Sử dụng kỹ thuật fish để kểm tra sự hội nhập của gen IL 6 phân lập từ người trong tế bào gốc phôi gà chuyển gen

Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Mục lục

Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm
i
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
Chương 1 – TỔNG QUAN 3
1.1. CHUYỂN GEN Ở GÀ 3
1.1.1. Các phương thức chuyển gen vào tế bào 3
1.1.2. Các phương pháp tạo gà chuyển gen 5
1.1.3. Những ứng dụng của gà chuyển gen 10
1.2. KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ (FISH) 12
1.2.1. Nguyên lý 12
1.2.2. Đầu dò cho phản ứng lai 13
1.2.3. Ưu điểm của kỹ thuật FISH 18
1.2.4. Ứng dụng của kỹ thuật FISH 19
1.3. INTERLEUKIN 6 Ở NGƯỜI 22
1.3.1. Giới thiệu 22
1.3.2. Chức năng 23
1.3.3. Những ứng dụng lâm sàng 24
1.3.4. Gen mã hóa IL–6 ở người 25
Chương 2 – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
2.1. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT 26
2.1.1. Đối tượng – vật liệu nghiên cứu 26
2.1.2. Dụng cụ và vật tư tiêu hao 29
2.1.3. Thiết bị nghiên cứu 29
2.1.4. Hoá chất sử dụng 30
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32
2.2.1. Tổng hợp đầu dò gắn huỳnh quang cho phản ứng lai FISH 32
2.2.2. Thu nhận tế bào gốc phôi gà chuyển gen IL–6 người 34
2.2.3. Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) 38

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Mục lục

Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm
ii
3.1. TỔNG HỢP ĐẦU DÒ HUỲNH QUANG BẰNG PHƯƠNG PHÁP
PCR 40
3.1.1. Thiết kế cặp mồi nhân đoạn gen IL – 6 40
3.1.2. Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR 46
3.1.3. Kết quả tổng hợp đầu dò bằng phản ứng PCR 49
3.2. THU NHẬN TẾ BÀO GỐC PHÔI GÀ CHUYỂN GEN IL–6 NGƯỜI 50
3.2.1. Phân lập và nhân nuôi tế bào gốc phôi gà 50
3.2.2. Thu nhận và duy trì tế bào gốc phôi gà chuyển gen 52
3.2.3. Kiểm tra sự có mặt gen chuyển trong tế bào bằng phản ứng PCR 54
3.3. KẾT QUẢ LAI FISH PHÁT HIỆN GEN IL–6 TRONG cESCs 55
3.4. THẢO LUẬN 57
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61
TÀI LIỆU THAM KHẢO 62
PHỤ LỤC A
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Danh mục hình minh họa

Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm
iii
DANH MỤC HÌNH MINH HỌA
Hình 1. Chu trình tái bản của retrovirus và cách thức sản xuất vector retrovirus 4
Hình 2. Mô hình chuyển gen thông qua trung gian tế bào ở gà 8
Hình 3. Quy trình của kỹ thuật FISH 12
Hình 4. Cấu trúc một số chất đánh dấu huỳnh quang thường được sử dụng 14
Hình 5. Vị trí của các nhiễm sắc thể trong nhân tế bào ở kỳ trung gian 19
Hình 6. Kiểu nhân phổ của nhiễm sắc thể tủy xương bệnh nhân đa u tủy 21

Hình 7. Một số ảnh hưởng của IL–6 trong cơ thể 23
Hình 8. Cấu trúc vector pLenti6/V5–DEST Gateway (ViraPower) của
Invitrogen 27
Hình 9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 32
Hình 10. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của cặp mồi với cADN của gen IL–6 42
Hình 11. Kết quả xác định vị trí tương đồng giữa cADN và mARN gen IL–6 43
Hình 12. Kết quả kiểm tra vị trí chèn của gen IL–6 trên vector 44
Hình 13. Kết quả kiểm tra vị trí bắt cặp của đầu dò trên vector 45
Hình 14. Kết quả kiểm tra khả năng bắt cặp giữa đầu dò với hệ gen gà bằng
BLASTn 46
Hình 15. Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ gắn mồi và nồng độ ion Mg
2+
tới hiệu
suất phản ứng PCR 47
Hình 16. Kết quả giải trình tự nucleotide các sản phẩm PCR và so sánh với
trình tự đầu dò theo lý thuyết 48
Hình 17. Kết quả điện di sản phẩm PCR tổng hợp đầu dò 49
Hình 18. cESCs 24 giờ nuôi cấy in vitro sau khi phân lập 51
Hình 19. cESCs nuôi cấy trên lớp tế bào nuôi 52
Hình 20. Đánh giá ảnh hưởng của lentivirus tới sự sinh trưởng của cESCs 53
Hình 21. Kết quả phân tích PCR các mẫu tế bào chuyển gen 54
Hình 22. Kết quả phân tích PCR các mẫu tế bào qua các lần cấy chuyển 55
Hình 23. Kết quả lai FISH trên tế bào gốc phôi gà chuyển gen IL–6 người 56

Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Danh mục bảng

Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm
iv
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Một số chất đánh dấu huỳnh quang và thuốc nhuộm sử dụng trong

FISH 15
Bảng 2. Vai trò của một số yếu tố chính của vector pLenti6/V5–DEST Gateway 28
Bảng 3. Dụng cụ và vật tư tiêu hao được sử dụng trong đề tài 29
Bảng 4. Các thiết bị nghiên cứu được sử dụng trong đề tài 29
Bảng 5. Các hóa chất được sử dụng trong đề tài 30
Bảng 6. Thành phần phản ứng PCR tối ưu hóa điều kiện tổng hợp của mồi IL–6 33
Bảng 7. Thành phần môi trường nuôi cấy cESCs 35
Bảng 8. Thành phẩn phản ứng PCR phát hiện gen chuyển trong tế bào 37
Bảng 9. Kết quả thiết kế cặp mồi sử dụng chương trình Primer3 41

Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Bảng ký hiệu và chữ viết tắt

Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm
v
BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt Viết đầy đủ
ADN Acid deoxyribonucleic
ARN Acid ribonucleic
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
BSA Bovine serum albumin
cESCs Chicken Embryonic Stem Cells
cADN Complementary ADN
CMV Cytomegalovirus
DAPI 4',6–diamidino–2–phenylindole
DIG Digoxigenin
DNase Deoxyribonuclease
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
FBS Fetal Bovine Serum
FISH Fluorescence in situ hybridization
HIV Human Immunodeficiency Virus

IL–6 Interleukin – 6
LTR Long Terminal Repeats
NCBI National Center for Biotechnology Information
PBS Phosphate Buffered Saline
PCR Polymerase Chain Reaction
PGCs Primordial germ cells
RNase Ribonuclease
SDS Sodium dodecyl sulfate
SSC Saline – sodium citrate buffer
SSCs Spermatogonial Stem Cells
T
a
Annealing template
T
m
Melting temperature
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Mở đầu

Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm
1
MỞ ĐẦU
Sử dụng động vật chuyển gen để sản xuất các loại protein dược phẩm là
hướng đi đã được quan tâm từ lâu. Trong lĩnh vực này, gia cầm chuyển gen đang
được chú ý đến với một số lợi thế vượt trội so với động vật có vú như thời gian tạo
dòng ngắn, trứng có môi trường vô trùng tự nhiên, thành phần protein lòng trắng
trứng đơn giản nên dễ tách sản phẩm chuyển gen,…. Tính đến nay, nhiều protein
dược phẩm tái tổ hợp ở người đã được nghiên cứu tạo ra từ gà chuyển gen, trong đó
một số sản phẩm đã bước vào giai đoạn thử nghiệm như kháng thể đơn dòng miR24
điều trị khối u ác tính, interferon β–1a chữa trị đa xơ cứng và interferon α–2a có
trong thuốc Roferon A chữa viêm gan C, ung thư máu. Những nghiên cứu về gà

chuyển gen gần đây tập trung chủ yếu vào phương pháp thông qua các tế bào gốc
phôi, với ưu điểm là lựa chọn được ngay từ đầu những tế bào mang gen chuyển
mong muốn trước khi tiêm chúng vào phôi nhận, do đó tiết kiệm được thời gian
cũng như chi phí cho quá trình sàng lọc cơ thể chuyển gen từ bố mẹ khảm.
Để tạo động vật chuyển gen hiệu quả thì cần phải có các hệ thống vector đủ
mạnh để chuyển được gen mong muốn với hiệu suất cao, duy trì ổn định trong cơ
thể vật chủ. Hệ thống được sử dụng thường xuyên nhất dựa vào retrovirus (virus
ARN) trong đó sử dụng các enzyme của bản thân và bộ máy phiên mã trong tế bào
chủ để sao chép hệ gen của chúng, sau đó tích hợp nó vào nhiễm sắc thể vật chủ
trong quá trình phân bào. Gần đây, một nhóm nhỏ của retrovirus là lentivirus đã
được coi như một công cụ hứa hẹn trong chuyển gen. Chúng mang đầy đủ các ưu
điểm của retrovirus, hơn nữa còn có khả năng chèn gen vào tế bào không phân chia,
loại vector này đặc biệt hiệu quả đối với tế bào gốc phôi do loại tế bào này rất khó
chuyển gen bằng các phương pháp khác.
Trong quá trình tạo động vật chuyển gen, các bước sàng lọc tế bào hay cơ thể
mang gen mong muốn đóng vai trò rất quan trọng. Gen chuyển cần được cài vào
ADN trong nhân tế bào để đảm bảo di truyền cho thế hệ sau qua con đường sinh sản
hữu tính, đồng thời phải được duy trì bền vững qua nhiều thế hệ động vật. Ngoài ra,
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Mở đầu

Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm
2
gen chuyển phải nằm ở vị trí thích hợp: trong vùng ADN hoạt động, không chèn
vào giữa gen cấu trúc hay các vùng ADN giữ chức năng điều hòa, Vì vậy, các kỹ
thuật nhằm xác định vị trí gen trong bộ nhiễm sắc thể đã được phát triển, trong số
đó ít tốn kém và dễ thực hiện nhất là kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (fluorescence
in situ hybridization – FISH). Cơ sở của kỹ thuật FISH dựa trên sự bắt cặp chính
xác giữa giữa ADN đích và đầu dò đánh dấu huỳnh quang có trình tự tương đồng.
Đây là một trong những kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong sinh học phân tử và
chẩn đoán nhằm phát hiện những bất thường trên nhiễm sắc thể, nghiên cứu cấu

trúc và chức năng tế bào, lập bản đồ kiểu nhân, xây dựng hệ thống phát sinh loài,
Có thể nói FISH là cầu nối giữa lĩnh vực di truyền học cổ điển với di truyền học
hiện đại, kết hợp sự chính xác của các kỹ thuật di truyền phân tử và sự quan sát trực
quan từ kính hiển vi.
Ở Việt Nam, một số bệnh viện lớn như Bệnh viện K, Bệnh viện Trung ương
Quân đội 108, Bệnh viên Nhi Trung ương, đã sử dụng kỹ thuật này để chẩn đoán
một số bệnh di truyền ở người. Tuy nhiên trong nghiên cứu cơ bản, việc ứng dụng
nó còn rất hạn chế. Đến nay, chưa có báo cáo nào về việc sử dụng để đánh giá sự
chèn gen ngoại lai vào hệ gen của tế bào động vật. Mặt khác, trong những nghiên
cứu trên, đầu dò sử dụng đều là các sản phẩm thương mại, hoặc được tự thiết kế
nhưng đặt tổng hợp tại các hãng nổi tiếng, chưa tự tổng hợp tại phòng thí nghiệm sử
dụng chúng.
Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá về tiềm năng ứng
dụng vector chuyển gen lentivirus đối với tế bào gốc phôi gà, sử dụng kỹ thuật
FISH để phát hiện vị trí gen chuyển IL–6 trong tế bào gốc phôi gà chuyển gen, từ
đó tạo tiền đề cho việc tạo gà chuyển gen thông qua tế bào gốc. Nghiên cứu này
cũng góp phần phát triển kỹ thuật FISH trong nghiên cứu cơ bản ở Việt Nam.

Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan

Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm
3
Chương 1 – TỔNG QUAN
1.1. CHUYỂN GEN Ở GÀ
1.1.1. Các phương thức chuyển gen vào tế bào
1.1.1.1. Chuy
ển gen sử dụng vector virus

Các hệ thống chuyển gen hiệu quả nhất hiện nay khai thác tiềm năng của
virus động vật đã tiến hóa hàng triệu năm qua. Những vector virus được tạo ra bằng

cách thay thế một hoặc một số gen của chúng bằng gen mong muốn. Ưu điểm của
hệ thống chuyển gen sử dụng virus là hiệu suất chuyển gen khá cao và ổn định. Tuy
nhiên, chúng có nhược điểm về độ an toàn, cũng như phản ứng miễn dịch của vật
chủ loại bỏ tác nhân virus. Những nhược điểm này đang dần được khắc phục trong
những vector tái bản thiếu thế hệ mới [58].
Đối với gia cầm, chuyển gen bằng retrovirus và lentivirus thu được nhiều
thành công nhất trừ trước đến nay. Retrovirus có vật chất di truyền là ARN, mang
ba gen chính là gag (mã hóa kháng nguyên kết hợp nhóm), env (mã hóa protein vỏ)
và pol (mã hóa enzyme phiên mã ngược reverse transcriptase và enzyme hội nhập
intergrase). Sau khi thâm nhiễm vào tế bào chủ (đang trong giai đoạn phân chia),
ARN phiên mã ngược thành ADN, từ đó hợp nhất với ADN tế bào chủ, trở thành
một bộ phận ổn định và hoạt động như các gen khác trong tế bào, có thể di truyền
lại cho các thế hệ sau. Nhờ tín hiệu đóng gói tương thích (), ARN phiên mã từ hệ
gen virus kết hợp trở lại với các protein virus (đều được tạo ra nhờ bộ máy tổng hợp
của tế bào chủ), tạo nên các hạt virus mới (Hình 1A). Khi thiết kế vector, người ta
chỉ sử dụng tín hiệu  và hai trình tự dài lặp lại ở hai đầu (long terminal repeat –
LTR), gen chuyển được chèn vào giữa hai LTR này. Vector cần có một dòng tế bào
đóng gói chứa retorvirus cải biến, có khả năng tạo ra các protein virus nhưng không
có tín hiệu  (Hình 1B). Nhờ vậy, các hạt virus mới được sinh ra chỉ chứa vector
chuyển gen quan tâm, không có khả năng tạo nên các virus khác [5, 72, 74]. Gần
đây, một nhóm nhỏ của retrovirus là lentivirus cũng được sử dụng rộng rãi trong
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan

Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm
4
chuyển gen. Chúng mang đầy đủ các ưu điểm của retrovirus, hơn nữa còn có khả
năng thâm nhiễm vào tế bào không phân chia [58, 74].

