Nghiên cứu quy trình giám định 11-Nor-9-Cacboxyl-Delta-9-Tetrahydrocannabinol trong nước tiểu của người bằng GC-MS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN




NGUYỄN THỊ TUYẾN



NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH
11-NOR-9-CACBOXYL-DELTA-9-TETRAHYDROCANNABINOL
TRONG NƯỚC TIỂU CỦA NGƯỜI BẰNG GC-MS





LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC






Hà Nội – 2014
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THỊ TUYẾN



NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH
11-NOR-9-CACBOXYL-DELTA-9-TETRAHYDROCANNABINOL
TRONG NƯỚC TIỂU CỦA NGƯỜI BẰNG GC-MS

Chuyên ngành: Hóa Phân tích
Mã số: 60440118


LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC



Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Xuân Trường




Hà Nội – 2014
LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Xuân
Trường đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, động viên và tạo điều kiện giúp đỡ em
hoàn thành luận văn này.
Em xin cảm ơn các thầy, cô giáo Khoa Hóa, trường Đại học Khoa học tự
nhiên đã dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập và

nghiên cứu, đặc biệt là sự chỉ bảo của PGS.TS.Nguyễn Văn Ri.
Em cũng xin chân thành cảm ơn Ths. Hoàng Ngọc Mai, cùng các anh chị
Trung tâm giám định ma túy - Viện Khoa học hình sự đã rất nhiệt tình giúp đỡ,
động viên, truyền đạt lại nhiều kinh nghiệm quý báu cho em.
Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn lãnh đạo phòng PC54 –CATP Hà Nội cùng các
đồng nghiệp trong đội giám định Hóa học- phòng PC54 – CATP Hà Nội đã hết
sức tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cám ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã hỗ trợ, là
chỗ dựa vững chắc giúp tôi hoàn thành luận văn.
Hà Nội, ngày 5 tháng 12 năm 2014
Học viên


Nguyễn Thị Tuyến

MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3
1.1. Cần sa, các chế phẩm từ cần sa và các hoạt chất chính của cần sa 3
1.1.1. Cần sa 3
1.1.2. Các chế phẩm từ cần sa 5
1.1.3. Tác hại của việc sử dụng cần sa 6
1.1.4. Các thành phần hóa học của cần sa có ý nghĩa trong khoa học hình sự 7
1.1.5. Thời gian phát hiện và đối tượng phân tích đối với người sử dụng cần sa 9
1.1.6. THC và sự chuyển hóa THC trong nước tiểu 10
1.1.7. THC-COOH 12
1.2. Một số phương pháp phân tích THC-COOH 13
1.2.1. Phương pháp phân tích THC-COOH bằng sắc ký lỏng 13
1.2.2. Phương pháp phân tích THC-COOH bằng sắc ký khí 17

1.3. Một số các nghiên cứu về phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng sắc ký
khí đã được công bố 20
1.4. Nguyên tắc phương pháp nghiên cứu xác định THC-COOH bằng GC-MS . 22
1.5. Cơ chế phân mảnh của THC-COOH-2TMS 22
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM 24
2.1. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 24
2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu 24
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu 24
2.1.3. Nội dung nghiên cứu 25
2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 26
2.2.1. Hóa chất 26
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị 27
2.3. Phương pháp nghiên cứu 28
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu 28
2.3.2. Phương pháp xử lý mẫu 28
2.4. Thực nghiệm 29
2.4.1. Khảo sát điều kiện phân tích trên thiết bị GC-MS Triple Quad 7000 29
2.4.2. Khảo sát điều kiện thủy phân và dẫn xuất 30
2.4.3. Khảo sát dung môi chiết 30
2.4.4. Khảo sát môi trường (pH) chiết 31
2.4.5. Khảo sát hiệu suất chiết 31
2.4.6. Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị 31
2.4.7. Xây dựng đường chuẩn 32
2.4.8. Đánh giá phương pháp phân tích 32
2.4.9. Phân tích mẫu thực tế 33
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34
3.1. Kết quả khảo sát điều kiện phân tích THC-COOH trên GC-MS 34
3.2. Kết quả khảo sát điều kiện thủy phân và dẫn xuất 40
3.3. Kết quả khảo sát điều kiện tối ưu cho quá trình chiết 40
3.3.1. Kết quả khảo sát dung môi chiết 40

