6 cánh, chứa 3 lá noãn nằm ở trên đài. Trên bầu có 3 vòi nhụy ngắn với đầu
nhụy uốn cong. Hoa đực có 5 lá đài dính với nhau trên một nửa chiều dài, nhẵn ở bên
trong và có lông ở phía ngoài. Có khoảng 8-10 nhị đực xếp thành hai vòng và mọc lên
từ các thùy của một đĩa phía dưới. Bao phấn mềm, hạt phấn 3 ngăn, dày dính, màng
ngoài hạt phấn có gai nhỏ.

Số lượng hoa của mỗi giống sắn không giống nhau, thường hoa đực sẽ nhiều
hơn hoa cái nhưng hoa cái lại thường nở trước hoa đực để tránh hiện tượng tự thụ
phấn. Hoa cái nở cuối cùng thường nở cùng với hoa đực nở đầu tiên trên cây. Hoa đực
thường nở vào giữa trưa còn hoa cái thường khép lại vào nửa cuối buổi chiều.
Bao phấn bắt đầu mở trước khi hoa nở được khoảng 2 giờ và mở hoàn toàn
trước khi hoa nở 1 giờ; sau đó phát tán nhờ gió hoặc côn trùng với phạm vi thụ phấn là
trong khoảng 30 cm. Tuổi thọ của hạt phấn là một tuần còn thời gian tiếp nhận hạt
phấn của đầu nhụy trong vòng 24 giờ. Sau 24 giờ, đầu nhụy bắt đầu héo, chuyển sang
màu nâu, khô đi và rụng chậm nhất là sau 1 ngày. Thời gian từ lúc thụ phấn đến thụ
tinh kéo dài từ 8-19 giờ [8], [19].




7
Quả và hạt
Quả sắn thuộc loại quả nang, mở khi chín, đường kính 1-1,5 cm. Quả có 3 ngăn,
được tạo thành từ 6 cánh của bầu hoa, mỗi ngăn chứa một hạt. Màu sắc quả thường
biến đổi từ lục nhạt, hơi vàng đến lục hay đỏ tía khá đậm. Cuống quả phình lên ở chỗ
tiếp xúc với quả. Sau khi chín, quả tự mở chỉ còn lại trục giữa của quả.Hạt sắn hình
trứng, tiết diện hơi giống hình tam giác. Hạt có vân hoặc những vết màu nâu đỏ trên
nền màu kem hoặc xám nhạt [8], [19].
1.1.3. Giá trị của cây sắn
Sắn là một trong 3 cây lương thực quan trọng nhất thế giới bên cạnh gạo và ngô
[26]. Củ sắn có hàm lượng tinh bột cao với khoảng 84-87% trọng lượng khô, là nguồn
cung cấp carbonhydrate cho hơn 500 triệu người ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới
cũng như hơn 1 tỷ người trên thế giới.Trong củ sắn cũng có một số loại axit amin chứa
lưu huỳnh tuy lượng không nhiều và hàm lượng thấp các protein, chất béo, một số chất
khoáng (P, K, Mg, ) và vitamin (B1, B2, ) [22], [25], [30]. Tại Châu Á, Châu Phi và
Mỹ Latinh, có khoảng 600 triệu người có cuộc sống phụ thuộc vào cây sắn. Ở những

khu vực này, cây sắn được coi là cây lương thực xóa đói giảm nghèo quan trọng do là
cây trồng phát triển tốt trên đất nghèo dinh dưỡng và có khả năng chịu hạn cao [8]. Ở
Đông Nam Á, sắn là một nguồn năng lượng chính cho người dân như tại Campuchia,
Lào và Myanmar [12].Củ sắn cũng là nguồn thức ăn quan trọng để sản xuất thức ăn
chăn nuôi [8].
Lá sắn chứa nhiều chất dinh dưỡng với hàm lượng protein cao hơn trong củ từ 6-
7% trọng lượng tươi và 21-25% trọng lượng khô. Hàm lượng lipit ở lá gấp 6 lần ở củ.
Ngoài ra, lá sắn chứa nhiều canxi, carotene, vitamin B1, vitamin C, nhiều axit amin
không thay thế đặc biệt lizin và triptophan nhưng thiếu methionin. Lá sắn được ủ chua
làm thức ăn cho trâu, bò,… hoặc thức ăn tươi cho cá, tằm,… [35].
Bên cạnh vai trò cung cấp tinh bột làm thức ăn cho người và động vật, sắn còn
góp phần vào sự đa dạng về kinh tế và tạo cơ hội cho phát triển công nghiệp công
nghiệp nhẹ, công nghiệp thực phẩm và nhiên liệu sinh học với hơn 80 quốc gia có khả
năng phát triển ngành công nghiệp từ sắn [8], [12]. Tinh bột sắn được dùng để sản xuất
các loại bánh, kẹo, bột ngọt, mì ăn liền, làm phụ gia dược phẩm và đặc biệt, sắn được

