Nghiên cứu các hợp chất ngoại bào của một số vi sinh vật đáy biển Bắc Bộ

VŨ VĂN NAM


NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT NGOẠI BÀO CỦA
MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐÁY BIỂN BẮC BỘ




LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC





Hà Nội – 2014
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC
KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN HÓA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC
KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN HÓA HỌC



VŨ VĂN NAM

NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT NGOẠI BÀO CỦA
MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐÁY BIỂN BẮC BỘ

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 60.44.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC


Người hướng dẫn khoa học: TSKH. Phạm Văn Cường




Hà Nội - 2014
LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn chân thành và sâu sắc, tôi xin trân trọng cảm ơn:
Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc nhất của mình tới TSKH. Phạm
Văn Cường đã chỉ ra hướng nghiên cứu, hướng dẫn tận tình, động viên và giúp đỡ
tôi trong suốt quá trình thực hiện của luận văn.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Hóa học, Hội đồng Khoa học,
Bộ phận đào tạo và các phòng chức năng đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi

để tôi hoàn thành luận văn.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Hoá Sinh biển đã cổ vũ, động
viên, tạo điều kiện cho tôi học tập và làm việc để tôi có thể thực hiện tốt các công
việc của luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đoàn Thị Mai Hương và TS. Trịnh Thị Thanh
Vân cùng các anh chị, các bạn đồng nghiệp của phòng Tổng hợp Hữu cơ và Trung
tâm Nghiên cứu và Phát triển thuốc – Viện Hóa Sinh biển đã giúp đỡ, đóng góp
nhiều ý kiến quý báu trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã cổ vũ, động viên
tôi hoàn thành tốt bản luận văn này.
Xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Tác giả


Vũ Văn Nam


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT…………………………

DANH MỤC CÁC BẢNG…………………………………………………


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ…………………………………………………

DANH MỤC CÁC HÌNH……………………………………………………

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC……………………………………………….

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3
1.1. Tổng quan về vi sinh vật biển 3
1.1.1. Vi sinh vật 3
1.1.2. Vai trò của vi sinh vật trong tự nhiên 4
1.1.3. Vai trò của vi sinh vật trong đời sống 5
1.1.4. Vi sinh vật biển 5
1.2. Nghiên cứu về đa dạng vi sinh vật biển Việt Nam 6
1.3. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của vi sinh vật biển trên thế giới 11
1.3.1. Hoạt tính kháng lao 13
1.3.2. Hoạt tính chống ung thư 14
1.3.3. Hoạt tính khác 16
1.4. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học vi sinh vật biển Việt Nam 18
1.5. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu vi khuẩn Photobacterium. 20
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.1. Đối tượng nghiên cứu, xác định tên khoa học 22
2.2. Phương pháp lấy mẫu 22
2.3. Phương pháp phân lập chủng vi sinh vật biển 22
2.4. Phương pháp nuôi cấy 22
2.5. Phương pháp tách chiết các hợp chất từ dịch ngoại bào nuôi cấy vi
sinh vật 24
2.6. Các phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất
từ dịch ngoại bào nuôi cấy chủng vi sinh vật biển Photobacterium sp. 24
2.7. Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được từ
dịch ngoại bào nuôi cấy chủng vi sinh vật. 25
2.8. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng vi sinh vật
kiểm định 25
2.8.1. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào 25

2.8.2. Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 26
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM 28
3.1. Xử lý mẫu và tách chiết, phân lập các chất từ dịch ngoại bào nuôi cấy chủng
vi khuẩn Photobacterium sp. 28
3.2. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được từ dịch
ngoại bào nuôi cấy chủng vi khuẩn Photobacterium sp. 31
3.2.1. Các chất phân lập được từ dịch chiết MeOH 31
3.2.2. Các chất phân lập được từ dịch chiết Etyl axetat 33
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37
4.1. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được từ dịch
chiết MeOH 37
4.1.1. Hợp chất 1-(pyrrolidine-2’-carbonyl)pyrrolidine-2-carboxamide (FM8.4) 37
4.1.2. Hợp chất Uracil (FM7.3) 42
4.1.3. Hợp chất Cyclo-(Pro-Gly) (FM4.2) 42
4.2. Các chất phân lập được từ cặn Etyl acetat 43
4.2.1. N-(2-oxoazepan-3-yl) acetamide (F5.5) 44
4.2.2. Hợp chất Cyclo-(Pro-Ala) (F5.4) 48
4.2.3. Hợp chất Cyclo-(Leu-Pro) (F5.1) 49
4.2.4. Hợp chất indole-3-carbonitrile (F3.3.1) 50
4.2.5. Hợp chất Thymine (F7.2) 51
4.2.6. Hợp chất 3-metyl pipererazine-2,5 dion (F8.2) 52
4.2.7. Hợp chất Axit benzoic (F2.2) 53
4.2.8. Hợp chất 4-(2-hydroxyethyl) phenol (F3.3.2) 53
4.3. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được 54
4.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào của các chất được phân lập 54
4.3.2. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của chất được phân lập 55
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55
CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN TỚI LUẬN VĂN 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
NMR: Nuclear Magnetic Resonance (phổ cộng hưởng từ hạt nhân)
1
H-NMR: Phổ cộng hưởng từ proton
13
C-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
13
C
DEPT: Distortionles Enhancement by Polarization Transfer (phổ DEPT)
COSY: Homonuclear Correlated Spectroscopy
HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation (phổ HMBC)
HMQC: Heteronuclear Multiple Quantum Coherence (phổ HMQC)
HSQC: Heteronuclear Single Quantum Coherence (phổ HSQC).
NOE: Nuclear Overhauser Effect (hiệu ứng NOE)
NOESY: Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy (phổ NOESY)
s: singlet
d: doublet

