Nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam Pangasius hypophthalmus bằng kỹ thuật lamp (Loop-mediated isothermal amplification)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NÔI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
o0o


TRẦN THỊ THANH HUYỀN



NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH
GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA VIỆT NAM
Pangasius hypophthalmus BẰNG KỸ THUẬT LAMP
(Loop - mediated isothermal amplification)



LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC




H NI – 2013




ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NÔI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
o0o

TRẦN THỊ THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH
GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA VIỆT NAM
Pangasius hypophthalmus BẰNG KỸ THUẬT LAMP
(Loop - mediated isothermal amplification)

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC
MÃ SỐ: 62.42.40.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
1. GS. TS. TRƯƠNG NAM HẢI
2. PGS. TS. KIỀU HỮU ẢNH

H NI - 2013




LỜI CẢM ƠN
Trước tiên tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu, phòng Đào
tạo Sau Đại học, Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh học, Bộ môn Vi sinh vật học và các thầy cô
trong Khoa Sinh học nơi đã đào tạo, dạy dỗ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn
thành tốt quá trình học tập của mình.
Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS. TS. Trương Nam Hải - Viện Trưởng

Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam là người hướng dẫn chính
của tôi trong nghiên cứu này. GS định hướng nghiên cứu, tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có
cơ hội tiếp cận với các khía cảnh mới của công nghệ sinh học và hoàn thành tốt luận án của
mình, đồng thời luôn luôn động viên, khích lệ tôi trong công việc. Tôi xin được bày tỏ lòng
biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Kiều Hữu Ảnh là người đồng hướng dẫn của tôi. PGS đã là
người chỉ đường, định hướng cho tôi không chỉ trong công việc chuyên môn mà truyền tải cho
tôi nhiều kinh nghiệm quý báu trong cuộc sống của mình
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS. Nguyễn Thị Trung – Phòng Kỹ
thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học người đã cận kề cùng tôi trong công việc và dành
nhiều thời gian thảo luận các phương pháp nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành được luận án
của mình. Đồng thời, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn đến các cán bộ Phòng Kỹ thuật di
truyền, Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình dạy dỗ, chỉ bảo, hướng dẫn cho tôi từ những
ngày đầu làm việc nơi đây cho đến khi tôi hoàn thành toàn bộ kết quả luận án. Tôi xin bày tỏ
lòng biết ơn đến TS. Bùi Thị Việt Hà – Chủ nhiệm bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học,
Trường Đại học Khoa học tự nhiên đã tạo điều kiện về mặt thời gian cho tôi trong thời gian
làm luận án.
Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng tri ân sâu sắc tới Bố-Mẹ tôi, người đã nuôi dưỡng
và dạy dỗ tôi, Chồng và con là chỗ dựa tinh thần và nguồn động viên để tôi có đủ nghị lực để
hoàn thành nhiệm vụ của mình.

Hà nội, ngày 15 tháng 9 năm 2013
TRẦN THỊ THANH HUYỀN




LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của một tập thể mà tôi là thành viên chính thức
thực hiện các nghiên cứu. Các số liệu và kết quả thí nghiệm được trình bày trong luận án là trung thực

và không trùng lặp với bất kỳ công trình nào khác.


NGHIÊN CỨU SINH


Trần Thị Thanh Huyền









MC LC
Trang
Trang phụ bìa

Lời cảm ơn

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

MỞ ĐẦU
1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
6
1.1. CÁ TRA VÀ BỆNH GAN THẬN MỦ
6
1.1.1. Cá tra Pangasianodon hypophthalmus
6
1.1.2. Bệnh gan mủ thận
9
1.1.2.1. Tác nhân gây bệnh
9
1.1.2.2. Đường lây truyền
11
1.1.2.3. Triệu chứng bệnh
12
1.1.2.4. Bệnh tích
13
1.1.2.5. Khả năng bùng phát bệnh
16
1.1.2.6. Điều trị bệnh
16
1.2. VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri
18