8
sử dụng làm nguồn nguyên liệu quan trọng để sản xuất cồn sinh học đem lại hiệu suất
và hiệu quả kinh tế cao.Thân sắn dùng để sản xuất nấm, nguyên liệu cho công nghiệp
xenlulozơ và nguyên liệu để sản xuất một số sản phẩm khác như màng phủ sinh học,
chất giữ ẩm, bao bì và phụ gia dược phẩm [8].
Tại Việt Nam, cây sắn đang được trồng rất rộng rãi và là cây lương thực được
xếp vào hàng thứ ba sau lúa và ngô. Cây sắn tạo ra lượng tinh bột cao nhất trong các
cây lương thực, chủ yếu được sử dụng làm thức ăn cho gia súc, và làm hàng xuất khẩu
có giá trị kinh tế cao.
1.2. Tình hình sản xuất và sử dụng sắn trên thế giới và Việt Nam
1.2.1. Trên thế giới
Sắn được trồng trên 100 nước có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới khắp châu
Á, châu Phi và Mỹ Latin. Diện tích, năng suất và sản lượng sắn trên thế giới có chiều
hướng gia tăng từ năm 1995 đến 2011 (Hình 2).

Hình 2. Diện tích, năng suất và sản lượng sắn của thế giới từ năm 1995 – 2011 [66]
Năm 2011, sản lượng sắn thế giới đạt 252,2triệu tấn củ tươi so với 231,76triệu
tấn năm 2010 và năm 1995 là 161,79 triệu tấn. Nước sản xuất sắn nhiều nhất là
Nigeria (45,72 triệu tấn), kế đến là Thái Lan (22,58 triệu tấn) và Indonesia (19,92 triệu
0
50
100
150
200
250
300
0
5
10
15
20
1995
1996
1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007

2008
2009
2010
2011
Sản lượng
Diện tích, năng suất
Diện tích (triệu ha)
Năng suất (tấn/ha)
Sản lượng (triệu tấn)

9
tấn). Nước có năng suất sắn cao nhất là Ấn Độ (31,43 tấn/ha), kế đến là Thái Lan
(21,09 tấn/ha), so với năng suất sắn bình quân của thế giới là 12,87 tấn/ha. Việt Nam
đứng thứ mười về sản lượng sắn trên thế giới (9,38 triệu tấn) (hình 3) [65].

Hình 3. Sản lượng sắn (năm 2008) của các nước trên thế giới [65]
1.2.2.Ở Việt Nam
Việt Nam đứng thứ mười về sản lượng sắn trên thế giới (9,38 triệu tấn). Quy
mô trồng sắn ở Việt Nam khá nhỏ, chủ yếu ở vùng núi và trung du, với diện tích trung
bình khoảng 0.27 ha/ thửa, trong đó, quy mô tại khu vực Đông Nam Bộ lớn nhất (0,85
ha) trong khi tại khu vực miền núi phía Bắc chỉ khoảng 0,2 ha. Ở miền Bắc, sắn được
trồng chủ yếu ở các khu vực có địa hình đồi núi và khoảng 68 % diện tích trồng sắn
trên đất đá và tương ứng khoảng 12% trên đất cát [2]. Ở Nam Việt Nam sắn được
trồng chủ yếu trên đất cát xám, có địa hình tương đối bằng phẳng và nghèo chất dinh
dưỡng. Vùng duyên hải miền Trung và Đông nam bộ chiếm hơn 60% diện tích trồng
sắn của toàn bộ khu vực phía nam, trong đó, hơn 30% sắn được trồng ở Tây Nguyên
và các tỉnh Đồng Nai, Bình Phước thuộc khu vực Đông Nam Bộ (Bảng 1).
Bảng 1. Diện tích trồng sắn tại Việt Nam (x1000 ha) từ năm 1995 – 2012 [66]