3.3.2. Kết quả khảo sát môi trường chiết (pH) 43
3.3.3. Kết quả khảo sát hiệu suất chiết 44
3.4. Phương pháp định lượng THC-COOH 44
3.4.1. Kết quả xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị 44
3.4.2. Xây dựng đường chuẩn 45
3.4.3. Kết quả đánh giá tính phù hợp của phương pháp 47
3.4.4. Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp 48
3.4.5. Quy trình giám định THC-COOH trên thiết bị GC-MS 49
3.5. Ứng dụng quy trình vào phân tích mẫu thực tế 51
3.6. Hướng phát triển của đề tài 51
KẾT LUẬN 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO 53
PHỤ LỤC 56
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Các thành phần hóa học của cần sa có ý nghĩa trong KHHS 7
Bảng 1.2. Hàm lượng THC thay đổi tùy vào các bộ phận của cây cần sa 8
Bảng 1.3. Thời gian phát hiện trên các đối tượng mẫu 9
Bảng 1.4. Một số nghiên cứu phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng sắc
ký lỏng 15
Bảng 1.5. Một số nghiên cứu phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng sắc
ký khí 21
Bảng 2.1. Thông tin một số mẫu nước tiểu bị bắt giữ 25
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến quá trình chiết 41
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình chiết 43
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát hiệu suất chiết 44
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của THC-COOH 45
Bảng 3.5. Kết quả so sánh giữa giá trị a với 0 của phương trình đường chuẩn 47
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp 47
Bảng 3.7. Hiệu suất thu hồi trên nền mẫu thật 48

Bảng 3.8. Kết quả định lượng thu được từ một số mẫu thực 51
DANH MỤC HÌNH VẼ
Trang

Hình 1.1. Các đặc điểm hình thái đặc trưng của cây cần sa 4

Hình 1.2. Cần sa trồng trong nhà 5

Hình 1.3. Sơ đồ quá trình chuyển hóa THC trong nước tiểu 12

Hình 1.4. Sắc đồ của THC-COOH khi phân tích bằng LC- MS 16

Hình 1.5. Phổ khối của THC-COOH khi phân tích bằng LC-MS 16

Hình 1.6. Sơ đồ thiết bị sắc ký khí và vận hành 19

Hình 1.7. Sự tạo thành và dẫn xuất THC-COOH 22

Hình 1.8. Cơ chế phân mảnh của THC-COOH-2TMS 23

Hình 2.1. Một số mẫu nước tiểu bị bắt giữ 24

Hình 3.1. Phổ khối của THC-COOH chuẩn 35

Hình 3.2. Sắc ký đồ của THC-COOH-2TMS ở CTN I 36

Hình 3.3. Phổ khối của THC-COOH-2TMS ở CTN I 37

Hình 3.4. Sắc ký đồ của THC-COOH-2TMS ở CTN II 38

Hình 3.5. Phổ khối của THC-COOH-2TMS ở CTN II 39

Hình 3.6. Ảnh hưởng của dung môi đến quá trình chiết 42
Hình 3.7. Ảnh hưởng của pH đến quá trình chiết 43

Hình 3.8. Đường chuẩn xác định THC-COOH 46

Hình 3.9. Sơ đồ quy trình xử lý, tách chiết THC-COOH trong mẫu nước tiểu 50

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

THC

Delta 9 –tetrahydrocannabinol

CBN

Canabinol

CBD Cannabidiol
THC-COOH 11-nor-9-cacboxyl-delta-9-tetrahydrocannabinol
TMCS

Trimetylclosilan

BSTFA

N,O-bis- (trimetylsilyl) trifloaxetamit

TMS Trimetylsilyl

IS Internal standard (Chất nội chuẩn)
PFPA/PFPOH

Pentafluoropropionic anhydride/pentafluoropropanol
MSTFA 2,2,2-Trifluoro-N-methyl-N-(trimethylsilyl)acetamide
EtOAc Etylaxetat
LOD Limit of detection (Giới hạn phát hiện)
LOQ Limit of quantity (Giới hạn định lượng)
HPLC
High performance liquid chromatography
(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)
GC Gas Chromatography (Sắc ký khí)
GC-MS Gas chromatography–mass spectrometry (Sắc ký khí khổi phổ)
LC-MS
Liquid chromatography–mass spectrometry (Sắc ký lỏng khối
phổ)
KHHS Khoa học hình sự
CTN Chương trình nhiệt


1
MỞ ĐẦU

Từ lâu người ta đã biết đến ma túy là những chất có tác dụng làm thay đổi
trạng thái tâm lý và sinh lý của người sử dụng, có khả năng bị lạm dụng và gây ra
sự phụ thuộc về tâm, sinh lý vào việc sử dụng các chất đó.
Khi ngừng dùng chất ma túy, người nghiện thường không kiểm soát được
hành vi của mình, tìm mọi cách để có ma túy sử dụng tiếp, có khuynh hướng gia
tăng liều lượng nhằm thỏa mãn trạng thái tinh thần, cảm giác mong muốn. Đó là
nguyên nhân làm gia tăng các loại tội phạm hình sự như trộm cắp, giết người,