1.2.1. Đặc điểm sinh học
18
1.2.2. Đặc điểm hệ gen
23
1.2.3. Độc tố gây bệnh và gen mã hóa độc tố gây bệnh
24
1.3. TÌNH HÌNH BỆNH DỊCH
24
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN Edwarsiella ictaluri
28
1.4.1. Phương pháp vi sinh và hóa sinh
28
1.4.2. Phương pháp sinh học phân tử
29
1.5. KỸ THUẬT LAMP (Loop- mediated isothermal amplifications)
30
1.5.1. Giới thiệu về kỹ thuật LAMP
32
1.5.2. Nguyên lý thiết kế mồi cho phản ứng LAMP
33
1.5.3. Cơ chế khuếch đại của phản ứng LAMP
35
1.5.4. Các phương thức phát hiện sự khuếch đại của phản ứng
LAMP
38
1.5.4.1. Điện di trên gel agarose
38
1.5.4.2. Phát hiện dựa vào chất phát huỳnh quang
39
1.5.4.3. Phát hiện dựa vào sản phẩm phụ của phản ứng

40
1.5.5. Ưu điểm của phương pháp LAMP
42
1.5.6. Các hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật LAMP tại Việt
Nam
43
Chương 2. NGUYÊN LIỆU V PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
46




2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ MÁY MÓC
46
2.1.1. Vật liệu
46
2.1.2. Hóa chất và máy móc thiết bị
47
2.2. PHƯƠNG PHÁP
48
2.2.1. Phương pháp vi sinh và hóa sinh
49
2.2.2. Các phương pháp sinh học phân tử
51
2.2.2.1. Tách chiết DNA từ vi khuẩn
51
2.2.2.2. Tách chiết DNA plasmid từ tế bào E. coli
51
2.2.2.3. Điện di DNA trên gel agarose
52

2.2.2.4. Thiết kế và tổng hợp các cặp mồi
53
2.2.2.5. Kĩ thuật PCR và LAMP
55
2.2.2.6. Phản ứng cắt DNA plasmid bằng enzym hạn chế
56
2.2.2.7. Ghép nối các đoạn DNA
57
2.2.2.8. Biến nạp DNA plasmid
58
2.2.2.9. Chọn lọc các thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp
59
2.2.2.10. Tinh sạch sản phẩm DNA plasmid bằng QIAGEN kit
59
2.2.2.11. Xác định trình tự nucleic acid
60
2.2.3. Tối ưu các điều kiện phản ứng LAMP
60




2.2.3.1. Xác định độ biến thiên Mg
2+
trong phản ứng
60
2.2.3.2. Xác định nồng độ Mg
2+
tối ưu
60

2.2.3.3. Xác định nồng dNTPs tối ưu
61
2.2.3.4. Xác định tỉ lệ mồi tối ưu
61
2.2.3.5. Xác định nồng độ betaine tối ưu
61
2.2.3.6. Xác định nhiệt độ phản ứng tối ưu
61
2.2.3.7. Xác định thời gian phản ứng tối ưu
61
2.2.3.8. Xác định độ đặc hiệu của phản ứng LAMP
61
2.2.3.9. Xác định giới hạn phát hiện của phản ứng LAMP
62
2.2.4. Phương pháp cảm nhiễm vi khuẩn gây bệnh vào vật chủ
62
2.2.4.1. Thiết kế thí nghiệm cảm nhiễm
62
2.2.4.2. Xác định LD
50

63
2.2.4.3. Giải phẫu mô học
64
2.2.5. Xử lí số liệu bằng phần mềm vi tính
64
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
66
3.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁ TRA VIỆT NAM
66

3.1.1. Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn
68
3.1.2. Nhuộm Gram
69
3.1.3. Khả năng di động, sinh indol và sinh H
2
S
69




3.1.4. Xác định hoạt tính catalase
72
3.1.5. Hoạt tính chondroitinase
73
3.1.6. Hoạt tính tan huyết
74
3.2. PHÂN LOẠI VI KHUẨN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC
PHÂN TỬ
76
3.2.1. Tách chiết DNA genom của vi khuẩn
76
3.2.2. Phân loại bằng so sánh trình tự rDNA 16S
77
3.3. PHÂN LẬP, TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN eip18
CỦA VI KHUẨN E. ictaluri
79
3.3.1. Phân lập gen eip18
80

3.3.2. Tách dòng gen eip18 bằng vector pJet 2.1/blunt
81
3.3.3. Kiểm tra sự có mặt của gen eip18 trong vector tái tổ hợp
81
3.3.4. Xác định trình tự gen eip18
83
3.4. THÍ NGHIỆM CẢM NHIỄM VI KHUẨN E. ictaluri
86
3.4.1. Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri E5
86
3.4.2. Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri E7
87
3.4.3. Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri E40
88
3.4.4. Dấu hiệu bệnh lý của cá sau khi cảm nhiễm
91
3.4.5. Kết quả tái phân lập và định danh vi khuẩn
93
3.5. PHÁT HIỆN GEN eip18 CỦA VI KHUẨN E. ictaluri BẰNG KỸ
THUẬT LAMP
95