10
Sản lượng sắn ở Việt Nam bị suy giảm trong suốt những năm 1980-1990,
nhưng trồng sắn đã tăng mạnh trong những năm gần đây (2000-2012). Sản lượng sắn
năm 2000 chỉ đạt 1,99 triệu tấn đã tăng gấp 5 lần, đạt 9,74 triệu tấn vào năm 2012
(Bảng 2). Sự nhảy vọt này là do có sự tăng mạnh cả diện tích trồng (từ 237600 ha năm
2000 lên 550600 ha năm 2012) và năng suất (từ 8,66 tấn/ha năm 2000 lên 17,7 tấn/ha
năm 2012). Sản lượng sắn ở các vùng miền Trung và khu vực Đông Nam Bộ chiếm
đến 78% tổng sản lượng cả nước, đặc biệt là các tỉnh Gia Lai, Kon Tum, Đắk
Nông,Đắk Lắk ở Tây Nguyên; Tây Ninh, Đồng Nai, Bình Phước, Bình Thuận ở khu
vực Đông Nam Bộ; và các tỉnh Phú Yên,Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định ở khu
vực duyên hải miền trung (Bảng 2).
Bảng 2. Sản lƣợng sắn (x 1000 tấn) trồng tại Việt Nam từ 1995 – 2012 [66]

Việt Nam đạt được tiến bộ nhanh trong việc áp dụng công nghệ mới trong chọn
tạo và nhân giống cây trồng mới ở châu Á. Tiến bộ nàylà kết quả của nhiều yếu tố,
trong đó sự thành công trong lai tạo giống và ứng dụng công nghệ mới là những yếu tố
góp phần chính. Sự kết hợp giữa sản xuất trên diện rộng và phát triển các ngành công
nghiệp chế biến tinh bột và ethanol đã tạo ra nhiều công ăn việc làm, tăng xuất khẩu,
thu hút đầu tư nước ngoài và góp phần công nghiệp hóa và hiện đại hóa một số khu
vực nông thôn. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (Bộ NN & PTNT) đã có kế
hoạch duy trì diện tích sắn khoảng 450000 ha 2011-2015, và những nỗ lực đang được
thực hiện để tăng năng suất củ tươi 16,9-20 tấn/ha vào năm 2011 và 23-24 tấn/ha vào
năm 2015 bằng cách sử dụng công nghệ mới, đặc biệt là trong lai tạo (Bộ NN & PTNT
7256/TB-BNN-VP 25/12/2009) [26].
Việt Nam gần đây đã phát triển một chính sách E10 mà sẽ yêu cầu sản xuất từ
100 đến 150 triệu lít mỗi năm. Thủ tướng Chính phủ đã phê duyệt "Đề án phát triển
nhiên liệu sinh học đến năm 2015 và tầm nhìn đến năm 2025", nhằm mục đích để sản

11
xuất nhiên liệu sinh học và một phần thay thế nhiên liệu truyền thống. Điều này sẽ

đóng góp vào an ninh năng lượng và bảo vệ môi trường. Dầu khí Việt Nam có kế
hoạch xây dựng ba nhà máy sắn dựa trên ethanol ở miền Bắc (Phú Thọ), miền Trung
(Quảng Ngãi) và miền Nam Việt Nam (Bình Phước) với tổng công suất hàng năm dự
kiến khoảng 300 triệu lít mỗi năm (Bảng 3). Sự kết hợp rộng rãi giữa sản xuất sắn
tươi, chế biến sắn tinh bột và sản xuất ethanol đã tạo ra nhiều công ăn việc làm, tăng
xuất khẩu, thu hút đầu tư nước ngoài, góp phần công nghiệp hóa và hiện đại hóa một
số khu vực nông thôn [68].

Bảng 3.Các nhà máy sản xuất Ethanol và rƣợu từ sắn của Việt Nam năm 2012 [67]
Tên nhà máy
Công suất
(triệu lít/ năm)

