Đánh giá ảnh hưởng của một số dịch chiết thực vật lên sự sinh trưởng phát triển và hoạt tính enzyme urease của một số vi khuẩn đất

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI






TRẦN THỊ ðÀO




ðÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ DỊCH CHIẾT
THỰC VẬT LÊN SỰ SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN VÀ
HOẠT TÍNH ENZYME UREASE CỦA MỘT SỐ
VI KHUẨN ðẤT




LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP



Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60 42 80

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. NGUYỄN TẤT CẢNH
TS. NGUYỄN THÀNH TRUNG


HÀ NỘI - 2012

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả
nghiên cứu trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa từng công bố trong
bất kỳ công trình nào.

Hà Nội, ngày 2 tháng 10 năm 2012
Người cam đoan


Trần Thị Đào
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

ii

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập, thực tập tốt nghiệp, tôi đã nhận được sự giúp đỡ
tận tình của các đoàn thể, cá nhân trong và ngoài trường.
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến hai thầy

giáo – PGS. TS. Nguyễn Tất Cảnh, giảng viên Bộ môn Canh Tác-Khoa Nông
học và TS. Nguyễn Thành Trung, giảng viên Bộ môn Công nghệ vi sinh-Khoa
Công nghệ sinh học-Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tạo điều kiện,
hướng dẫn và tận tình giúp đỡ tôi suốt quá trình thực tập và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong khoa Công nghệ sinh
học, các thầy cô giáo; Cán bộ nghiên cứu của Bộ môn Công nghệ vi sinh-
Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá
trình học tập cũng như trong thời gian thực tập tốt nghiệp.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, bạn bè luôn bên cạnh động viên,
giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu, học tập và làm thực tập tốt nghiệp.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 2 tháng 10 năm 2012
Học viên


Trần Thị ðào
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

iii

MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ix

I. MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2. Mục đích, yêu cầu 3

1.2.1 Mục đích 3

1.2.2. Yêu cầu 3

1.3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 3

1.3.1. Ý nghĩa khoa học 3

1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn 3

II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1. Quá trình chuyển hóa đạm trong đất 4

2.1.1. Quá trình cố định nitơ trong đất 5

2.1.2. Quá trình amôn hóa 5

2.1.3. Quá trình nitrat hóa 8

2.2. Giới thiệu về vi sinh vật đất 9

2.2.1. Thành phần vi sinh vật đất 9

2.2.2. Vai trò của vi sinh vật đất 10

2.3. Cấu trúc và chức năng của enzyme urease 11

2.3.1. Cấu trúc phân tử và hoạt động của enzyme urease 11

2.3.2. Vai trò của enzyme urease 14

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

iv

2.4. Các chất ức chế hoạt động enzyme urease 16

2.4.1. Ảnh hưởng của các hợp chất vô cơ đến khả năng hoạt động của
enzyme urease 16

2.4.2. Một số chất hữu cơ kìm hãm hoạt động enzyme urease 18

2.5. Vai trò của dịch chiết thực vật trong hoạt động kháng khuẩn 20

III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

3.1. Vật liệu 24

3.2. Môi trường 24

3.3. Nội dung nghiên cứu 25

3.4. Phương pháp nghiên cứu 25

3.4.1. Phương pháp thu thập các mẫu thực vật mục tiêu 25

3.4.2. Phương pháp chiết tách dịch chiết thực vật thô 25

3.4.3. Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu đất 26

3.4.4. Phương pháp phân lập vi khuẩn amôn trong đất 27

3.4.5. Phương pháp làm thuần, quan sát hình thái khuẩn lạc (Nguyễn Lân
Dũng, 1972) 28

3.4.6. Phương pháp giữ giống 28

3.4.7. Phương pháp làm tiêu bản soi bào tử vi khuẩn 29

3.4.8. Phương pháp chiết tách DNA (Miniprep of bacteria genomic DNA
(molecular Cell Physiology, 2002) 29

3.4.9. Phương pháp phân tích trình tự các isolate phân lập được 30

3.4.10. Phương pháp đánh giá tác động của dịch chiết thực vật đến sinh
trưởng, phát triển của vi khuẩn phân lập được 31

3.4.11. Phương pháp đánh giá tác động kìm hãm của dịch chiết thực vật thô
lên hoạt tính enzyme urease thương mại 32

IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

4.1. Kết quả thu thập các mẫu thực vật mục tiêu từ Sa Pa – Lào Cai 34

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

v

4.2. Kết quả phân lập vi khuẩn amôn hóa trong đất trồng lúa vùng đồng
bằng sông Hồng Gia Lâm – Hà Nội 40

4.3. Kết quả giải trình tự 16s rDNA của các isolate phân lập được 46

4.3.1. Kết quả nhân 16s rDNA của các chủng phân lập 46

4.3.2. Kết quả giải trình tự 16s rDNA của các chủng phân lập được 47

4.4. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết thực vật đến sinh
trưởng, phát triển của vi khuẩn phân lập được 48

4.5. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết thực vật đến hoạt tính
enzyme urease 51

4.5.1. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết thực vật chiết bằng nước
cất đến hoạt tính enzyme urease thương mại 52