cướp của, mại dâm, là nguyên nhân của rất nhiều tội phạm kinh tế như buôn lậu,
gian lận, tham nhũng [3].
Cùng với các loại ma túy gây hậu quả nghiêm trọng tới đời sống xã hội
như thuốc phiện và các chất nhóm Opiat, các chất kích thích thần kinh nhóm
Amphetamine, nhóm Cocain, các thuốc an thần gây ngủ nhóm Benzodiazepine,
các thuốc an thần gây ngủ nhóm Barbiturat, hiện nay loại ma túy gây ảo giác Cần
sa đang ngày càng được giới trẻ sử dụng nhiều.
Người sử dụng cần sa có thể bị rối loạn thần kinh, gây mất thăng bằng,
chóng mặt, rối loạn tình dục, làm giảm khả năng sinh sản, làm trụy thai, chết thai
thậm chí gây rối loạn nhiễm sắc thể nếu sử dụng lâu dài. Từ cần sa người 61 chất
khác nhau, với thành phần chủ yếu là THC (delta 9 –tetrahydrocannabinol), CBN
(canabinol), CBD (cannabidiol). Trong đó THC là hoạt chất chính gây ra tác dụng
tâm lý tới người sử dụng cần sa.[16]
Cần sa được dùng chủ yếu bằng cách hút. Sau khi hút 24 giờ, khoảng 50%
lượng THC bị đào thải dưới dạng chuyển hóa, 50% còn lại được phân bố trong
toàn cơ thể, chủ yếu ở các mô mỡ, sau đó bị đào thải từ từ trong những ngày tiếp
theo. Khi bài tiết trong nước tiểu, chủ yếu là các sản phẩm oxy hóa THC-COOH
(11-nor-9-cacboxyl-delta-9-tetrahydrocannabinol) và các sản phẩm liên hợp với
một hoặc hai phân tử axit glucuronic của THC-COOH [3]. Đây chính là các đối
tượng để kiểm tra việc sử dụng cần sa.

2
Việc phân tích THC-COOH trong nước tiểu có thể thực hiện bằng phân
tích miễn dịch, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) hay bằng sắc ký khí (GC), tuy
nhiên HPLC là phương pháp tốn kém hơn do giá thành dung môi tương đối đắt.
Phương pháp sắc ký khí có hiệu quả tách rất cao, thời gian phân tích nhanh, độ
nhạy và độ chọn lọc cao. Vì thế chúng tôi lựa chọn sử dụng thiết bị sắc ký khí
khối phổ để xác định THC-COOH.
Từ hiện trạng sử dụng và mức độ nguy hại mà cần sa đem đến cho người
sử dụng nó, đồng thời để phục vụ cho công tác giám định ma túy, đề tài này

chúng tôi tập trung “Nghiên cứu quy trình giám định 11-nor-9-cacboxyl-delta-
9-tetrahydrocannabinol trong nước tiểu của người bằng thiết bị sắc ký khí khối
phổ” nhằm kiểm tra phát hiện đối tượng sử dụng cần sa.

3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Cần sa, các chế phẩm từ cần sa và các hoạt chất chính của cần sa
1.1.1. Cần sa
Cây cần sa được trồng phổ biến ở những vùng nhiệt đới từ hàng trăm năm
nay nhằm mục đích lấy sợi gai và là chất gây ra tác dụng tâm lý. Tại hầu hết các
nước trên thế giới, việc trồng trọt và buôn bán cây cần sa bị coi là bất hợp pháp vì
đã được đưa vào danh mục các chất ma túy bị cấm. Tuy nhiên, nó vẫn được trồng
bất hợp pháp ở nhiều vùng thuộc Bắc Mỹ, Nam Mỹ, khu vực Caribe, châu Phi và
Đông Nam Á. Châu Mỹ chiếm khoảng 55% sản lượng trên toàn cầu năm 2006,
sau đến Châu Phi (khoảng 22%) [21]. Ở Việt Nam, nó còn có tên gọi là cây gai
dầu, trước đây mọc nhiều ở khu vực Long Xuyên, Châu Đốc.
Bộ phận chứa hoạt chất có tác dụng trên hệ thần kinh là lá, quả và hoa. Các
bộ phận này được thu hoạch riêng, phơi khô, ép thành bánh hoặc bó lại để sử
dụng bằng cách hút, đôi khi dùng đường uống. Dưới đây là các đặc điểm hình
thái đặc trưng của cần sa [21]:

4

Hình 1.1. Các đặc điểm hình thái đặc trưng của cây cần sa
A - Đặc điểm đặc trưng của hoa cần sa đực
B - Đặc điểm đặc trưng của hoa cần sa cái
1 - Chùm nhị hoa 8 - Hạt cần sa có lá bắc
2 - Nhị hoa (nhị khác và ngắn hơn) 9 - Hạt cần sa không có lá bắc
3 - Nhị hoa 10 - Hạt cần sa (nhìn ngang)