t: triplet
q: quartet
qui: quintet
sxt: sextet
sep: septet
o: overlapping
b: broad
dd: doublet of doublets
dt: doublet of triplets
dq: doublet of quartets
δ
H
, δ
C
: Độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon.
ppm: part per million (phần triệu).
EIMS: Electron Inoniziation Mass Spectroscopy (phổ khối phun mù điện tử).
HRMS: High Resolution Mass Spectroscopy (phổ khối phân giải cao)
DMSO: Dimethylsulfoxide
đnc: Điểm nóng chảy
TLC: Thin Layer Chromatography (sắc ký bản lớp mỏng)
CC: Column Chromatography (sắc ký cột)
RP: Reverse Phase (sắc ký pha đảo)
IC
50
Nồng độ tác dụng ức chế 50% tế bào thử nghiệm
MIC Nồng độ ức chế tối thiểu
HKTS Hiếu khí tổng số
Tên riêng của các hợp chất tự nhiên phân lập được được viết theo nguyên bản tiếng Anh

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Số lượng một số nhóm vi sinh vật trong các mẫu nước biển và trầm tích
tại Cát Bà 7

Bảng 1.2. Kết quả phân loại một số chủng vi khuẩn thuộc Cát Bà 8

Bảng 1.3. Kết quả phân loại một số chủng nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn tại Cát Bà8

Bảng 1.4. Số lượng và số chủng vi sinh vật tách được trong các mẫu nước biển
Việt Nam 9

Bảng 1.5.Xạ khuẩn từ đảo Cát Bà 11

Bảng 4.1. Dữ kiện phổ
1
H-NMR (CD
3
OD; 500 MHz) và
13
C-NMR (CD
3
OD; 125
MHz) của FM8.4 39

Bảng 4.2. Dữ kiện phổ
1
H-NMR (CD
3
OD; 500 MHz) và
13

C-NMR (CD
3
OD; 125
MHz) của F5.5 45

Bảng 4.3. Hoạt tính gây độc tế bào của các chất được phân lập 54

Bảng 4.4.Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của chất được phân lập 55











DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1.Hình ảnh một số vi sinh vật 4

Hình 2.1. Một số hình ảnh trong quá trình phân lập chủng vi sinh vật 23

Hình 3.1.Sơ đồ chiết mẫu nuôi cấy chủng vi khuẩn Photobacterium sp. 28

Hình 3.2. Sơ đồ phân lập cặn chiết MeOH 29

Hình 3.3.Sơ đồ phân lập cặn chiết EtOAc 30

Hình 4.1. Cấu trúc các hợp chất được phân lập từ cặn MeOH 37

Hình 4.2. Phổ khối của FM8.4 38

Hình 4.3. Phổ
1
H-NMR giãn rộng của FM8.4 39

Hình 4.4. Phổ
13
C-NMR giãn rộng của chất FM8.4 40

Hình 4.5. Phổ COSY của chất FM8.4 40

Hình 4.6. Phổ HMBC của chất FM8.4 41

Hình 4.7. Một số tương tác chính trên phổ HMBC và COSY của chất FM8.4 41

Hình 4.8. Một số tương tác chính trên phổ HMBC ( ) của chất FM4.2 43

Hình 4.9. Cấu trúc các hợp chất phân lập được từ cặn Etyl acetat 44

Hình 4.10. Phổ khối của chất F5.5 45

Hình 4.11. Phổ
1
H-NMR của chất F5.5 46

Hình 4.12. Phổ
13

C-NMR của chất F5.5 47

Hình 4.13. Phổ COSY của chất F5.5 47

Hình 4.14. Phổ HMBC của chất F5.5 47

Hình 4.15. Tương tác chính trên phổ COSY ( ) , HMBC ( ) của chất F5.5 48

Hình 4.16. Tương tác chính trên phổ HMBC ( ) của chất F5.4 49

Hình 4.17. Tương tác chính trên phổ HMBC ( ) của chất F5.1 50

Hình 4.18. Tương tác chính trên phổ HMBC ( ) của chất F3.3.1 51





DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Phổ của hợp chất 1-(pyrrolidine-2’-carbonyl)pyrrolidine-2-carboxamide
(FM8.4) PL1
Phụ lục 2. Phổ của hợp chất Uracil (FM7.3) PL5
Phụ lục 3. Phổ của hợp chất Cyclo-(Pro-Gly) (FM4.2) PL7
Phụ lục 4. Phổ của hợp chất N-(2-oxoazepan-3-yl) acetamide (F5.5) PL11
Phụ lục 5. Phổ của hợp chất Cyclo-(Pro-Ala) (F5.4) PL15
Phụ lục 6. Phổ của hợp chất Cyclo-(Leu-Pro) (F5.1) PL19
Phụ lục 7. Phổ của hợp chất Indole-3-carbonitrile (F3.3.1) PL23
Phụ lục 8. Phổ của hợp chất Thymine (F7.2) PL27
Phụ lục 9. Phổ của hợp chất 3-methylpiperazine-2,5-dione (F8.2) PL29
Phụ lục 10. Phổ của hợp chất Axit benzoic (F2.2) PL31