4.5.2. Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết thực vật chiết bằng các loại
dung môi hữu cơ khác nhau đến hoạt tính enzyme urease 56

V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 65

5.1. Kết luận 65

5.2. Kiến nghị 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

vi

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Hàm lượng đạm bị mất ở các dạng khác nhau (Ledgard 2001) 8
Bảng 2.2. Sự phân bố của vi sinh vật trong đất xác định theo chiều sâu đất
(Lê Xuân Phương, 2008) 10
Bảng 2.3. Hoạt độ kìm hãm của Quercetin và các glycoside của nó đối với
urease từ đậu rựa (Jack bean) và urease từ Lactobusillus
fermentum (Shabana, 2010) 18
Bảng 3.1. Thành phần phản ứng PCR cho nhân dòng gen 16s rRNA 30
Bảng 3.2. Trình tự mồi 16s rDNA sử dụng trong nhân dòng gen 31
Bảng 4.1. Danh mục tên các loài thực vật sử dụng làm vật liệu nghiên cứu
tại Sa Pa (Ninh Thị Phíp, 2008) 35
Bảng 4.2. Đặc điểm thực vật học của các loài cây sử dụng làm vật liệu
nghiên cứu (Ninh Thị Phíp, 2008) 35
Bảng 4.3. Mô tả công dụng và phân bố của các loài nghiên cứu
(Ninh Thị Phíp, 2008) 38
Bảng 4.4. Hình thái khuẩn lạc và bào tử của các vi khuẩn amôn hóa được
phân lập trong đất trồng lúa vùng đồng bằng sông Hồng – Gia

Lâm – Hà Nội 41
Bảng 4.5. Kết quả Blast trình tự 16s rDNA của isolate R17 47
Bảng 4.6. Khả năng kìm hãm của các mẫu dịch chiết thực vật chiết bằng
nước đến sinh trưởng, phát triển của các isolate phân lập được 50
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

vii

DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1. Các quá trình chuyển hóa đạm trong đất (Courtney Johnson, 2005) 4
Hình 2. Trung tâm hoạt động của urease dựa trên phân tích sinh lý
và quang phổ (Mobley et al., 1995) 12
Hình 3. Cấu trúc tinh thể trung tâm hoạt động của enzyme urease
(Mobley và cộng sự, 1995) 13
Hình 4. Cơ chế hoạt động của enzyme urease (Mobley và cộng sự, 1995) 14
Hình 5. Các hợp chất vô cơ ức chế hoạt động của enzyme urease
(Shabana, 2010) 17
Hình 6. Các dạng cấu trúc của quercetin glycoside (Shabana, 2010) 19
Hình 7. Kết quả kiểm tra các mẫu vi khuẩn amôn hóa phân lập được
trên môi trường Christene’s urê agar 45
Hình 8. Kết quả nhân gen 16s rDNA với cặp mồi 16sF1 và 16sR1 46
Hình 9. Kết quả Blast trình tự 16s rDNA của isolate R17 48
Hình 10a. Khả năng ức chế sinh trưởng isolate R19 của các mẫu dịch chiết
thực vật chiết bằng nước cất 49
Hình 10b. Khả năng ức chế sinh trưởng isolate R20 của các mẫu dịch chiết
thực vật chiết bằng nước cất 49
Hình 11a. Ảnh hưởng của dịch chiết dàng mê công và dịch chiết Puồng
đìa nhau đến hoạt tính enzyme urease thương mại 53
Hình 11b. Ảnh hưởng của dịch chiết đìa chụt và dịch chiết đìa sài đến hoạt

tính enzyme urease thương mại 54
Hình 11c. Ảnh hưởng của dịch chiết tầm gửi ký và dịch chiết tùng diè đến
hoạt tính enzyme urease thương mại 54
Hình 11d. Ảnh hưởng của dịch chiết xà đìa pi đến hoạt tính enzyme urease
thương mại 55
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

viii

Hình 12a. Ảnh hưởng của dịch chiết dàng mê công chiết bằng các dung
môi hữu cơ khác nhau đến hoạt tính enzyme urease thương mại 58
Hình 12b. Ảnh hưởng của dịch chiết puồng đìa nhau chiết bằng các dung
môi hữu cơ khác nhau đến hoạt tính enzyme urease thương mại 59
Hình 12c. Ảnh hưởng của dịch chiết đìa sài chiết bằng các dung môi hữu
cơ khác nhau đến hoạt tính enzyme urease thương mại 60
Hình 12d. Ảnh hưởng của dịch chiết đìa chụt chiết bằng các dung môi hữu
cơ khác nhau đến hoạt tính enzyme urease thương mại 61
Hình 12e. Ảnh hưởng của dịch chiết tầm gửi ký chiết bằng các dung môi
hữu cơ khác nhau đến hoạt tính enzyme urease thương mại 62
Hình 12f. Ảnh hưởng của dịch chiết tùng diè chiết bằng các dung môi hữu
cơ khác nhau đến hoạt tính enzyme urease thương mại 63
Hình 12g. Ảnh hưởng của dịch chiết xà đìa pi chiết bằng các dung môi hữu
cơ khác nhau đến hoạt tính enzyme urease thương mại 63
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

ix

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

AHA: Acetohydroxamic acid

CT: Công thức
DCD: Dicyandiamide
DCTV: Dịch chiết thực vật
H. pyroli: Helicobacter pyroli
IC: Inhibitor concentration
MT: Môi trường
LB: Luria Broth
nBTPT: N-(n-butyl) thiophosphoric triamide