4 - Hạt phấn hoa 11 - Hạt cần sa (hình cắt ngang)

5
5 - Nhụy hoa cái có lá bắc 12 - Hạt cần sa (hình bổ dọc)
6 - Nhụy hoa cái không có lá bắc 13 - Hạt cần sa đã lột vỏ
7 - Bầu nhụy hoa cái (hình bổ dọc)
Tại một số nước đã xuất hiện hiện tượng trồng trái phép cần sa trong nhà,
có thể trồng theo phương pháp thủy canh, không cần đất mà sử dụng đèn chiếu
sáng nhằm qua mặt các cơ quan an ninh cho thấy mức độ phức tạp và khó khăn
trong công tác điều tra phòng chống tội phạm.
Hiện nay, cần sa được sử dụng ở rất nhiều nơi, đặc biệt là bộ phận những
người trẻ tuổi. Cần sa thường được cuộn thành điếu giống như điếu thuốc lá để
hút nhằm tạo cảm giác hưng phấn. Một điếu cần sa nhỏ có thể được bán với giá
thành rất đắt so với thuốc lá.

Hình 1.2. Cần sa trồng trong nhà
1.1.2. Các chế phẩm từ cần sa
Trong nông nghiệp cây cần sa đã được sử dụng để lấy sợi từ lâu. Các sản
phẩm hợp pháp cần sa gồm có hạt cần sa, dầu từ hạt cần sa và tinh dầu cần sa [9].

6
Các chế phẩm từ cần sa được sản xuất với các quy trình khác nhau và cách
chuyển hóa khác nhau để nhằm mục đích buôn lậu và sử dụng bất hợp pháp, các
chế phẩm và sản phẩm trái phép của cần sa gồm ba loại chính là: Cây cần sa,
nhựa cần sa và dầu cần sa do hàm lượng THC cao.
Nhựa cần sa là sản phẩm chế biến bằng cách loại bỏ hạt, sợi, hàm lượng
THC đạt 2-10% [4]. Nhựa cần sa được sản xuất tại khoảng 65 nước trên thế giới,
chủ yếu là tại các nước thuộc khu vực Bắc Phi và Tây-Nam Á, đặc biệt là
Afghanistan và Pakistan [21].
Cần sa lỏng là dịch chiết lỏng của cần sa thực vật hoặc nhựa cần sa, với

dụng cụ chiết tương tự như chiết soxhlet. Các dung môi hữu cơ thường dùng là
etanol, clorofom, n-hexan, ete dầu hỏa, cần sa lỏng chứa THC tới 10-30%. [16]
1.1.3. Tác hại của việc sử dụng cần sa
Cần sa gây ra hàng loạt những biến đổi về tâm lý và hành động ở người sử
dụng, thường tạo ra những khoái cảm, hưng phấn, nói nhiều. Nếu như người
nghiện heroin chỉ trở nên hung dữ khi lên cơn thèm thuốc thì người nghiện cần sa
có thể trở nên hung dữ ngay cả khi đang hưng phấn. Khi sử dụng cần sa, các cơ
quan cảm giác như thị giác, thính giác, xúc giác và vị giác bị kích thích mạnh dẫn
đến ảo giác, trí nhớ lẫn lộn, không phân biệt được quá khứ, hiện tại. Người
nghiện có thể quên đi mọi lo lắng, ưu tư, cảm thấy mình trôi nổi, bồng bềnh,
không quan tâm đến việc gì, không có mục đích rõ ràng. Từ đó dẫn đến những
trang thái bất thường về hành vi, không làm chủ được các hoạt động của bản thân.
Sử dụng cần sa lâu dài có thể bị rối loạn thần kinh, tình dục, giảm khả năng sinh
sản, gây ra trụy thai, chết thai hay rối loạn nhiễm sắc thể. Cần sa có thể gây ra bất
tỉnh, thậm chí dẫn đến tử vong.
Bên cạnh đó cần sa cũng có một vài công dụng dùng trong y học như
chống lại tác dụng gây nôn của các chất hóa trị liệu chống ung thư, làm thư giãn
cơ, chống co giật, hạ nhãn áp. Tuy nhiên việc sử dụng cần sa cho mục đích y học
cần được kiểm soát chặt chẽ.

