Nghiên cứu khả năng tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter dưới tác dụng của tác nhân gây đột biến tia UV

LỜI CẢM ƠN
Khóa trọng, em xin
Đại học Sư phạm Hà
Bằng tất cả lịng kính luận tốt nghiệpđược bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Đinh Thị Nội 2
Kim Nhung đã tận tình hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ em trong suốt q trình hồn thành luận văn
này.
Em xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy Nguyễn Khắc Thanh, thầy Phương Phú
Công đã truyền đạt những kiến thức quý báu cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong
suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài bộ môn.
Em cảm ơn chân thành tới các bạn cùng nhóm đề tài bộ mơn vi sinh, trường Đại học sư
phạm Hà Nội 2 đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong q trình hồn thành đề
tài nghiên cứu.
Cuối cùng em xin được cảm ơn gia đình, những người thân, bạn bè đã quan tâm, động viên,
giúp đỡ em trong suốt thời gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn.
Hà Nội, ngày tháng năm 2013 Sinh viên thực hiện

Nguyễn Ngọc Mai

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những gì viết trong luận văn này đều là sự thật. Đây là kết quả nghiên cứu
của riêng tôi. Tất cả các số liệu đều được thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số
liệu sao chép hay bịa đặt, khơng trùng với kết quả đã công bố. Trong tài liệu này tôi có sử dụng một
số tài liệu của một số tác giả, tôi xin phép tác giả để bổ sung cho luận văn của mình.
Nếu sai tơi hồn tồn chịu trách nhiệm.
Hà Nội, ngày tháng năm 2013 Sinh viên

Nguyễn Ngọc Mai

Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2


DANH MUC CÁC TỪ VIÉT TẮT
BC
PMG

Khóa luận tốt nghiệp cellulose
: Bacterial

Dai hoc Su pham Hà Nôi 2

: Phosphoglucomutase

UGP

: Glucose-1-phosphate uridylytransferase

1PFK

: Fructose-1-phosphate kinase

Pru-6-P

: Fructose-6-phosphate

Glc-1-P

: Glucose-1-phosphate

UDPGlc

: Uridine diphospho glucose

GK

: Glucokinase

FBP

: Fructose-1,6-biphosphate phosphatase

G6PDH

: Glucose-6-phosphate dehydrrogenase

PGI

: Phosphoglucoisomerase

PTS

: Hê thông Phosphotransferase

Fru-bi-P

: Fructose-1,6-bi-phosphate

Glc-6-P

: Glucose-6-phosphate

PGA

: Phosphogluconic acid

FK

: Fructokinase

es

: Cellulose synthate

CFU

: Clony Forming Unit

uv

: Ultra Violet

vsv

: Vi sinh vât

Cs

: Công su

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Ngày nay công nghệ sinh học đang dần trở thành một ngành kĩ thuật chủ đạo
của nhiều quốc gia trên thế giới. Gắn liền với nó là cơng nghệ vi sinh với những


thành tựu lớn có ý nghĩa trong đời sống, trong các ngành cơng nghiệp, y học...Vi
khuẩn Gluconacetobacter thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm hiếu khí bắt buộc, hố
Khóa luận tốt nghiệp
Dai hoc Su pham Hà Nôi 2
dưỡng thuộc chi Acetobacter, họ Acetobacteraceae. Khi nuôi cấy vi khuẩn này trên
môi trường dịch lỏng, chúng sẽ hình thành trên bề mặt một lớp màng BC, đó là tập
hợp các tế bào vi khuẩn liên kết với phân tử cellulose. Màng BC cấu tạo bởi những
chuỗi polimer-P-1,4 glucopyranose không phân nhánh được tổng hợp từ một số lồi
vi khuẩn khi ni cấy chúng trên môi trường dịch lỏng.
Màng BC do Gluconacetobacter tạo ra có cấu trúc hóa học và đặc tính cơ học
giống với cellulose của thực vật nhưng có thêm một số tính chất hóa lý đặc biệt như:
độ bền học, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, tính đàn hồi lớn, khả năng thấm
hút nước nhanh, khả năng polymer hóa rất lớn. Vì vậy BC được ứng dụng rộng rãi
trên thế giới trong rất nhiều lĩnh vực công nghệ.
Trên thế giới màng BC đã được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực công
nghệ khác nhau: như dùng làm màng phân tách cho q trình xử lí nước, chất mang
đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào,dùng làm chất biến đổi độ nhớt trong
sản xuất các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay
thay thế thực phẩm. Đặc biệt trong lĩnh vực y học, màng BC đã được ứng dụng làm
da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo
điếu trị các bệnh tim mạch; làm mặt nạ dưỡng da cho con người.
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC còn ở mức độ khiêm tốn,