NCBI: National center for biotechnology information
PCR: Phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction)
SB: Sodium phosphate buffer
WHO: World health organism

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

1

I. MỞ ðẦU
1.1 ðặt vấn ñề
Urê là loại phân bón hiện nay được sử dụng rộng rãi trên thế giới và ở
Việt Nam. Đây là một loại phân đạm dạng hạt, có hàm lượng đạm khá cao trong
phân (46%). Do giá thành sản xuất thấp, đồng thời có ít nguy cơ làm tăng độ
chua của đất nên phân urê hiện được sử dụng rộng rãi (Tisdale et al., 1985). Urê
là loại phân dễ hoà tan trong nước. Nó có thể tồn tại ở hai dạng là phân urê
amôn nitrat và phân urê hỗn hợp. Tuy nhiên, phân urê có hai nhược điểm là
dễ dàng bị mất đạm do bốc hơi khi bón lên bề mặt đất (Fenn & Hossner,
1985) và dễ làm tổn thương hạt giống cây trồng nếu bón gần hạt với nồng độ
cao. Khi được bón vào đất, urê bị thủy phân rất nhanh thành amôn (NH
3

) dưới
tác dụng của enzyme urease được sinh ra từ nhóm vi sinh vật trong đất
(Conrad, 1940). Quá trình thủy phân urê xảy ra càng nhanh thì hàm lượng
NH3 tạo ra càng lớn và lượng NH3 này có thể bị mất đi vào trong khí quyển
khi nó tồn tại gần mặt đất.
Ở Việt Nam, theo tổng kết năm 2008 của Cục trồng trọt, tổng lượng phân
bón vô cơ các loại được sử dụng là 2,4 triệu tấn/năm. Theo tính toán ở nước ta,
hiện nay hiệu suất sử dụng phân đạm mới chỉ đạt 30-45%, phân lân đạt 40-45%,
phân kali đạt 40-50%. Hiệu suất sử dụng phân bón khác nhau tuỳ theo chất đất,
giống cây trồng, thời vụ, phương pháp bón phân, chất lượng phân bón. Hàng
năm, lượng phân bón vào đất nhưng không được cây trồng sử dụng do sự bay
hơi, rửa trôi, thấm sâu chiếm khối lượng rất lớn: 1,77 triệu tấn urê, 2,07 triệu tấn
supelân, 344 nghìn tấn kali. Do đó, việc nâng cao hiệu quả sử dụng phân urê
không chỉ làm tăng năng suất cây trồng mà còn giảm thiểu ô nhiễm môi trường
(Christensen, 1946).
Trong thời gian qua, đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng các chất hóa học
vô cơ vào kiểm soát hoạt động enzyme urease trong đất nhằm nâng cao hiệu quả
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

2

sử dụng phân đạm urê (Mulvaney et al., 1981). Tuy nhiên, phần lớn các chất vô
cơ có khả năng kìm hãm hoạt động enzyme urease thường có độc tính và khả
năng kìm hãm không ổn định (Xiao et al., 2007). Đã có những nghiên cứu ứng
dụng các hợp chất tự nhiên trong việc điều khiển hoạt động enzyme urease sinh
ra từ vi khuẩn Helicobacter pyroli trong việc điều trị bệnh ở người và động vật
(Xiao et al., 2007). Tuy nhiên, việc nghiên cứu ứng dụng các hợp chất tự nhiên
chiết xuất từ thực vật trong việc kìm hãm hoạt động enzyme urease trong đất
nhằm nâng cao hiệu quả phân đạm còn rất hạn chế.
Việt Nam là nước có quần thể thực vật rất phong phú. Do vậy, các

hoạt chất có nguồn gốc từ thực vật cũng rất đa dạng và tác dụng của chúng
đến hệ sinh thái, đến sản xuất nông nghiệp có tiềm năng to lớn. Gần đây,
nhóm nghiên cứu của Trường ĐHNN Hà Nội đã tiến hành thu thập một số
loài cây bản địa của Việt Nam thuộc nhóm cây trong bài thuốc tắm của
người Dao đỏ ở Sa Pa-Lào Cai. Dịch chiết từ những loài thực vật này đã
được sử dụng để kiểm tra khả năng làm giảm quá trình mất đạm trên một
số ruộng trồng lúa và ngô. Kết quả bước đầu cho thấy, một số dịch chiết
thực vật có tác dụng kìm hãm quá trình mất đạm thể hiện qua lượng phân
đạm được sử dụng thấp hơn mà cây trồng vẫn duy trì, thậm chí sinh trưởng
và phát triển tốt hơn so với đối chứng (Đỗ Thanh Bình, 2010; Bùi Hữu
Ngọc, 2010). Dựa trên kết quả này, nhóm nghiên cứu đã sơ bộ nhận định
rằng, một số dịch chiết thực vật có nguồn gốc từ Sa Pa-Lào Cai có khả
năng làm giảm quá trình mất đạm trong đất nông nghiệp. Do đó, đề tài
“ðánh giá ảnh hưởng của một số dịch chiết thực vật lên sự sinh trưởng
phát triển và hoạt tính enzyme urease của một số vi khuẩn ñất” được
thực hiện sẽ là cơ sở cho việc sử dụng các dịch chiết thực vật nhằm làm
tăng hiệu quả sử dụng đạm urê trong sản xuất nông nghiệp.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