3.5.1. Khuếch đại gen eip18 bằng kỹ thuật LAMP
95
3.5.2. Tối ưu các điều kiện của phản ứng LAMP
97
3.5.2.1. Ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng

97
3.5.2.2. Ảnh hưởng thời gian phản ứng
98
3.5.2.3. Ảnh hưởng của nồng dNTPs
99
3.5.2.4. Ảnh hưởng của tỉ lệ mồi
100
3.5.2.5. Ảnh hưởng của nồng độ betaine
100
3.5.2.6. Ảnh hưởng của nồng độ Mg
2+

101
3.5.2.7. Ngưỡng phát hiện gen eip18 của phản ứng LAMP sử
dụng chỉ thị Calcein
105
3.5.2.8. Độ đặc hiệu của cặp mồi khuếch đại gen eip18 bằng
phương pháp LAMP
108
KẾT LUẬN
110
KIẾN NGHỊ
112
DANH MC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÓ LIÊN QUAN
ĐẾN NI DUNG LUẬN ÁN
113
TÀI LIỆU THAM KHẢO
114
PH LC

NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

at
Attogram

BHI
Brain Heart Infusion
Môi trường dịch thể BHI
BHIA
Brain Heart Infusion Agar
Môi trường thạch BHI
Bp
Base pair
Cặp bazơ
CFU
Conoly forming unit
Đơn vị hình thành khuẩn lạc
cs
Cộng sự

CT
Công thức

Da

Dalton

DNA
Deoxyribonucleic acid

dNTP
Deoxyribonucleotide 5’- triphosphates
ĐBSCL
Đồng bằng sông Cửu long

EIM
Edwardsiella ictaluri medium
Môi trường đặc hiệu E. ictaluri
EtBr
Ethidium Bromide

EIA
Enzyme immunoassay
Miễn dịch enzym
ELISA
Enzyme-linked immunosorbent assay
Kỹ thuật miễn dịch hấp phụ gắn
enzym
FDA
Food and Drug Administration
Cục quản lý thực phẩm và dược
phẩm Hòa Kỳ
FDR
Flourescent dectection reagent
Thuốc thử phát hiện bằng huỳnh

quang




fg
Femtogram

ha
Hecta

Kb
Kilo base

Mb
Mega base

LAMP
Loop-mediated isothermal
amplification
Khuếch đại đẳng nhiệt có tạo
thành vòng
OD
Optical Density

PCR
Polymerase chain reaction
Phản ứng chuỗi trùng hợp
rDNA
Ribosomal Deoxyribonucleic acid

RNA
Ribonucleic acid

rRNA
Ribosomal Ribonucleic acid

TAE
Tris-acetate-EDTA

UV
Ultraviolet







DANH MC CÁC BẢNG

STT
Tên bảng
Trang
1
Bảng 1.1. Diện tích và sản lượng nuôi cá tra ở các địa phương năm 2011
8
2
Bảng 1.2. Các loài cá vật chủ mà vi khuẩn E. tarda và E. ictaluri gây
bệnh

22
3
Bảng 2.1. Danh sách các mồi nhân gen eip18 của vi khuẩn E. ictaluri
bằng kỹ thuật LAMP và PCR
47
4
Bảng 2.2. Mật độ vi khuẩn E. ictaluri (CFU/ml) trước khi gây cảm
nhiễm
63
5
Bảng 2.3. Bố trí công thức thí nghiệm cảm nhiễm cá tra
63
6
Bảng 3.1. Kí hiệu và nguồn gốc các chủng vi khuẩn phân lập từ cá tra
Việt Nam
66
7
Bảng 3.2. Hoạt tính phân giải chondroitin của các chủng nghiên cứu
75
8
Bảng 3.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập từ
cá tra Việt Nam
76
9
Bảng 3.4. So sánh trình tự gen eip18 của các dòng E5/4, E40/3 và Ei/10
với trình tự gen eip18 của vi khuẩn E. ictaluri và gen evpC của
vi khuẩn E. tadar bằng chương trình ClustalW
84
10
Bảng 3.5. LD