7
1.1.4. Các thành phần hóa học của cần sa có ý nghĩa trong khoa học hình sự
Bảng 1.1. Các thành phần hóa học của cần sa có ý nghĩa trong KHHS [21]
(-)-
Δ
9-trans-Tetrahydrocannabinol
Tetrahydrocannabinol, THC

- Công thức phân tử: C
21

H
30
O
2
- Khối lượng phân tử: 314,46 g/mol
- Gần như không tan trong nước (2,8
mg/l ở 23
o
C), tan tốt trong dung môi
etanol, clorofom, hexan.
- Dược lý: Giảm đau, kháng viêm,
chống nôn.
(-)-∆
9
-trans-Tetrahydrocannabinolic
Acid, THCA

- Công thức phân tử:

C
22
H
30
O
4
- Khối lượng phân tử: 358 g/mol
- Gần như không tan trong nước, tan
tốt trong dung môi etanol, clorofom,
hexan.
- Dược lý: Kháng khuẩn, kháng sinh.

Cannabinol,
CBN

- Công thức phân tử:

C
21
H
26
O
2
- Khối lượng phân tử: 310,43 g/mol
- Gần như không tan trong nước, tan
tốt trong dung môi etanol, clorofom,
hexan.
- Dược lý: An thần, giảm đau, chống
co giật, kháng sinh, kháng viêm.
Cannabidiol,
CBD

- Công thức phân tử:

C
21
H
30
O
2
- Khối lượng phân tử: 314,46 g/mol
- Gần như không tan trong nước, tan

tốt trong dung môi etanol, clorofom,
hexan.
- Dược lý: An thần, giảm đau, chống
co thắt, kháng viêm.

8
Cannabigerol, CBG

- Công thức phân tử: C
21
H
32
O
2
- Khối lượng phân tử: 316,48 g/mol
- Dược lý: Kháng sinh, kháng viêm,
giảm đau, chống nấm.

Cannabivarin,
CBV

- Công thức phân tử:

C
19
H
22
O
2
- Khối lượng phân tử: 282,38 g/mol

Cannabichromene,
CBC

- Công thức phân tử:

C
21
H
30
O
2
- Khối lượng phân tử: 314,46 g/mol
- Dược lý: Kháng viêm, kháng sinh,
giảm đau, chống nấm,

Hàm lượng THC trong cần sa thực vật khoảng 0,5-5%. Các kết quả phân
tích hàm lượng THC trong cần sa thực vật ở Việt Nam khoảng 3-5%, tuy nhiên
trong một số mẫu, có thể đạt tới 10-12% [4].
Bảng 1.2. Hàm lượng THC thay đổi tùy vào các bộ phận của cây cần sa [21]
STT Loại cây cần sa Hàm lượng THC
1 Hoa cái 10-12%
2 Lá 1-2%
3 Thân 0,1-0,3%
4 Gốc <0,03%

Hàm lượng THC của các sản phẩm cần sa (cây, nhựa và dầu) là tỷ lệ của
khối lượng hoạt chất THC trên khối lượng của các phần của cây cần sa sử dụng.
Ví dụ như một nghiên cứu ở Thụy Sĩ năm 2006 cho thấy 2/3 vụ bắt giữ cây
cần sa có hàm lượng THC trong cây cần sa từ 2 – 12 %, 2/3 số vụ bắt giữ nhựa

9
cần sa có hàm lượng THC từ 4 – 21 %, tùy thuộc vào điều kiện và kỹ thuật canh
tác cụ thể, còn quá trình chiết nhựa và nụ hoa cần sa có thể cho ra sản phẩm dầu
cần sa có hàm lượng THC lên tới 60% [10].
1.1.5. Thời gian phát hiện và đối tượng phân tích đối với người sử dụng cần sa
Chưa có nghiên cứu nào chỉ ra thời gian chính xác để phát hiện mẫu dương
tính với người sử dụng cần sa, bởi nó phụ thuộc nhiều yếu tố như loại mẫu, độ
nhạy của thiết bị phát hiện, tần suất, liều lượng, thời gian sử dụng lần cuối cùng,
hệ thống tiêu hóa, di truyền, tình trạng trao đổi chất, hệ thống bài tiết của mỗi cá
nhân, đồng thời còn những yếu tố khác tác động vào như bệnh tật hay sử dụng
cùng lúc các loại ma túy khác. Dưới đây là thời gian gần đúng có thể phát hiện
trên một số loại mẫu sau khi lấy mẫu đối với người sử dụng cần sa [5].
Bảng 1.3. Thời gian phát hiện trên các đối tượng mẫu
Mẫu Nước tiểu Máu Tóc Nước bọt
Người sử dụng một lần 1-7 ngày 12-24 giờ