các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu nghiên cứu. Các kết quả ứng
dụng của màng BC hầu như mới chỉ dừng lại ở điều kiện thí nghiệm. Trong những
năm gần đây phịng thí nghiệm Vi sinh Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 phân lập
tuyển chọn được chủng Gluconacetobacter có khả năng tạo màng BC và những
nghiên cứu bước đầu cho thấy màng BC từ chủng Gluconacetobacter có khả năng
ứng dụng cho trị bỏng cho thỏ là cơ sở để tạo ra màng trị bỏng cho người. Màng BC
hoàn tồn có thể sản xuất trong nước bằng phương pháp lên men tĩnh của vi khuẩn
Gluconacetobacter trong môi trường lỏng. Tuy nhiên một vấn đề gặp phải là chủng
Gluconacetobacter dễ bị thối hóa. Vì vậy việc khơng ngừng nâng cao hoạt tính sinh


tổng hợp cellulose là rất cần thiết. Chính vì lý do đó, với mong muốn tuyển chọn
được chủng có khả năng tạo màng BC trong thời gian nhanh hơn, dai hơn chủng
Khóa luận tốt nghiệp
Dai hoc Su pham Hà Nơi 2
Gluconacetobacter tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu khả năng tạo màng
BC từ chủng Gluconacetobacter dưới tác dụng của tác nhân gây đột biến tia uv ”
2. Mục tiêu đề tài
Tuyển chọn được chủng đột biến từ chủng Gluconacetobacter có khả năng
tạo màng BC trong thời gian ngắn.
3. Nội dung đề tài
3.1.

Xác định thời gian đột biến dưới tác nhân đột biến tia uv

3.2.

Gây đột biến và tuyển chọn chủng đột biến.
3.3. Xác định sự thay đổi hình dạng tế bào, hình thái khuẩn lạc của
chủng trước và sau khi đột biến.

4. Ý nghĩa khoa học
Chọn chủng sau đột biến tị chủng Gluconacetobacter có khả năng tạo
màng BC trong thời gian ngắn.
5. Ý nghĩa thực tiễn
Tạo màng BC trong thời gian ngắn nhất và tốt nhất có triển vọng ứng dụng vào
một số lĩnh vực trong cuộc sống, đặc biệt là lĩnh vực y học.
6. Điểm mới
Chọn được chủng sau đột biến từ chủng Gluconacetobacter có khả
năng tạo màng BC trong thời gian ngắn, dai hơn chủng gốc.
NÔI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vị trí và đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới

1.1.1.

Vị trí phân loạỉ của Gluconacetobacter trong sinh giới
Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì Gluconacetobacter thuộc

giống

Acetobacter,

họ

Pseudomonadaceae,

bộ

Pseudomonadales,

lớp

Schizommycetes. Việc phân loại vi khuẩn này cịn nhiều tranh cãi, có một số tác giả
coi Gluconacetobacter như một loài phụ của A. aceti [17].


1.1.2.

Đặc điểm phân loại

1.1.2.1.

Đặc điểm hình thái, tể bào học
Khóa luận tốt nghiệp
Dai hoc Su pham Hà Nơi 2
Gluconacetobacter có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước khoảng

2|xm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, khơng có khả năng di động,
khơng sinh bào tử. Các tế bào được bao bọc bởi chất nhày tạo váng nhăn và dày.
Váng có chứa hemicellulose nên khi gặp H2SO4 và thuốc nhuộm iôt sẽ bắt màu xanh
(do phản ứng của hemicellulose), chúng có thể tích luỹ 4,5% acid acetic trong môi
trường. Khi nồng độ acid acetic quá cao vượt quá giới hạn cho phép, nó sẽ ức chế
hoạt động của vi khuẩn [13].
Vi khuẩn Gluconacetobacter thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt
buộc, hố dị dưỡng. Tế bào của chúng thường tìm thấy trong giấm, dịch rượu, nước
ép hoa quả, trong đất.


Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Hình 1.1. Vi khuẩn Gluconacetobacter
1.2.2.2.

Đặc điểm nuôi cấy
Trên môi trường thạch đĩa, vi khuẩn Gluconacetobacter hình thành khuẩn lạc nhẵn

hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hay gợn sóng, màu trắng hoặc trong suốt,
khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên dễ tách khỏi môi trường. Vi khuẩn Gluconacetobacter
khi nuôi cấy trong môi trường lỏng ở điều kiện tĩnh, chúng sẽ hình thành trên bề mặt
mơi trường một lớp màng BC.
Ngược lại trong điều kiện ni lắc, cellulose hình thành dạng hạt nhỏ với kích
thước khơng đều nhau và phân tán trong môi trường dinh dưỡng tạo ra những đặc tính
hình thái khác hẳn cellulose trong điều kiện ni cấy tĩnh.
1.1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá Đặc
điểm sinh lý:
Vi khuẩn Gluconacetobacter phát triển ở nhiệt độ 25 - 35°c, pH: 4-6. Nhiệt độ và
pH tối ưu tuỳ thuộc vào giống. Ở 37°c, tế bào sẽ suy thối hồn tồn ngay cả trong mơi
trường tối ưu. Tuy nhiên vẫn cịn những ý kiến khác


Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

nhau và nhiều tranh cãi về điều kiện nhiệt độ, pH tối thích cho chủng vi khuẩn
Gluconacetobacter sinh trưởng và tạo màng.
Gluconacetobacter có khả năng chịu được pH thấp, vì thế thường bổ sung thêm

acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ.
Đặc điểm sinh hoá:
Năm 1950, Frateur [20] đã chính thức đưa ra một khóa phân loại mới căn cứ
vào các tiêu chuẩn: Khả năng oxy hóa acid acetic thành CƠ2 và H2O; hoạt tính
catalase; khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer [20]...Theo quan điểm này
Gluconacetobacter là chủng thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ
Pseudomonadales, lớp Schizomycetes. Đặc điểm phân biệt với các chủng khác trong
cùng một chi được trình bày ở bảng 1.1 dưới đây [20] :
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn Glucoĩlũcetobũcter
theo Frateur (1950)
STT
Đặc điểm
Hiện tượng
1
2
3

Oxy hoá ethanol thành Chun hố mơi trường chứa Bromphenol
acid acetic
Blue 0,04% từ màu xanh sang màu vàng
Hoạt tính catalase Hiện tượng sủi bọt khí
Sinh trưởng trên mơi Sinh khối khơng phát triển

trường Hoyer
Chuyển hoá glycerol Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch sau lên men
thành
dihydroxyaceton
5 Chun hố glucose Vịng sáng xt hiện xung quanh khuân lạc
thành acid
trên môi trường chứa CaC0

6
Kiểm tra khả năng Khơng hình thành sắc tố nâu
sinh sắc tố nâu
7 Kiểm tra khả năng Váng vi khuẩn xuất hiện màu lam
tổng hợp cellulose
1.1.3.
Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Gluconacetobacter
4

3

1.1.3.1.

Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Kết quả
+
+
+

+
+


Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Để vi khuẩn sinh trưởng và phát triển tốt hơn cần cung cấp nguồn cacbon phù
hợp. Tuỳ nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp là vô cơ hay hữu cơ. Giá trị

dinh dưỡng và khả năng hấp thụ cacbon phụ thuộc vào hai yếu tố: thành phần hoá học và
tính chất sinh lý của nguồn thức ăn, đặc điểm sinh lý của từng loại vi sinh vật.
Người ta sử dụng đường làm thức ăn nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật dị dưỡng.
Đường đơn ở nhiệt độ cao có thể bị chuyển hố thành loại hợp chất có màu tối khó hấp
thụ. Trong mơi trường kiềm sau khử trùng, đường cịn dễ bị chuyển hố làm biến đổi pH
môi trường. Để tránh hiện tượng này khi khử trùng mơi trường có chứa đường người ta
thường chỉ hấp ở áp lực 0,5atm ở 110° trong 30 phút. Từ các loại đường đơn tốt nhất nên
sử dụng phương pháp hấp gián đoạn (phương pháp Tyndal). Để nuôi cấy các loại vi sinh
vật khác người ta sử dụng các nồng độ đường không giống nhau, với vi khuẩn thường
dùng 0,5-0,2% đường. Hầu hết các vi sinh vật chỉ đồng hoá được các loại đường ở dạng
đồng phân D [1].
Các hợp chất hữu cơ chứa cả cacbon cả nitơ (pepton, nước thịt, nước chiết ngô,
nước chiết nấm men, nước chiết đại mạch,...) có thể vừa sử dụng làm nguồn cacbon, vừa
sử dụng làm nguồn nitơ đối với vi sinh vật [1].
1.1.3.2.

Nhu cầu nitơ của vi sinh vật
Nguồn nitơ vô cơ dễ hấp thu nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NĨỈ4 +. Tuy nhiên,

khi nuôi cấy vi khuẩn trong mơi trường có sử dụng NĨĨ4 + thì sau khi chúng đồng hóa
NĨỈ4 + trong mơi trường sẽ tích lũy anion vô cơ ( SO4 2", Cl" ...) làm hạ thấp rất nhiều trị
số pH của môi trường. Muối anion của các axit hữu cơ ít làm chua mơi trường hơn do đó
có lúc được sử dụng nhiều hơn (mặc dù đắt hơn).
Muối nitrat là nguồn thức ăn nitơ thích hợp với nhiều loại tảo, nấm sợi, xạ khuẩn
nhưng lại ít thích hợp với vi khuẩn, vì sau khi vi khuẩn sử dụng hết NC>3"cac ion kim
loại còn lại sẽ kiềm hóa mơi trường [1].


Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Vi sinh vật có khả năng đồng hóa tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ. Các thức
ăn này vừa là nguồn cacbon vừa là nguồn cung cấp nitơ cho vi sinh vật. Vi sinh vật
khơng có khả năng hấp thụ trực tiếp các protein cao phân tị, chỉ có các polypeptid khơng
chứa q 5 gốc axit amin mới có thể di chuyển trực tiếp qua màng tế bào chất của vi sinh
vật [1].
1.1.3.3. Hàm lượng ethanol trong dung dịch lên men
Ethanol được sử dụng như một cơ chất. Hàm lượng ethanol có thể thay đổi từ 210% V. Hàm lượng cao hơn sẽ làm giảm năng suất lên men. Theo Hong Joo Son lại cơng
bố hàm lượng ethanol có thể thay đổi từ 0,2-1% tốt nhất ở 0,6% . Theo Nodes, lượng
ethanol duy trì trong mơi trường ln giữ ở 3-3,5% . Các tác giả Ebner và Heừich, cho
lượng ethanol dùng từ 7-10% V. Để tránh hiện tượng oxy hố hồn tồn acid acetic cần
có một lượng ethanol sót trong sản phẩm từ 0,2-0,5% để ức chế tự tổng hợp enzyme oxy
hố acid acetic và muối acetate [1], [23].
Ngồi việc oxy hố ethanol, vi khuẩn acetic cịn có khả năng oxy hoá các rượu
khác thành các acid tương ứng.
1.2. Lược sử nghiên cứu về vi khuẩn A. xylỉnum trên thế giới và Việt Nam

1.2.1. Tình hình nghiên cứu Ả. xylỉnum trên thế giới
Hiện nay, vi khuẩn A. xylinum và ứng dụng của nó đang được sự quan tâm của
nhiều nhà khoa học trên thế giới. Tập trung theo hai hướng cơ bản:
Hướng thứ nhất: Chủ yếu là phân lập tuyển chọn, nghiên cứu các đặc tính sinh học
của A. xylinum từ đó xác định vị trí phân loại của chúng trong sinh giới.
Tiêu biểu là các nghiên cứu của Beijerinck, Frateur [20]. Trên cơ sở nghiên cứu
các đặc tính hình thái, ni cấy, sinh lý - sinh hóa các tác giả xác định nguồn gốc, đặc
điểm phân loại của A. xylinum. Các nghiên cứu của một số nhà khoa học Nhật Bản như
Kumiko Nanda và cs, p. M. Kutima; T.T. Kadere và cs [25]. Các tác giả phân lập tuyển
chọn và nghiên cứu đặc tính sinh học của A. xylinum, và một số chủng vi khuẩn acetic

Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

khác phân lập từ các sản phẩm lên men truyền thống của Nhật như Mnazi, Komesu,
Kurosu.
Hướng thứ hai: Nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp, đặc điểm và ứng dụng của
BC vi khuẩn A. xylỉnum.
Đó là các nghiên cứu về khả năng tổng hợp cellulose của các chủng A.xylỉnum;
ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp
cellulose. Mở đầu là s. Hestrin; M. Scharmn và cs [22], [27], [26], sau là một loạt các
nghiên cứu tương tự, [19], [21], [23].
Tiếp đến là nghiên cứu cơ chế tổng hợp màng BC, con đường chuyển hóa cacbon
trong vi khuẩn A. xylinum. Mở đầu là nghiên cứu của R.M. Brown và cs, K.Zaar [18].
Gần đây cơ chế sinh tổng hợp cenllulose, các hệ enzyme tham gia và con đường chuyển
hóa cacbon trong vi khuẩn A. xylinum mới dần được sáng tỏ [27].
Từ nửa sau thế kỷ XIX đến nay đã có rất nhiều cơng trình nghiên cứu về ứng
dụng của màng BC trong các lĩnh vực khác nhau. Đặc biệt là màng trị bỏng, sử dụng
màng BC đắp lên vết thương hở, vết bỏng và đã thu được kết quả tốt như Wan và Millon
đã được đăng ký bản quyền về làm màng BC từ A. xylinum dùng trị bỏng [28]. về sau có
nhiều tác giả khác cũng nghiên cứu về hướng này.
1.2.2.

Tình hình nghiên cứu Ả. xylỉnum ở Việt Nam
Trong điều trị bỏng, để giảm đau cho bệnh nhân, hạn chế mất dịch, máu qua vết

thương, hạn chế nhiễm khuẩn vết bỏng, kích thích biểu mơ hố ở bỏng nơng hay kích
thích tạo mô hạt ở bỏng sâu người ta thường sử dụng các loại vật liệu che phủ tạm thời.
Việc sử dụng các vật liệu che phủ tạm thời có nguồn gốc từ da dị loại để che phủ vết
thương phần mềm, vết bỏng đã được sử dụng từ rất lâu. Tuy nhiên, việc sử dụng những

loại da này cũng mới chỉ dừng lại ở cách sử dụng đơn giản, đó là da tươi. Mặc dù da dị
loại tươi có những ưu điểm, đặc biệt là khả năng bám dính tốt, nhưng nó cũng có những
nhược điểm nhất định. Hơn nữa, việc sử dụng lại ở thế bị động, bảo quản và xử lý phức


Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

tạp, khó có thể sử dụng rộng rãi trên lâm sàng. Vật liệu từ da đồng loại là lý tưởng nhất
cho việc che phủ vết thương, vết bỏng nhưng trong nhiều trường hợp rất khan hiếm;
khơng đủ đáp ứng được. Chính vì vậy vật liệu che phủ tạm thời từ các loại màng sinh
học là lựa chọn số một, có vai trò rất quan trọng trong điều trị bỏng. Một trong các loại
màng sinh học đã và đang được quan tâm ngày nay là màng cellulose vi khuẩn.
Tại Việt Nam việc nghiên cứu và sử dụng màng BC từ vi khuẩn A. xylỉnum ngày
càng được quan tâm . Có một số các nghiên cứu, công bố liên quan đến A. xylỉnum sự
hình thành màng BC và ứng dụng màng BC. Các cơng trình mới chỉ bước đầu nghiên
cứu q trình tạo màng, đặc tính cấu trúc màng làm cơ sở chế tạo màng trị bỏng [9]; sản
xuất thạch dừa [7]. Gần đây nhất là nghiên cứu ứng dụng màng BC làm chất nền và giá
đỡ để cố định tế bào vi khuẩn của Nguyễn Thúy Hương và Phạm Thành Hổ [29].


Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Theo tác giả Nguyễn Văn Thanh, Trưởng bộ Vi sinh - Ký sinh, Đại học Y Dược,
Thành phố Hồ Chí Minh cho biết nhóm nghiên cứu của ơng chế tạo thành cơng màng trị
bỏng sinh học có tẩm dầu mù u bằng phương pháp lênmen. Nó có khả năng thấm nước
cao, kết dính chặt và trơ về mặt hóa học nên nó có vai trị như màng sinh học có thể thay

thế da tạm thời [30].
Nghiên cứu về màng trị bỏng của tác giả như Huỳnh Thị Ngọc Lan, nghiên cứu
chế tạo màng trị bỏng từ Bâcterỉãl cellulose của A. xylinum và hoạt chất tái sinh mơ của
dầu mù u. Ngồi ra, có nghiên cứu về hiệu ứng làm lành vết thương của hỗn hợp
Chỉstosan tan ưong nước, Bacterỉâl cellulose , Nano bạc của nhóm tác giả Nguyễn Thị
Mỹ Lan, Huỳnh Thị Phương Linh, Lê Thị Mỹ Phước và Nguyễn Quốc Hiển [10].
Và tại phòng Vi sinh vật, khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2,
nhóm nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung và cs đang tiến hành nghiên cứu quy
trình sản xuất màng BC với chất lượng tốt và ứng dụng vào trị bỏng bước đầu đã đạt
được thành công [14].
1.3.Đặc đỉễm và cơ chế hình thành màng BC

1.3.1.

Đạc điểm cấu trúc cửa màng BC
Cellulose được cấu tạo bởi chuỗi polyme p - 1,4 glucopyranose mạch thẳng. Nó

có thành phần hố học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu trúc và đặc tính củã
nó lại khác xa nhau.

Sợì cellulose của màng BC Sợi cellulose của thực vật Hình 1,2. Cấu

trúc cellulose


Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Chuỗi polyme p - 1,4 glucopyranose mới hình thành liên kết với nhau tạo thành
sợi nhỏ (subfibril) có kích thước l,5nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo sợi lớn hơn - sợi vĩ
mô, những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo dải lớn. Những dải
lớn từ tế bào này khi đẩy ra ngoài sẽ liên kết với với những dải lớn của tế bào khác bằng
liên kết hiđro hoặc Vandesvan tạo thành dạng sệt (gel) hay một lớp màng mỏng. Kích
thước bên của màng tăng lên khi quần thể vi khuẩn sinh trưởng. Những điểm tạo màng
BC mới có thể xuất hiện, chính vì thế mà màng BC được mở rộng.
1.3.2.

Cơ chế tổng hợp màng BC
Quá trình sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được điều hoà

một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều loại enzyme, phức hợp
xúc tác và các protein điều hoà [16].
Theo tác giả Alina Krystynowics và cộng sự có 4 enzyme tham gia xúc tác tổng
hợp cellulose ở vi khuẩn Gluconacetobacter:
Glucokinase (GK): Phosphoryl hóa C6 của glucose.
Phosphoglucomutase (PGM): Xúc tác quá trình chuyển hóa Glucose - 6 phosphat thành
glucose - 1 phosphat.
Glucose - 1 - phosphate uridylyltransferase (UDPG pyrophosphorylase hay UGP): Xúc
tác tổng hợp UDP - Glucose.
Cellulose synthase (CS): Xúc tác tổng hợp cellulose từ UDP - glucose.
Con đường sinh tổng hợp cellulose được thể hiện rõ ở hình dưới đây


Khóa luận tốt nghiệp

UDPGlc

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Glucose

Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp cellulose ở Gluconacetobacter
1.4. Đột biến ở vỉ sinh vật

Đột biến (Mutation) bắt nguồn từ chữ Hy Lạp có nghĩa là biến đổi, được nhiều
nhà nghiên cứu khai thác ở các khía cạnh khác nhau. Theo quan điểm hiện đại, đột biến
CELLULOSE
là những biến đổi trong vật chất di truyền xảy ra đột ngột.

Với vi sinh vật, các nhà nghiên cứu quan tâm phân loại đột biến theo hai hướng:
tác nhân gây đột biến, và tính trạng biến đổi do đột biến.


Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Các phương pháp chính gây đột biến vi sinh vật:
Gây đột biển bằng tác nhân hóa học: Có rất nhiều hóa chất có thể gây đột biến,
trong đó các chất gây đột biến mạnh nhất gồm có: metylmetansunfonat,
etylmetansunfonat, dimetylsunfat, dietylsunfat, metylnitronitrozoguanidin,...
Gây đột biến bằng tác nhăn vật lỷ: Là sử dụng các tia phóng xạ như tia
a, p, Y, và tia tử ngoại có tác dụng gây nhiều loại đột biến, thường dùng trong phịng thí
nghiệm. Tia tử ngoại với bước sóng 260nm có hiệu quả cao trong việc gây đột biến cho
vi sinh vật , tác dụng chủ yếu lên các bazơ pirimidin. Tia tử ngoại (ultraviolet) (UV) là

tác nhân được nhà nghiên cứu sử dụng gây đột biến từ những năm đầu của thế kỉ XIX,
do đó có những ưu điểm vượt trội so với các phương pháp đương thời. Tia uv tác động
vào bộ máy di truyền gây biến đổi mạnh có thể tạo ra các chủng có hoạt tính mạnh,
ngồi ra tia uv cịn khá an tồn đối với người sử dụng. Nên trong khuôn khổ luận văn
này, chúng tơi đi sâu phân tích ảnh hưởng của tia uv đến đột biến của vi sinh vật.
Tia uv nằm trong vùng quang phổ khơng nhìn thấy của ánh sáng mặt trời. Là sóng
điện từ có bước sóng từ: 150.10" 10m 4- 0,4.10" m (150A° -T 4000A0). Theo các nghiên
6

cứu đột biến tia uv thì bước sóng 2600A0 đến 2800A° có tác dụng biến đổi mạnh nhất
tới bộ máy di truyền vsv. Đây cũng bước sóng mà các nhà nghiên cứu hay dùng.
Cơ chế gây đột biến của tia uv đối với YSY còn nhiều tranh cãi, tuy nhiên nhiều
nghiên cứu đưa ra một giả thuyết chung như sau: Ở bước sóng 2600A 0 ADN của vi
khuẩn hấp thụ mạnh nhất. Dưới tác động của tia uv, bazo cystein gắn thêm phân tử H2O
vào liên kết c = c của mạch vòng và thymin bị đứt liên kết c = c mạch vòng nối hai phân
tử dime thymin. Do đó các nhánh thymin gần nhau trong chuỗi ADN xuất hiện các liên
kết cộng hóa trị, ức chế sự nhân đôi của ADN [3].
Từ nhu cầu sản xuất trên quy mô công nghiệp, các nhà nghiên cứu đã và đang tiến
hành những phương pháp tác động đến bộ máy di truyền của các chủng dại, nhằm chọn
ra giống có khả năng “siêu tổng hợp” đáp ứng những nhu cầu cấp thiết hiện nay. Thành


Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

tựu nổi bật nhất nhờ sử dụng phương pháp đột biến này mang lại là việc tuyển chọn
thành công “siêu chủng” Pénicillium chrysogenum Wis 49-133 dùng để sản xuất
Pennicillin. Nhờ phương pháp này từ chủng gốc ban đầu (1941) hoạt tính chỉ đạt 30
Ul/ml đến năm 1967 đạt 5000 Ul/ml. Với cơng đoạn gây đột biến sau đó chọn lọc các

chủng có hoạt tính mạnh. Các nhà nghiên cứu đã tạo ra được “siêu chủng” có năng suất
gấp 700 lần so với chủng dại. Thành cơng này đã góp phần khơng nhỏ trong công nghiệp
sản xuất kháng sinh phục vụ nhu cầu cấp thiết cho con người.
Ngày nay, với những kỹ thuật hiện đại gây biến đổi bộ máy
di truyền của vsv theo những hướng xác định như lai ghép tế
bào trần và chuyển gen. Đã thu được những chủng có năng
suất rất cao nhưng các nhà nghiên cứu vẫn thường xuyên dùng
phương pháp tuyển chọn bằng tia uv. Phương pháp này đơn giản,
dễ làm, an tồn đặc biệt chi phí thấp.
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1.
2.1.1.

Đối tượng nghiền cứu và hóa chất
Đổi tượng nghiên cứu

Chủng vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 được phân lập từ màng của các nguồn
nguyên liệu khác nhau nhờ quá trình lên men giấm từ bia, giấm lên men theo phương
pháp cổ truyền, chủng giống nhận từ phòng Vi sinh vật, khoa Sinh - KTNN, trường Đại
học Sư phạm Hà Nội 2.
2.1.2.

Hóa chất
- Nguồn đường: glucose (sản xuất tại cty Dược T.w MEDIPLANTEX Hà Nội,

Việt Nam)
- Nguồn nitơ:
+ Nguồn nitơ vô cơ: (N£[4)2804 (sản xuất tại Trung Quốc)
+ Nguồn nitơ hữu cơ: pepton (sản xuất tại Trung Quốc)
- Một số hóa chất vơ cơ: KH2PO4, MgS04.7IỈ20, NaOH (sản xuất tại Trung

Quốc)
- Một số loại thuốc nhuộm: tím gentian, dung dịch fushsin, dung dịch


Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

lugol
- Agar (sản xuất tại cty TNHH Hải Long, Hải Phòng, Việt Nam)
- Acid acetic (sản xuất tại cty hóa chất Đức Giang, Hà Nội, Việt Nam) (được
cung cấp bởi phòng Yi sinh vật, khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2)
2.1.3.