Phụ lục 11. Phổ của hợp chất 4-(2-hydroxyethyl)phenol (F3.3.2) PL34






1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Đại dương chiếm 70% diện tích bề mặt trái đất, là nơi có sự đa dạng về
sinh học lớn nhất trên trái đất. Đây là nơi sinh sống của 34 trên 36 ngành động
thực vật trên trái đất với hơn 300000 loài sinh vật đã được biết đến. Môi trường
biển đã được biết đến như một nguồn phong phú cung cấp các hợp chất thiên
nhiên, nó như một kho dược liệu khổng lồ đang chờ được khai thác và khám phá.
Đặc thù môi trường sống khắc nghiệt dưới biển sâu chính là điều kiện để hình
thành các hợp chất hữu cơ với những đặc điểm cấu trúc hóa học độc đáo và hoạt
tính sinh học quý giá [1,2].
Việc nghiên cứu các hoạt chất thứ cấp được sản sinh từ vi sinh vật biển trên
thế giới đã thu được nhiều thành tựu đáng kể. Trong số rất nhiều các hợp chất thứ
cấp với cấu trúc hóa học đặc biệt đã có nhiều hợp chất thể hiện hoạt tính sinh học
rất phong phú. Đồng thời nhiều hợp chất trong số này đã đang được thử nghiệm sâu
hơn nhằm ứng dụng trong y dược. Trong khi đó, nghiên cứu các hợp chất thứ cấp từ
nguồn vi sinh vật biển của Việt Nam mới chỉ được bắt đầu, có rất ít các nghiên cứu
đã công bố, mặc dù nguồn đa dạng vi sinh vật biển của nước ta là rất lớn nhờ vị trí
địa lý tiếp giáp với biển [1,2,10].
Việt Nam có tiềm năng to lớn về tài nguyên biển, với hệ sinh vật biển đa
dạng và phong phú. Đất nước ta nằm trong khu vực biển Thái Bình Dương, sở hữu
hơn 1 triệu km
2

vùng biển [1]. Do vậy, việc tiến hành nghiên cứu các hợp chất thứ
cấp của nguồn vi sinh vật biển Việt Nam nhằm phát hiện các chất có hoạt tính sinh
học cao có thể nghiên cứu ứng dụng trong lĩnh vực y dược là hướng nghiên cứu cần
thiết, hứa hẹn nhiều triển vọng. Ngoài ra, trong rất nhiều nghiên cứu về các đối
tượng sinh vật biển như hải miên, san hô , các hợp chất phân lập được đã được xác
định là do chính các vi sinh vật cộng sinh tạo ra. Việc thu lượng lớn các đối tượng
sinh vật biển này cho nghiên cứu hóa học là rất khó khăn, đòi hỏi nhiều công sức và
kinh phí. Do vậy, nếu tiến hành nghiên cứu các hợp chất từ vi sinh vật, chỉ cần thu 1
lượng mẫu nhỏ phục vụ việc phân lập vi sinh vật, sau đó tiến hành sinh khối với
lượng lớn trong phòng thí nghiệm phục vụ việc nghiên cứu hóa học.

2

Trong khuôn khổ của Đề tài nghiên cứu khoa học: “Nghiên cứu phát hiện
các hợp chất chống lao từ nguồn vi sinh vật đáy biển vùng đông bắc bộ Việt
Nam”, mã số: VAST. TĐ. ĐAB .04/13-15. Kết quả sàng lọc cho chủng vi khuẩn
Photobacterium sp. được phân lập từ đất bùn Vịnh Hạ Long thể hiện hoạt tính
kháng vi sinh vật kiểm định đối với chủng Staphylococcus aureus, Echerichia coli
và nấm Fusarium oxysporum [50]. Cho đến nay, trên thế giới chưa có công trình
nghiên cứu kỹ về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất ngoại
bào của các loài thuộc chi Photobacterium. Do vậy, chúng tôi lựa chọn chủng vi
khuẩn Photobacterium sp. này làm đối tượng nghiên cứu của luận văn với mục tiêu:
- Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc các chất từ dịch ngoại bào của
chủng vi khuẩn Photobacterium sp.
- Khảo sát hoạt tính chống ung thư và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm
định của các chất phân lập được làm cơ sở khoa học định hướng cho việc nghiên
cứu ứng dụng các hợp chất này.

3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về vi sinh vật biển
1.1.1. Vi sinh vật
Vi sinh vật (Microorganism) là những sinh vật có kích thước rất nhỏ từ vài
trăm nm đến vài nm, muốn thấy rõ chúng phải sử dụng kính hiển vi. Vi sinh vật
phân bố ở khắp mọi nơi trên trái đất. Chúng có mặt trên cơ thể người, động vật,
thực vật, trong đất, trong nước, trong không khí, trên mọi đồ dùng,vật liệu, từ biển
khơi đến núi cao, từ nước ngọt, nước ngầm cho đến nước biển Vi sinh vật tham
gia tích cực vào việc thực hiện các vòng tuần hoàn sinh - địa - hoá học
(biogeochemicalcycles) như vòng tuần hoàn cacbon, vòng tuần hoàn nitơ, vòng tuần
hoàn photpho, vòng tuần hoàn lưu huỳnh [2,7] Dựa vào đặc điểm cấu tạo tế bào,
người ta chia ra làm 3 nhóm lớn như sau:
- Nhóm chưa có cấu tạo tế bào bao gồm các loại virút.
- Nhóm có cấu tạo tế bào nhưng chưa có cấu trúc nhân rõ ràng (cấu trúc
nhân nguyên thủy) được gọi là nhóm Procaryotes, bao gồm vi khuẩn, xạ khuẩn
và tảo lam.
- Nhóm có cấu tạo tế bào và có cấu trúc nhân phức tạp được gọi là Eukaryotes
bao gồm nấm men, nấm sợi (gọi chung là vi nấm) một số động vật nguyên sinh và
tảo đơn bào.
Như vậy, vi sinh vật không có mặt trong hai giới động vật và thực vật. Người
ta ước tính trong số 1,5 triệu loài sinh vật có khoảng 200000 loài vi sinh vật. Tuy

nhiên hàng năm, có thêm hàng nghìn loài sinh vật mới được phát hiện, trong đó có
không ít loài vi sinh vật [2].
Vi khuẩn - Tiếng Anh và tiếng La Tinh là bacterium, đôi khi còn được gọi là
vi trùng. Vi khuẩn là một nhóm sinh vật

đơn bào, có kích thước nhỏ (kích thước
hiển vi) và thường có cấu trúc tế bào đơn giản không có nhân, bộ khung tế bào
(cytoskeleton) và các bào quan như ty thể và lục lạp [2,7].

