Nghiên cứu quy trình xác định nhanh vi khuẩn lao và lao kháng thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ QUỐC PHÒNG

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC.10





BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI







TÊN ĐỀ TÀI
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH NHANH VI
KHUẨN LAO VÀ LAO KHÁNG THUỐC
BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ
Mã số: KC.10.15/06-10




Cơ quan chủ trì đề tài: Học viện Quân Y
Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Thái Sơn

8507

Hà Nội – 2010



BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ QUỐC PHÒNG
CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC.10




BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI


TÊN ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH NHANH
VI KHUẨN LAO VÀ LAO KHÁNG THUỐC
BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ
Mã số: KC.10.15/06-10

Chủ nhiệm đề tài/dự án: Cơ quan chủ trì đề tài/dự án:




TS. Nguyễn Thái Sơn PGS.TS. Hoàng Văn Lương

Ban chủ nhiệm chương trình Bộ Khoa học và Công nghệ







Hà Nội – 2010
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. VI KHUẨN LAO VÀ BỆNH LAO 3
1.1.1. Vi khuẩn lao 3
1.1.2. Bệnh lao 9
1.2. DỊCH TỄ PHÂN TỬ CỦA VI KHUẨN LAO VÀ LAO KHÁNG THUỐC 21
1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO 26
1.3.1. Các phương pháp truyền thống 26
1.3.2. Các phương pháp miễn dịch 28
1.3.3. Các phương pháp sinh học phân tử 29
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO KHÁNG
THUỐC 35
1.4.1. Phương pháp xác định kiểu hình 35
1.4.2. Phương pháp xác định kiểu gen 38
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PH
ƯƠNG PHÁP 47
2.1.
VẬT LIỆU 47
2.1.1. Các chủng vi khuẩn lao, mẫu bệnh phẩm và vector 47

2.1.2. Các primer và probe 48
2.1.3. Các hóa chất, nguyên liệu khác 49
2.1.4. Các môi trường, hoá chất sử dụng trong nuôi cấy và xác định vi khuẩn lao 50
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 51
2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử vi khuẩn lao và vi khuẩn lao
kháng thuốc 51
2.2.1.1. Thu thập, bảo quản các chủng vi khuẩn lao và mẫu bệnh phẩm 51
2.2.1.2. Phương pháp thuần nhất mẫu bệnh phẩm đờm 53
2.2.1.3. Nuôi cấy vi khuẩ
n lao 53
2.2.1.4. Phương pháp kháng sinh đồ xác định tính kháng thuốc 55
2.2.1.5. Tách chiết ADN vi khuẩn lao 56
2.2.1.6. Khuếch đại các đoạn gen đích bằng PCR 57
2.2.1.7. Phương pháp spoligotyping 59
2.2.1.8. Tách dòng gen rpoB và katG phục vụ cho giải trình tự 60
2.2.1.9. Phát hiện đột biến liên quan kháng đa thuốc bằng các phương pháp sinh
học phân tử 61
2.2.2. Xây dựng quy trình chẩn đoán phát hiện nhanh vi khuẩn lao và vi khuẩn lao
kháng thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử 62
2.2.2.1. Tạo panel mẫu chuẩn 63
2.2.2.2. Thiết kế các primer nhân các đoạn gen đích 63
2.2.2.3. Thiết kế probe phát hiện tính kháng thuốc 66
2.2.3. Tạo các bộ kit xác định nhanh các chủng vi khuẩn lao và lao kháng thuốc ở
Việt Nam 66
2.2.3.1. Tạo bộ kit multiplex PCR chẩn đoán nhanh vi khu
ẩn lao 66
2.2.3.2. Tạo bộ kit multiplex realtime PCR phát hiện nhanh vi khuẩn lao kháng đa
thuốc 69
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 71
3.1. ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ PHÂN TỬ VI KHUẨN LAO VÀ LAO KHÁNG

THUỐC 71
3.1.1. Thu thập các chủng vi khuẩn lao trên toàn quốc 71
3.1.2. Đặc điểm phân tử vi khuẩn lao ở Việt Nam 72
3.1.3. Đặc điểm phân typ vi khuẩn lao ở Việt Nam 76
3.1.3.1. Mô hình phân tử chủng lao khu vực miền Bắc (spoligotype) 77
3.1.3.2. Mô hình phân tử chủng lao khu vực miề
n Trung 79
3.1.3.3. Mô hình phân tử chủng lao khu vực miền Nam 81
3.1.4. Đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao kháng thuốc ở Việt Nam 83
3.1.4.1. Đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao nhạy cảm thuốc 83
3.1.4.2. Đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao kháng đơn thuốc 86
3.1.4.3. Đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao kháng đa thuốc 89
3.1.4.4. Đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao siêu kháng thuốc 91
3.1.5. Dịch tễ
học phân tử của vi khuẩn lao Việt Nam 92
3.1.5.1. Phân bố dòng theo khu vực nghiên cứu của vi khuẩn lao Việt Nam 92
3.1.5.2. Phân bố dòng theo đặc điểm kháng thuốc của vi khuẩn lao Việt Nam 95
3.1.5.3. Phân bố dòng theo đặc điểm kháng thuốc và theo khu vực của vi khuẩn
lao Việt Nam 97
3.1.5.4. Phân bố chủng lao Việt Nam theo tuổi và giới tính bệnh nhân và theo khu
vực 100
3.1.5.5. Phân bố chủng lao Việt Nam theo tuổi bệnh nhân và mức độ kháng thuốc 103
3.1.5.6. Mối liên quan giữa phân bố dòng vi khuẩn lao Việt Nam và tuổi bệnh
nhân 105
3.1.5.7. Mức độ kháng thuốc của vi khuẩn lao Việt Nam theo dòng 108
3.1.5.8. Mức độ kháng thuốc của vi khuẩn lao Việt Nam theo dòng và theo khu
vực 110
3.1.6. Đặc điểm đột biến ở các gen liên quan kháng thuốc của vi khuẩn lao ở Việt
Nam 111
3.1.6.1. Phát hiện đột biến trên gen katG 112