50
của các mẫu vi khuẩn cảm nhiễm vào cá tra giống
P. hypophthalmus
88
11
Bảng 3.6. Chỉ tiêu sinh hóa của các mẫu vi khuẩn phân lập sau cảm
nhiễm
94
12
Bảng 3.7. So sánh giới hạn phát hiện của phương pháp LAMP và PCR
105








DANH MC CÁC HÌNH

STT
Tên hình
Trang
1
Hình 1.1 Cá tra bị bệnh gan mủ thận với bụng sưng to và nhiều đốm
trắng ở nội tạng
12
2
Hình 1.2. Bệnh tích trên gan thận và tỳ tạng

13
3
Hình 1.3. Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri soi dưới kính hiển vi điện tử
(A) và nhuộm Gram (B)
19
4
Hình 1.4. Bộ kit API-20E với các giếng phản ứng sinh hóa
29
5
Hình 1.5. Nguyên tắc thiết kế mồi cho phản ứng LAMP
34
6
Hình 1.6. Nguyên lý khuếch đại ADN của phản ứng LAMP
38
7
Hình 1.7. Quy trình phát hiện tác nhân gây bệnh bằng phương pháp
LAMP
39
8
Hình 1.8. Nguyên tắc của sự phát quang bởi Calcein
41
9
Hình 1.9. Phát hiện phản ứng LAMP bằng đo độ đục, bằng huỳnh
quang hoặc soi dưới đèn UV
42
10
Hình 2.1. Bản đồ vector tách dòng pJet 1.2/blunt
46
11
Hình 3.1. A- Giải phẫu nội tạng cá tra khỏe mạnh A và

B - cá tra biểu hiện bệnh gan thận mủ
67
12
Hình 3.2. Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn E7 và E. ictaluri ATCC 33202
trên môi trường EIM
68
13
Hình 3.3. Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn E. tarda và vi khuẩn phân lập
từ mẫu gan, thận, tỳ tạng cá bệnh trên môi trường BHIA
68




14
Hình 3.4. Hình ảnh nhuộm Gram của mẫu vi khuẩn phân lập được kí
hiệu E40 bắt màu Gram âm và đối chứng là vi khuẩn Bacillus
subtilis bắt màu Gram dương
69
15
Hình 3.5. Khả năng di động, sinh indol và H
2
S của các các mẫu phân
lập tại Việt Nam E5, E7, E10, E40
70
16
Hình 3.6. Phản ứng phân giải tryptophan thành gốc indol
72
17
Hình 3.7. Khả năng sinh catalaza của các mẫu vi khuẩn nghiên cứu và

E.i- E. ictaluri ATCC 33202
72
18
Hình 3.8. Hoạt tính chondroitinase của các mẫu vi khuẩn nghiên cứu
74
19
Hình 3.9. Hoạt tnh tan huyết của các mẫu vi khuẩn nghiên cứu
75
20
Hình 3.10. Điện di kiểm tra sản phẩm tách genom trên gel agarose
77
21
Hình 3.11. Cây phát sinh chủng loại của các mẫu vi khuẩn E5, E7 và
E40 phân lập tại Việt Nam so với các loài gần gũi dựa trên
trình tự rADN 16S
78
22
Hình 3.12. Sơ đồ thiết kế tách dòng gen eip18 của vi khuẩn E. ictaluri
79
23
Hình 3.13. Phân lập gen eip18 từ vi khuẩn E. ictaluri
80
24
Hình 3.14. A. Kết quả điện di sản phẩm DNA plasmid tách từ tế bào
E. coli DH 10B. B. Kết quả PCR đoạn gen eip18 trên plasmid
bằng cặp mồi Eip18
82
25
Hình 3.15. A - Kết quả điện di đồ sản phẩm cắt plasmid bằng enzym
hạn chế BglII. B - Kiểm tra điện di đồ sản phẩm cắt plasmid

bằng enzym KpnI
83
26
Hình 3.16. Điện di đồ sản phẩm plasmid đã tinh sạch của các dòng tế
bào E5/4, Ei/10 và E40/3
83
27
Hình 3.17. So sánh trình tự gen eip18 của các mẫu vi khuẩn nghiên cứu
85




với trình tự gen eip18 đã được công bố trên Ngân hàng Gene
28
Hình 3.18. Biểu đồ tỷ lệ % cá tra giống bị chết theo ngày cảm nhiễm
bởi vi khuẩn E. ictaluri E5
86
29
Hình 3.19. Biểu đồ tỷ lệ % cá tra giống bị chết theo ngày cảm nhiễm
bởi vi khuẩn E. ictaluri E7
87
30
Hình 3.20. Biểu đồ tỷ lệ % cá tra giống bị chết theo ngày cảm nhiễm
bởi vi khuẩn E. ictaluri E40
88
31
Hình 3.21. Đốm trắng trên nội quan cá tra. A- Cá thu ở ao nuôi thâm
canh; B- Cá được gây cảm nhiễm bởi vi khuẩn E. ictaluri
trong phòng thí nghiệm; C- Cá khỏe mạnh