4

Virút là một dạng đặc biệt chưa có cấu trúc cơ thể là những tác nhân gây
nhiễm trùng có kích thước nhỏ nhất (đường kính từ 20-300 nm) và trong bộ gen của
chúng chỉ chứa 1 loại axit nucleic (RNA hoặc DNA). Axit nucleic được bao bọc
trong lớp vỏ protein và bên ngoài cùng có thể được bao quanh 1 màng lipid. Toàn
bộ phân tử virút được gọi là virion. Có 3 loại virus chính là Viroid (ARN có tính
cảm nhiễm), Virusoid (ARN không có tính cảm nhiễm) và Virino. Số virút đã được
đặt tên là khoảng 4000 loài [2,7].
Xạ khuẩn - danh pháp khoa học là Actinobacteria, tiếng Anh là Actinomycetes
là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Trước
kia được xếp vào tản thực vật (tức nấm), nhưng ngày nay chúng được xếp vào vi
khuẩn (Schizomycetes). Xạ khuẩn có nhiều nét khác với nấm nhưng giống vi
khuẩn: có giai đoạn đơn bào và có giai đoạn đa bào, kích thước rất nhỏ, nhân giống
với vi khuẩn, không có màng nhân và tiểu hạch, vách tế bào không chứa cellulose
hoặc chitin, giống với vi khuẩn, phân chia tế bào giống với vi khuẩn (kiểu
Amitose). Xạ khuẩn không có giới tính (không có tế bào đực cái), hoại sinh và ký
sinh [2,5].

Vi khuẩn Escherichia
coli

Nấm men
Saccharomyces
cerevisae
Nấm sợi Alternaria Vi tảo Chlorella
Hình 1.1.Hình ảnh một số vi sinh vật
1.1.2. Vai trò của vi sinh vật trong tự nhiên
Phân giải các hợp chất hữu cơ. Làm nguồn thức ăn bổ dưỡng cho các sinh
vật hóa dị dưỡng hữu cơ khác, tức là chuyển hóa nhanh các chất hữu cơ trong chu
trình thức ăn. Làm nguồn thức ăn cho các loại giun, sâu bọ tạo ra mạng lưới thức

5

ăn. Biến đổi các chất để các cơ thể khác nhau có thể sử dụng được. Biến đổi rất lớn
các chất bằng cách hình thành các chất hòa tan và khí, từ đó tạo ra các chất tham gia
vào con đường chuyển hóa trực tiếp hoặc biến đổi môi trường một cách gián tiếp.
Hình thành các chất ức chế làm giảm hoạt động của các vi sinh vật khác, của thực
vật và động vật. Số lượng và chủng vi sinh vật trong tự nhiên là rất lớn, rất đa dạng
và luôn biến đổi. Ở một số nơi, số vi sinh vật phụ thuộc vào nguồn chất dinh dưỡng,
các chất độc hại và các tác nhân tới hạn khác. Vi sinh vật có vai trò quan trọng
trong vòng tuần hoàn các nguyên tố C, N, S, P… và có khả năng chuyển hóa các
hợp chất độc hại chứa kim loại nặng như bạc, vàng, thủy ngân, đồng… thành các
dạng không độc hại hoặc ít độc hơn đối với cơ thể người động vật và cây trồng [7].
1.1.3. Vai trò của vi sinh vật trong đời sống
Sử dụng vi sinh vật trong lên men đồ uống, lên men lactic, ủ chua thức ăn
gia súc, sử dụng những tác nhân ức chế vi sinh vật trong bảo quản thực phẩm, giữ
vệ sinh môi trường làm việc và hoạt động sống.
Vi sinh vật, đặc biệt là vi khuẩn – mô hình lý tưởng trong công nghệ di
truyền và công nghệ sinh học. Một số vi sinh vật là tác nhân gây bệnh trên người,
động vật và cây trồng. Hiện có khoảng 1000 loài virút gây bệnh trên thực vật, gần
90% các bệnh đường hô hấp ở người là do virút, trong đó có bệnh viên đường hô

hấp cấp (bệnh SARS), HIV/AIDS vẫn là đại dịch chưa có thuốc chữa khỏi, các
bệnh vi khuẩn trên người cũng rất nhiều như viên xoang mũi (Staphylococcus sp),
bạch hầu (Corynebacteriumdiphtheria), ho gà (Bordetella pertusis), lao phổi
(Mycobacterrium tuberculosis) [7].
1.1.4. Vi sinh vật biển
Biển là môi trường sống rất đặc biệt, vì ở đó nghèo chất dinh dưỡng và độ
mặn cao. Biển là một hệ sinh thái tự nhiên lớn nhất địa cầu vì hơn 70% bề mặt trái
đất được bao phủ bởi nước. Vi sinh vật biển có khả năng thích nghi với các điều
kiện môi trường biển luôn bị thay đổi, điều này mở ra các triển vọng phát triển các
hợp chất hữu cơ thứ cấp duy nhất. Số lượng vi sinh vật biển không cao như trên