Tên nhà máy
Công suất
(triệu lít/ năm)
Ethanol Đại Tân
125

Ethanol Tùng Lâm
70
Ethanol Dung Quất
100

Alcohol Lam Sơn
25
Ethanol Bình Phước
100

Alcohol Bình Tây

60
Ethanol Tam Nông
100

Đồng Xanh
70
Tổng cộng
650 triệu lít/ năm

1.3. Lịch sử phát triển của công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật
Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật được khởi nguồn từ học thuyết tế bào,
được nêu bởi Schleiden và Schwan vào năm 1983. Đến năm 1902, Haberlandt đã đưa
học thuyết trên vào thực nghiệm với nỗ lực tạo các phôi nhân từ các tế bào soma từ lá
một số cây một lá mầm, tuy nhiên, những thí nghiệm của ông đã thất bại bởi các cây
một lá mầm rất khó nuôi cấy và các tế bào này đã mất khả năng tái sinh. Sau đó, Kotte
và Robins (năm 1922)đã lặp lại thí nghiệm này với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một
cây hòa thảo. Trong môi trường lỏng gồm có muối khoáng và glucose, đầu rễ sinh
trưởng khá mạnh, tạo nên một hệ rễ nhỏ có cả rễ phụ. Thành công bước đầu của thí
nghiệm này đã mở ra giai đoạn phát triển mạnh mẽ của công nghệ nuôi cấy mô tế bào
với thành công của White(1934) khi nuôi cấy thành công rễ cây cà chua
(Lycopersicum esculentum) trong môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose và nước
chiết nấm men. Sau đó, White đã thay thế nước chiết nấm men bằng hỗn hợp 3 loại

12
vitamin nhóm B: thiamine (B1), pyridoxine (B6) và nicotinic acid nên việc nuôi cấy
đầu rễ trong thời gian vô hạn đã được tiến hành ở nhiều cây khác nhau.Sau khi Went
và Thimann phát hiện chất điều hòa sinh trưởng (hormone) đầu tiên làacid-β-
indolacetic (IAA) và kết tinh được chất này, Gautheret cùng với Nobercourt (năm
1939) đã thành công trong việc duy trì sự sinh trưởng trong thời gian vô hạn của mô
sẹo cà rốt (Daucuscarota) trên một môi trường rắn bằng thạch, bằng cách cấy chuyền 6

tuần một lần [16].
Giai đoạn 1941-1957 là thời kì phát triển mạnh của các chất điều hòa sinh
trưởng, khởi đầu là phát hiện tác dụng kích thích sinh trưởng của nước dừa trong nuôi
cấy phôi họ cà và cà rốt [11]. Nhiều chất sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin được
nghiên cứu và tổng hợp thành công như α-napthil acetic acid (NAA) và 2,4-dichloro
phenoxy acetic (2,4-D), giúp cho việc tạo mô sẹovà phân chia tế bào thành công ở
nhiều đối tượng thực vật trước đây rất khó nuôi cấy, tạo ra những bước tiến rất quan
trọng cho việc xây dựng các môi trường nuôi cấy mô, tế bào. Năm 1955, kinetin đầu
tiên là 6-furfurylaminopurine được phân lập, gộp với các chất có hoạt tính tương tự
được phát hiện sau này thành nhóm cytokinin với chất đầu tiên được tách từ thực vật
bậc cao là zeatin lấy từ mầm ngô [15], [40], [58].Năm 1962, Skoog và Murashige công
bố các kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tỉ lệ kinetin/auxin trong môi trường nuôi
cấy đối với việc hình thành các cơ quan của mô sẹo thuốc lá và được xác nhận trên
nhiều cây khác nhau [43]. Thành công của Skoog và Murashige dẫn đến nhiều phát
hiện quan trọng khác, mở đầu cho giai đoạn thứ ba của lịch sử nuôi cấy mô thực vật [16].
Trong thời gian từ 1954 đến 1959, kĩ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn, được
phát triển bởi Muir, Hildebrandt và Riker; Nickell (1956); Melches và Beckman
(1959). Năm 1960, Bergman đã thu được một huyền phù không có tế bào dính cụm mà
gồm hầu hết là tế bào đơn có khả năng sống, phân chia và tái tạo mô sẹo. Cùng với
Bergman, nhiều tác giả đã thành công trong việc tạo dựng được một cây hoàn chỉnh từ
một tế bào, chứng minh tính toàn năng của tế bào thực vật. Khả năng nuôi cấy tế bào
thực vật trong các bình lên men dùng trong công nghiệp vi sinh và khả năng tái tạo cây
hoàn chỉnh từ tế bào đã mở ra những triển vọng mới trong việc tạo dòng tế bào đột
biến, các dòng tế bào siêu sản xuất (over-production) một sản phẩm thứ cấp nào đó và
khả năng tăng tần suất đột biến trong di truyền đột biến ở thực vật bậc cao [32].