91
32
Hình 3.22. Đặc điểm mô bệnh học của cá tra gây cảm nhiễm bởi vi
khuẩn E . ictaluri
92
33
Hình 3.23. Kết quả tái phân lập vi khuẩn trên cá tra sau khi cảm nhiễm
bằng các mẫu vi khuẩn nghiên cứu
94
34
Hình 3.24. Phản ứng LAMP khuếch đại gen eip18
95
35
Hình 3.25. Cắt sản phẩm LAMP bằng enzyme Mnl I
97
36
Hình 3.26. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng
98
37
Hình 3.27. Ảnh hưởng của thời gian tới phản ứng LAMP khuếch đại
gen eip18 của mẫu vi khuẩn E. ictaluri E7
99
38
Hình 3.28. Ảnh hưởng của nồng độ dNTPs đến phản ứng LAMP
100
39
Hình 3.29. Ảnh hưởng của tỷ lệ mồi (A) và nồng độ Betain (B) đến
phản ứng LAMP
101
40

Hình 3.30. Ảnh hưởng của nồng độ MgSO
4
đến phản ứng LAMP
102
41
Hình 3.31. Ảnh hưởng của nồng độ MgSO
4

đến sự phát quang của
Calcein
102




42
Hình 3.32. Giá trị OD
400
tương ứng với các nồng độ MgSO4 khác nhau
103
43
Hình 3.33. Phát hiện sản phẩm phản ứng LAMP bằng chỉ thị Calcein
dưới tia UV trong điều kiện phòng có chiếu sáng (A) và trong
buồng tối (B)
104
44
Hình 3.34. Phát hiện sản phẩm phản ứng LAMP bằng chỉ thị SYBR
Green I
105
45

Hình 3.35. Giới hạn phát hiện gen eip18 của phản ứng LAMP
106
46
Hình 3.36. Độ đặc hiệu của cặp mồi khuếch đại gen eip18 bằng phản
ứng LAMP
108



1


MỞ ĐẦU
Nuôi trồng thủy sản trong đó có nuôi cá tra thương phẩm hiện đóng một vai trò
quan trọng trong ngành xuất khẩu nói chung và xuất khẩu thủy sản nói riêng. Hoạt
động này đã và đang được nhiều chính phủ khuyến khích nhằm tạo ra lượng hàng hóa
có giá trị kinh tế cao, giải quyết vấn đề việc làm cho người lao động, tăng thu nhập và
góp phần đẩy lùi nghèo đói ở các nước đang phát triển. Ở Việt Nam, trong 10 năm trở
lại đây nghề nuôi cá tra đang phát triển rất nhanh với quy mô lớn tại một số tỉnh đồng
bằng Sông Cửu Long như An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Bến Tre, Tiền Giang… với
diện tích nuôi trồng đạt 6.300 ha mặt nước tnh đến năm 2011 [15]. Cá tra Pangasius
hypophthalmus là loài đặc hữu của lưu vực sông Mê Kông và được xem là một trong
những đối tượng xuất khẩu tiềm năng. Ước tính trung bình kim ngạch xuất khẩu cá tra
hàng năm đóng góp khoảng 10% tổng kim ngạch xuất khẩu. Theo thống kê của Hiệp
hội nuôi trồng và xuất khẩu thủy sản, năm 2008 xuất khẩu cá tra ra thị trường thế giới
đạt 1,2 tỷ USD, năm 2009 đạt 1,34 tỷ USD, năm 2010 đạt 1,4 tỷ USD, năm 2011 đạt
1,8 tỷ USD, dự kiến kim ngạch xuất khẩu cá tra ra thị trường thế giới bao gồm Châu
Âu, Mỹ, Mexico… đạt 1,8 đến 2 tỷ USD đến hết năm 2012 [16].
Sự phát triển quá nhanh không theo quy hoạch của ngành nuôi cá tra tại khu vực
Đồng bằng sông Cửu long đã dẫn đến sự bùng nổ dịch bệnh trên diện rộng, dịch bệnh