Hình 1. Chu trình tái b
ản của retrovirus v

à cách th
ức sản xuất vector retrovirus

Chu trình tái bản của retrovirus (hình trái): Virus xâm nhập vào tế bào chủ, sử dụng
enzyme phiên mã ngược để tổng hợp ADN từ ARN của mình; ADN này hội nhập vào hệ
gen tế bào, sử dụng bộ máy tổng hợp của tế bào để phiên mã thành ARN và dịch mã tạo
các protein virus; các protein này đóng gói ARN lại tạo thành các hạt virus mới và giải
phóng vào môi trường. Khi sản xuất vector retrovirus (hình phải), vector đóng gói mang
các gen mã hóa protein virus nhưng không có tín hiệu đóng gói (

–), nên vector tạo thành
chỉ chứa cấu trúc gen chuyển trong vector retrovirus (chứa tín hiệu đóng gói

+) [72].
1.1.1.2. Chuy
ển gen không d
ùng virus
Việc chuyển gen không sử dụng virus trên tế bào động vật đã được thực hiện
từ cách đây hơn 40 năm, chúng có ưu điểm về độ an toàn, không gây miễn dịch và
đơn giản, tuy nhiên hiệu quả thấp hơn nhiều so với khi sử dụng virus. Những
phương pháp được sử dụng nhiều hiện nay bao gồm các phương pháp vật lý (vi
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan

Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm
5
tiêm, xung điện, súng bắn gen, ) hoặc sử dụng hóa chất (calcium phosphate,
DEAE–dextran, liposome, ) [77].
Phương pháp vật lý được sử dụng thường xuyên nhất là sử dụng xung điện
(electroporation). Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên đặc điểm màng tế bào hoạt
động như một tụ điện không cho dòng điện đi qua. Người ta sử dụng hiệu điện thế

cao gây sốc trong một thời gian ngắn làm tăng tạm thời điện thế màng tế bào lên
xấp xỉ 1V. Kết quả là xảy ra sự tái tổ chức các thành phần trên màng một cách đáng
kể, tạo ra những kênh vận chuyển nước hoặc các lỗ. ADN thẩm thấu vào trong tế
bào qua đó [34, 66]. Phương pháp này có những ưu điểm như chuyển gen hiệu quả,
áp dụng được với đa số các loại tế bào, có thể tiến hành với mô còn nguyên vẹn
[77]. Tuy nhiên, xung điện ảnh hưởng lớn tới khả năng sống sót và sinh trưởng của
tế bào (sự chuyển nhiễm tối ưu có thể đạt được trong điều kiện gây chết tới 50% số
lượng tế bào) [61, 77].
Các phương pháp hóa học đều có bản chất là sự liên kết giữa phần mang điện
tích dương của hóa chất sử dụng với gốc phosphate âm của bộ khung acid nucleic,
hình thành phức hệ đại phân tử (polyplex). Phức hệ này được đưa vào trong tế bào
chủ yếu bằng con đường thực bào. Vì vậy, phương thức này có ưu điểm là không
ảnh hưởng lớn tới tế bào, tuy nhiên thao tác thực hiện tương đối phức tạp, đồng thời
nhiều loại tế bào khó chuyển nhiễm bằng những hóa chất này. Kết tủa calcium
phosphate và DEAE–dextran được sử dụng sớm nhất và hiện nay vẫn còn phổ biến,
ngoài ra còn nhiều loại hóa chất khác như các phân tử polycationic (dendrimers
polyamidoamine), polypeptide (polylysine, polyornithine, các dạng kết hợp giữa
chúng) và polyethylenimine [77].
1.1.2. Các phương pháp tạo gà chuyển gen
1.1.2.1. Vi tiêm trực tiếp ADN vào đĩa phôi giai đoạn sớm
Vi tiêm ADN ngoại lai vào nhân nguyên của trứng mới thụ tinh là phương
pháp đầu tiên được sử dụng để tạo động vật có vú chuyển gen và hiện nay vẫn rất
phổ biến. Trên gà, phương pháp này cũng thu được thành công nhất định: Love và
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan

Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm
6
cộng sự vi tiêm trực tiếp ADN vào hợp tử, thu được bảy cá thể gà chuyển gen sống
sót đến khi trưởng thành, trong đó 3,4% gà con thế hệ tiếp theo nhận gen chuyển từ
một cơ thể gà trống thu được [53]. Tuy vậy, phương pháp này bộc lộ rất nhiều

nhược điểm. Trước hết, phương pháp này không thể thao tác với số lượng lớn, do
mỗi ngày chỉ có một quả trứng rụng và việc kích thích siêu bài noãn ở gà khó hơn
nhiều so với ở động vật có vú. Thêm vào đó, để thu được mỗi trứng mới thụ tinh,
người ta phải giết một con gà mái, đồng thời trứng sau vi tiêm phải được bao bọc
trong lớp lòng trắng và vỏ đá vôi như tự nhiên để có thể phát triển [18, 51].
Các nhà nghiên cứu đã thay đổi phương pháp này phù hợp với gia cầm bằng
cách tiếp cận hai giai đoạn: đĩa phôi của trứng chưa ấp (giai đoạn X theo hệ thống
phân chia của Eyal–Giladi, Kochav [41]) và phôi sau khoảng 55–72 giờ ấp (giai
đoạn 17–20 theo hệ thống phân chia của Humberger và Hamilton [27]). Kwon và
cộng sự tạo gà chuyển gen mã hóa protein phát huỳnh quang màu xanh lá cây tăng
cường (Enhanced Green Fluorescence Protein – EGFP) bằng cách vi tiêm vector
retrovirus vào đĩa phôi giai đoạn X, trong đó nhiều bộ phận như đầu, chi, mắt và
một số nội tạng đều biểu hiện EGFP [43]. Nhóm nghiên cứu của Kamihira đã chứng
minh gen chuyển có khả năng biểu hiện cao khi được tiêm vào phôi 55–60 giờ ấp.
Họ tiêm vector retrovirus chứa các gen mã hóa chuỗi đơn Fv và Fc của globulin
miễn dịch G1 của người vào phôi gà, tạo được gà chuyển gen biểu hiện protein này
trong huyết thanh và lòng trắng trứng (khoảng 5,6 mg/ml) [36]. Ở Việt Nam, năm
2010, Nguyễn Thị Hồng Hạnh và cộng sự cũng đã báo cáo về việc tạo gà chuyển
gen bằng phương pháp vi tiêm vector vào đĩa phôi giai đoạn X, trong đó gen chuyển
được phát hiện trong máu gà con sinh ra bằng phương pháp PCR [2].
1.1.2.2. Chuyển gen qua tinh trùng
Đây là phương pháp dựa trên khả năng của tinh trùng có thể lưu giữ ADN
ngoại sinh và chuyển nó vào trứng trong quá trình thụ tinh. Tinh trùng được ủ trực
tiếp với ADN trần, ngoài ra người ta có thể tăng cường hiệu quả quá trình này bằng
cách sử dụng xung điện hay các chất hóa học như liposome, calcium phosphate,
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan

Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm
7
DEAE–dextran. Tinh trùng mang ADN được thụ tinh nhân tạo, thụ tinh trong ống

nghiệm hay có thể được tiêm trực tiếp vào trứng. Lợi thế lớn nhất của phương pháp
này là hiệu quả chuyển gen cao, giá thành thấp, dễ thực hiện [39, 47].
Sử dụng phương pháp này, năm 2000, Harel-Markowitz và cộng sự đã tạo
được gà chuyển gen mã hóa EGFP và hormone kích thích nang trứng (follicle
stimulating hormone – FSH) của người, trong đó tinh trùng được ủ với plasmid và
một loại liposome là Lipofectamine®. ADN ngoại lai đã được phát hiện trong mẫu
mô gan, da, tim và bạch huyết bằng kỹ thuật PCR, cũng như được chứng minh biểu
hiện bằng RT–PCR và miễn dịch phóng xạ [28]. Mới nhất, năm 2013, nhóm nghiên
cứu của Samoylov đã tạo gà chuyển gen mã hóa nhân tố kích tích tạo quần lạc bạch
cầu hạt (Granulocyte Colony–Stimulating Factor – gcsf) của người, sử dụng
Lipofectamin® 2000 để tăng hiệu quả hấp thu ADN của tinh trùng. Kết quả có
33,3% gà con sinh ra mang gen chuyển mong muốn, với hàm lượng protein gcsf
trong huyết thanh đạt khoảng 50–220 pg. Sử dụng những gà trống này thụ tinh nhân
tạo với gà mái bình thường đã thu được 37,5% gà con thế hệ tiếp theo mang gen
chuyển [73]. Ở Việt Nam, Lê Thị Tuyết và cộng sự đã công bố nghiên cứu chuyển
gen qua tinh trùng ở gà năm 2010, trong đó phát hiện được gen chuyển ở nhiều mô,
cơ quan khác nhau của gà con thế hệ tiếp theo [10].
1.1.2.3. Chuyển gen thông qua trung gian tế bào
Các phương pháp trên đều có nhược điểm là gen chuyển được tích hợp ngẫu
nhiên vào nhiễm sắc thể của phôi, do đó không đánh giá sớm được ảnh hưởng của
vị trí chèn gen đến sức sống của gà con sinh ra. Gần đây, người ta sử dụng các tế
bào nuôi cấy in vitro làm trung gian cho quá trình tạo gà chuyển gen, nhờ đó sàng
lọc ngay từ đầu những tế bào mang gen chuyển ở vị trí mong muốn, giảm thời gian
cũng như chi phí đánh giá và chọn lọc kiểu hình cơ thể biến đổi di truyền [6, 88].
Những loại tế bào được quan tâm gồm: tế bào gốc phôi, tế bào sinh dục nguyên
thủy và tế bào gốc tinh nguyên bào (Hình 2).
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan

Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm
8

Hình 2. Mô hình chuyển gen thông qua trung gian tế bào ở gà
Các tế bào gốc phôi (ESCs) hoặc tế bào sinh dục nguyên thủy (PGCs) thu nhận từ phôi
được chuyển nhiễm với vector mang gen mong muốn, những tế bào mang gen chuyển được
sàng lọc và vi tiêm trở lại phôi nhận, từ đó thu được gà khảm. Phương pháp tương tự cũng
được tiến hành với tế bào gốc tinh nguyên bào (SSCs) thu nhận từ tinh hoàn gà trống,
những tế bào mang gen chuyển được tiêm trở lại vào tinh hoàn gà trống đã triệt sản [51].
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan

Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm
9
Tế bào gốc phôi (Embryonic Stem Cell – ESCs) là những tế bào đa tiềm
năng chưa biệt hoá, trong điều kiện thích hợp có khả năng biệt hóa thành tất cả các
loại tế bào có nguồn gốc từ ba lá phôi. Bên cạnh đó, ESCs có khả năng tự duy trì và
nhân lên trong thời gian dài. Vì vậy chúng trở thành công cụ hữu hiệu trong việc tạo
động vật chuyển gen [4, 46]. Năm 1990, Petitte đã lần đầu tiên tạo được gà khảm
bằng phương pháp vi tiêm các tế bào đĩa phôi vào phôi giai đoạn X [68]. Đến năm
2006, Wang đã chuyển gen thành công vào ESCs bằng liposome và vector virus. Sử
dụng các tế bào này tiêm vào phôi nhận, nhóm nghiên cứu đã thu được gà con mang
gen chuyển ở hầu hết các mô cơ thể với một bản sao duy nhất. Tuy nhiên, sự đóng
góp của các tế bào biến đổi di truyền vào dòng tinh là không thể hoặc hiệu suất rất
thấp [92]. Đến nay, chưa có báo cáo nào về việc ESCs sau khi nuôi cấy quá một
tuần có thể đóng góp vào dòng sinh dục của gà khảm, có thể việc nuôi cấy in vitro
đã làm ESCs mất dần khả năng này [51]. Ở Việt Nam, năm 2012, Nguyễn Lai
Thành và cộng sự cũng đã chuyển gen vào ESCs sử dụng vector lentivirus, sau khi
tiêm chúng vào phôi nhận đã thu được gà con mang gen ở mô ruột. Tuy vậy các
phôi được vi tiêm thường chết ở giai đoạn sớm của quá trình phát triển, chỉ có 10%
trong số đó nở thành gà con, có thể do gen chuyển chèn vào những vị trí gen hoạt
động, ảnh hưởng tới sức sống của phôi [6].
Một cách tiếp cận khác là hướng đến các tế bào sinh dục nguyên thủy