3.1.6.2. Phát hiện đột biến trên gen rpoB 117
3.2. XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN NHANH VI KHUẨN LAO VÀ
LAO KHÁNG THUỐ
C BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ 124
3.2.1. Xây dựng quy trình chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao 124
3.2.1.1. Xây dựng quy trình tách chiết ADN của vi khuẩn lao 124
3.2.1.2. Tạo panel mẫu chuẩn 127
3.2.1.3. Quy trình multiplexPCR chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao 129
3.2.2. Xây dựng quy trình chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao kháng thuốc 141
3.2.2.1. Quy trình chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc bằng giải trình tự ADN 141
3.2.2.2. Quy trình chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao kháng thuốc bằng realtime PCR 150
3.3. XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẾ TẠO CÁC BỘ KIT XÁC ĐỊNH
NHANH CÁC CHỦNG VI KHUẨN LAO VÀ LAO KHÁNG THUỐC Ở
VI
ỆT NAM 163
3.3.1. Xây dựng quy trình chế tạo bộ kit xác định nhanh vi khuẩn lao 163
3.3.1.1. Tạo master mix 163
3.3.1.2. Nghiên cứu thử nghiệm độ nhạy, độ đặc hiệu và ngưỡng phát hiện của
phản ứng multiplex PCR trên panel mẫu 163
3.3.1.3. Đánh giá hiệu quả chẩn đoán của kit mPCR trên mẫu bệnh phẩm lâm sàng 166
3.3.2. Kết quả chế tạo thử nghiệm kit multiplex PCR 171
3.3.3. Kiểm tra tính ổn định của kit multiplex PCR 172
3.3.4. Chứng nhận bảo hộ quyề
n sở hữu trí tuệ 175
3.3.5. Xây dựng quy trình và sản xuất kit chẩn đoán phát hiện nhanh vi khuẩn lao
kháng đa thuốc 176
3.3.5.1. Chế tạo thử nghiệm kit realtime PCR 176
3.3.5.2.
Nghiên cứu thử nghiệm, đánh giá kit realtime PCR trên panel mẫu chuẩn 178
CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN 183

4.1. Dịch tễ học phân tử vi khuẩn lao và lao kháng thuốc 183
4.2. Xây dựng được một số quy trình chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao và vi khuẩn
lao kháng thuốc 183
4.3. Chế tạo được một số bộ kit chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao và vi khuẩn lao
kháng thuốc 184
CÁC KẾT QUẢ KHÁC 184
KIẾN NGHỊ 184
TÀI LIỆU THAM KHẢO 185

1
MỞ ĐẦU
Lao là một bệnh truyền nhiễm và đã từng được Tổ chức y tế thế giới
(WHO) khuyến cáo về tình trạng khẩn cấp toàn cầu. Vi khuẩn lao
(Mycobacterium tuberculosis) hiện đang gây nhiễm cho khoảng 1/3 dân số thế
giới (hơn 2 tỷ người) và ước tính mỗi năm có khoảng 8 triệu trường hợp
nhiễm mới và 2 triệu người chết [70].
Việt Nam đứng thứ
12 trong số 22 quốc gia có gánh nặng bệnh nhân lao
cao trên thế giới. Một trong những nhân tố góp phần gia tăng bệnh lao là
những khó khăn trong quá trình chẩn đoán. Phát hiện nhanh vi khuẩn lao dựa
vào phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen các mẫu bệnh phẩm nghi lao, nhiều
trường hợp cho âm tính giả khi số lượng vi khuẩn lao ≤ 10
4
vi khuẩn/ml. Nuôi
cấy vi khuẩn lao được coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán nhưng trên môi
trường Lowenstein phải mất khoảng 4-8 tuần mới cho kết quả. Trên hệ thống
nuôi cấy cải tiến MGIT, BACTEC mất khoảng 2 tuần, nếu làm kháng sinh đồ
mất thêm ít nhất 2 tuần nữa, do vậy khó đáp ứng yêu cầu giám sát và thanh
toán bệnh lao [62]. Hiện nay, nhờ áp dụng các phương pháp sinh học phân tử
vào chẩn đoán vi khuẩn lao và vi khuẩn lao kháng thuốc, kh

ắc phục được đặc
điểm mọc rất chậm của vi khuẩn lao, rút ngắn thời gian chẩn đoán lao từ 4-8
tuần theo cách nuôi cấy tự nhiên xuống còn 2-4 ngày. Kỹ thuật sinh học phân
tử được sử dụng rộng rãi nhất là phản ứng PCR khuếch đại gen đích IS6110,
đây là một trình tự chèn (IS - Insertion Sequence) có nhiều bản copy (khoảng
4-20 bản copy) đặc hiệu cho chủng Mycobacterium tuberculosis complex.
Việt Nam hiện có một vài công ty xây dự
ng kít thương phẩm chẩn đoán vi
khuẩn lao sử dụng gen đích là IS 6110 như công ty Nam Khoa, Việt Á. Tuy
nhiên, một số nghiên cứu gần đây cho thấy có khoảng 5-8% chủng lao tại
Đông Nam châu Á, Việt Nam và Ấn Độ khuyết đoạn gen này trong bộ gen
[24] [27] [63] [37] [68], vì vậy một số xét nghiệm cho kết quả âm tính giả.
Nhằm khắc phục tình trạng trên, một số tác giả trên thế giới đề xuất sử dụng
mộ
t số gen đích khác trong PCR chẩn đoán vi khuẩn lao như IS1081; 23S
rDNA [24] [68] [62]. Nhưng cho đến nay chưa có tác giả nào trong nước đề
xuất hoặc công bố quy trình PCR mới cho chẩn đoán vi khuẩn lao ở Việt Nam.
Đặc biệt, tình hình kháng thuốc của vi khuẩn lao tại Việt Nam đang là
một vấn đề đáng lo ngại. Theo Chương trình Chống lao Quốc gia năm 2006,
2
tỷ lệ kháng thuốc tiên phát là 32,5% vào loại cao trên thế giới. Tỷ lệ kháng đa
thuốc chung là 4%, trong đó tỷ lệ đa kháng thuốc thứ phát là 19,3%, tỷ lệ đa
kháng thuốc tiên phát là 2,7%. Ước tính đến 2015, số ca tử vong do lao
khoảng 14.000 người. Trong đó kháng với rifampicin và isoniazid được quan
tâm nhất, vì đây là những kháng sinh chủ lực trong phác đồ điều trị lao. Việc
chẩn đoán và điều trị lao kháng thuốc gặp rất nhi
ều khó khăn, tốn kém cả về
vật chất, công sức và thời gian. Trên thế giới, một số kít thương phẩm chẩn
đoán nhanh vi khuẩn lao kháng thuốc như INNO-LIPA RMP TB kit (Bỉ);
Geno type MTB assay kit (Đức)… Tuy nhiên hiện nay chưa có dữ liệu đầy đủ

về đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao kháng đa thuốc ở Việt Nam nên không
có cơ sở để sử dụng kit này, hơn nữa giá thành các bộ kít thương mạ
i này
không phù hợp với điều kiện kinh tế Việt Nam. Hiện trong nước chưa có kit
thương phẩm chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc, do vậy việc nghiên cứu và
phát triển kit chẩn đoán lao và lao kháng thuốc ở Việt Nam là cần thiết.
Vì vậy, đề tài này được đặt ra nhằm vào các mục tiêu sau:
1. Đặc điểm dịch tễ học phân tử của vi khuẩn lao và vi khuẩn lao kháng
đa thuốc.
2. Xây dự
ng qui trình xác định nhanh các chủng vi khuẩn lao và lao
kháng thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử.
3. Xây dựng qui trình chế tạo các bộ kit xác định nhanh các chủng vi
khuẩn lao và lao kháng thuốc ở Việt Nam.