3

1.2. Mục ñích, yêu cầu
1.2.1 Mục ñích
- Xác định được dịch chiết thực vật có khả năng kìm hãm hoạt tính
enzyme urease.
- Đánh giá được tác động của dịch chiết thực vật lên sự sinh trưởng của vi
sinh vật chuyển hóa đạm trong đất.
1.2.2. Yêu cầu
- Thu thập một số mẫu thực vật sinh trưởng tại vùng Sa Pa – Lào Cai
- Phân lập và bảo tồn nhóm vi khuẩn amôn hóa trên đất phù sa sông Hồng

trồng lúa ở Gia Lâm, Hà Nội.
- Chiết xuất, thu dịch chiết của một số mẫu thực vật được thu thập từ Sa
Pa – Lào Cai
- Xác định được dịch chiết thực vật có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát
triển và hoạt tính enzyme urease của vi khuẩn phân lập được.
1.3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
Đề tài đã góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu ban đầu về đặc điểm hình thái,
hóa sinh, phân tử của vi khuẩn amôn hóa trong đất trồng lúa, đồng thời đánh giá
được tác động của một số dịch chiết thực vật tiềm năng tới sinh trưởng, phát
triển và hoạt tính enzyme urease của nhóm vi khuẩn này trong đất. Đây là công
trình nghiên cứu hoàn toàn mới ở Việt Nam.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả ban đầu mà đề tài có được đã mở ra một hướng nghiên cứu ứng
dụng mới tạo ra nguồn chế phẩm thực vật kiểm soát quá trình chuyển hóa phân
đạm urê trong đất, tăng cường hiệu quả sử dụng đạm cũng như phát triển nông
nghiệp bền vững.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

4

II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Quá trình chuyển hóa ñạm trong ñất
Nitơ là nhân tố dinh dưỡng thiết yếu cho sự sinh trưởng và năng suất cây
trồng. Hàm lượng nitơ trong đất rất thấp và thường tồn tại ở dạng cây trồng
không đồng hóa trực tiếp được (Vũ Hữu Yêm, 1995). Trong đất, các dạng tồn tại
của nitơ liên tục trải qua các quá trình biến đổi. Trong đó, quá trình cố định nitơ,
quá trình amôn hóa và quá trình nitrat hóa làm tăng lượng đạm dễ tiêu trong đất
cho cây trồng. Ngược lại, quá trình phản nitrat hóa, quá trình bay hơi và quá
trình rửa trôi đạm làm giảm lượng đạm dễ tiêu trong đất cho cây trồng

(Courtney Johnson, 2005).

Hình 1. Các quá trình chuyển hóa ñạm trong ñất (Courtney Johnson, 2005)
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

5

2.1.1. Quá trình cố ñịnh nitơ trong ñất
Quá trình cố định nitơ phân tử là quá trình đồng hóa nitơ của không khí
thành nitơ dưới dạng amôn nhờ tác dụng của các vi sinh vật đất có khả năng sinh
enzyme nitrogenase.
N
2
+ 6e + 12ATP + 12H
2
O 2NH
4
+
12ADP + 12P + 4H
+
Có nhiều loài vi khuẩn trong đất có khả năng cố định nitơ phân tử. Trong
đó, có 3 nhóm chính: nhóm vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh (Rhizobium sp),
nhóm vi khuẩn cố định sống tự do trong đất (Azotobacter sp, Clostridium sp) và nhóm
vi tảo cố định nitơ (Lương Đức Phẩm, 2009).
2.1.2. Quá trình amôn hóa
Quá trình amôn hóa là quá trình phân giải protein và các hợp chất hữu cơ
khác chứa nitơ tạo thành amôniac.
Các vi khuẩn có khả năng amôn hóa bao gồm nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn
sinh bào tử và không sinh bào tử. Đa số vi sinh vật amôn hóa thuộc nhóm đa
thực. Khi sinh trưởng trong môi trường chứa nhiều thành phần protein, các vi

sinh vật amôn hóa đều tiết enzyme proteinase vào môi trường. Dưới tác dụng
của enzyme này, protein được thủy phân thành amino acid. Các amino acid sinh
ra được vi sinh vật amôn hóa sử dụng làm nguồn năng lượng hoặc dùng cho các
quá trình sinh tổng hợp tế bào. Các sản phẩm đặc trưng của quá trình phân giải
protein là NH
3
và H
2
S.
a, Quá trình amôn hóa protein
Protein là thành phần cơ bản của tế bào chất, hàng năm protein được đưa
vào đất với số lượng rất lớn (bao gồm xác hữu cơ, phân chuồng, phân xanh,
phân rác). Trong protein chứa khoảng 15 – 17% nitơ.
Nitrogenase
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