6

cạn. Vi sinh vật biển có thể phân lập được từ trầm tích biển, nước biển, từ các đối
tượng mà hoạt động hoặc bất động mà vi sinh vật có thể cộng sinh. Hiểu được qui
luật phân bố của vi sinh vật biển sẽ làm dễ dàng và tạo điều kiện thuận lợi để thu
thập chúng từ các vật mẫu thích hợp cho việc phân lập định hướng các nhóm vi sinh
vật có hoạt tính sinh học đã được phân loại [1,2,10].
Với mức đa dạng sinh học cao thì các vi sinh vật biển đóng vai trò quan
trọng đối với vòng tuần hoàn sinh địa hóa các nguyên tố cơ bản. Những vi sinh vật
này có thể tìm thấy ở bất kỳ ngõ ngách nào ở đại dương từ trên bề mặt đến dưới
thềm đáy biển, trên các cơ thể sinh vật biển hay cả giữa những dòng hải lưu. Dưới
5% số tế bào vi khuẩn quan sát được ở các mẫu sinh vật lấy từ biển là có thể phát
triển trong các môi trường nuôi cấy nhân tạo. Và người ta ước tính rằng số vi khuẩn
biển hiện giờ đã có thể nuôi cấy và phân lập chỉ chiếm dưới 1% số loài trong thực
tế. Vi sinh vật biển từ lâu đã được biết đến như một trong số các nguồn tài nguyên
quan trọng sản sinh các chất với cấu trúc hóa học đa dạng và có hoạt tính sinh học
mới. Ngoài ra, vi sinh vật biển cũng đã được nghiên cứu ứng dụng trong nhiều lĩnh
vực của đời sống nhờ các tính chất đặc hiệu của chúng [1,2].
1.2. Nghiên cứu về đa dạng vi sinh vật biển Việt Nam

Việt Nam có tiềm năng to lớn về tài nguyên biển, với hệ sinh vật biển đa
dạng và phong phú. Đất nước ta nằm trong khu vực biển Thái Bình Dương, sở hữu
hơn 1 triệu km
2
vùng biển. Kết quả thống kê đến nay đã thông báo 12000 loài động
thực vật biển ở Việt Nam, trong đó có rất nhiều loài có độc tính sinh học tiềm tàng.
Tuy nhiên, việc điều tra nghiên cứu để khai thác tiềm năng đó vẫn còn hạn chế.
Nghiên cứu, phát triển, khai thác những nguồn tài nguyên sinh vật biển đang là vấn
đề cấp bách không chỉ nước ta mà trên toàn thế giới [1].
Để có thể đánh giá và nghiên cứu sử dụng các vi sinh vật biển, trong nghiên
cứu về đa dạng sinh học vi sinh vật biển thuộc vùng biển Cát Bà, Hải Phòng, tác giả
Lại Thúy Hiền và cộng sự (Viện Công nghệ sinh học, Viện HLKHCNVN) đã khảo

7

sát, phân tích và thống kê sự có mặt của vi sinh vật từ các mẫu nước biển Cát Bà
[4]. Kết quả cho thấy khu hệ vi sinh vật ở vịnh Lan Hạ - Cát Bà rất đa dạng và
phong phú bao gồm cả vi khuẩn hiếu khí, nấm mốc, nấm men, xạ khuẩn, vi khuẩn
lên men, vi khuẩn chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ, vi khuẩn sử dụng các
hyđrocacbon và vi khuẩn khử sulphat.
Bảng 1.1. Số lượng một số nhóm vi sinh vật trong các mẫu nước biển và trầm tích tại Cát Bà
Tọa độ
Hiếu khí
Nấm
mốc
Nấm
Men
Xạ
khuẩn Lên men

Sử dụng
hyđrocacbon
Nitrit
hóa
Nitrat
hóa
Khử
nitrat

Khử
sulphat
20°43’820” 10
5
4 x 10
1
0 0 10
4
10
4
10
2
10 5x 10
1

5 x 10
1

107°4’480” 2 x 10
7
8 x 10

4
0 0 10
5
10
5
10
5
10
2
10
2
10
5

20°45’263” 10
5
0 0 0 10
5
10
4
10
l
10
3
10
3
10
107°04’02” 1,7 x 10
7
0 0 0 10

6
5 x 10
5
10
3
10
3
10
4
10
4

20°45’915” 10
6
2 x 10
2
0 0 10
4
5 x 10
4
10
2
10
4
10
4
10
107°03’519” 1,8 x 10
7
10

4
0 0 5 x 10
5
10
5
10
4
10
4
10
4
10
5

20°46’175” 10
6
2 x 10
2
0 10 10
5
5 x 10
4
10
2
10
2
5x10
2
10
107°04’906” 1,6 x 10

7
4 x 10
4
0 0 10
6
5 x 10
5
10
4
10
6
10
6
10
5

20°46’886” 10
6
0 0 0 10
5
5 x I0
4
10
2
10
3
10
3
10
2

107
o
06’001 1,7 x 10
7
2 x 10
2
0 0 10
7
5 x 10
5
10
4
10
6
10
6
5 x 10
5

20°47’563” 10
6
6x 10
1
0 10 10
5
5 x 10
4
10
2

10
2
10
2
10
l

107
o
06’584” 3,4 x 10
7
4 x 10
2
0 0 10
6
10
5
10
4
10
6
5x10
5
5 x 10
5

20°45’702” 10
6
2 x 10
1

2 x 10
1
0 10
4
5 x 10
4
10
2
10
2
5x10
2
10
2

107°07
’
625” 1,7 X 10
7
0 0 0 10
5
10
5
10
4
10
4
10
4
5 x10

5

20°45’356” 10
5
4 x10
1
0 0 10
5
5 x10
4
10
2
10
2
10
2
10
107°07’758” 1,8 X 10
7
0 0 0 10
6
10
5
10
3
10
3
10
3
5 x 10

5

20°44’161” 10
6
0 2 x10
1
0 5 x 10
4
5 x10
4
10
2
10
4
10
4
10
2

107°03’853” 1,7 x 107 8 x10
2
0 0 10
7
5 x 10
5
10
3
10
6
10

6
5 x 10
5

20°44’496” 10
6
0 0 10 10
4
5 x 10
4
10
4
10
2
10
3
10
107°03’513 1,9 x 10
7
0 0 0 5 x 10
5
5 x 10
5
10
4
10
6
10
6
10

4

Đánh giá phân loại vi khuẩn từ một số mẫu nước và trầm tích chọn lọc cho
thấy các chủng vi khuẩn Gram âm chiếm ưu thế hơn các chủng Gram dương. Các