3
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. VI KHUẨN LAO VÀ BỆNH LAO
Bệnh lao là bệnh truyền nhiễm đã xuất hiện hàng nghìn năm nay, nhưng
phải đến ngày 24/3/1882 nhà bác học người Đức- Robert Koch lần đầu tiên
phát hiện ra vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) (vì vậy còn được gọi
là Bacilie de Kock- BK). Đây là một mốc quan trọng trong lịch sử y học bởi
đã tìm ra nguyên nhân của căn bệnh vô cùng nguy hiểm cho cả thế giới vào
thời điể
m đó. Sau này, ngày 24/3 hàng năm được lấy làm ngày phòng chống
lao trên toàn thế giới.
1.1.1. Vi khuẩn lao
1.1.1.1. Giới thiệu vi khuẩn lao
Vi khuẩn lao có tên khoa học là Mycobacterium tuberculosis. Thực chất
tác nhân gây bệnh lao là một phức hợp gồm nhiều loài được gọi chung là

Mycobacterium tuberculosis complex. Các loài trong phức hợp này là tác nhân
gây nên bệnh lao trên các vật chủ khác nhau. Khả năng gây bệnh của các loài
là khác nhau, trong đó loài gây bệnh thường xuyên trên người là
Mycobacterium tuberculosis.








Vi khuẩn lao trên kính hiển vi quang học Vi khuẩn lao trên kính hiển vi điện tử

Hình 1.1. Hình ảnh vi khuẩn lao
* Đặc điểm hình thể, cấu trúc
Vi khuẩn lao có hình trực mảnh, kích thước dài 2-4 µm, rộng 0,3-1,5 µm,
đứng riêng lẻ hoặc xếp thành hình chữ N, Y, V hoặc thành dãy phân nhánh
4
như cành cây. Tuy nhiên cũng tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy và thời gian
nuôi cấy mà vi khuẩn có kích thước và hình dạng thay đổi, từ cầu trực khuẩn
đến trực khuẩn dài [67].
Vi khuẩn không di động, không sinh bào tử, khó bắt màu các thuốc
nhuộm thông thường do có lớp sáp ở thành tế bào. Mycobacterium
tuberculosis được xếp vào nhóm vi khuẩn Gram dương, tuy nhiên khi nhuộm
Gram vi khuẩn bắt màu rất yếu hoặc không giữ được màu thuốc nhuộm.
Thường nhuộ
m theo phương pháp Ziehl - Neelsen, trực khuẩn lao không bị
cồn và acid làm mất màu của carbonfuchsin, bắt màu đỏ.
Trực khuẩn lao có cấu trúc rất phức tạp, hoàn hảo, ít vi sinh vật nào có

được. Dưới kính hiển vi điện tử trực khuẩn lao có cấu trúc như sau:
- Cấu trúc vách tế bào
Lớp vách của trực khuẩn có vai trò rất quan trọng. Cấu trúc của lớp này
ngoài đảm bảo cho sự tồn tại của trực khuẩn, làm cho trực khuẩ
n bền vững đối
với hiện tượng thực bào, khi xâm nhập vào cơ thể trực khuẩn lao khó bị tiêu
diệt, ảnh hưởng rất lớn đến khả năng gây bệnh của trực khuẩn [38].
Mycobacterium tuberculosis có cấu trúc vách tế bào phức tạp, chia thành
4 lớp, lớp trong cùng là cấu trúc màng có thành phần chủ yếu là các
phospholipid. Các phân tử phospholipid lại bao gồm hai nhóm, nhóm ưa nước
hướng về bên trong và nhóm kị nước hướng về bên ngoài, quay ra phía vỏ
.
Lớp tiếp theo là peptidoglican liên kết với đường arabinose và các phân tử
mycolic acid tạo nên một bộ khung định hình cho vi khuẩn đảm bảo cho vỏ vi
khuẩn có độ cứng nhất định. Lớp ngoài là lớp được tạo nên bởi sự liên kết
giữa các mycolic acid và các chất lipid phức tạp, đây là lớp tạo nên độc tính
của vi khuẩn lao và có cấu trúc làm tăng khả năng chống thấm nước của thành
vi khuẩn giúp trực khuẩn t
ồn tại lâu với môi trường bên ngoài, chống khả năng
bị huỷ diệt bởi đại thực bào và các tế bào miễn dịch. Lớp ngoài cùng có cấu
trúc peptidoglycolipid, đây là lớp chỉ thấy ở vi khuẩn lao phát triển bên trong
tế bào, nó có tác dụng tăng cường như một lớp áo giáp cho các vi khuẩn nằm
5
trong tế bào chống được các enzyme phân giải từ các lysozyme của tế bào.

Hình 1.2 Cấu trúc thành tế bào vi khuẩn lao

Cấu trúc khá hoàn hảo trên đây của lớp vỏ giúp cho trực khuẩn lao chống
lại được mọi yếu tố tác động của môi trường bên ngoài, chống lại được tác
động của acid và các chất kiềm ở một nồng độ nhất định.
- Bào tương
Trong bào tương có những hạt có thể có vai trò trong việc sinh ra thể
siêu lọc của trực khuẩn - kích thước nhỏ hơn trực khuẩn bình thường 20 l
ần.
Có thể đó là biến đổi của trực khuẩn khi gặp điều kiện không thuận lợi, như
khi điều trị thuốc chống lao kéo dài, trực khuẩn có thể biến đổi để thích ứng.
Một số tác giả đã nêu ra nhận xét: nếu trong đờm người bệnh có thể siêu lọc
của trực khuẩn lao thì tổn thương ở phổi thường lan tràn, có nhiều nốt loét và
b
ệnh kéo dài hơn các bệnh nhân khác.
- Hạt nhân
Hạt nhân chứa các acid nucleic, ở vi khuẩn lao việc thông tin di truyền
ngoài vai trò của thể nhiễm sắc (chromosom) còn có vai trò của plasmid nằm
ngoài nhiễm sắc thể. Có thể, thể nhiễm sắc của trực khuẩn đã chuyển một số
thông tin di truyền nào đó cho plasmid vì plasmid có kích thước phân tử nhỏ
hơn nó nên dễ truyền thông tin từ tế bào này sang tế bào khác. Như vậy, trong
6
cơ chế kháng thuốc của trực khuẩn lao ngoài nhiễm sắc thể, plasmid cũng
đóng vai trò quan trọng.
Ngoài thể siêu lọc như trên, trực khuẩn lao còn tồn tại dưới thể L. Đó là
các trực khuẩn lao mất một phần hoặc toàn bộ cấu trúc vỏ vi khuẩn, hạt nhân
biến đổi nhìn không rõ, bào tương thuần nhất, ít các hạt hơn trực khuẩn lao