13
Năm 1960, Cooking đã dùng cellulase để phân hủy vỏ cellulose của vỏ tế bào
thực vật, thu protoplast, mở đầu cho các kĩ thuật lai và dung hợp tế bào vào những
năm 1970 [20]. Bên cạnh đó, khả năng biến nạp của tế bào thực vật được đề xuất vào

năm 1965 cho dù chúng gây ra nhiều tranh cãi về khả năng xâm nhập và biểu hiện
cũng như tồn tại lâu dài của ADN ngoại lai. Nhờ các plasmid, hàng loạt gene ngoại lai
được chuyển vào nhiều họ thực vật. Các phương pháp để đưa gene ngoại lai vào tế bào
thực vật cũng trở nên đa dạng với những kĩ thuật hiện đại như sử dụng điện
(electroporation), kĩ thuật vi tiêm (microinjection), sử dụng siêu âm (ultrasonic gene
transfer), sử dụng súng bắn gene (gene gun) đang được các phòng thí nghiệm trên thế
giới ứng dụng và phát triển bên cạnh kĩ thuật chuyển gen truyền thốngbằng vi khuẩn
Agrobacterium [16].
Khả năng ứng dụng nuôi cấy mô thực vật dễ thấy nhất là trong lĩnh vực nhân
giống cây trồng và phục tráng cây trồng với thí nghiệm của Morel (1960) trên các loài
địa lan (Cymbidium). Với phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, Morel có thể phục
tráng, tạo các dòng vô tính không bị nhiễm bệnh virus. Kỹ thuật này đặc biệt có giá trị
với khoai tây, dâu tây, cây ăn quả và hàng loạt cây trồng có giá trị kinh tế cao như
chuối, cà phê, cọ dầu, sắn, khoai tây, cây ăn quả có múi và đã có những đóng góp to
lớn cho nông nghiệp thế giới.
Hiện nay, công nghệ nuôi cấy mô thực vật được ứng dụng mạnh mẽ vào thực
tiễn chọn giống, nhân giống, vào việc sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học
và vào nghiên cứu lí luận di truyền thực vật bậc cao. Các hiểu biết cơ bản về đời sống
của mô và tế bào đơn độc trong môi trường nhân tạo, nhu cầu chất khoáng, vitamin,
chất sinh trưởng, nguồn cacbon của chúng, các kỹ thuật cơ bản để tách, nuôi cấy, điều
khiển sự phân hóa từ các bộ phận khác nhau của cây trồng là những tiền đề được
chuẩn bị trong giai đoạn trước.
Ở Việt Nam, nuôi cấy mô thực vật hiện nay được đưa vào trong các chương
trình chọn giống, nhân giống hiện đại. Mặc dù còn rất nhiều vấn đề phải đi sâu nghiên
cứu để giải quyết trong những năm tới, nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam đã thoát khỏi
giai đoạn phôi thai của nó và đang chuẩn bị những đóng góp tích cực vào lí luận sinh
học cây trồng và vào thực tiễn nông nghiệp.

14

1.4. Nguyên lý và ứng dụng của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.4.1. Cơ sở lí thuyết
Cơ sở của phương pháp nuôi cấy mô-tế bào là học thuyết về tính toàn năng
(totipotence) của tế bào. Theo Haberlandt (1902), tất cả các tế bào của cây đều mang
toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể, khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào
đều có khả năng tái sinh và phát triển thành cá thể hoàn chỉnh. Thực tế đã chứng minh
được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. Hàng
trăm loài cây trồng đã được nhân giống trên qui mô thương mại bằng cách nuôi cấy
trong môi trường nhân tạo vô trùng và tái sinh chúng thành cây với hệ số nhân giống
vô cùng lớn [42].
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro thực chất là kết quả của các
quá trình biệt hóa và phản biệt hóa. Tất cả tế bào trong cơ thể thực vật đều bắt nguồn
từ tế bào phôi sinh. Sự chuyển tế bào phôi sinh thành các tế bào chuyên hóa để đảm
nhiệm các chức năng khác nhau được gọi là sự phân hóa tế bào. Ngược lại với quá
trình biệt hóa, phản biệt hóa là quá trình tế bào đã phân hóa chuyển ngược về dạng
phôi sinh và tái phân chia.Bản chất của quá trình này là một quá trình hoạt hóa, ức chế
các gen. Trong quá trình phát triển cá thể, ở từng thời điểm nhất định đều có một số
gen nhất định được hoạt hóa cho ta tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt
động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc phân tử
ADN của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn
được hài hòa. Mặt khác, khi nằm trong khối mô bình thường, tế bào luôn bị chi phối
bởi các tế bào xung quanh. Khi tế bào được tách riêng rẽ, tác dụng ức chế của các tế
bào xung quanh không còn nữa thì các gen được hoạt hóa và quá trình phân hóa sẽ xảy
ra theo một quá trình định sẵn [9].
Trong môi trường nuôi cấy phù hợp, có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, tế
bào soma được kích thích giải biệt hóa thành tế bào toàn năng và phân chia tế bào tạo
thành cụm mô sẹo. Sự hình thành mô sẹo chia ra 3 giai đoạn: phát sinh mô sẹo, phân
chia tế bào và biệt hóa. Sự phát sinh mô sẹo phụ thuộc chủ yếu vào tình trạng sinh lí
của mô được đưa vào nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy. Sau khi tế bào phân chia và tăng
sinh khối, quá trình biệt hóa bắt đầu và có sự xuất hiện các con đường trao đổi chất