Không chắc
chắn
Không có giá
trị
Người sử dụng thường
xuyên
7-100 ngày

2-7 ngày Hàng tháng 0-24 giờ

Có thể kiểm tra huyết tương, nước bọt, mẫu tóc, hơi thở để phát hiện cần
sa trong cơ thể người sử dụng, tuy nhiên việc xét nghiệm nước tiểu được thực
hiện với chi phí rẻ hơn, việc lấy mẫu nhanh chóng, thời gian phát hiện lâu hơn và

xử lý mẫu cũng dễ dàng hơn so với mẫu máu, mẫu tóc, nước bọt và hơi thở. Vì
thế, lấy mẫu nước tiểu sẽ thuận lợi đối với điều kiện tại các phòng thí nghiệm
giám định Hóa học của các tỉnh thành trong cả nước cũng như Viện KHHS của
Bộ công an hiện nay.
Thời gian để phát hiện được cần sa trong nước tiểu phụ thuộc rất lớn vào
tần suất sử dụng, đối với những người sử dụng thường xuyên (trên một lần một
tuần), dạng chuyển hóa của THC là THC-COOH trong nước tiểu nồng độ có thể
đạt hàng trăm ng/ml [5].

10
Xét nghiệm nước tiểu có thể dựa trên sự phát hiện THC-COOH, một dạng
chuyển hóa của THC, nó là thành phần mang hoạt tính dược lý chính của cần sa.
Các nghiên cứu trên cơ thể người chỉ ra rằng, 80-90% tổng số THC được bài tiết
trong vòng 5 ngày, khoảng 20% trong nước tiểu và 65% trong phân [11]. Trong
huyết tương nồng độ THC cao nhất sau khi hút một liều thường rơi vào 2ng/ml
trong 4-6 giờ, và có thể phát hiện sau vài phút. Nước tiểu của người sử dụng cần
sa có chứa THC-COOH ở cả dạng tự do và dạng liên hợp với axit glucuronic.
THC có thể tích lũy trong mô mỡ, tạo ra nồng độ bài tiết cao hơn và thời
gian phát hiện lâu hơn. Nếu có tiền sử sử dụng cần sa, xét nghiệm nước tiểu với
người sử dụng bình thường có thể phát hiện sau khi sử dụng 2 tuần, và có thể lâu
hơn với người sử dụng kinh niên. Bất kể thí nghiệm nào cũng cần đo cả dạng tự
do và dạng chuyển hóa, bao gồm cả thủy phân để tăng độ nhạy của phép phân
tích.
Hoạt chất THC có thể hấp thu qua niêm mạc đường tiêu hóa, tuy nhiên tốc
độ chậm và thất thường, mức độ hấp thu thường chỉ đạt 6-20% qua đường tiêm
tĩnh mạch, 18% qua đường hút. Do đặc tính ưa mỡ cao nên THC có thể phân bố
rộng rãi trong toàn bộ cơ thể. THC chuyển hóa ở phổi nếu dùng bằng cách hút, ở
gan nếu uống. [4]
Mặc dù trong cần sa có trên 60 chất Cannabis được tìm thấy nhưng hoạt
chất chính tạo ra tác dụng của cần sa là THC, CNB và CBD. Để xác định việc sử

dụng cần sa, cần thiết phải kiểm tra dạng chưa chuyển hóa của các chất
cannabinoid chính là THC, CBN, CBD. Tuy nhiên lượng chất chưa chuyển hóa
này trong nước tiểu rất thấp, với THC chỉ khoảng 0,005-0,01% liều sử dụng, và
chỉ đào thải trong vòng vài giờ [4]. Bởi vậy hiện nay đối tượng giám định chủ
yếu là sản phẩm chuyển hóa của THC là 11-nor-9-cacboxyl-delta-9-
tetrahydrocannabinol (THC-COOH).
1.1.6. THC và sự chuyển hóa THC trong nước tiểu
1.1.6.1. Cấu tạo THC
- Công thức phân tử: C
21
H
30
O
2

11
- Công thức cấu tạo:

1.1.6.2. Tính chất vật lý THC
- Ở dạng tinh khiết, THC ở trạng thái rắn kết tinh khi lạnh, dạng nhớt và
dính khi ấm.
- Tan rất ít trong nước nhưng tan tốt trong hầu hết các dung môi hữu cơ.
- Khối lượng phân tử: M = 314,46 g/mol.
- Nhiệt độ sôi: 157
o
C
- Độ tan trong nước: 0,0028 mg/ml ở 20
o
C
1.1.6.3. Tính chất hóa học và sự chuyển hóa THC