6

Quá trình phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ (protein) để tạo ra
NH
3
cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng dưới tác dụng của các loài sinh vật
được gọi là quá trình amôn hóa protein.
* Cơ chế của quá trình amôn hóa protein
Dưới tác dụng của enzyme protease, các protein được phân giải thành các
hợp chất đơn giản hơn (polypeptit, olygopeptit). Các chất này tiếp tục được phân
giải thành amino acid nhờ tác dụng của enzyme peptidase ngoại bào hoặc cũng
có thể trực tiếp được hấp thụ vào tế bào vi sinh vật, sau đó tiếp tục chuyển hóa
thành amino acid. Các amino acid này sẽ được sử dụng một phần vào quá trình
sinh tổng hợp protein của vi sinh vật, một phần được tiếp tục phân giải để tạo

thành NH
3
, CO
2
và nhiều sản phẩm trung gian khác. Khi phân giải các amino
acid chứa S (như metionin, xistin, xistein), vi sinh vật giải phóng ra H
2
S và nếu
tích lũy nhiều H
2
S trong đất sẽ làm thối rễ cây trồng. Ngoài ra, khi phân giải
tryptophan, một số vi sinh vật có thể sinh ra chất có mùi thối là indon và scaton.
Một số amin sinh ra trong quá trình khử cacboxyl của các amino acid có thể độc
với người và gia súc, đáng chú ý là histamin, acmatin, putrexin, cadavein.
* Các nhóm vi sinh vật có khả năng phân giải protein:
Các nhóm vi sinh vật có khả năng phân giải protein đa dạng và phong phú
bao gồm vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn. Vi khuẩn có khả năng phân giải protein bao
gồm: Bacillus mycoides, Bacillus mesentercus, Bacillus subtilis, Proteus
vulgaris, Chromobacterium prodigiosum, Pseudomonas fluorescens,
Escherichia coli, Clostridium sporogenes. Xạ khuẩn có khả năng phân giải
protein bao gồm: Streptomyces griseus, Streptomyces rimesus. Nhiều chủng nấm
cũng có khả năng phân giải protein như: Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus,
Aspergillus terricoda, Aspergillus niger, Penicillum camomberli, Mucor. Các vi
sinh vật này đều có khả năng sinh enzyme protease, peptidase xúc tác quá trình
thủy phân liên kết peptit và một số liên kết khác (Nguyễn Xuân Thành, 2007).
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

7

Amôn được sinh ra có thể được cây trồng hấp thụ hoặc tham gia vào quá

trình nitrat hóa hoặc bị mất đi vào trong không khí do bị chuyển đổi thành NH
3
tùy thuộc vào pH đất, khả năng trao đổi ion của đất và nhiệt độ đất (Courtney
Johnson, 2005).
b, Quá trình amôn hóa urê
Urê là một loại hợp chất hữu cơ đơn giản chứa 46,6% N, được sản xuất
trong các nhà máy phân bón bằng phương pháp hóa tổng hợp từ các chất vô cơ.
Mặc dù, hàm lượng dinh dưỡng trong đạm urê rất cao nhưng cây trồng không
thể đồng hóa trực tiếp phân urê. Khi được bón vào đất, thông qua quá trình phân
hủy và chuyển hóa bởi các loài vi sinh vật, urê được chuyển hóa thành dạng dễ
tiêu cung cấp nguồn nitơ cho cây trồng.
* Cơ chế của quá trình amôn hóa urê
Dưới tác dụng của enzyme urease do các loài vi sinh vật tiết ra làm xúc
tác cho quá trình chuyển hóa urê.
urease
CO(NH
2
)
2
+ H
2
O -> 2NH
3
+ CO
2

* Các loại vi sinh vật phân giải urê
Có nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm sợi sống trong đất có khả năng
phân giải urê. Trong đó, đáng chú ý là các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải
urê được phân lập: Planosarcina ureae, Micrococcus eurae, Sarcina hansenii,

Bacillus pasteurii, Bacillus hesmogenes, Bacillus psichrocatericus, Bacillus
amylovorum, Pseudobacterium eruolyticum, Chromobacterium, Proteus
vulgaris. Vi khuẩn phân giải urê thường thuộc loại háo khí hoặc kỵ khí không
bắt buộc, chúng phát triển tốt ở pH = 6,5 – 8,5.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

8

2.1.3. Quá trình nitrat hóa
Quá trình nitrat hóa là quá trình chuyển hóa amôn thành nitrat bởi tác
động của vi sinh vật trong điều kiện hiếu khí. Quá trình này được thực hiện qua
hai giai đoạn: giai đoạn nitrite hóa và giai đoạn nitrat hóa bởi hai nhóm vi khuẩn
tuần tự nối tiếp nhau được gọi chung là vi khuẩn nitrat hóa (Lương Đức Phẩm, 2009).