diễn ra hàng năm gây thiệt hại không nhỏ cho người dân, ảnh hưởng nghiêm trọng tới
môi trường thủy sản và các ngành kinh tế liên quan. Một trong những bệnh nguy hiểm
trên cá tra là bệnh gan thận mủ hay còn gọi là bệnh đốm trắng nội tạng được phát hiện
lần đầu tiên tại Việt Nam vào đầu mùa lũ năm 1998 ở một số vùng nuôi cá thâm canh
trọng điểm như An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ. Sau đó bệnh lan rộng ra các tỉnh
nuôi cá tra lân cận và cả một số tỉnh mới phát triển nuôi cá tra như Trà Vinh, Bến Tre,
Sóc Trăng [3]. Thời kỳ cao điểm của bệnh dịch thường vào tháng 9 tới tháng 12. Bệnh
được đánh giá là vô cùng nguy hiểm do tốc độ lây lan nhanh, khó kiểm soát và khó


2

điều trị do bệnh không có những triệu chứng điển hình ở giai đoạn sớm. Tốc độ lây lan
của bệnh tỷ lệ thuận với mức độ thâm canh, mật độ nuôi cá trên một đơn vị diện tch ao
nuôi. Thêm vào đó, vấn đề quản lý nguồn nước, quản lý thức ăn và khống chế bệnh
dịch còn chưa đáp ứng kịp với việc mở rộng diện tích nuôi trồng hàng năm dẫn đến
việc khi đã xuất hiện bệnh thì thường gây ra dịch cho cả một vùng nuôi trồng thủy sản.
Do đó, việc xác định sớm và nhanh tác nhân gây bệnh sẽ đóng góp không nhỏ vào vấn
đề kiểm soát bệnh dịch, giảm thiểu những tổn thất kinh tế cho người nuôi và các ngành
kinh tế liên quan. Tại Việt Nam, tuy đã có nhiều công trình nghiên cứu xác định tác
nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra nhưng chưa có sự thống nhất về kết quả. Năm
2001, Ferguson và cs đã công bố tác nhân gây bệnh là Bacillus sp. [43]. Một năm sau
đó tác giả lại đnh chnh tác nhân gây bệnh là Edwardsiella ictaluri [36]. Cũng trong
năm đó, ở Indonesia nhóm nghiên cứu của Kei Yuasa và cs lần đầu tiên chứng minh E.
ictaluri là tác nhân gây bệnh đốm trắng nội tạng ở cá tra [119]. Năm 2003 Trần Thị
Minh Tâm và cs công bố tác nhân gây bệnh là vi khuẩn Hanfia alvei và Pleisiomonas
shigelloides [11]. Khác hoàn toàn với các kết quả nghiên cứu trước đây, khi Lý Thị
Thanh Loan và cs năm 2007 công bố tác nhân gây bệnh là Clostridium sp. - trực khuẩn
Gram dương, kỵ khí bắt buộc trong khi các tác nhân được công bố trước đây đều là
trực khuẩn Gram âm [7]. Còn tại Mỹ, các nhà khoa học đã khẳng định chính xác tác

nhân gây hoại tử gan, thận và nhiễm trùng huyết trên cá nheo Mỹ Ictalurus punctatus
là vi khuẩn E. ictaluri [94]. Mặc dù đã có nhiều công trình nghiên cứu khẳng định tác
nhân gây bệnh gan thận mủ là E. ictaluri nhưng bên cạnh đó vẫn tồn tại những ý kiến
cho rằng đó là do vi khuẩn khác gây ra. Như vậy, việc xác định tác nhân chính gây
bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam là vấn đề cần phải được làm sáng tỏ.
Có rất nhiều phương pháp khác nhau để xác định sự có mặt của một tác nhân
gây bệnh từ những phương pháp truyền thống như: phân lập trên môi trường chọn lọc,
xác định đặc tnh sinh lý, hóa sinh, phương pháp huyết thanh học… đến các phương
pháp phân tử như PCR, RT-PCR, multiplex PCR… Tuy nhiên, việc phát triển một


3

phương pháp chẩn đoán nhanh, chnh xác tác nhân gây bệnh và có khả năng ứng dụng
nhanh bên ngoài phòng thí nghiệm đóng vai trò quan trọng không chỉ góp phần khẳng
định tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam mà còn có ý nghĩa quan trọng
trong phòng chống, kiểm soát và điều trị bệnh. Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến
hành đề tài:

“Nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam
Pagasius hypophthalmus bằng kỹ thuật LAMP (Loop-mediated isothermal
amplification”
Mục tiêu của đề tài:
- Xác định tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam Pangasius
hypophthalmus.
- Chẩn đoán nhanh, chính xác tác nhân gây bệnh trên các mẫu bệnh phẩm bằng
kỹ thuật LAMP.