Dụng cụ, thiết bị
Trong quá trình tiến hành thí nghiệm chúng tơi đã sử dụng những dụng cụ thiết bị

như:
Nồi hấp khử trùng, tủ sấy (Haraeus, Đức).
Box cấy vô trùng (Haraeus, Đức).


Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Cân điện tử (Precica XT 320 M, Thụy Sỹ)
Micropipep (Gilson, Pháp).
Tủ lạnh (Tawasi, Nhật).
Kính hiển vi quang học (Olympus CX41 , Nhật).

Hộp lồng, ống nghiệm, pipet, bàn trang thủy tinh, bình tam giác, lam kính, la
men, đèn cồn,... và nhiều dụng cụ hóa sinh thơng dụng khác (được cung cấp bởi
phịng Vi sinh vật, khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2)
2.1.4.

Môi trường nghiên cứu

2.1.4.1.

Môi trường giữ giống (môi trường cơ bản):

Glucose: 20g/l;

MgS0 .7H 0: 2g/l

Pepton: 5g/l

Nước máy: 1000 ml

4

(NH ) S04: 3g/l KH2PO4: 2g/l
4

2

Agar: 20g/l.

2

2.1.4.2. Môi trường nhân giống: Glucose: 20g/l

MgS0 .7H 0: 2g/l Nước máy:

Pepton: 5g/l

1000 ml

4

2

KH2PO4: 2g/l
(NH ) S04: 3g/l
4

2

2.2.Phương pháp nghiền cứu

2.2.1.

Phương pháp vi sinh

2.2.1.1.

Phương pháp đếm khuẩn lạc
Lấy lml dịch huyền phù có chứa vi khuẩn 24 giờ ni cấy, pha lỗng theo phương
pháp pha loãng giới hạn rồi dùng micropipet hút 0,1 ml pha

Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

lỗng rồi trang đều trên môi trường thạch đĩa. Nuôi ở 30°c trong 5 ngày đếm khuẩn lạc
(CFU) trong môi trường đĩa Petri, từ đó xác định số lượng tế bào vi khuẩn trong lml
dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức.
1000 1

N = A.——.——
Vị 10 "
Trong đó N : Tổng số CFU trong lml mẫu ban đầu.
Aị: Số khuẩn lạc trung bình tạo vịng phân giải
CaCƠ3 trên đĩa phân lập có độ pha lỗng 10~n. Vị:
Thể tích dịch mẫu trên mỗi đĩa phân lập.
10~n : Là độ pha loãng của mẫu phân lập.
2.2.1.2.

Phương pháp phân biệt tể bào vi khuẩn Gluconacetobacter bằng

phương pháp nhuộm Gram
Vi khuẩn Gluconacetobacter là các vi khuẩn Gram âm, do đó có thể phân biệt
với vi khuẩn Gram dương nhờ phương pháp nhuộm Gram (nhuộm kép).
Tiến hành: Lấy chủng vi khuẩn Gluconacetobacter đem nhuộm tiêu bản theo
phương pháp Gram. Sau đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu của kính hiển vi quang học
Olympus với độ phóng đại 1000 lần [2], [4], [5].
2.2.1.3.

Phương pháp bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng

Các chủng giống sau khi phân lập, được sơ bộ xác định là Gluconacetobacter

được cấy vào ống thạch nghiêng, nuôi 4-5 ngày trong tủ ấm ở 30°c. Sau đó giữ lạnh
trong tủ lạnh ở 4°c dùng cho các nghiên cứu tiếp theo. Cấy truyền và giữ giống trên
thạch nghiêng khoảng 1 tháng một lần [4], [5].
2.2.1.4.

Phương pháp hoạt hoá giống
Giống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi đem sử dụng phải

hoạt hoá giống, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh vật cho quá t rình lên


Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

men. Phương pháp hoạt hố giống sử dụng mơi trường tiêu chuẩn khơng có thạch agar,
đem hấp thanh trùng. Sau đó đem xử lý trong đèn tím 15 phút, cấy chuyển giống từ ống
thạch nghiêng vào và ni lắc 135 vịng/phút trong 24 giờ [4], [5].
2.2.1.5.

Phương pháp lên men tạo màng
Sử dụng môi trường lên men tạo màng đem hấp thanh trùng. Sau đó khử khuẩn ở

đèn cực tím trong 15 phút. Bổ sung vào mơi trường 5% giống hoạt hố. Nuôi cấy ở điều
kiện tĩnh trong 3-4 ngày.
2.2.2.