NH
4
+
NO
2
-
NO
3
-
amôn nitrite nitrate
Cây trồng có thể hấp thụ dinh dưỡng nitơ ở cả 2 dạng: dạng amôn và dạng
nitrat. Tuy nhiên, nitrat mang điện tích âm và không được giữ trong đất. Do vậy,
nitrat dễ bị rửa trôi khi gặp điều kiện phù hợp. Ngược lại, amôn mang điện tích
dương và được duy trì bởi khả năng trao đổi cation của đất. Hơn nữa, trong điều
kiện yếm khí, nitrat bị giảm do quá trình phản nitrat hóa thành N
2

O và N
2
(Lương Đức Phẩm, 2009). Do đó, quá trình nitrat hóa và quá trình thủy phân urê
bởi enzyme urease trong đất cần phải được kiểm soát để hạn chế sự rửa trôi nitơ,
phát thải khí hiệu ứng nhà kính, bay hơi NH
3
từ đất, nâng cao hiệu quả sử dụng
đạm trong đất.
Bảng 2.1. Hàm lượng ñạm bị mất ở các dạng khác nhau (Ledgard 2001)
Các dạng ñạm bị mất Hàm lượng (kg N/ha/năm)
Phát thải khí N
2
O 2 (0,5-5)
Phản nitrat hóa 6 (4-17)
1
Bay hơi NH
3
7 (1-17)
Rửa trôi 23 (12-100)
2
Ghi chú: 1: Bao gồm phát thải khí N
2
, N
2
O, NO
2: Tính theo tổng số nitơ ñầu vào của 100 kg N/ha/năm
Nitrosomonas
s

Nitrosobacter

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

9

2.2. Giới thiệu về vi sinh vật ñất
2.2.1. Thành phần vi sinh vật ñất
Đất là môi trường lý tưởng đối với nhiều loài vi sinh vật. Hệ vi sinh vật
trong đất rất phong phú và đa dạng, bao gồm: vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn, nhiều
loại tảo, nguyên sinh động vật. Trong đó, vi khuẩn là nhóm chiếm nhiều nhất
về số lượng. Trong một gram đất có hàng trăm, hàng nghìn triệu vi khuẩn.
Chúng bao gồm vi khuẩn háo khí, vi khuẩn kị khí, vi khuẩn tự dưỡng, vi
khuẩn dị dưỡng. Số lượng và thành phần hệ vi sinh vật đất thay đổi theo điều
kiện sống trong đất. Chúng phụ thuộc vào thành phần hóa học, tính chất cơ lý,
pH đất, nhiệt độ, độ ẩm và mức thoáng khí trong đất. Ngoài ra, vi sinh vật đất
còn chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố khí hậu, thời gian trong năm, phương thức
canh tác, cây trồng che phủ.
Số lượng vi sinh vật đất thay đổi theo độ sâu của đất. Trên bề mặt đất và
sâu xuống 0,5cm, số lượng vi sinh vật thường rất ít. Do ở lớp đất này, vi sinh vật
chịu ảnh hưởng lớn bởi tác động của bức xạ mặt trời. Ở độ sâu 10 - 20 cm so với
bề mặt, đất có độ ẩm thích hợp, các chất dinh dưỡng tích luỹ nhiều, không bị tác
động của bức xạ mặt trời nên vi sinh vật phát triển nhanh, các quá trình chuyển
hoá quan trọng trong đất chủ yếu xảy ra trong tầng đất này. Số lượng và thành
phần vi sinh vật sẽ giảm đi khi độ sâu của đất hơn 30 cm và tại độ sâu 4 - 5m
hầu như rất ít (trừ trường hợp đất có mạch nước ngầm). Mặt khác, số lượng và
thành phần vi sinh vật trong đất còn thay đổi tuỳ chất đất. Ở nơi đất nhiều chất
hữu cơ, giàu chất mùn, điều kiện hiếu khí tốt, độ ẩm đất thích hợp vi sinh vật
phát triển mạnh. Trong khi những nơi đất có lẫn đá, cát số lượng và thành phần
vi sinh vật ít hơn.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

10

Bảng 2.2. Sự phân bố của vi sinh vật trong ñất xác ñịnh theo chiều sâu ñất
(Lê Xuân Phương, 2008)
Chiều

sâu

ñất

(cm)