thông thường, nhìn bề ngoài trên kính hiển vi điện tử
thể L có dạng hình cầu,
sinh sản theo kiểu nẩy chồi, không thể nuôi cấy ở môi trường thông thường.
Về mặt sinh học thể L chuyển hóa rất ít, hầu như không chịu tác dụng của các
thuốc chống lao. Thể L thực chất có thể là hình thức tồn tại của loại trực
khuẩn lao nằm vùng dai dẳng trong cơ thể, có vai trò quan trọng trong việc tái
phát bệnh lao. Theo dõi hình thể L có thể sẽ giúp cho công tác điề
u trị, có thể
dự đoán khả năng tái phát của bệnh.
* Đặc điểm nuôi cấy
Trực khuẩn lao là vi khuẩn ưa khí bắt buộc, không mọc được ở điều
kiện kị khí. Nhiệt độ thích hợp để mọc là 37
o
C. Hầu như không mọc ở nhiệt
độ dưới 37
o
C hoặc trên 42
o
C.
Trực khuẩn lao rất hiếu khí, phát triển tốt nhất khi pO
2
là 100 mmHg và
pCO
2
là 40 mmHg. Đỉnh phổi và vùng phổi dưới xương đòn hay mắc lao nhất
(pO
2
120-130 mmHg khi đứng) rồi đến thân xương và đầu xương (pO
2
là 100

mmHg). Gan lách, dạ dày, thực quản ít mắc lao hơn vì pO
2
thấp.
Không nuôi được vi khuẩn lao ở môi trường thông thường, phải nuôi ở
môi trường đặc biệt, giàu chất dinh dưỡng, chứa trứng, khoai tây, xitrat,
glixerol, asparagin, xanh malachit. Môi trường thường dùng là môi trường đặc
Loewenstein được cải tiến bởi Jensen, hoặc môi trường lỏng Sauton.
Trực khuẩn lao là vi khuẩn mọc chậm, thời gian một thế hệ của
Mycobacterium tuberculosis khoảng 18 giờ, phải 4-6 tuần sau mới hình thành
khuẩn lạc điển hình, dạng R. Trong
điều kiện tự nhiên vi khuẩn lao có thể tồn
tại 3 đến 4 tháng nơi tối ẩm, trong điều kiện phòng thí nghiệm người ta có thể
giữ và bảo quản chúng trong nhiều năm. Tuy nhiên dưới ánh sáng mặt trời
7
trực tiếp thì sau 30 phút vi khuẩn lao sẽ bị tiêu diệt. Dưới ánh sáng của tia cực
tím, vi khuẩn lao chỉ tồn tại được 2 đến 3 phút. ở nhiệt độ 42
o
C vi khuẩn lao
ngừng phát triển, ở nhiệt độ 80
o
C vi khuẩn lao chết sau 10 phút.
1.1.1.2. Đặc điểm hệ gen của vi khuẩn lao
Bộ gen hoàn chỉnh của Mycobacterium tuberculosis chủng H37Rv có
chiều dài 4.411.532 bp - bao gồm 3794 gen, trong đó có 3924 gen mã hóa cho
protein và 50 gen mã hóa cho các RNA chức năng; đây là genome có kích
thước rất lớn, đặc tính là chứa nhiều Guanine và Cystosine (G + C khoảng
65%) và không thay đổi hầu như trên toàn bộ genome (điều này khẳng định cho
giả thuyết rằng hầu như không có sự chuyển gen theo chiều ngang giữa các vi
khuẩn). Chỉ m
ột số rất ít các vùng có sự chênh lệch trong tỷ lệ G+C. Một nhóm

các gen đáng chú ý với tỷ lệ G+C cao (>80%) duy nhất trong vi khuẩn và thuộc
về họ protein PE và PPE. Những nhóm có G+C thấp (<50%) là các nhóm mã
hóa cho các protein xuyên màng hoặc mã hóa sự tổng hợp polypeptide. Sự khác
biệt này đối với tỷ lệ G+C thấp được giải thích là hậu quả của tính kỵ nước bắt
buộc của các acid amine - là điều cần thiết đối với mọi protein xuyên màng nào
được mã hóa b
ằng các đơn vị mã hóa có tỷ lệ G+C. Bộ gen của vi khuẩn lao có
chứa tới 90,8 % trình tự được dự đoán là có mã hóa cho protein và chỉ có 8 gen
giả (pseudogene - gen không mang thông tin di truyền mã hóa cho protein) [43].
Trong hệ gen của phần lớn các vi khuẩn thường có nhiều operon rRNA (operon
rrn) nằm gần vị trí khởi đầu tái bản. Tuy nhiên hệ gen của vi khuẩn lao chỉ có
duy nhất 1 operon rrn cách vị trí khởi đầu tái bản 1,5Mb. Điều này góp phần lý
giải về tốc
độ sinh trưởng rất chậm của vi khuẩn đặc biệt này [17].
Một trong những đặc tính được quan tâm nhiều nhất của Mycobacterium
tuberculosis là nghiên cứu sự có mặt và phân bố của các trình tự chèn (IS),
trong đó đặc biệt là đoạn IS6110. Thể gen của M. tuberculosis H37Rv có 16
bản sao IS6110 và 6 bản sao IS1081; tuy nhiên chỉ có 95% số chủng vi khuẩn
lao có chứa 4-20 bản sao IS6110. Bộ gen của Mycobacterium tuberculosis
thiếu hệ thống MutS có tác dụng sửa chữa các lỗ
i trong bắt cặp nucleotide. Tuy
8
nhiên sự tái bản ở vi khuẩn lao lại rất chính xác do sự có mặt của gần 45 gen
liên quan đến cơ chế sửa chữa DNA bao gồm cả 3 bản sao của gen mutT mã
hóa cho loại enzyme chịu trách nhiệm cho việc loại bỏ các Guanin bị oxy hóa
trong quá trình tái bản- nguyên nhân gây ra sự bắt cặp sai [32, 34].
1.1.1.3. Phân loại vi khuẩn lao
Trong hệ thống sinh giới, vi khuẩn lao được phân loại như sau:
Giới: Bacteria
Ngành: Actinobacteria

Lớp: Actinobacteria
Phân lớp: Actinobacteridae
Bộ
: Actinomycetales
Phân bộ: Corynebacterineae
Họ: Mycobacteriaceae
Giống: Mycobacterium
Loài: Mycobacterium tuberculosis
Các chủng vi khuẩn lao được chia làm 2 nhóm:
M. tuberculosis complex (MTBC) gồm 4 loài có khả năng gây bệnh lao:
- M. tuberculosis
- M. bovis
- M. africanum
- M. microti.
Trong đó M. tuberculosis gây bệnh phổ biến nhất.
Mycobacterium other than tuberculosis (MOTT) gồm nhiều loài không
gây bệnh lao ở người:
- M. avium
- M. ortuitum
- M. govdovac
- M. kansisii
9
1.1.2. Bệnh lao
Bệnh lao gắn liền với sự phát triển xã hội loài người từ hàng ngàn năm
nay. Trên thế giới, chưa bao giờ và không có một quốc gia nào, một khu vực
nào, một dân tộc nào không có người mắc bệnh lao và chết do lao. Bệnh lao
được phát hiện từ trước công nguyên ở Ấn Độ, Ai Cập, Hy Lạp và các nước
vùng Trung Á. Năm 1908, Mantoux dùng phương pháp tiêm tuberculin trong
da để phát hiện dị ứng lao. Cũng trong năm đó, Calmette và Guérin nghiên
cứ