15
dẫn đến sự sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học [17]. Sự biệt hóa tế bào hình
thành chất liệu tạo nhu mô các loại, các tế bào rây, hơn nữa hình thành vùng mô phân
sinh, trung tâm sự tạo nên chồi và rễ [29].
Khả năng hình thành chồi phụ thuộc vào số lần cấy chuyền và hàm lượng các
chất điều hòa sinh trưởng, trong đó, tỷ lệ cytokinin/auxin từ 10–100 đóng vai trò quyết
định. GA
3
cản trở sinh tổng hợp và tích lũy tinh bột, cần thiết trong hình thành chồi,
tuy nhiên sự hình thành chồi nhiều khi lại xảy ra trên môi trường không có chất kích
thích sinh trưởng hoặc có cytokinin và không có auxin . Ngược lại, quá trình tạo rễ cần
auxin, khoáng, nhiệt độ, ánh sáng. Để tạo ra rễ thường dùng phlorolgucinol + IBA có
hiệu quả hơn chỉ dùng auxin [6].
1.4.2. Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro
Phương pháp nuôi cấy mô – tế bào có những ưu điểm đáng lưu ý như (1) Cây
con được trẻ hóa và sạch bệnh, vì vậy có tiềm năng sinh trưởng, phát triển và năng
suất cao; (2) tạo được cây con đồng nhất về mặt di truyền, bảo tồn được các tính trạng
đã chọn lọc; (3) Tạo được dòng thuần của các cây tạp giao; (4) Tạo được cây có
genotip mới (đa bội, đơn bội); (5) Bảo quản và lưu giữ tập đoàn gen; (6) Có khả năng
sản xuất quanh năm; (7) Có thể nhân nhanh nhiều cây không kết hạt trong những điều
kiện sinh thái nhất định hoặc hạt nảy mầm kém và (8) Hệ số nhân giống cực kì cao
(thường đạt được ở các loài cây khác nhau trong phạm vi từ 3
6
-10
12
/năm), rút ngắn
thời gian đưa một giống mới vào sản xuất đại trà.Trong công tác giống cây trồng, vấn
đề chất lượng và số lượng giống được quan tâm hàng đầu. Bằng phương pháp nuôi cấy
đỉnh sinh trưởng, người ta đã tạo ra được những giống cây hoàn toàn sạch virus bởi (1)

Đỉnh sinh trưởng không có hệ mô dẫn, làm cho virus và vi sinh vật không có khả năng
thâm nhập; (2) Đỉnh sinh trưởng là nơi sinh tổng hợp của auxin nên hàm lượng auxin
khá cao, auxin có tác dụng ức chế sinh sản của virus và (3) Quá trình phân chia của tế
bào phôi sinh (ở đỉnh sinh trưởng) không kéo theo sự phân chia của virus[16], [17].
Tuy nhiên, phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô – tế bào cũng có những
nhược điểm nhất định, trong đó yêu cầu trang thiết bị đắt tiền và kĩ thuật cao, nên
thường chỉ được áp dụng đối với những cây có giá trị cao hoặc khó nhân giống bằng
phương pháp khác. Hơn nữa, cây con có kích thước nhỏ, đòi hỏi phải có chế độ chăm