8

chủng Gram âm phân loại được thuộc các chi: Acinobacter, Pseudomonas,
Flavobacterium, Sphingomonas, Ochrobactrum còn vi khuẩn Gram dương chỉ có
Bacius, Janibacier. Các loài vi khuẩn phân lập đều có tỷ lệ tương đồng rất cao 93 -
100% so với các chủng trong ngân hàng dữ liệu. Trong khi đó, đối với các loại nấm
men, nấm mốc, xạ khuẩn tại Cát Bà chủ yếu bao gồm Candida, Rhodotorula,
Cladosporium, Penicillium và Steptomyces (bảng 1.2).
Bảng 1.2. Kết quả phân loại một số chủng vi khuẩn thuộc Cát Bà
TT

Mẫu

Tên

Độ tương đồng

1

Nước bề mặt

Pseudomonas vesicularis

93,3%

2

Nước bề mặt

Flavobacterium indologenes

79,1%

3

Nước bề mặt

Pseudomonas vesicularis

93,3%

4

Nước bề mặt

Pseudomonas aeruginosa

99,9%

5

Nước bề mặt

Sphingomonas paucimobilis

99,7%

6

Nước bề mặt

Acinetobacter johnsonii

89%

7

Nước bề mặt

Pseudomonas cepacia

99%

8

Trầm tích

Ochrobactrum cytisis

100%

9

Trầm tích

Bacillus megatherium

100%

10

Nước bề mặt

Janibacter marinus

100%


Bảng 1.3. Kết quả phân loại một số chủng nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn tại Cát Bà
TT

Mẫu

Tên

1

Nước tầng giữa

Penicillium duclauxe

2

Trầm tích

Penicillium oxalicum

3

Nước bề mặt

Cladosporium sphaerospermum
4

Nước bề mặt

Penicillium oxalicum

5

Nước bề mặt

Candida parasilosis

6

Nước bề mặt

Rhodotorula mucilaginosa 2

7

Nước bề mặt

Streptomyces celluloflavus

8

Nước bề mặt

Streptomyces sclerotialus


9

Cũng trong một nghiên cứu tương tự, Tống Kim Thuần và cộng sự (Viện
Công nghệ sinh học) đã công bố nghiên cứu đa dạng vi sinh vật trên các mẫu nước
biển, động, thực vật và trầm tích ở các vùng biển khác nhau của Việt Nam, như
Quảng Bình, Bình Định, Phú Yên, Nha Trang, đảo Trường Sa, Hải Phòng và Nam
Định [11]. Từ 10 mẫu nước, 12 mẫu trầm tích, 2 mẫu san hô và 1 mẫu rong ở các
địa điểm và các vị trí lấy mẫu khác nhau của biển Việt Nam, tác giả đã phân lập và
xác định số lượng các nhóm vi sinh vật biển (bảng 1.4).
Bảng 1.4. Số lượng và số chủng vi sinh vật tách được trong các mẫu nước biển Việt Nam
Địa điểm
lấy mẫu
Đặc điểm mẫu
Vi khuẩn Nấm sợi Nấm men Xạ khuẩn
CFU/ml SCTĐ CFU/ml SCTĐ CFU/ml

SCTĐ CFU/ml

SCTĐ
Cửa Đà

Rằng

Gần bờ, độ
sâu 4,7 m,
độ mặn 2,5%
3,3x10
1
19 3,7x10
1
9 0 0 2,3x10
1
10
Vịnh Quy
Nhơn
Xa bờ, độ sâu 1,7 m,
độ mặn 3%
7,2x
10
2
25 0,8x10
1
5 0,4x10
1
1 0 0
Xa bờ, độ sâu l,5 m,
độ mặn 3%
5,1x10
2

29
1,1x10
1

9 0 0 0,3x10
1
1
Xa bờ, độ sâu 1,8 m,
độ mặn 3%
3,4x10
2
17 3,3x10
1
8 0,5x10
1

2
0 0
Đảo
Trường Sa
Xa bờ, độ
sâu 0,2 m,
độ mặn 3%
7,6x10
3
11 0,7x10
1
5 0 0 5,0x10
1
1
Biển Hả
i
Phòng
Ao nuôi rong tảo,

nước lợ
1,0x10
3
17 2,0x10
1
5 0 0 5 1
Đảo Cát Bà

Nước ở độ sâu 6 m,
độ mặn 3%
7,0x10
2
30 10
1
2 0 0 3 1
Hạ Long
Nước ven bờ, độ mặ
n
2%
3,2x10
3
20 2 x10
2
4 2 2 5 2
Nam Định
Nước nuôi tôm, độ
mặn 2%
1,2x10
1
32 4,2 x10

2
10 2,0x10
2
3 2,8x10
1
4
Nha Trang

Cửa sông, nước lợ
5,2x10
3
15 2,6x10
1
3 3,2x10
2
9 8 2
Tổng số chủng: 314 215 60 17 22
Ghi chú: CFU: đơn vị hình thành khuẩn lạc; SCTĐ: sổ chủng tách được


10

Bảng 5. Số lượng và vi sinh vật tách được trong các mẫu trầm tích biển Việt Nam
Địa điể
m
lấy mẫu

Đặc điếm mẫu
Vi khuẩn Nấm sợi Nấm men Xạ khuẩn
CFU/g SCTD CFU/g SCTĐ CFU/g SCTĐ CFU/g SCTĐ