THC tan nhiều trong hầu hết các dung môi hữu cơ, đặc biệt là chất béo và
rượu. THC không bền với nhiệt độ cao và ánh sáng, dễ cháy. Nó tác dụng với
oxoaxit hay axit cacboxylic tạo ra este và nước. Nó có thể bị oxy hóa thành
anđehit hoặc xeton dưới điều kiện khác nhau.
Khi sử dụng cần sa, hoạt chất chính trong cần sa là THC bị hấp thụ vào cơ
thể. THC chứa một nhóm –OH được chuyển hóa trong gan, qua quá trình hydro
hóa nhóm –CH
3
tạo thành THC-OH, thông qua quá trình oxy hóa một nhóm –OH
xúc tác bởi các enzyme Cytochrome P450 (CYPs) trong gan tạo thành THC-
COOH chứa một nhóm –COOH. Sau đó THC-COOH chứa 2 nguyên tử Hydro
linh động, tác dụng với axit glucuronic trong cơ thể người thành dạng muối của
axit glucuronic, và được thải ra ngoài bằng đường nước tiểu sau khi thận bài tiết.
Quá trình chuyển hóa được thể hiện qua sơ đồ sau:



12











Hình 1.3. Sơ đồ quá trình chuyển hóa THC trong nước tiểu

1.1.7. THC-COOH
THC-COOH được hình thành trong cơ thể do quá trình oxy hóa THC bởi
các enzyme của gan. Sau đó, tiếp tục chuyển hóa thành dạng glucuronic, tạo
thành một hợp chất tan được trong nước và có thể dễ dàng bài tiết trong cơ thể
người [13].
Công thức phân tử: C
21
H
28
O
4

Khối lượng phân tử: 344,445 g/mol
Công thức cấu tạo:

THC
THC-OH
THC-COOH
mono/diglucuronic

THC-COOH
Hydro hóa
Oxy hóa

13
Thời gian bán hủy: 5,2-6,2 ngày [8]
Do đặc điểm công thức cấu tạo có 2 nguyên tử H
+
linh động của nhóm –
OH và nhóm –COOH nên THC-COOH có các phản ứng hóa học đặc trưng của

nguyên tử H
+
.
1.2. Một số phương pháp phân tích THC-COOH
- Phương pháp sắc ký bản mỏng: Việc định tính các cấu tử dựa vào tỷ số
giữa độ di chuyển của chất so với độ di chuyển của dung môi trong cùng thời
gian chạy sắc ký. Sau đó, dựa vào diện tích pic trong mẫu để bán định lượng cấu
tử cần phân tích.
- Phân tích miễn dịch: Ưu điểm của phương pháp là không cần chiết và
làm sạch mẫu, thời gian phân tích nhanh và có thể áp dụng với một lượng mẫu
lớn. Các kháng thể sử dụng trong các kít thử thường có hoạt tính cao với sản
phẩm chuyển hóa THC-COOH, tuy nhiên còn có tác dụng chéo đối với các sản
phẩm chuyển hóa khác. Vì thế phương pháp này ít khi được sử dụng do tốn kém
và không tin cậy.
Hiện nay, phương pháp sử dụng thiết bị sắc ký khí và sắc ký lỏng được
dùng rộng rãi để phân tích THC cũng như THC-COOH vì có ưu điểm hiệu quả
tách tốt, độ nhạy và độ chính xác cao.
1.2.1. Phương pháp phân tích THC-COOH bằng sắc ký lỏng
Để phân tích THC-COOH trên thiết bị HPLC, các bước chuẩn bị, xử lý
mẫu cũng tương tự như đối với sắc ký khí được trình bày trong mục 1.2.2 phía
dưới. Tuy nhiên đối với phương pháp này, chúng ta không cần thực hiện giai
đoạn dẫn xuất mẫu. Vì với thiết bị HPLC có thể phân tích được cả các hợp chất
hữu cơ dễ bay hơi và khó bay hơi.
Sắc ký lỏng là kỹ thuật tách chất dựa trên cả hiện tượng vật lý và hóa học.
Trong quá trình sắc ký, trong cột sắc ký luôn xảy ra cân bằng động giữa pha tĩnh
và pha động, nghĩa là sự vận chuyển và phân bố chất tan luôn được lặp đi lặp lại
giữa hai pha. Chất phân tích được di chuyển từng lớp qua pha tĩnh từ đầu đến
cuối cột sắc ký theo pha động với dòng chảy liên tục, tốc độ và thành phần nhất

14

định, hay gradient. Do tính chất và cấu trúc của mỗi phân tử chất tan là khác nhau
nên tốc độ di chuyển của mỗi chất cũng khác nhau. Khi ở trong pha động, nó dịch
chuyển theo tốc độ của dòng pha động, còn khi ở trên pha tĩnh nó lại bị pha tĩnh
giữ lại trong một khoảng thời gian nhất định trong cột tách sắc ký, thời gian này
phụ thuộc vào bản chất sắc ký của cột pha tĩnh, cấu trúc và tính chất của mỗi chất
tan, đồng thời cũng phụ thuộc vào bản chất của thành phần pha động dung để rửa
giải chất tan ra khỏi cột sắc ký. Vì thế trong quá trình sắc ký có chất tan bị lưu
giữ lâu, có chất tan bị lưu giữ ít trên cột. Điều đó dẫn đến kết quả có quá trình
tách các chất xảy ra trên cột sắc ký.
Tùy theo tính chất và hàm lượng chất phân tích, trong sắc ký lỏng người ta
đưa ra một số phương pháp cơ bản sau:
- Sắc ký lỏng pha thường (NP-HPLC).
- Sắc ký lỏng pha đảo (RP-HPLC).
- Sắc ký trao đổi ion.
- Sắc ký rây phân tử.
- Sắc ký ái lực.
Mỗi phương pháp có đặc điểm riêng về pha tĩnh và pha động, detector
cũng như cách vận hành. [2]
Một số các nghiên cứu về phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng sắc
ký lỏng đã công bố:

15
Bảng 1.4. Một số nghiên cứu phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng sắc ký lỏng
STT

Tác nhân và nhiệt độ
thủy phân
Chiết
Thiết bị phân
tích
Nội chuẩn
LOD
(ng/ml)

LOQ
(ng/ml)
H
(%)
Khoảng
tuyến tính
(ng/ml)
1
[13]
β-glucuronidase ở
37
o
C/20 giờ
Pha rắn LC-MS-MS THC-COOH-d3 5 10 -
5-1000
(r=0,9996)
2

[6]
KOH 10M
50
o
C/20 phút
- HPLC - 10 - -

r=0,9995
3
[23]
β-glucuronidase/
arylsulfatase 37
o
C/5 giờ
Pha lỏng LC-MS-MS THC-COOH-d3 - - -
10-10000
(r=0,991)



16

Dưới đây là sắc ký đồ của THC-COOH được phân tích trên thiết bị sắc ký lỏng
khối phổ.

Hình 1.4. Sắc đồ của THC-
COOH
khi phân tích bằng LC- MS

Hình 1.5. Phổ khối của THC-COOH khi phân tích bằng LC-MS

17
1.2.2. Phương pháp phân tích THC-COOH bằng sắc ký khí
1.2.2.1. Thủy phân mẫu
Trên 80% lượng THC-COOH có trong nước tiểu dưới dạng liên hợp
glucuronic. Do vậy phải tiến hành thủy phân để tách gốc glucuronic ra khỏi THC-
COOH. Đối với mẫu cần sa, thủy phân trong môi trường kiềm cho hiệu quả cao
và ổn định hơn các phương pháp thủy phân trong môi trường axit và men.
1.2.2.2. Phương pháp chiết
Sau khi tiến hành thủy phân để tách THC-COOH ra khỏi dạng liên hợp của
nó với axit glucuronic, thì việc quan trọng tiếp theo là phải tách chúng ra khỏi
nước tiểu, hiệu quả tách càng cao đồng nghĩa với việc phân tích càng chính xác.
Có nhiều phương pháp tách chiết, tuy nhiên cần lựa chọn phương pháp sao cho
phù hợp với đối tượng mẫu, yêu cầu phân tích cũng như điều kiện phòng thí
nghiệm. Một số phương pháp phù hợp để chiết THC-COOH từ nước tiểu là chiết
lỏng-lỏng, chiết pha rắn, vi chiết pha rắn.
Quá trình tách trong chiết pha rắn cũng tương tự như chiết lỏng- lỏng và
phương pháp sắc ký, chủ yếu dựa trên định luật phân bố chất tan giữa hai pha
không trộn lẫn vào nhau. Chiết pha rắn thuận lợi hơn so với việc chiết pha lỏng,
nhưng trong đề tài này để phù hợp với điều kiện nghiên cứu tại nhiều phòng thí
nghiệm Kỹ thuật hình sự ở Công an các tỉnh thành trong cả nước, chúng tôi lựa
chọn chiết pha lỏng để tách THC-COOH ra khỏi nước tiểu.
1.2.2.3. Kỹ thuật dẫn xuất
Dẫn xuất: Kỹ thuật dẫn xuất hóa đóng vai trò quan trọng trong sắc ký khí
nhằm phân tích các chất khó bay hơi, đặc biệt là các hợp chất chứa một hoặc
nhiều nhóm chức, mà có khả năng hấp phụ đặc trưng gây ra sự giãn pic và làm
biến dạng pic, đặc biệt ở nồng độ thấp. Việc dẫn xuất hóa không chỉ tạo nên các
pic cân đối mà còn làm tăng độ phân giải, giúp định lượng chính xác. Các kiểu
dẫn xuất thường dùng là trialkyl silan hóa, este hóa, alkyl hóa…[1]
THCCOOH là hợp chất phân cực, chứa proton H

+
, nên sử dụng dẫn xuất
alkylsilyl là phù hợp. Trong quá trình dẫn xuất, phản ứng phải được thực hiện