u vaccine phòng lao và đã thành công vào năm 1921 (vaccine BCG-
Bacillus Calmette-Guérin). Đến năm 1944, Waksmann tìm ra kháng sinh chữa
lao đầu tiên là streptomycine, năm 1952, thuốc isoniazid được đưa vào điều trị
lao. Năm 1965, thuốc rifampicin được nghiên cứu thành công và năm 1978, cơ
chế và tác dụng của pyrazynamide được xác định. Những thuốc này cùng với
việc tiêm chủng phòng lao bằng vaccine BCG đã làm thay đổi được tình hình
lao trên thế giới.
Do sự phát minh các thuốc hóa học chống lao khiến việc chữa lao đơn
giản hơn và hiệ
u quả hơn, đồng thời đã phát sinh tâm trạng lạc quan của y
giới, đã làm lãng quên căn bệnh nguy hiểm này. Ngày nay, bệnh lao đang xuất
hiện trở lại và cùng với đại dịch HIV/AIDS trở thành một trong những căn
nguyên gây mắc bệnh và tử vong chủ yếu, đặc biệt tại các nước đang phát
triển.
Năm 1993, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã tuyên bố tình trạng khẩn cấ
p
toàn cầu của bệnh lao và mối hiểm hoạ của nó trong tương lai là bệnh lao kháng
thuốc.
1.1.2.1. Tình hình bệnh lao trên thế giới
Hiện nay, trên thế giới có khoảng 2,2 tỷ người đã nhiễm lao (chiếm 1/3
dân số thế giới). Theo số liệu công bố của WHO [73], ước tính trong năm
2006 có thêm khoảng 9,3 triệu người mắc lao mới và 2,4 triệu người chết do
lao. Khoảng 95% số bệnh nhân lao và 98% số người chết do lao ở các nướ
c có
thu nhập vừa và thấp, 75% số bệnh nhân lao cả nam và nữ ở độ tuổi lao động.
10
Trong đó, có khoảng 80% số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22 nước có gánh nặng
bệnh lao cao [6].
Hiện nay, tỷ lệ điều trị thành công trên toàn cầu đạt 85%, nhưng tỷ lệ phát
hiện chỉ đạt 44% số bệnh nhân ước tính. Như vậy, còn rất nhiều bệnh nhân lao

không được chữa trị đang tiếp tục lây bệnh cho cộng đồng, và theo ước tính của
WHO, mỗi năm có thêm 1% dân số thế giới b
ị nhiễm lao (65 triệu người) [73].
Hơn 33% số bệnh nhân lao toàn cầu tại khu vực Đông - Nam châu Á.
Cuối thập niên 70 đầu thập niên 80 ở một số nước phát triển đã tưởng như
chế ngự được hoàn toàn bệnh lao, do đó bệnh lao đã đi vào quá khứ bởi sự
lãng quên của các nhà y học và khoa học. Tuy nhiên thực tế lại không như vậy
bởi sự xuất hiện của cơ ch
ế kháng lại thuốc kháng sinh của khuẩn lao, khiến
cho việc phát hiện và điều trị ngày càng trở nên khó khăn và tốn kém.
Vì vậy bệnh lao vẫn tiếp tục là một trong ba căn bệnh truyền nhiễm
nguy hiểm nhất trên thế giới cùng với hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải
(AIDS) và sốt rét. Điều này đã một lần nữa khơi dậy các nghiên cứu sâu hơn
trong phương pháp phát hi
ện, chẩn đoán và điều trị bệnh lao. Bệnh lao là kết
quả của nghèo đói và nghèo đói lại là nguyên nhân làm cho bệnh lao phát
triển.
1.1.2.2. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam
Việt nam đứng thứ 12 trong 22 nước có số bệnh nhân lao cao trên toàn
cầu. Trong khu vực Tây - Thái Bình Dương, Việt nam đứng thứ ba sau Trung
quốc và Philippin về số lượng bệnh nhân lao lưu hành cũng như bệnh nhân lao
mới xuất hiện hàng năm [49]. Theo chương trình Chống lao Quố
c gia, mỗi
ngày có gần 400 người mắc bệnh lao, trong đó hơn 75% thuộc lứa tuổi lao
động, tỷ lệ tử vong do lao là 26/100.000 dân [10]. Chỉ số nguy cơ nhiễm lao
ước tính chung cả nước là 1,7%, miền Bắc 1,2%, miền Nam 2,2%. Tổng số
nhiễm lao ước tính khoảng 44% dân số. Số liệu điều tra dịch tễ học của
Chương trình chống lao quốc gia năm 2006 cho thấy tỉ lệ mắc lao mới các thể
là 173/100.000 dân, tỉ lệ lao AFB (+) là 77/100.000 dân, tỉ lệ hiện mắc lao các
11

thể là 225/100.000 dân, tỉ lệ tử vong do lao là 23/100.000 dân.
Năm 1995, trước những biến động xấu đi của tình hình dịch tễ bệnh lao
toàn cầu, công tác chống lao thực sự bắt đầu phải đối mặt với những thách
thức mới là bệnh lao kháng thuốc và Lao/HIV, Nhà nước và Bộ Y tế Việt nam
đã quyết định đưa Chương trình chống lao thành một trong những Chương
trình y tế Quốc gia trọng đi
ểm (Chương trình chống lao quốc gia - CTCLQG)
[7].
Năm 1996, Chương trình chống lao quốc gia với sự hỗ trợ về kỹ thuật
và tài chính của Chính phủ Hà Lan, Hiệp hội chống lao Hoàng gia Hà Lan, Uỷ
ban hợp tác y tế Hà Lan - Việt nam, CTCLQG đã hình thành và xây dựng kế
hoạch phòng chống lao giai đoạn 1996-2000. Đến năm 1999, chiến lược
DOTS (điều trị bằng hoá trị liệu ngắn ngày có kiểm soát trực tiếp) đã được
bao ph
ủ 100% số huyện trên cả nước.
Trong giai đoạn 1997-2002, CTCLQG đã phát hiện được 532.703 bệnh
nhân lao các thể, tỷ lệ phát hiện đạt 82% số bệnh nhân ước tính (so với mục
tiêu của WHO là 70%), CTCLQG đã điều trị 260.698 bệnh nhân lao phổi
AFB(+) với tỷ lệ khỏi là 92%.
Năm 2002, khu vực Tây-Thái Bình Dương phát hiện 806.460 bệnh nhân
lao các thể, 372.220 bệnh nhân lao phổi AFB (+) mới. Trong đó, số bệnh nhân
do CTCLQG Việt nam phát hiện chiếm 12% b
ệnh nhân các thể và 15% số
bệnh nhân lao phổi AFB (+) mới.
Với những kết quả đạt được trong chỉ tiêu phát hiện và điều trị bệnh
nhân, năm 1996, Việt nam là nước đầu tiên ở Châu Á đã đạt được mục tiêu
của WHO. Việt nam đã được WHO và Ngân hàng thế giới đánh giá cao thành
tích đạt được trong mọi hoạt động chống lao. Từ năm 1997, WHO và Hiệp hội
Bài lao và Bệnh phổi Quốc tế
cùng phối hợp với CTCLQG Việt Nam tổ chức