16
sóc đặc biệt ở giai đoạn sau ống nghiệm cũng là một trở ngại lớn. Bên cạnh đó, khả
năng tái sinh có thể bị mất đi do cấy truyền mô sẹo hay huyền phù tế bào nhiều lần và
cây giống có thể bị nhiễm bệnh đồng loạt trong quá trình chuyển cây ra thực địa.
Phương pháp nuôi cấy mô-tế bàođang được sử dụng để phục vụ cho những mục đích
nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại cây trồng
khác nhau như cây lương thực có củ, cây rau, cây hoa, cây cảnh và cây dược liệu thuộc
nhóm cây thân thảo, các kiểu gen quí hiếm của giống cây lâm nghiệp và gốc ghép
trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh và nhiều giống cây kinh tế khác.
1.4.3. Các hướng ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
Trong nhân giống in vitro, cây non có thể được tái sinh từ các đỉnh sinh trưởng
có sẵn trong các bộ phận (phôi, đỉnh chồi, chồi nách) hoặc từ những mô có khả năng
hình thành điểm sinh trưởng phụ. Qua đó, cũng có hai phương pháp tương ứng để tái
sinh cây con, bao gồm tái sinh trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng và tái sinh gián tiếp thông
qua giai đoạn hình thành mô sẹo. Trong tái sinh trực tiếp, cây con được tạo thành bởi
quá trình phát động những điểm sinh trưởng đã tồn tại sẵn trong mô nuôi cấy phân
chia và tái sinh thành cây. Các điểm sinh trưởng này bao gồm các tế bào phôi sinh
chứa 2n nhiễm sắc thể đặc trưng cho loài. Cây con tạo ra theo con đường này hoàn
toàn đồng nhất về mặt di truyền và duy trì được những tính trạng của cây mẹ. Ngược
lại, tái sinh gián tiếp không tạo thành cây ngay mà thông qua quá trình phát triển thành
khối mô sẹo. Hệ số nhân của hướng này vô cùng lớn bởi từ một khối mô sẹo có thể tạo

ra khối lượng lớn cây giống trong một thời gian ngắn thông qua kĩ thuật tạo phôi soma
hoặc chế ra hạt giống nhân tạo. Tuy nhiên, nhiều cây tái sinh từ mô sẹo có thể rất khác
với cây mẹ về mặt di truyền do quá trình phát sinh và phát triển của mô sẹo thường
xuất hiện đột biến gen, gây ra bởi hiện tượng nội nguyên phân, là hiện tượng nhân đôi
nhiễm sắc thể không kèm theo sự phân bào. Đột biến tuy không có lợi cho việc duy trì
nguyên trạng những đặc tính di truyền trong quá trình tạo giống nhưng lại chính là đối
tượng tìm kiếm trong quá trình cải tạo giống. Ngoài việc cung cấp những đột biến tự
nhiên, mô sẹo còn là đối tượng lí tưởng để tạo ra những đột biến nhân tạo bằng các tác
nhân gây đột biến hoặc công nghệ gen.

17
Vì vậy, trong nhân giống in vitro, để nhân nhanh những cá thể đã chọn lọc
người ta thường tái sinh cây theo hướng trực tiếp, còn mục tiêu của tái sinh gián tiếp là
tạo ra nhiều biến dị để phục vụ cho việc chọnlọc và cải tạo giống cây trồng [3].
1.5. Môi trƣờng nuôi cấy tế bào mô thực vật
Môi trường nuôi cấy là yếu tố quyết định tăng trưởng, phát triển và biệt hóa của
tế bào – mô thực vật. Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thay đổi tùy theo loài
thực vật, loại tế bào, mô và bộ phận nuôi cấy. Mặc dù có sự đa dạng về thành phần và
nồng độ các chất nhưng tất cả các loại môi trường nuôi cấy mô đều gồm các thành
phần sau: các khoáng đa lượng, các khoáng vi lượng, đường làm nguồn cacbon, các
vitamin, các chất điều hòa sinh trưởng.Ngoài ra, người ta còn bổ sung một số chất hữu
cơ có thành phần xác định (amino acid, EDTA, …) và một số chất có thành phần
không xác định như nước dừa, dịch trích nấm men…Tuy vậy, một số thành phần
không thể thiếu trong mỗi môi trường nuôi cấy, bao gồm nước, chất khoáng, nguồn
hidrocacbon và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Tất cả các thành phần này đều
có vai trò cực kì quan trọng, tham gia vào một hoặc nhiều chức năng trong sự sinh
trưởng và phân hoá của thực vật nuôi cấy in vitro [23].
1.5.1. Các chất khoáng
Đối với cây trồng, các chất vô cơ đóng vai trò rất quan trọng. Chúng là thành
phần cấu tạo nên cấu trúc tế bào, chẳng hạn như Mg là một phần của phân tử diệp lục,