4

Nội dung nghiên cứu:
- Phân lập vi khuẩn từ các mẫu cá tra bị bệnh gan thận mủ thu được tại khu vực
Đồng bằng Sông Cửu Long.
- Xác định một số đặc điểm sinh hóa và phân loại dựa vào trình tự gen mã hóa
rARN 16S.
- Phân lập, tách dòng và xác định trình tự gen đặc trưng của vi khuẩn phân lập
được.
- Sử dụng kỹ thuật LAMP để phát hiện vi khuẩn dựa trên trình tự của gen đặc
trưng của vi khuẩn đó.
- Tối ưu hóa các điều kiện phản ứng LAMP khuếch đại gen đặc trưng của vi
khuẩn
- Sử dụng chỉ thị kim loại Calcein để làm dấu hiệu phát hiện phản ứng bằng mắt
thường.


5

Những đóng góp mới của luận án:
- Lần đầu tiên ứng dụng một phương pháp chẩn đoán phẩn tử mới có tên là
LAMP – khuếch đại đẳng nhiệt có tạo thành các vòng để xác định bệnh do vi
khuẩn gây ra ở thủy sản.
- Đây là phương pháp đơn giản, phát hiện nhanh kết quả bằng mắt thường dựa
vào sự thay đổi của chỉ thị kim loại Calcein từ cam sang xanh mà không cần sự
hỗ trợ của các thiết bị nghiên cứu khác.

Luận án được thực hiện tại: Viện Công nghệ Sinh học – Viện Khoa học và Công
nghệ Việt Nam.

6

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÁ TRA VÀ BỆNH GAN THẬN MỦ
1.1.1. Cá tra Pangasius hypophthalmus
Cá tra và cá basa là hai trong số 11 loài thuộc họ cá tra Pangasiidae đã được xác
định ở sông Cửu Long. Theo dẫn liệu từ [124], hệ thống phân loại
của loài cá tra được xác định như sau :
Giới: Animalia Linnaeus, 1758
Ngành: Chordata Bateson, 1885
Ngành phụ: Vertebrata Cuvier, 1812
Tổng lớp: Osteichthyes Huxley, 1880 – Bony fishes
Lớp: Actinopterygii Huxley, 1880 – Ray-finned fishes
Lớp phụ: Neopterygii
Tổng bộ: Ostaryphysi
Bộ: Siluriformes
Họ cá tra: Pangasiidae - Bleeker, 1858
Giống cá tra dầu: Pangasius Valenciennes in Cuvier and Valenciennes, 1840
Loài cá tra: Pangasius hypophthalmus (Sauvage, 1878)
Các đồng danh của loài cá tra bao gồm:
- Helicophagus hypophthalmus Sauvage, 1878
- Pangasianodon hypophthalmus Sauvage, 1878
- Pangasius hypophthalmus Sauvage, 1878
- Pangasius pangasius non Hamilton,1822
- Pangasius pleurotaenia non Sauvage, 1878
- Pangasius sutchi Fowler, 1937
Cá tra phân bố tự nhiên chủ yếu ở vùng hạ lưu sông Mê kông, có mặt ở cả bốn
nước Lào, Việt Nam, Campuchia, Thái Lan. Tài liệu phân loại gần đây nhất của tác giả