8 khoá học về quản lý Chương trình chống lao cho các học viên quốc tế tại
Việt Nam. Mô hình hoạt động chống lao ở Việt nam được xem là mô hình để
học viên các nước học tập.
12
Hiện nay nguy cơ nhiễm lao hàng năm ở nước ta ước tính là 1,5% (ở các
tỉnh phía Nam là 2%, ở các tỉnh phía Bắc là 1%).
Trên thực tế có thể chỉ số nguy cơ nhiễm lao hàng năm có thể cao hơn
1,5% như vậy các con số nêu trên có thể còn lớn hơn. Điều đó sẽ tăng thêm sự
khó khăn đối với công tác chống lao không những trong những năm tới mà có
thể còn trong thời gian khá dài, ngay cả khi đã bước sang thiên niên k
ỷ mới.
1.1.2.3. Bệnh lao kháng thuốc và cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao
* Bệnh lao kháng thuốc
Vi khuẩn lao kháng thuốc đang là một trở ngại lớn đối với công tác
phòng chống lao toàn cầu. Theo thông báo của WHO năm 2007 [71, 73], tỷ lệ
lao kháng đa thuốc là 4,8%. Tỷ lệ lao kháng thuốc tiên phát với ít nhất 1 loại
thuốc là 17% (từ 0% đến 56,3%), kháng isoniazid là 10,3%, kháng đa thuốc
thay đổi từ 0% đến 22,3%. Trường hợp kháng thuốc thứ phát: kháng ít nhấ
t 1
loại thuốc là 35%, kháng isoniazid là 27,7%, tỷ lệ kháng đa thuốc là 15,3%, tỷ
lệ kháng đa thuốc mở rộng là 7,0%. Tại Uzbekistan tỷ lệ đa kháng thuốc lên
đến 60,0%, Azerbaijan là 55,8%. Trung Quốc, Ấn Độ, Liên bang Nga là
những nước có tỷ lệ lao kháng thuốc lớn nhất. Hiện nay 69 nước và vùng lãnh
thổ được xác định là xảy ra lao kháng đa thuốc, và 45 nước xuất hiện lao
kháng đa thuốc mở rộng. Theo ước tính của WHO, tỷ lệ lao kháng
đa thuốc
mở rộng tăng từ 1 triệu ca đến 1,5 triệu ca trong khoảng thời gian từ 2-3 năm.
Vi khuẩn lao kháng đa thuốc đang là một thách thức lớn cho toàn cầu. Trong
khi thuốc chống lao hàng đầu chỉ có 5 thuốc, thì thuốc chống lao loại hai
thường có độc tính cao và giá thành rất đắt. Những người mắc bệnh lao với

chủng vi khuẩn kháng đa thuốc mở rộng cần phải điều tr
ị trên 2 năm so với từ
6-8 tháng trước đây và chi phí điều trị cũng tăng lên gấp 100 lần.
Tại Việt Nam, theo CTCLQG năm 2006, tình hình kháng thuốc của vi
khuẩn lao tại Việt Nam đang là một vấn đề đáng lo ngại, tỷ lệ kháng thuốc tiên
phát là 30,7% vào loại cao trên thế giới. Tỷ lệ kháng đa thuốc chung là 4%,
13
trong đó tỷ lệ đa kháng thuốc thứ phát là 19.3%, tỷ lệ đa kháng thuốc tiên phát
là 2,7%. Ước tính đến 2015, số ca tử vong do lao khoảng 14.000 [73].
Thuốc kháng sinh đầu tiên dùng để điều trị lao là streptomycin, nhưng
sau vài năm sau khi kháng sinh này được sử dụng thì người ta đã nhận thấy
hiện tượng đề kháng lại streptomycin của vi khuẩn lao. Sau đó các kháng sinh
chống lao khác tiếp tục ra đời: para - aminosalysilic, isoniazid, rifampicin,…
nhưng đều không mang lại hiệu quả
sau một thời gian điều trị nhất định. Khả
năng điều trị thành công có thể đạt 95 - 100 % đối với những bệnh nhân mắc
lao thông thường, trong khi tỷ lệ thành công với bệnh nhân mắc lao kháng
thuốc là 20 - 30 %, thậm chí còn không điều trị được khi mắc lao kháng đa
thuốc và kháng thuốc phổ rộng mặc dù đã dùng kết hợp đến năm loại kháng
sinh điều trị lao. Vì vậ
y, việc phát hiện và ngăn chặn sự lan truyền các chủng
lao đa kháng thuốc là vấn đề quan trọng nhất trong điều trị lao hiện nay.
Tính kháng thuốc của vi khuẩn lao được định nghĩa là sự giảm mức
mẫn cảm của Mycobacterium tuberculosis trong in vitro làm cho chúng có sự
khác biệt với các chủng dại chưa bao giờ tiếp xúc với thuốc kháng sinh. Trong
các trường hợp lao kháng thuốc cần phải phân biệt:
Lao kháng thu
ốc là những trường hợp vi khuẩn lao kháng với một
trong những thuốc chống lao dòng thứ nhất: isoniazid, rifampin,
pyrazinamide, ethambutol hoặc streptomycin.

- Lao kháng đa thuốc (MDR-TB): là vi khuẩn lao kháng ít nhất với cả 2
loại thuốc là isoniazid và rifampicin, đây là 2 loại thuốc chống lao dòng thứ
nhất thường được sử dụng đầu tay để điều trị cho tất cả các bệnh nhân, và có
thể kháng thêm một số tác nhân hoá trị liệu khác.
- Lao đa kháng thu
ốc phổ rộng (XDR-TB): là sự đề kháng với isoniazid
và rifampin cộng với fluoroquinolone và ít nhất 1 trong số 3 thuốc chống lao
dòng thứ hai dùng đường tiêm (amikacin, kanamycin hoặc capreomycin).
Kháng thuốc tiên phát là kháng thuốc xẩy ra ở một bệnh nhân trước đó
chưa sử dụng một liệu pháp điều trị chống lao nào, còn kháng thuốc thứ phát
14
là sự phát triển của kháng thuốc trong hoặc sau liệu pháp điều trị bằng hoá
chất. Kháng thuốc tự nhiên là tính kháng thuốc của các chủng kiểu dại với các
thuốc đặc hiệu. Ví dụ: tất cả các chủng M. bovis kiểu dại đều có tính kháng
thuốc tự nhiên với pyrazinamide, Mycobacterium tuberculosis có tính kháng
tự nhiên với penicillin.
* Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao
Tính kháng thuốc của vi khuẩn lao là một sự khuế
ch đại nhân tạo của
một hiện tượng tự nhiên liên quan đến sự phát sinh các đột biến một cách ngẫu
nhiên ở các gen nằm trong vùng nhân của tế bào vi khuẩn. Không giống với
nhiều vi khuẩn khác, vi khuẩn lao không có sự chuyển gen kháng thuốc giữa
các vi khuẩn thông qua các gen nhảy hoặc plasmid, Các chủng vi khuẩn lao
kiểu dại không tiếp xúc với các thuốc chống lao sẽ không bao giờ xuất hiện
tính kháng thuốc ngoại trừ tính kháng thuốc tự nhiên c
ủa các loài vi khuẩn với
một số thuốc như M. bovis kháng pyrazinamide, M. tuberculosis kháng
penicillin,
Trong quá trình nhân lên của trực khuẩn lao, tính kháng thuốc được phát
triển theo những trật tự xác định. Trong mỗi ổ lao thường có khoảng 107 tế bào