Ca là thành phần của màng tế bào, N là thành phần quan trọng của amino axít, vitamin,
protein và các axít nucleic. Tương tự, Fe, Zn và Mo cũng là thành phần của một số
enzym. Do đó, trong các môi trường nuôi cấy, chất khoáng mặc dù có hàm lượng và
thành phần khác nhau, phụ thuộc vào mục đích nuôi cấy, nhưng là yếu tố không thể
thiếu, đóng một số vai trò là các vật liệu tổng hợp tế bào, thành phần coenzyme và
đóng vai trò cân bằng, ổn định áp suất thẩm thấu của môi trường và tế bào.
Trong môi trường, các muối khoáng được chia thành các nguyên tố vi lượng và
đa lượng. Các nguyên tố này là rất cần thiết cho sinh trưởng của mô và tế bào thực vật.
Môi trường nuôi cấy phải chứa ít nhất 25 mmol/L nitrate và potassium. Tuy nhiên, hầu
hết các nghiên cứu đều cho thấy nguồn N cung cấp trong môi trường dưới cả 2 dạng
nitrate và amonium (2-20 mmol/L) là tốt hơn cả. Trong trường hợp chỉ dùng amonium,

18
thì cần phải bổ sung thêm một acid dạng mạch vòng (cycle acids), tricarboxylic acid
hoặc một số acid khác nữa (dạng muối), như: citrate, succinate, hoặc malate sao cho
mọi ảnh hưởng độc do nồng độ của amonium vượt quá 8 mmol/L trong môi trường
được giảm bớt. Khi các ion nitrate và amonium cùng hiện diện trong môi trường nuôi
cấy, thì ion sau được sử dụng nhanh hơn. Các nguyên tố khác, đóng vai trò vi lượng
như: Ca, P, S và Mg, nồng độ thường dùng trong khoảng 1-3 mmol/L [50].
1.5.2.Các vitamin
Tất cả các tế bào được nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại
vitamin cơ bản nhưng thường là với số lượng dưới mức yêu cầu. Do đó, để mô có sức
sinh trưởng tốt phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin. Các
vitamin là rất cần thiết cho các phản ứng sinh hoá. Thông thường thực vật tổng hợp
các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng. Thực vật cần vitamin
để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Khi tế bào và mô dược nuôi cấy in
vitro thì một vài vitamin trở thành yếu tố hạn chế sự phát triển của chúng. Các vitamin
được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic (PP),
pyridoxine (B6) và myo-inositol. Thiamin với nồng độ biến thiên từ 0,1-10 mg/l là yếu
tố thiết yếu cho sự tăng trưởng của tất cả các tế bào. Acid nicotinic và pyridoxine

thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhưng cũng không cấn thiết cho sự tăng
trưởng của tế bào nhiều loài thực vật. Acid nicotinic thường được sử dụng với nồng
độ 0,1-5 mg/l, và pyridoxine được sử dụng với nồng độ 0,1-10 mg/l. Myo-inositol mặc
dù có bản chất là một carbohydrate nhưng có vai trò quan trọng, kích thích cho sự tăng
trưởng của tế bào đa số loài thực vật. Myo-inositol được phân tách ra thành acid
ascorbic và peptine và được đồng hóa thành phosphoinositide và phosphatidylinositol
có vai trò quan trọng trong sự phân chia tế bào. Myo-inositol thường được sử dụng
trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật ở nồng độ 50-5000 mg/l. Một số
vitamin, đặc biệt là nicotinic axit (vitamin B3), canxi pantothenate (vitamin B5) và
biotin thường xuyên được sử dụng để nâng cao sức sinh trưởng của mô nuôi cấy.Các
vitamin khác như acid folic, acid ascorbic, panthothenic acid, vitamin E (tocopherol),
riboflavin và p-aminobenzoic acid cũng được sử dụng trong một số môi trường nuôi
cấy khi nồng độ thiamin thấp và có vai trò kích thích sự sinh trưởng của thực vật trong
giai đoạn khởi đầu nuôi cấy [12], [60].