(Primordial Germ Cells – PGCs). Đây là những tế bào đầu dòng của trứng và tinh
trùng, có thể tìm thấy trong liềm mầm phôi giai đoạn 7–10 (sau 23–38 giờ ấp), sau
đó chúng lưu thông trong mạch máu phôi, đến các vị trí sau này hình thành tuyến
sinh dục trưởng thành [62]. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng PGCs sau khi
nuôi cấy in vitro vẫn có thể hội nhập được vào phôi nhận, đóng góp vào quá trình
tạo trứng và tinh trùng. Van de Lavoir và cộng sự đã phân lập PGCs từ mạch máu
phôi, chuyển gen và nuôi cấy trong thời gian dài (lên tới 209 ngày) vẫn có thể đóng
góp vào sự hình thành các tế bào sinh dục khi được tiêm vào phôi giai đoạn X [87].
Tuy nhiên, việc thu nhận PGCs từ máu của phôi gà gặp nhiều khó khăn do chúng
chiếm tỷ lệ rất thấp (0,05% tổng số tế bào máu) [65]. Một số nhóm nghiên cứu khác
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan

Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm
10
đã tìm cách phân lập loại tế bào này từ các tuyến sinh dục phôi. Shiue và cộng sự đã
thu nhận PGCs từ phôi 5,5 ngày ấp (giai đoạn 28). Những tế bào này trải qua 281
ngày nuôi cấy vẫn duy trì các đặc điểm đặc trưng, và khi được tiêm vào động mạch
chủ lưng của phôi 2,5 ngày ấp (giai đoạn 17) vẫn có khả năng tạo thành gà khảm
dòng sinh dục [81]. Motono và cộng sự cũng đã hoàn thiện phương pháp tạo gà
chuyển gen bằng PGCs thu nhận từ phôi 2,5 và 5,5 ngày ấp, trong đó chứng minh
rằng khả năng truyền lại gen chuyển của gà mái khảm tốt hơn so với gà trống [60].
Ngoài ra, một số phòng thí nghiệm đã hướng đến sử dụng tế bào gốc tinh
nguyên bào (Spermatogonial Stem Cells – SSCs) làm trung gian cho quá trình
chuyển gen. SSCs mang những đặc điểm đặc trưng của tế bào gốc đa tiềm năng,
chiếm khoảng 0,33–0,44% số lượng tế bào trong tinh hoàn gà con 4 tuần tuổi,
0,029–0,072% ở gà trưởng thành 24 tuần tuổi [35]. Sử dụng những tế bào này tiêm
vào ống sinh tinh của gà nhận, người ta đã thu được gà trống khảm trong tinh hoàn
với hiệu suất lên tới 50% [67]. Sự phát triển của phương pháp này giúp giảm thiểu
đáng kể thời gian tạo gà chuyển gen, minh chứng là thời gian từ khi chuyển nhiễm
vector vào tế bào cho đến khi gà khảm thế hệ tiếp theo được nở ra chỉ khoảng 38–

45 ngày (tiêm vào gà trưởng thành) cho đến 137–188 ngày (tiêm vào gà con) [49].
1.1.3. Những ứng dụng của gà chuyển gen
1.1.3.1. T
ạo mô h
ình nghiên c
ứu y
– sinh h
ọc

Gà được coi là hệ thống thử nghiệm quan trọng trong các lĩnh vực sinh học
phát triển, miễn dịch học, vi sinh vật học. Nhiều khám phá có ý nghĩa sinh học
mang tính lịch sử (ví dụ như virus có khả năng gây nên khối u, hay các tế bào B là
một nhóm nhỏ của tế bào lympho) được phát hiện lần đầu tiên ở gà [16]. Các dòng
gà chuyển gen có thể sử dụng để khám phá chức năng của nhiều gen trong quá trình
phát triển phôi thai của động vật có vú nói chung. Năm 2006, nhóm nghiên cứu
thuộc Đại học Sheffield (Anh) đã đánh giá khả năng bất hoạt gen của các ARN can
thiệp (iARN) trên mô hình phôi gà. Kết quả, các iARN có khả năng làm im lặng
một số gen trong khu vực đặc hiệu của hệ thống thần kinh phôi, với hiệu suất đạt
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan

Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm
11
trên 90% [20]. Năm 2010, McGrew và cộng sự đã chứng minh một trong những yếu
tố kiểm soát biểu hiện gen ở chuột nằm trên locus chuỗi nhẹ myosin 1/3 (myosin
light chain 1/3 – MLC1/3) có khả năng hoạt động ở phôi gà. Yếu tố này có thể điều
khiển sự biểu hiện của gen lacZ trong sợi cơ xương tương tự như ở chuột. Đây là
một minh chứng cho thấy các yếu tố kiểm soát biểu hiện của một số gen trong quá
trình phát triển có thể tương đồng giữa các loài, chúng có thể hoạt động trong mô
hình phát triển tương đương [56].
1.1.3.2. S

ản xuất protein tái tổ hợp

Việc sử dụng động vật có vú (bò, cừu, dê,…) chuyển gen làm “lò phản ứng
sinh học” đã sản xuất được nhiều protein dược liệu từ sữa, như –1 antitrypsin,
calcitonin, interleukin–2, erithropoeietin,… Sản lượng sản phẩm thu được từ động
vật có vú rất ấn tượng, đối với bò là khoảng 8.000 lít sữa, với lượng protein tái tổ
hợp có thể lên tới 40 kilogam mỗi năm [33].
Gần đây, gà chuyển gen được quan tâm hơn với nhiều lợi thế. Thứ nhất,
chúng có thời gian tạo dòng ngắn, chi phí chăn nuôi cũng thấp hơn so với các động
vật có vú khác. Thứ hai, trứng gà rất giàu protein, trong đó hơn một nửa (54%)
được tạo bởi sự biểu hiện của gen duy nhất ovalbumin, do đó dễ dàng sản xuất
lượng lớn protein tái tổ hợp với độ tinh khiết cao. Thứ ba, trứng gà chứa nhiều chất
ức chế protease tự nhiên và môi trường vô trùng tạo điều kiện lý tưởng cho việc ổn
định hoạt tính sinh học của protein tái tổ hợp. Ngoài ra, mô hình glycosyl hóa nhiều
protein ở người giống với gà hơn động vật có vú, đồng thời một số protein gây độc
cho động vật có vú có thể được tạo ra ở gà [18, 52].
Tính đến nay, nhiều protein dược phẩm tái tổ hợp ở người đã được nghiên
cứu tạo ra từ mô hình này, như chuỗi đơn Fv và Fc của globulin miễn dịch G1 [36],
hormone kích thích nang trứng (FSH) [28], nhân tố kích tích tạo quần lạc bạch cầu
hạt (gcsf) [73], Một số sản phẩm đã bước vào giai đoạn thử nghiệm như kháng thể
đơn dòng miR24 điều trị khối u ác tính, interferon β–1a chữa trị đa xơ cứng và
interferon α–2a có trong thuốc Roferon A chữa viêm gan C, ung thư máu [52].
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan

Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm
12
1.2. KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ (FISH)
1.2.1. Nguyên lý
Cũng như các kỹ thuật lai acid nucleic khác, kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ
(Fluorescence In Situ Hybryzation – FISH) dựa trên đặc tính biến tính và hoàn

nguyên của acid nucleic [85]. Trong phản ứng lai, sự tương đồng trình tự giữa đầu
dò và ADN đích cho phép chúng kết hợp chính xác với nhau tạo thành phức hệ lai.
Tín hiệu huỳnh quang gắn trên đầu dò được phân tích dưới kính hiển vi huỳnh
quang, cho phép phát hiện và xác định vị trí của gen đích trên mẫu nghiên cứu
(Hình 3) [94].