trở lên trong khi đó tần số xuất hiện đột biến liên quan đến tính kháng isoniazid
của vi khuẩn lao khoảng 10-7 đến 10-9 còn tần số đột biến kháng rifampicin là
khoảng 10-10. Tính kháng thuốc do sự phát sinh ngẫu nhiên các đột biến liên
quan này được gọi là tính kháng di truyền . Khi không có mặt của thuốc kháng
sinh, các chủng vi khuẩn lao mẫn cảm thuốc phát triển lấn át các chủng kháng
thuốc. Sự có mặt của thuốc kháng sinh trong điều trị đã cung cấp một áp lực chọn
lọc cho các chủng vi khuẩn lao. Các chủng mẫn cảm bị ức chế sinh trưởng, thậm
chí bị tiêu diệt, các chủng kháng thuốc trở thành ưu thế hình thành tính kháng
thuốc thu được, đặ
c biệt là trong các bệnh nhân có chứa một lượng lớn trực
khuẩn lao. Sự lây lan của các chủng kháng thuốc này sang những người khác làm
cho những người này bị nhiễm vi khuẩn lao kháng thuốc ngay từ đầu (tính kháng
thuốc sơ cấp).
15
Tính kháng nhiều loại thuốc khác nhau của vi khuẩn liên quan đến sự có
mặt đồng thời các đột biến ở các gen đặc hiệu. Ví dụ, tính kháng isoniazid của
vi khuẩn lao có tần số là từ 10
-7
đến 10
-9
, sự xuất hiện các đột biến liên quan
đến tính kháng rifampicin có tần số khoảng 10
-10
, và sự xuất hiện các đồng
thời các đột biến liên quan đến tính kháng cả 2 loại thuốc này có tần số
khoảng 10
-14
. Tuy nhiên, trong một quần thể vi khuẩn chỉ kháng isoniazid, các
đột biến ngẫu nhiên phát sinh có thể dẫn đến tính kháng rifampcin ở một vài cá
thể. Khi bệnh nhân được điều trị bằng tổ hợp isoniazid và rifampicin, các chủng

kháng cả 2 loại thuốc này sẽ được chọn lọc phát triển ưu thế. Tương tự như vậy,
sự xuất hiện của các đột biến có thể dẫn đến tính kháng tổ hợp các loạ
i thuốc
kháng sinh khác ở vi khuẩn lao.


Hình 1.3 Cơ chế phát triển tính kháng thuốc ở vi khuẩn lao (WHO, 1996)



16
Bảng 1.1. Vị trí các gen liên quan đến kháng thuốc ở MTB (Multidrug-resistance)
Thuốc Gen Sản phẩm Tỷ lệ gặp ở các
chủng kháng (%)
Rifampicin
rpoB B-subunit of RNA polymerase >95
Isoniazid
katG
oxyR-ahpC
Catalase-peroxidase
Alky hydro-reductase
60-70
~20
INH-
Ethionamide
inhA Enoyl-ACP reductase <10
Streptomycin
rpsL
rrs
Ribosomal protein S12

16s rRNA
60
<10
Fluoroquinolone
gyrA DNA gyrase >90
Pyrazinamide
pncA Amidase 70-100
Ethambutol
emb CAB EmbCAB 69

- Kháng rifampicin: Rifampicin (RIF) được đưa vào sử dụng trong điều
trị chống lao vào đầu những năm 1970 và là một thành phần rất quan trọng
trong điều trị. Cơ chế tác động của RIF liên quan đến ức chế enzyme RNA
polymerase phụ thuộc DNA, enzyme này là một phức oligomer bao gồm 4
tiểu đơn vị khác nhau (a, b, b9), và được mã hoá bởi các gen rpoA, rpoB,
rpoC, rpoD) có thể xẩy ra một trong hai dạng là core enzyme (a2bb9) và
holoenzyme (a2bb9 plus s).
RIF gắn với tiểu đơn v
ị b của RNA polymerase (rpoB), enzyme chịu
trách nhiệm cho sao chép và biểu hiện của các gen ở mycobacteria, kết quả là
ức chế hoạt động sao chép của vi khuẩn.
Chẩn đoán phân tử của tính kháng rifampin là phù hợp nhất vì các
nghiên cứu chỉ ra rằng tính kháng thuốc là do đột biến ở vùng lõi của gen
rpoB. Các phương pháp phân tử đã được tận dụng bao gồm đọc trình tự tự
động trực tiếp vùng đích đã được khuếch đạ
i của gen rpoB. Khuếch đại vùng
đích bằng PCR tiếp đó là bằng phân tích tính đa hình các sợi đơn (SSCP) và
thử nghiệm có thể thương mại hoá dựa trên khuếch đại vùng đích bằng PCR
sau đó lai mẫu dò thẳng với các đầu dò oligonucleotide (INNO-LiPA Rif. TB
17

kit, Innogenetics, Zwijnaarde, Belgium). Dữ liệu từ một số nghiên cứu chỉ ra
rằng khoảng 95% chủng M. tuberculosis lâm sàng kháng rifampin mang các
đột biến điểm riêng biệt hoặc các đột biến thêm đoạn, mất đoạn định vị trong
vùng lõi 81 bp (vùng xác định tính kháng rifampin) của rpoB (các codon 507
đến 533) mã hoá cho 27 acid amin. Đây là mối tương quan chặt chẽ của sự
thay thế acid amin đặc biệt và nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc. Các
đột biến mất nghĩa tiêu biểu ở codon 516/ 526/531 cho kết quả kháng rifampin
ở mức cao trong khi đó những sự thay đổi acid amin ở vị trí 514 hoặc 533
thường cho kết quả kháng rifampin ở mức thấp. Các nghiên cứu trước đó chỉ
ra rằng 45% các chủng có các đột biến mất nghĩa ở codon 531 (S531) trong
khi 35% các chủng kháng thuốc có sự thay đổi codon 526 (H526) dẫn đến
thay thế acid amin. Các đột biến này không có trong các sinh vật mẫn cảm.
Tuy nhiên, các nghiên cứu cụ th
ể hơn được tiến hành từ các vùng khác nhau
trên thế giới đã chỉ ra rằng tần số của các đột biến đặc biệt thay đổi đáng kể
giữa các cộng đồng dân tộc và các vùng địa lý. Tuy nhiên cơ chế kháng thuốc
chưa được xác định ở gần 5% các chủng lâm sàng kháng rifampin khi không
có đột biến nào được phát hiện ở vùng lõi 81 bp hoặc ở đâu đó trong gen rpoB
khi những chủng này được xác nhận tính kháng rifampin bở
i xét nghiệm tính
mẫn cảm chuẩn, điều này cho thấy một phần nhỏ của các chủng kháng
rifampin sẽ không được phát hiện bởi các phương pháp phân tử so với thử
nghiệm tính mẫn cảm thuốc kiểu hình thông thường.
- Kháng isoniazid: Isoniazid là một thuốc tổng hợp, cơ bản được sử dụng
chủ yếu để điều trị nhiễm các thành viên M. tuberculosis complex (M.
tuberculosis, M. bovis,
M. africanum và M. microti) như là tất cả mycobacteria
khác và các prokaryote khác kháng với isoniazide. Các chủng mẫn cảm của M.
tuberculosis có MIC nhỏ hơn 0.05 mg/ml. Cơ sở phân tử của tính kháng với
isoniazid phức tạp hơn và được gây ra bởi đa dạng đột biến trong 4 gen khác