Bình

Định

Gần bờ, độ sâu 0,7 m,
độ mặn 2%

4,2x10
3

23

1,1x10
2

7

0

0

2x10
2

1

Gần bờ, ở độ
sâu 0,9 m,
độ mặn: 2%

1,3x10
4

12

9,3x10
1

6

0

0

1,7x10
2

3

Gần bờ, độ sâu 2,1 m,
độ mặn 2%

2x10
4

13

7,5x10
1

6

0

0

8,8x10
l

2

Gần bờ, độ sâu 1,2 m,
độ mặn 2%

2,2x10
4

9

2x10
2

4

0

2

0

0

Độ sâu: 2,l m, độ mặn:
2%

2,2x10
4

7

1,1x10
2

3

0

0

1,1x10
3

4

Xa bờ, độ sâu 9,1 m, độ

mặn 2%

3,7x10
2

9

1,3x10
2

2

0

0

0

0

Quảng

Bình

Gần bờ, độ sâu 2 m, độ
mặn 2%

1,3x10
4

44

3,2x10
2

1

0

0

0

0

Xa bờ, độ sâu 10,3 m,
độ mặn 2%

9,6x10
3

6

2,2x10
2

8

0

0

0

0

Gần bờ, độ sâu 2,6 m,
độ mận 2%

2,1x1o
4

23

0

0

0

0

0

0

Xa bờ, độ sâu 11,6 m,
độ mặn 2%

3,7x10
3

6

7,8x10
2

7

0

0

5x10
1

1

Xa bờ, độ sâu 33 m, độ
mặn 2%

5,6x10
4

12

0

0

2x10
3

1

0

0

Xa bờ, độ sâu 4,8 m, độ

mặn 2%

1,2x10
4

18

6,9x10
1

3

2,5x10
1

1

0

0

Tổng số: 244

182


47


4

11

Ghi chú: CFU: đơn vị hình thành khuẩn lạc; SCTĐ: sổ chủng tách được
Nhóm xạ khuẩn từ lâu đã được biết đến như là nguồn sản sinh các hợp
chất có hoạt tính sinh học cao và luôn là đối tượng được quan tâm nghiên cứu
nhiều. Từ các mẫu đất và lá cây mục thu tại Cát Bà đã phân lập được 424 chủng xạ
khuẩn [2,6]. Trong số các chủng này, 353 chủng (83,25%) phân lập được từ đất và
71 chủng (16,75%) từ mẫu lá cây mục. Các chủng xạ khuẩn phân lập đã được xác
định tên và phân thành 2 nhóm Streptomyces và non-Streptomyces (xạ khuẩn

11

hiếm). Nhóm Streptomyces bao gồm 296 chủng (chiếm khoảng 69,81%) và 128
chủng thuộc nhóm xạ khuẩn hiếm non-Streptomyces (chiếm khoảng 30,19%). Như
vậy, có thể thấy các chủng thuộc nhóm Streptomyces chiếm số lượng đông đảo
hơn. Mặt khác, xét về mức độ đa dạng, có thể thấy các chi Micromonospora,
Nonomureae và Nocardia là các chi chiếm ưu thế trong các chi xạ khuẩn hiếm
(non-Streptomyces) thu thập tại Cát Bà. Các loài thuộc ba chi này cũng thường
được phân lập ở các địa điểm khác ở Việt Nam [20].
Tuy đây mới chỉ là những nghiên cứu bước đầu, nhưng đã cho thấy bức tranh
sơ bộ về đa dạng sinh học các chủng xạ khuẩn có tại đảo Cát Bà, một vườn quốc

gia có đa dạng sinh học cao ở Việt Nam.
Bảng 1.5.Xạ khuẩn từ đảo Cát Bà

C
á
c

n
h
ó
m

x
ạ
kh
u
ẩ
n

S
ố
l
ượ
n
g
ch
ủ
n
g

%
Streptomyces 296 69,81
Micromonospora 27 6,36
Nonomuraea 17 4,00
Nocardia 12 2,83
Kineosporia 8 1,90
Microbispora 7 1,65
Actinomadura 7 1,65
Pseudonocardia 6 1,42
Nocardiopsis 6 1,42
Micrococcus 5 1,18
Streptosporangium 5 1,18
Khác (mỗi loại ít hơn1%) 28 6,60
T
ổ
n
g

c
ộ
n
g

424 100,00
1.3. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của vi sinh vật biển trên thế giới
Vi sinh vật biển bao gồm vi khuẩn và nấm được xem là nguồn mới nhiều
tiềm năng cho việc cung cấp các hợp chất có hoạt tính sinh học cao. Nhiều loại vi
sinh vật biển sinh sống trong các điều kiện khắc nghiệt, chính bởi vậy chúng thường

12

sản sinh các hợp chất có hoạt tính sinh học lý thú [1,2,10,11]. Từ dòng vi khuẩn
dưới biển sâu, người ta tách được một hợp chất Macrolid (1) mới gây độc tế bào.
Khi nuôi cấy chúng, sản sinh ra một loại chất mới mà trên cạn chưa từng có như
Macrolactin A (2), có tác dụng ức chế tế bào ung thư, bảo vệ tế bào limpho T,
chống virút HIV [40]. Tuy nhiên, nuôi cấy và phân lập các vi sinh vật biển là công
việc rất khó khăn. Nguyên nhân việc khó nuôi cấy là do ở biển khơi nghèo chất
dinh dưỡng, có độ muối khác nhau, vi sinh vật biển đã thích nghi với việc đói và
môi trường nghèo nên không phát triển trên môi trường giầu chất dinh dưỡng hơn.
Người ta đã sử dụng các môi trường và các phương pháp khác nhau để tách các
nhóm vi sinh vật biển khác nhau [10].