Phương pháp đột biến vi sinh vật

Nguyên tắc đột biến: lấy chủng có khả năng tạo màng chất lượng cao nhân thuần,

ổn định hoạt tính [8].
Chúng tơi tiến hành đột biến vi sinh vật dưới tác dụng của đèn uv có bước sóng
253,7 nm trong các thời gian khác nhau: 3, 5 ,7, 9 phút. Với cách đột biến như sau:
Đột biến trên môi trường thạch đĩa: nuôi vi khuẩn trên môi trường lỏng (môi
trường lên men) ở 25-30°C ữong 8-12h (khoảng thời gian quần thể vi sinh vật bắt đầu
phân chia mạnh khi bước vào pha log). Pha loãng mẫu, trang đều trên môi trường thạch.
Đe trong tủ ấm ở 25-30°C trong 2-3h để các tế bào phân chia. Sau đó tiến hành gây đột
biến dưới đèn uv.
2.2.3.

Phương pháp tuyển chọn sơ bộ các chủng sau đột biến
Chuẩn bị các đĩa petri chứa môi trường thạch, trang vi khuẩn Gluconacetobacter

và đột biến ở thời gian thích hợp. Sau đó các đĩa này được nuôi ở tủ ấm 25-30°C. Khi
các khuẩn lạc mọc, dùng que cấy tách riêng các khuẩn lạc cấy sang mơi trường thạch
nghiêng, sau đó đem ni ở tủ ấm. Khi vi khuẩn Gluconacetobacter trong các ống thạch
nghiêng này mọc, tiến hành hoạt hóa và lên men tạo màng.


Khóa luận tốt nghiệp
2.2.4.

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Phương pháp tốn học
Xử lý thống kê các kết quả thí nghiệm theo một số phương pháp trong cuốn

“ứng dụng tin học trong sinh học” [11], và “Thống kê và ứng dụng” [15] như:

* Số trung bình cộng: Dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại
—

thí nghiệm:

1 x=- Xi
” i=1
"

* Trung bình bình phương các sai lệch:

* Sai số đại diện của trung bình cộng:
* Hệ số biến thiên trung bình cộng:

v

x

* Tính giá trị trung bình cộng tổng thể:
Theo cơng thức:

n

ỵ&i;

Trong đó:

M:

Giá trịtrung bình tổng thể

Xị: Giá trị của mỗikết quả thí nghiệm
n:

Sốlần thí nghiệm


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN cứu VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xác định thời gian gây đột biến phù hợp

Chúng tôi tiến hành đột biến bằng cách đặt mẫu cần đột biến cách đèn uv có
bước sóng 253,7nm là 15cm ở các thời gian khác nhau. Kết quả thể hiện qua bảng
3.1.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của thời gian tác động tia uv đến khả năng sinh trưởng
của vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2
Thời gian đột biến (phút)

Khả năng mọc của vi khuẩn

3

++++

5

++

7

+

-

9

Chú thích:
+ + ++: Mọc rẩt tốt (mật độ khuẩn lạc >30CFU/đĩa)
+ + : Mọc khá (mật độ khuẩn ỉạc từ 4 -10 CFU/đĩa petrỉ)
+ : Mọc yếu (mật độ khuẩn từ 1-3 CFU/đĩa petri)
: Không mọc trên 50% sổ đĩa petri Nhân xét 1: Tại thời điểm 3 phút số
lượng khuẩn lạc mọc tốt, tại thời điểm 5 phút, khả năng sống sót của vi khuẩn khá,
tại thời điểm 7 phút số lượng khuẩn lạc mọc yếu nhất. Ở thời gian 9 phút, khơng một
tế

bàonào của vi

khuẩn sống sót, tuy nhiên tác động tia uv dưới 7 phút thì chúng vẫn

mọc.

Qua bảng số liệu ta thấy , thời gian tác động của tia uv càng dài thì càng ảnh
hưởng càng mạnh tới khả năng sống sót của vi khuẩn.Vậy chứng tỏ tại thời điểm 7


phút chính là ranh giới của sự đột biến và không đột biến nên tôi quyết định chọn
chủng đột biến với thời gian đột biến là 7 phút với khoảng
cách đèn tử ngoại 15 cm là thích hợp cho quá trình tác động tia UY đối với vi khuẩn
Gluconacetobacter BHN2 nhằm thu được dịng đột biến.
Có thể giải thích điều này do sức sống của các tế bào vi khuẩn là khác nhau nên
chúng chống chịu khác nhau đối với tia tử ngoại.
3.2. Tuyển chọn chủng sau đột biến từ chủng Gluconacetobacter BHN2 có

khả năng tạo màng BC

Bảng 3.2. Khả năng tạo màng BC của các chủng sau đột biến bằng tia uv
từ chủng Gluconacetobacter BHN2

STT

Kí hiệu chủng

1

ĐB1

2

ĐB2

3

ĐB3

4

ĐB4

5
6

ĐB5

Thời gian tạo màng

Khả năng tạo màng

(giờ)
75 giờ
-

+
-

50 giờ
-

+
-

-

-

ĐB6

48 giờ

+

7
8

ĐB7

51 giờ
-

+
-

9

ĐB9

10

ĐB10

78 giờ
-

+
-

Chú thích:

ĐB8

+ : Tạo màng
- : Không tạo màng