Hình 3. Quy trình c
ủa kỹ thuật
FISH
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan

Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm
13
Mẫu phân tích (máu ngoại vi, tế bào nuôi cấy, tiêu bản cố định mô, ) được
biến tính ADN và ủ với đầu dò đánh dấu có trình tự đặc hiệu. ADN cạnh tranh
(thường sử dụng ADN tinh trùng cá hồi) và thêm vào hỗn hợp lai nhằm giảm liên
kết không đặc hiệu giữa đầu dò và ADN đích. Sau khi lai và rửa nguyên liệu thừa,
mẫu được phát hiện trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua kháng thể thứ cấp đặc hiệu
gắn huỳnh quang [15, 94].
1.2.2. Đầu dò cho phản ứng lai
1.2.2.1. Đầu dò đánh dấu trực tiếp và gián tiếp
Những nghiên cứu đầu tiên về kỹ thuật lai tại chỗ được công bố vào cuối
những năm 1960, đều sử dụng đầu dò đánh dấu phóng xạ (
32
P,
35
S,
3
H), tuy nhiên
các chất phóng xạ có nhiều nhược điểm về độ an toàn, thời gian và chi phí tiến

hành. Từ những năm 1980, sau thí nghiệm lai sử dụng đầu dò ADN gắn biotin và
kháng thể đánh dấu huỳnh quang của Langer và Safer, các chất đánh dấu huỳnh
quang đã dần thay thế các chất phóng xạ. Đầu dò huỳnh quang thể hiện một số ưu
điểm nổi bật hơn hẳn so với loại đầu dò phóng xạ: độ bền và độ an toàn cao, ít gây
hại với môi trường và con người, kết quả lai thu được chính xác, đánh dấu được với
nhiều loại thuốc nhuộm phát xạ tại những bước sóng khác nhau cho phép phát hiện
nhiều trình tự đích chỉ với một lần lai. Đặc biệt, sử dụng chất đánh dấu huỳnh quang
thu được tín hiệu ở chính xác vị trí bắt cặp, trong khi các đầu dò phóng xạ có thể chỉ
cho phép quan sát được tín hiệu trong ảnh chụp nhiễu xạ cách vị trí bắt cặp một
khoảng nhất định. Có hai loại đầu dò huỳnh quang theo phương pháp phát hiện vị
trí lai: trực tiếp và gián tiếp [59].
Trong phương pháp gián tiếp, các phân tử đánh dấu (như biotin, digoxigenin
– DIG, dinitrophenol) được gắn vào đầu dò, sau đó mẫu lai được phát hiện bằng
kháng thể thứ cấp đánh dấu huỳnh quang tương ứng. Hệ thống phổ biến nhất hiện
nay sử dụng biotin (Hình 4), được phát triển bởi David Ward và cộng sự từ năm
1981 [44]. Đầu dò gắn biotin sau phản ứng lai được phát hiện bởi nhiều thuốc thử
khác nhau, thường sử dụng nhất là streptavidin và avidin do chúng có khả năng liên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan

Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm
14
kết với biotin tốt nhất (trong đó streptavidin được ưa thích hơn do điểm đẳng điện
gần như trung tính giúp giảm liên kết không đặc hiệu [59]. Ngoài hệ thống sử dụng
biotin, các đầu dò gắn DIG (Hình 4) cũng thường xuyên được sử dụng. DIG là
steroid có nguồn gốc duy nhất từ hoa và lá của một số thực vật chi Digitalis (như D.
purpureaand, D. lanata), do đó kháng thể kháng DIG hầu như không gắn kết với
các vật liệu sinh học khác. Trong lai FISH, các kháng thể kháng DIG có thể được
kết hợp với alkaline phosphatase, peroxydase, Rhodamine,… [31]. Phương pháp sử
dụng đầu dò gián tiếp có ưu điểm là tạo ra các tín hiệu huỳnh quang cường độ cao,
nhưng chúng gặp bất lợi khi cần thêm bước ủ để liên kết phức hệ lai và kháng thể

thứ cấp gắn huỳnh quang [59].

Hình 4. Cấu trúc một số chất đánh dấu huỳnh quang thường được sử dụng
Đối với phương pháp trực tiếp, các phân tử báo cáo được gắn trực tiếp vào
đầu dò và từ đó có thể quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang ngay sau phản ứng
lai mà không cần thêm bước ủ kháng thể thứ cấp. Những chất huỳnh quang thường
được sử dụng trong trường hợp này là các hợp chất thuộc các nhóm coumarin,
fluorescein, rhodamine và cyanine (Bảng 1). Ưu điểm của phương pháp này là thao
tác đơn giản hơn phương pháp gián tiếp, hiện tượng nhiễu nền thấp. Tuy nhiên, tín
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan

Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm
15
hiệu thu được có cường độ yếu hơn. Người ta có thể cái tiến bằng cách sử dụng
thêm kháng thể thứ cấp gắn chất phát huỳnh quang mạnh, khi đó nó không khác
phương pháp phát hiện gián tiếp như đã trình bày ở trên [59].
B
ảng
1. M
ột số
ch
ất đánh dấu huỳnh quang v
à thu
ốc nhuộm sử dụng trong FISH

Huỳnh quang Ex (nm)

Em (nm)

Các chất đánh dấu

7–Amino–4–methylcoumarin–3–acetic acid, NHS (AMCA)

354 411
7–Diethylaminocoumarin–3–carboxylic acid, NHS 432 472
Pacific Blue™ , NHS 416 451
Fluorescein–5/6–isothiocyanate (FITC) 494 519
Tetramethylrhodamine–5/6–isothiocyanate (TRITC) 544 572
Oregon Green® 488 isothiocyanate 493 520
Rhodamine Green™ carboxylic acid, NHS 504 532
Alexa Fluor® 488 494 519
Alexa Fluor® 568 577 602
Alexa Fluor® 594 590 615
Texas Red® sulfonyl chloride 587 602
Cy3™ 550 570
Cy5™ 649 670
Các thuốc nhuộm ADN
4',6–Diamidino–2–phenylindole (DAPI) 367 452
Propidium iodide (PI) 543 614
Ex: đỉnh hấp thụ; Em: đỉnh phát quang; NHS: N–Hydroxysuccinimidyl Ester
Gần đây, người ta có thể sử dụng kết hợp nhiều đầu dò gắn các chất huỳnh
quang khác nhau, từ đó thu được nhiều tín hiệu khác nhau trên cùng một mẫu lai.
Phương pháp này được ứng dụng hiệu quả khi phân tích kiểu nhân sinh vật [59].
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan

Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm
16
1.2.2.2. Các phương pháp đánh dấu đầu dò
Ba phương pháp thông dụng được sử dụng để đánh dấu đầu dò là dịch
chuyển điểm đứt (nick translation), kéo dài mồi ngẫu nhiên (random primed) và

PCR. Cả ba phương pháp này đều sử dụng hoạt tính enzyme để gắn deoxyribo–
nucleotide triphosphate đánh dấu lên phân tử đầu dò.
Phương pháp dịch chuyển điểm đứt
Phương pháp dịch chuyển điểm đứt sử dụng đồng thời hoạt tính của hai loại
enzyme là ADN polymerase và DNase. Đầu tiên, DNase I tạo ra một điểm đứt trên
phân tử ADN làm bộc lộ đầu 3’–OH. Điểm đứt được dịch chuyển dần nhờ hoạt tính
5’ – 3’ exonuclease của enzyme ADN polymerase I. Trong khi đó, enzyme ADN
polymerase I bám vào đầu 3’–OH và tổng hợp kéo dài chuỗi nhờ hoạt tính 5’ – 3’
polymerase Klenow của nó. Trong suốt quá trình tổng hợp, nucleotide đánh dấu
được bổ sung vào hỗn hợp phản ứng sẽ thay thế một trong số các phân tử dNTP và
được cài nhập vào sợi ADN đang được tổng hợp, kết quả là tạo thành phân tử đầu
dò được đánh dấu. Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến trong đánh dấu đầu
dò cho FISH, với ưu điểm là tạo ra được đầu dò có kích thước tối ưu bằng cách điều
chỉnh nồng độ DNase. Phản ứng đánh dấu thực hiện tối ưu trong 60–90 phút, với
kích thước đầu dò khoảng 200–500 bp [21, 22, 59].
Phương pháp tổng hợp kéo dài mồi ngẫu nhiên
Phương pháp tổng hợp kéo dài mồi ngẫu nhiên (còn được gọi là đánh dấu
oligo) dựa trên phản ứng lai của hexanucleotide với sợi ADN khuôn nhờ hoạt tính
kéo dài chuỗi của tiểu đơn vị Klenow thuộc enzyme ADN polymerase I. Bước đầu
tiên của phương pháp là gây biến tính ADN tạo ra sợi đơn, sau đó cho các đoạn
hexanucleotide bắt cặp ngẫu nhiên với ADN khuôn, các đoạn này được dùng như
mồi cho đoạn Klenow của ADN polymerase I tổng hợp kéo dài ADN, với nguyên
liệu là các nucleotide đánh dấu [22, 93]. Đầu dò thu được có kích thước tối ưu trong
khoảng 200–1000 bp, với lượng từ 30–70 ng (với 10 ng mẫu ban đầu, ủ trong 1 giờ)
đến 2,10–2,65 mg (3 mg mẫu ban đầu, ủ 20 giờ). Nhược điểm lớn của phương pháp
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan

Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm
17
này là khó kiểm soát kích thước đầu dò, do đó tín hiệu thu được yếu và thường bị

nhiễu. Tuy nhiên, phương pháp này vẫn được lựa chọn với mục đích phát hiện các
gen đơn bản trong hệ gen bằng kỹ thuật Southern blot [22, 59, 93].
Phương pháp PCR
Các deoxynucleotide gắn huỳnh quang có thể được enzyme ADN Taq
polymerase sử dụng như một cơ chất phản ứng trong PCR, tạo ra các phân tử ADN
được đánh dấu. Phương pháp này vừa có độ đặc hiệu, độ nhạy cao hơn các phương
pháp đánh dấu khác, vừa cho phép tạo ra đầu dò với hiệu suất lớn (lên tới một triệu
bản sao sau 20 chu kỳ phản ứng). Hơn nữa, với phương pháp PCR, người sử dụng
có thể kiểm soát kích thước đầu dò thông qua vị trí đầu 5’ của cặp mồi dùng trong
phản ứng, nhờ đó tạo ra đầu dò có kích thước tối ưu phù hợp với mục đích thí
nghiệm (thông thường kích thước đầu dò tổng hợp theo phương pháp này khoảng
200–600 bp) [19, 59].
1.2.2.3. Các loại đầu dò
Một số loại đầu dò thường sử dụng là đầu dò đặc hiệu locus, đầu dò trình tự
lặp lại và đầu dò toàn bộ nhiễm sắc thể.
Đầu dò đặc hiệu locus được tạo ra từ một phần của gen và được sử dụng để
phát hiện một vùng nhất định trên nhiễm sắc thể. Vị trí của gen đích trên nhiễm sắc
thể được xác định thông qua phản ứng lai của nhiễm sắc thể với đầu dò [23]. Kích
thước đầu dò thay đổi thùy theo tính chất của vector nhân bản, từ plasmid (1 – 10
kb) cho đến PAC, BAC, YAC (80 kb – 1 Mb). Đầu dò này đặc biệt hiệu quả cho
việc phát hiện các tái cấu trúc nhiễm sắc thể như chuyển đoạn, đảo đoạn hay mất
đoạn. Sử dụng các đầu dò cho các vị trí khác nhau với các màu huỳnh quang khác
nhau, người ta dễ dàng phát hiện các hiện tượng bất thường này [26, 37].
Đầu dò trình tự lặp lại trên nhiễm sắc thể được tạo thành từ các trình tự lặp
lại ở tâm động hoặc đầu mút. Ví dụ như đầu dò đầu mút nhiễm sắc thể (với trình tự
oligonucleotide TTAGGG lặp lại nhiều lần) có khả năng liên kết với tất cả các
nhiễm sắc thể trong tế bào [37]. Đầu dò bắt cặp với các trình tự lặp lại đặc trưng
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan

Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm

18
trên từng nhiễm sắc thể thường xuyên được sử dụng hơn, với việc sử dụng các màu
huỳnh quang khác nhau để nhuộm các nhiễm sắc thể khác nhau. Loại này đặc biệt
thích hợp cho việc phát hiện các trường hợp đơn nhiễm (monosomy), tam nhiễm
(trisomy) và các dị bội khác [57].
Đầu dò toàn bộ nhiễm sắc thể là tập hợp các đầu dò nhỏ hơn, lai với các trình
tự khác nhau dọc theo chiều dài của cùng một nhiễm sắc thể, nhờ đó, có thể nhuộm
màu toàn bộ nhiễm sắc thể. Hình ảnh phân tích nhiễm sắc thể cho phép phân biệt
các nhiễm sắc thể dựa trên màu sắc của chúng. Phương pháp này thể hiện tính ưu
việt hơn hẳn so với phương pháp lập bản đồ kiểu nhân dựa vào mô hình nhuộm
băng truyền thống, đặc biệt là cho việc phân tích tính bất thường nhiễm sắc thể [54,
55]. Người ta có thể sử dụng tới 24 màu huỳnh quang để đánh dấu các nhiễm sắc
thể, từ đó phát triển hai kỹ thuật FISH độc lập nhau là đa màu (Multiplex FISH –
M-FISH) và kiểu nhân phổ (Spectral Karyotyping – SKY). Đây đều là những kỹ
thuật đột phá, thường xuyên được sử dụng trong chẩn đoán và nghiên cứu [12, 38].
1.2.3. Ưu điểm của kỹ thuật FISH
Kỹ thuật FISH được sử dụng phổ biến trong sinh học phân tử và chẩn đoán
điều trị. Nó có thể được ứng dụng trong chẩn đoán trước sinh với các khiếm khuyết
nhiễm sắc thể có khả năng di truyền, phát hiện sau sinh các thay đổi di truyền,
nghiên cứu về khối u, cấu trúc và chức năng tế bào, Một lợi thế nữa từ kỹ thuật
FISH là cho phép quan sát từng nhiễm sắc thể trên kiểu nhân, qua đó nhận dạng
được từng gen, nhiễm sắc thể và các bất thường di truyền [90, 91]. FISH cũng được
ứng dụng để xác định vị trí cài nhập của gen chuyển trong hệ gen tế bào chủ mà
không đòi hỏi tách chiết ADN hệ gen cũng như không cần nuôi cấy thêm [29, 79].
Kỹ thuật FISH được xem như cầu nối giữa lĩnh vực di truyền học cổ điển với di
truyền học hiện đại, nó kết hợp sự chính xác của các kỹ thuật di truyền phân tử và
sự quan sát trực quan từ kính hiển vi. Độ nhạy cao, độ đặc hiệu và tốc độ tiến hành
là những ưu điểm nổi bật đã giúp FISH trở thành công cụ hữu hiệu trong các nghiên
cứu cơ bản cũng như chẩn đoán và điều trị [12, 26, 37].
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan

Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm
19
1.2.4. Ứng dụng của kỹ thuật FISH
1.2.4.1. Ứng dụng trong phân tích kiểu nhân
Hệ thống nhận dạng nhiễm sắc thể dựa trên kỹ thuật FISH có thể được sử
dụng cho mục đích phân tích kiểu nhân. Phản ứng lai có thể tiến hành với một tập
hợp các đầu dò khác nhau bằng một hệ thống chất phát huỳnh quang cho những phổ
màu khác nhau, vì vậy có thể phát hiện đồng thời tất cả các nhiễm sắc thể trong hệ
gen. So với các phương pháp phân tích kiểu nhân truyền thống, chi phí các xét
nghiệm FISH chỉ bằng một nửa trong khi thời gian tiến hành thí nghiệm nhanh hơn.
Vì vậy, FISH nhanh chóng trở thành một công cụ quan trọng và hữu ích cho việc
phân tích kiểu nhân, phục vụ cho các nghiên cứu di truyền học tế bào [50, 79].
Năm 1996, hai nhóm nghiên cứu độc lập công bố các nghiên cứu phân tích
kiểu nhân sử dụng kỹ thuật FISH với 24 màu huỳnh quang, chính là hai kỹ thuật M-
FISH và SKY [78, 82]. Ứng dụng các kỹ thuật này, người ta đã xác định được các
chuyển đoạn không tương hỗ, tái sắp xếp lại nhiễm sắc thể trong các tế bào ung thư
[76]. Đặc biệt, M-FISH cũng lần đầu tiên chứng minh được ở kỳ trung gian trong
quá trình phân bào, các nhiễm sắc thể không phân bố ngẫu nhiên mà mỗi chiếc
chiếm một vị trí nhất định trong nhân tế bào (Hình 5) [13, 83].

Hình 5. V
ị trí của các nhiễm sắc thể trong nhân tế b
ào
ở kỳ trung gian

(A) Tín hiệu huỳnh quang thu được từ các đầu dò đánh dấu đặc hiệu với 24 nhiễm sắc thể
(các cặp 1–22, nhiễm sắc thể giới tính X và Y); (B) Vị trí chính xác của các nhiễm sắc thể
ở pha G0, các vùng đen trong nhân không bắt màu huỳnh quang là khu vực của nhân con.
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan

Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm
20
Với các góc độ chụp khác nhau, người ta có thể xây dựng được vị trí không gian ba chiều
của các nhiễm sắc thể. Kết quả được phân tích trên nguyên bào sợi người [13, 83].
1.2.4.2. Ứng dụng trong nghiên cứu cấu trúc nhiễm sắc thể
FISH là một kỹ thuật mạnh mẽ được sử dụng trong việc phát hiện các bất
thường nhiễm sắc thể như thể dị bội, mất đoạn hay chuyển đoạn [30, 89].
Hiện tượng chuyển đoạn đầu tiên được phát hiện bằng kỹ thuật FISH gây
bệnh ở người là chuyển đoạn giữa cánh dài nhiễm sắc thể số 9 và cánh ngắn nhiễm
sắc thể số 22, tạo nên nhiễm sắc thể Philadelphia. Đột biến này có liên quan mật
thiết với bệnh bạch cầu nguyên bào tủy mãn tính (chronic myelogenous leukemia –
CML), 95% những người mắc bệnh gặp bất thường này [71] (một tỷ lệ nhỏ bệnh
nhân được phát hiện hiện tượng chập ba nhiễm sắc thể số 8 [26]). Tuy nhiên chuyển
đoạn này không phải đặc hiệu để chẩn đoán CML, do nó cũng chiếm một tỷ lệ nhỏ
gây nên bệnh bạch cầu nguyên bào lympho cấp tính (acute lymphoblastic leukaemia
– ALL). Bệnh này cũng lần đầu tiên được phát hiện nhờ kỹ thuật FISH, trong đó
gần 25% các trường hợp bệnh liên quan đến chuyển đoạn giữa cánh ngắn nhiễm sắc
thể 12 và cánh dài nhiễm sắc thể 21 [26]. Ngoài ra, còn rất nhiều các bất thường
nhiễm sắc thể cũng được phát hiện nhờ kỹ thuật FISH như một số dạng ung thư, vô
sinh, hội chứng Down, Prader – Willi, Angelman, Velocardiofacial,… [75].
Ở Việt Nam, trong vài năm trở lại đây, một số bệnh viện lớn như bệnh viện
Trung ương Quân đội 108, Bạch Mai, Nhi Trung ương,… cũng đã đẩy mạnh ứng
dụng kỹ thuật này để chẩn đoán ung thư và một số hội chứng giai đoạn trước sinh.
Trong giai đoạn 2004–2006, nhóm nghiên cứu thuộc ĐH Y Dược TP. HCM đã
nghiên cứu 1302 thai phụ có nguy cơ sinh con dị bội nhiễm sắc thể, phát hiện 136
trường hợp với nhiều dạng khác nhau như chập ba nhiễm sắc thể 13 (hội chứng
Patau), chập ba nhiễm sắc thể 18, chập ba nhiễm sắc thể 21 (hội chứng Down), XO,
XXX và XXY [3]. Năm 2008, khoa Di truyền và Sinh học phân tử – bệnh viện Nhi
Trung ương cũng đã ứng dụng kỹ thuật này để phát hiện một số bất thường trên tế

bào lympho B nuôi cấy in vitro như mất đoạn q11–13 ở nhiễm sắc thể 15 gây hội