Vi sinh vật cộng sinh với thực vật và động vật không xương sống có ý nghĩa rất
lớn trong việc tách chiết các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học. Một trong những
loài vi khuẩn cộng sinh với bọt biển là Rhopaloeides odorabile. Ngoài ra rất nhiều loài
vi khuẩn lạ thường và chưa được mô tả thường cộng sinh với tảo biển. Khoảng 30% vi
khuẩn cộng sinh với tảo xanh (Hamimeda sp.) và tảo nâu (Lopophora sp.) có thể nuôi
cấy được là vi khuẩn Gram dương (+). Các vi khuẩn Gram (+) thường gặp ở trầm tích
biển và chúng có khả năng sinh các chất thứ cấp có hoạt tính diệt côn trùng, các
enzyme gây độc cho tế bào [37]. Từ nấm sợi cộng sinh với tảo nâu biển Roseuvuigea
cũng tách được chất kháng sinh mới Pestanlone ức chế sinh trưởng vi khuẩn [35]. Các
chất chống oxy hóa Superoxidase glutathione (SOD) và một số dẫn suất mới
Hydroquinone, Oxepinamides A-C, Fumiquinazolines H-1 cũng được tách chiết từ vi

13

khuẩn biển và nấm sợi biển Acremonium sp. [12]. Xạ khuẩn biển cũng là nguồn tách
chiết các chất có hoạt tính sinh học mới mà các nguồn trên cạn không có. Ngoài các
hợp chất kháng sinh được tách từ nhóm xạ khuẩn Streptomyces. Diazepinomicin- một
hợp chất alkaloid mới kháng khuẩn cũng được tách ra từ xạ khuẩn biển

Micromonospora [10].
Do đó, các loài sống dưới đáy biển thường rất đặc biệt và có chứa các hợp chất
có khung cacbon rất khác biệt, đồng thời các hợp chất này thể hiện nhiều hoạt tính
sinh học đa dạng.
1.3.1. Hoạt tính kháng lao
Một trong những hợp chất chống lao đầu tiên được phát hiện từ loài vi khuẩn
biển là hợp chất streptomycin (3) được phân lập từ loài xạ khuẩn Streptomyces
griseus vào năm 1944 [22]. Tiếp theo phải kể đến là rifampicin (4) (một kháng sinh
chủ yếu dùng để điều trị lao hiện nay) là một kháng sinh bán tổng hợp từ rifamycin,
một hợp chất được phân lập lần đầu tiên từ Streptomyces mediterranei vào năm
1959 [43]. Trong một nghiên cứu gần đây, Zhang và cộng sự đã phân lập hai hợp
chất có hoạt tính chống lao rất đáng quan tâm là actinomycin X
2
(5) và actinomycin
D (6) từ loài Streptomyces sp. MS449 có trong bùn biển [17].



14

Trong một nghiên cứu khác, khi nghiên cứu về một số loài vi sinh vật biển
Pseudomonas, hai dipeptide vòng là massetolide A (7) và viscosin (8) đã được phân
lập và xác định cấu trúc hóa học. Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng lao trên
Tubercle bacillus và Mycobacterium avium-intracellulare cho thấy massetolide A
thể hiện hoạt tính ức chế với giá trị MIC là 5–10 và 10–20 mg/mL. Trong khi
viscosin thể hiện giá trị MIC 2,5–5 và 5–10 mg/mL tương ứng đối với Tubercle
bacillus và Mycobacterium avium-intracellulare [21]. Các chủng thuộc
Streptomyces luôn là đối tượng quan tâm nghiên cứu của nhiều nhóm trên thế giới
do có thể sản sinh nhiều các hợp chất có cấu trúc lý thú và hoạt tính sinh học đa
dạng. Hai hợp chất peptide vòng là cyclo-D-Pro-D-Leu và cyclo-D-Pro-D-Val được

phân lập từ loài vi khuẩn biển LS247 tương đồng với chủng Streptomyces puniceus
thể hiện hoạt tính kháng lao đối với chủng Tubercle bacillus với giá trị MIC lần lượt
là 7,1 và 18,5 mg/mL [48]. Cũng trong một nghiên cứu của chương trình sàng lọc
về loài vi khuẩn biển Streptomyces platensis, hợp chất tự nhiên có cấu trúc hóa học
rất lý thú là platensimycin (9) đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa học. Các
khảo sát về hoạt tính sinh học cho thấy hợp chất này rất có tiềm năng trong nghiên
cứu ứng dụng trong y dược do có hoạt tính rất mạnh với việc kháng các chủng vi
khuẩn gram (+) với phổ rất rộng [14].

1.3.2. Hoạt tính chống ung thư
Hoạt tính chống ung thư của các hợp chất thứ cấp được các loài vi sinh vật biển
sản sinh cũng cho thấy vi sinh vật biển là nguồn quan trọng trong nghiên cứu tìm
kiếm các chất có hoạt tính sinh học. Trong số các hợp chất này, nhiều hợp chất có
chứa khung cấu trúc hóa học đặc biệt, chưa từng phát hiện từ các nguồn khác. Các
hợp chất lagunapyrones A-C (10-12), được phân lập từ xạ khuẩn (actinomycete,
CNB-984) từ bùn biển cho thấy khả năng chống ung thư rất đáng quan tâm [51].

15


Bisucaberin (13) là một dimer vòng của 2 phân tử l-hydroxy-l,6-diazaundecane-
2,5-dione đã được phân lập từ loài khuẩn đáy biển Alteromonas haloplanktis SB-
112. Cấu trúc hóa học của hợp chất này đã được khẳng định bằng phương pháp
nhiễu xạ tia X. Hoạt tính chống ung thư của bisucaberin được biết đến nhờ khả năng
ức chế quá trình sinh tổng hợp DNA của tế bào ung thư [32].


Nghiên cứu về loài khuẩn biển Alteromonas sp., Kobayashi và cộng sự đã phân
lập và xác định cấu trúc của hợp chất alkaloid là alteramide A (14). Các kết quả
khảo sát hoạt tính chống ung thư cho thấy alteramide A có khả năng ức chế sự phát

triển của các dòng tế bào ung thư P-388, L-1210 và KB [30]. Halobacillin (15) là
một acylpeptide vòng mới thuộc lớp chất iturin được phân lập từ loài khuẩn
Bacillus lấy từ mẫu bùn biển. Hợp chất này cũng cho thấy khả năng ức chế sự phát
triển của một số dòng tế bào ung thư [31].