Vi

khuẩn

Xạ

khuẩn

Nấm

mốc

Rong

tảo

3-8 9.750.000

2.080.000

119.000

25.000

20 - 25 2.179.000

245.000

50.000

5.000

35 - 40 570.000

49.000

14.000

500
65 - 75 11.000

5.000

6.000

100
135
-

145

1.400


3.000



2.2.2. Vai trò của vi sinh vật ñất
Trong đất, vi khuẩn chiếm khoảng 90% vi sinh vật tổng số. Xạ khuẩn
chiếm khoảng 8%, vi nấm 1%, còn lại 1% là tảo, nguyên sinh động vật. Tỷ lệ
này thay đổi tuỳ theo các loại đất khác nhau cũng như khu vực địa lý, tầng đất,
thời vụ, chế độ canh tác. Ở những đất có đầy đủ chất dinh dưỡng, độ thoáng khí
tốt, nhiệt độ, độ ẩm và pH thích hợp thì vi sinh vật phát triển nhiều về số lượng
và thành phần. Sự phát triển của vi sinh vật lại chính là nhân tố làm cho đất thêm
phì nhiêu, màu mỡ.
Đánh giá độ phì nhiêu của đất phải tính đến thành phần và số lượng vi
sinh vật. Nếu chỉ tính đến hàm lượng chất hữu cơ thì khó giải thích được tại sao
ở một vùng đất chiêm trũng hàm lượng chất hữu cơ, chất mùn, đạm, lân đều cao
mà cây trồng phát triển lại kém. Đó là do điều kiện yếm khí của đất hạn chế các
loại vi sinh vật háo khí phát triển làm cho các chất hữu cơ không được phân giải.
Các dạng chất khó tiêu đối với cây trồng không được chuyển hóa thành dạng dễ
tiêu. Các chất độc tích luỹ trong đất trong quá trình trao đổi chất của cây cũng
không được phân giải nhờ vi sinh vật, gây ảnh hưởng xấu đến cây trồng.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

11

Vai trò của hệ vi sinh vật đối với môi trường đất là rất lớn. Vi sinh vật đất
không những tham gia vào các quá trình tổng hợp các chất cần thiết cho cây
trồng, tăng nguồn dinh dưỡng cho đất mà còn tham gia vào các quá trình phân
giải các hợp chất hữu cơ trong đất, tạo thành mùn làm tăng độ phì cho đất. Bên
cạnh đó, vi sinh vật đất có vai trò tăng cường chuyển hóa các chất vô cơ chứa
nitơ, phospho, lưu huỳnh, sắt, mangan từ các dạng khó tan thành dạng dễ tan
cho cây trồng sử dụng. Hơn nữa, nhờ có hệ vi sinh vật, đất có thể được sử dụng
như các cánh đồng lọc sinh học cho các loại nước thải sinh hoạt, nước thải chế
biến thực phẩm có chứa các chất hữu cơ dễ dàng phân hủy, giàu nitơ, phospho
nhưng không chứa kim loại nặng vượt mức cho phép (Lê Xuân Phương, 2008).
Sở dĩ hệ vi sinh vật đất có vai trò quan trọng trong chuyển hóa các
chất dinh dưỡng trong đất là vì chúng có khả năng tiết ra ngoài môi trường
ngoại bào rất nhiều loại enzyme như amylase, protease, phytase, urease,…
Những enzyme này tham gia vào quá trình thủy phân, chuyển hóa các hợp
chất hữu cơ tồn tại sẵn trong đất cũng như thông qua hoạt động sản xuất
nông nghiệp dưới dạng phân bón. Khi bón phân urê vào đất, hợp chất này sẽ
được chuyển hóa thành các dạng khác nhau thông qua sự hoạt động của hệ
vi sinh vật amôn hóa, nitrit hóa, nitrat hóa. Nhóm vi sinh vật này đều có khả
năng tiết ra enzyme urease, xúc tác cho quá trình thủy phân urê cung cấp
dạng nitơ dễ tiêu cho cây trồng.
2.3. Cấu trúc và chức năng của enzyme urease
2.3.1. Cấu trúc phân tử và hoạt ñộng của enzyme urease
2.3.1.1. Cấu trúc phân tử của enzyme urease
Enzyme urease là enzyme liên kết với ion kim loại Nikel (Ni). Cấu
trúc phân tử, số lượng, kiểu dáng của các tiểu cấu tử, khối lượng phân tử và
trình tự amino acid của enzyme urease phụ thuộc vào nguồn gốc sinh ra nó.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

12

Enzyme urease của vi khuẩn chứa 3 tiểu cấu tử α, β, γ với khối lượng phân
tử tương ứng của chúng nằm trong khoảng 68–73kDa (α), 8–17kDa (β) và
8–12kDa (γ). Cấu trúc phân tử của enzyme urease vi khuẩn chủ yếu là cấu
trúc trimer gồm 3 tiểu cấu tử (αβγ)
3
. Ngược lại, cấu trúc phân tử của enzyme
urease của Helicobacter pylori chỉ chứa 2 kiểu cấu tử: kiểu α (60–66kDa) và
kiểu β (26–31kDa). Tuy nhiên, enzyme urease của .H. pyroli có các yếu tố
cấu trúc cơ bản là các trimer: (αβ)
3
hình thành lên phức tứ diện ((αβ)
3
)
4
có
khối lượng phân tử 1100kDa. Đây là cấu trúc siêu phân tử duy nhất có vai
trò quan trọng trong việc bảo vệ H. pyroli chống lại môi trường acid (Benini
et al., 1999; Jabri et al., 1995; Mobley et al., 1995).