nhau của M. tuberculosis, katG mã hoá catalase peroxidase, inhA mã hoá
enoyl acyl carrier protein (ACP) reductase, kasA mã hoá cho b-ketoacyl A C
18
P synthase và ahpC mã hoá cho alkylhydroperoxide reductase. Mặc dù thế,
gần 5-10% các chủng M. tuberculosis kháng isoniazid không có một đột biến
có thể xác định. Tính kháng isoniazid ở mức cao có liên quan đến lâm sàng
chủ yếu là do các đột biến thêm đoạn/ mất đoạn hoặc các đột biến nhầm nghĩa/
vô nghĩa bên trong gen katG. Đối với sự đề kháng INH, đột biến trên gen katG
hay gặp nhất ở vị trí 315 [12, 64]. Sự thay thế Ser315Thr xảy ra ở khoảng 30-
60% ch
ủng kháng sự thay thế này trong gen katG đã chỉ ra trực tiếp là dẫn tới
tính kháng cao với isoniazid. Đột biến S315T được đi kèm bởi sự mất đi vị trí
enzyme giới hạn ở vị trí này. Do đó đột biến nhầm nghĩa có thể được phát hiện
dễ dàng bằng phân tích giới hạn các đoạn được khuếch đại (PCR-RFLP). Sự
kiện và tính lan truyền của đột biến này trong các chủng M. tuberculosis lâm
sàng kháng isoniazid thay
đổi đáng kể phụ thuộc vào vùng địa lý và thành
phần dân tộc của những cá nhân bị nhiễm. Do đó sàng lọc sự thay đổi di
truyền này trong gen katG có thể cung cấp một phương pháp sàng lọc nhanh
cho việc phát hiện các chủng lao M. tuberculosis kháng isoniazid, cung cấp
tính lan rộng cao của đột biến đặc biệt có thể được thiết lập từ một vùng địa lý
xác định.
Đột biến thay thế S315T trên gen katG cũng thường đ
i kèm với biểu hiện
của protein alkyl hydroperoxide reductase (ahpC). Sự biến đổi của 5
nucleotide khác đã được xác định ở vùng promoter của gen ahpC, dẫn tới
bieur hiện quá mức của ahpC và đề kháng INH.
Đột biến xảy ra trên gen inhA sẽ dẫn tới kháng ngay từ đầu với INH và
ethionamide (ETH) [13]. Sáu vị trí đột biến trong cấu trúc của gen inhA liên
quan đến kháng INH đã được xác định là Ile16Thr, Ile21Thr, Ile21Val,

Ile47Thr, Val78Ala and Ile95Pro) [14, 52]. Tuy nhiên các đột biến này ít gặp.
Các nghiên cứu cũng cho thấy khoả
ng 70-80% các chủng lâm sàng kháng INH
có sự đột biến ở gen katG và inhA [51].
Đột biến xảy ra trên gen kasA dẫn tới sự đề kháng yếu với INH, mà
thường gặp ở các vị trí codon 66 (GAT-AAT), codon 269 (GGT-AGT), codon
19
312 (GGC-AGC) and codon 413 (TTC-TTA) [51] [46]. Tuy nhiên các đột
biến này cũng được tìm thấy trên các chủng nhạy cảm với INH [40].
- Kháng Pyrazinamide: Pyrazinamide là một chất cấu trúc tương tự
nicotinamide được sử dụng như một thuốc chống lao cơ bản. Thuốc này được
đòi hỏi để giết chết những mycobacteria nửa tiềm tàng trong môi trường acid
cũng như trong phagolysosomes. Pyrazinamide được chuyển thành acid
pyrazinoic là dạng thuốc hoạt động, bởi enzym của mycobactera là
pyrazinamidase được mã hoá bởi gen pncA và các chủng M. tuberculosis
kháng pyrazinamide thiếu hoạt tính của enzyme.
Sự đề kháng với kháng sinh này được cho là có đột biến trên gen pncA.
Các chủng M. tuberculosis lâm sàng mẫn cảm được tìm ra để có trình tự kiểu
dại xác định trong khi 75 -95% các chủng kháng pyrazinamide có một đột
biến điểm (nhầm nghĩa/ vô nghĩa hoặc đột biến mất đoạn hoặc thêm đoạn) trải
ra toàn bộ chiều dài của gen
pncA. Sự đa dạng của các đột biến làm cho nó
không chắc chắn là một phương pháp phân tử phù hợp có thể được đặt ra cho
việc phát hiện nhanh tính kháng pyrazinamide ở các chủng M. tuberculosis
lâm sàng. Thiếu các đột biến pncA lên đến 25% các chủng lâm sàng trong một
số nghiên cứu chỉ ra sự tồn tại ít nhất một gen thêm vào tham gia vào tính
kháng pyrazinamide. Người ta cũng thấy rằng không phải tất cả các chủng có
đột biến đều liên quan đến kháng PZA và các ch
ủng kháng PZA còn liên quan
đến các cơ chế khác.

- Streptomycin: Streptomycin là một kháng sinh aminoglycoside được sử
dụng như một thuốc cơ bản để điều trị lao. Thuốc gắn với 16S rRNA ức chế
khởi đầu dịch mã và ảnh hưởng đến tính chính xác của dịch mã trong quá trình
tổng hợp protein. Đột biến liên quan đến tính kháng streptomycin ở M.
tuberculosis đã được xác định trong gen 16S rRNA (rrs) và gen rpsL mã hoá
cho protein S12 của ribosome. Từ đó genom của
M. tuberculosis có một bản
copy gen đơn bản của gen rrn, những thay đổi nucleotide đơn lẻ có thể tiềm ẩn
sinh ra tính kháng với kháng sinh. Các đột biến điểm xảy ra ở 65–67% các