W. Rainboth xếp cá tra thuộc giống cá tra dầu. Tên loài Pangasianodon hypophthalmus
7

được ông sử dụng lần đầu vào năm 1996 để chỉ định cho loài cá Tra và sau đó được
nhiều tác giả khác sử dụng phổ biến đến nay [85]. Tên đặt cho loài này khác nhau theo
vùng phân bố. Ở Campuchia là Trey pra (tên Khmer), Lào là Pa souay kheo, pa suay,
Thái là Pla saa wha, pla suey và Việt Nam là cá tra [14].
Ở nước ta những năm trước đây khi chưa có sinh sản cá nhân tạo, cá bột và cá
tra giống được vớt trên sông Tiền và sông Hậu. Cá trưởng thành chỉ thấy trong ao nuôi,
rất ít gặp ở tự nhiên và địa phận Việt Nam do cá có tập tnh di cư ngược dòng sông Mê
kông để sinh sống và tìm nơi sinh sản tự nhiên. Hiện nay, cá tra nước ta được đưa vào
nuôi công nghiệp trên quy mô lớn tại các vùng thuộc đồng bằng Sông Cửu Long bao
gồm các tỉnh trọng điểm như Cần Thơ, An Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Bến Tre và
một số tỉnh lân cận với diện tích mặt nước lên đến 6.300 ha bao gồm cả diện tích mặt
nước tận dụng trên các sông lớn như sông Tiền và sông Hậu [15].
Cá nheo Mỹ thuộc họ Ictaluridae, bộ Siluriformes [103] với đặc điểm gồm 8 râu
quanh miệng, đuôi xẻ đôi sâu, nhiều đốm 2 bên cơ thể, vây lưng và vây ngực có gai
nhọn, cứng [110]. Loài cá này đẻ trứng dễ dàng nhưng lại không sinh sản trong ao
nuôi. Loài này có khả năng chịu oxi thấp, mật độ nuôi cao và có khả năng thch ứng
nhanh với sự thay đổi khí hậu, sử dụng được thức ăn công nghiệp nên được xem là đối
tượng tiềm năng của các mô hình nuôi trồng và sản xuất thủy sản ở quy mô công
nghiệp. Khác với cá nheo Mỹ về một số đặc điểm sinh học trong đó đặc điểm dễ nhận
thấy nhất là cá tra Pangasius hypophthalmus chỉ có 2 đôi râu ở miệng, đôi râu mép dài
và đôi râu hàm dưới ngắn [14]. Đối tượng này được nuôi ở quy mô công nghiệp ở một
số tỉnh đồng bằng Sông Cửu Long như: An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Bến Tre,
Tiền Giang… với tốc độ phát triển rất nhanh và đem lại lợi ch cao cho người nông
dân. Tuy nhiên, thiệt hại hàng năm do bệnh dịch gây ra cũng rất lớn và mặc dù được
phát hiện muộn hơn so với một số các bệnh khác nhưng bệnh gan thận mủ được đánh
giá là bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng. Tỷ lệ cá chết do nhiễm bệnh cao, từ 50 - 60%
và nguy hiểm nhất là giai đoạn cá giống. Ở giai đoạn này tỷ lệ cá chết có thể lên tới

8

90% [3]. Bệnh nếu không được phát hiện và điều trị kịp thời sẽ rất khó kiểm soát và
ảnh hưởng trực tiếp tới năng suất mùa vụ và việc xuất khẩu ra thị trường thế giới.
Bảng 1.1. Diện tích và sản lượng nuôi cá tra ở các địa phương năm 2011 [15]
Tỉnh
Sản lượng (tấn)
Diện tích nuôi trồng (ha)
Tây Ninh
4.500
25
Tiền Giang
36.700
180
Bến Tre
126.750
650
Trà Vinh
28.622
131,7
Vĩnh Long
111.517
405,9
Đồng Tháp
341.884
1529
An Giang
245.000
1330
Cần Thơ

163.444
937
Hậu Giang
43.470
189
Sóc Trăng
27.400
167
Kiên Giang
6.966
27
Tổng cộng
1.136.253
5571,6

Về mặt xuất khẩu, cá tra là một trong những đối tượng xuất khẩu quan trọng có
đóng góp không nhỏ làm tăng kim ngạch xuất khẩu thủy sản hàng năm của Việt Nam.
Sản phẩm xuất khẩu chiếm ưu thế vẫn là hàng phi lê đông lạnh với giá trị xuất khẩu đạt
1,79 tỷ USD năm 2011 chiếm 99% tỷ trọng xuất khẩu cá tra của Việt Nam. Mặt hàng
chế biến vẫn còn khiêm tốn, chỉ chiếm 1% tổng giá trị xuất khẩu cá tra. Tnh đến năm
2011, đã có hơn 230 doanh nghiệp xuất khẩu cá tra đến hơn 130 thị trường trên thế giới
bao gồm Châu Âu, Mỹ, Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc và Hồng Kông, Australia,
Canada, Mehico, Nga… đạt giá trị 1,8 tỷ USD, tăng gần 26,5% với khối lượng xuất
khẩu trên 600 nghìn tấn, tăng 3% so với năm 2010 [15].