Hình 2. Trung tâm hoạt ñộng của urease dựa trên phân tích sinh lý
và quang phổ (Mobley et al., 1995)
Vị trí hoạt động của enzyme urease được đặt ở tiểu cấu tử α, chứa 2 ion
Ni cách nhau khoảng 3,5-3,7A
o
. Mỗi ion Ni được liên kết với 2 phân tử histidyl
và 3 chất cho N hoặc O đi kèm để tạo nên một mạng lưới phối hợp gồm 5 phối
tử. Bên ngoài có thêm thiol có thể dịch chuyển một phối tử dẫn tới tạo nên một
cầu nối giữa 2 ion Ni.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

13

Cấu trúc trung tâm hoạt động 2 ion Ni của enzyme urease được xác định
bằng phân tích cấu trúc tinh thể. Các phối tử với trung tâm kim loại của enzyme
urease bao gồm các đuôi UreC. Lys-217 được carbamyl hóa cho phép Lys-217
tạo thành cầu nối giữa 2 ion Ni. Một phân tử nước được liên kết chính với các
ion Ni, được điều phối bởi ASP-360, 134, 136 tạo nên một cấu trúc hình cầu.
Một ion kim loại ở cấu trúc năm thành phần và một ion kim loại khác ở cấu trúc
4 thành phần có một phần chiếm giữ ở phía dưới. His219 và His320 là môi
trường trung gian với trung tâm kim loại. Cấu trúc này thuận lợi cho sự liên kết
cơ chất.

Hình 3. Cấu trúc tinh thể trung tâm hoạt ñộng của enzyme urease
(Mobley và cộng sự, 1995)
2.3.1.2. Cơ chế hoạt ñộng của enzyme urease
Enzyme urease có trung tâm hoạt động liên kết với hai ion Ni. Các phối tử
liên kết với trung tâm hoạt động của enzyme urease của vi khuẩn bao gồm cầu
lysine cacbamate, một cầu nối phân tử nước, 4 imidazone histidine có chứa liên
kết đôi với 1 ion Ni và một aspartic có phần đuôi liên kết với một ion Ni. Cơ
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

14

chất urê bám vào vị trí O liên kết với một ion Ni dẫn đến phân cực nhóm
cacbonyl của urê. His320 hoạt động như một chất nền chung (B) hoạt hóa phân
tử nước (hoặc nhóm hydroxyl) đã được liên kết với ion Ni thứ hai. Ái lực của
nhóm hydroxyl với nhóm cacbonyl của urê tạo nên thể tứ bội trung gian phân
hủy thành cacbamate giải phóng NH

3
và loại nước khỏi cacbamate để hoàn
thành một chu kỳ.


Hình 4. Cơ chế hoạt ñộng của enzyme urease (Mobley và cộng sự, 1995)

2.3.2. Vai trò của enzyme urease
2.3.2.1. Vai trò của enzyme urease trong quá trình gây bệnh ở người và ñộng vật
H. pyroli được coi là tác nhân gây bệnh loét dạ dày, tá tràng và ung thư dạ
dày. Điều đáng chú ý là H. pylori có thể tồn tại và phát triển trong môi trường
acid của dạ dày bằng cách tiết ra một lượng lớn enzyme urease (10-15% protein
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

15

tổng số (theo khối lượng)). Enzyme urease thủy phân urê có mặt trong dịch dạ
dày giải phóng ra NH
3
trung hòa acid trong dạ dày (Ha et al., 2001). Enzyme
urease tồn tại như nhân tố độc lực trong cơ chế gây bệnh sỏi thận và tiết niệu ở
người và động vật (Andrews et al., 1984).
Quá trình hình thành sỏi thận thường liên quan đến vi khuẩn thủy phân
urê như Ureaplasme urealyticum. Toàn bộ tế bào của H. pylori kích thích khối
oxi hóa trong bạch cầu trung tính ở người (Suzuki et al., 1992). Các hydro
peroxide từ khối oxy hóa này phản ứng với NH
3
được giải phóng ra bởi hoạt
động của enzyme urease của H. pylori tạo ra sản phẩm monochloramine gây độc
(Mai và et al., 1991). Do nồng độ NH

3
tăng trong cơ thể gây ra một số rối loạn
thần kinh dẫn tới bệnh Parkinson (Amtul et al., 2002). Một số nghiên cứu gần
đây cho thấy, nhiễm H. pylori cũng liên quan đến các bệnh động mạch vành và
bệnh tim (Danesh et al., 1998; Mendall et al., 1994; Tougas et al., 1999).
2.3.2.2. Vai trò enzyme urease trong nông nghiệp
Trong nông nghiệp, enzyme urease sinh ra bởi các vi sinh vật phân bố
rộng rãi trong các môi trường đất và môi trường nước, nơi mà nó đóng một vai
trò thiết yếu trong quá trình trao đổi nitơ (Bast, 1986). Ví dụ, quá trình phân hủy
protein và tạo nucleotide yêu cầu hoạt động của enzyme urease. Việc bón phân
urê hiệu quả đòi hỏi quá trình thủy phân urê phải được kiểm soát để nâng cao
hiệu quả phân bón và giảm thiểu thiệt hại cây trồng.
Khả năng nitơ bị cố định là yếu tố giới hạn chính tới năng suất nông
nghiệp. Hai hình thức tồn tại chính của nitơ trong môi trường đất là protein
và polynucleotide. Các hợp chất này bị thủy phân thành amino acid và
monor nucleotide và sau đó tiếp tục bị thủy phân bởi nhiều enzyme tạo
thành amôn. Sản phẩm amôn có thể được các vi sinh vật và cây trồng tiếp
nhận và sử dụng. Tuy nhiên, trong nhiều môi trường, mức độ sẵn có các
hợp chất nitơ là không đủ để tạo năng suất cây trồng tối ưu. Vì vậy, các