Nghiên cứu tiềm năng ứng dụng của chủng nấm mốc M4V có khả năng phân giải Cellulose trên phế phụ phẩm nông nghiệp để thu Cellulase phục vụ chăn nuôi

LỜI CẢM ƠN
Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS. Phương Phú Công, người đã trực tiếp, tận
tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài này.
Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong tổ Vi sinh vật học và toàn thể các thầy cô
khoa Sinh - KTNN trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá
trình học tập và nghiên cứu tại đây.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn động viên giúp đỡ em trong
suốt thời gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 05 năm 2013 Sinh viên
Nguyễn Thị Dung
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, các kết quả thu
được trong khoá luận là trung thực, chưa từng được công bố trong bất kì công trình khoa học
nào.
Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Hà Nội, tháng 05 năm 2013 Sinh viên
Nguyễn Thị Dung
Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2
SVTH: Nguyễn Thị Dung 1 K35B - SP Sinh
DANH MUC BẢNG
•
Bảng 1.1. Thành phần lignocellulose trong rác thải và phế phụ phẩm
DANH MUC HÌNH
•
CÁC THUẢT NGỮ VIẾT TẮT
Cs : Cộng sự
CMC : Cacboxyl methyl cellulose
CMC - ase : Cacboxylmethylcellulase
Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2
SVTH: Nguyễn Thị Dung 2 K35B - SP Sinh

MỤC LỤC
MỞ ĐÀU
í . Lý do chọn đề tài
Trong thời gian gần đây chăn nuôi đang gặp phải những khó khăn với hàng loạt các vấn đề
nổi lên như: nhiều dịch bệnh như cúm gia cầm tái phát và giá thức ăn chăn nuôi cao, Chính vì
vậy, ngành chăn nuôi nước ta đang đứng trước một thách thức mới là làm thế nào để có một nền
nông nghiệp bền vững và ổn định trong thời kì kinh tế hội nhập, phát triển nhanh, luôn đổi mới và
nhiều cạnh tranh này.
Mặt khác, một nền nông nghiệp phát triển như ở Việt Nam thì vấn đề được đặt ra là đầu ra
cho các phế phụ phẩm trong nông nghiệp sau thu hoạch như rơm rạ, vỏ trấu, vỏ lạc Nguồn phế
phụ phẩm trong nông nghiệp thải ra trong quá trình sản xuất và chế biến nông sản của nước ta ước
tính khoảng trên 50 triệu tấn mỗi năm. Lượng phế thải lớn này là những hợp chất hữu cơ giàu
cacbon và các chất khoáng đa vi lượng. Đây là nguồn nguyên liệu có giá trị cao cho sản xuất các
dạng chế phẩm sinh học cũng như phân hữu cơ sinh học phục vụ sản xuất nông nghiệp đặc biệt là
trong lĩnh vực chăn nuôi. Do vậy, cần phải có những phương pháp, những nghiên cứu khả thi và
hiệu quả để tận dụng nguồn phế phẩm nông nghiệp dồi dào này [26]
Enzyme cellulase là một phức hệ enzyme có tác dụng thủy phân cellulose, chúng được tổng
hợp chủ yếu nhờ vi sinh vật trong đó nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose cao hơn cả như
Aspegillus, Mucor, Tricoderma Cellulase là một phức hệ enzyme rất quan trọng và được ứng dụng
rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Cellulase được sử dụng với 2 mục đích chính : Dùng cellulase trực
tiếp trong phân giải các phế thải của công nghiệp thực phẩm, phế thải nông nghiệp bổ sung vào
thức ăn gia súc và vào trong công nghệ môi trường ; Thủy phân cellulase tạo cơ chất lên men để thu
Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2
SVTH: Nguyễn Thị Dung 3 K35B - SP Sinh
sản phẩm cuối cùng khác nhau. Cellulase đã, đang và sẽ ngày càng được sử dụng nhiều hơn để bổ
sung vào thức ăn cho vật nuôi [12].
Từ rất lâu trước, con người cũng đã biết đến sự tồn tại của các chủng nấm mốc và đã biết ứng
dụng chúng vào nhiều lĩnh vực như công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp dược phẩm,
công nghệ môi trường, nông nghiệp Trên thế giới cũng như trong nước đã có nhiều nghiên cứu về
cellulase ứng dụng trong chăn nuôi như : Chu Thanh Bình và Cs (2012) đã ứng dụng các chủng

nấm men trong chế biến bãi thải hoa quả giàu cellulose làm thức ăn gia súc ; Nguyễn Lân Dũng
(1991) đã lên men xốp sắn bằng cách sử dụng Aspergillus hennebergi niger sản phẩm dùng làm
thức ăn cho bò; Phương Phú Công (2008) Tuyển chọn và ứng dụng một số chủng vi sinh vật có khả
năng lên men xylan trên phế phụ phẩm nông nghiệp để thu xylanase phục vụ cho chăn nuôi và đã
thu được kết quả cho nhiều triển vọng.
Xuất phát từ những yều cầu cấp thiết như trên tôi chọn đề tài “ Nghiên cứu tiềm năng ứng
dụng của chủng nấm mốc M4V có khả năng phân giải cellulose trên phế phụ phẩm nông nghiệp để
thu ceỉỉuỉase phục vụ chăn nuôi ”
2 . Mục tiêu của đề tài
Nghiên cứu tiềm năng ứng dụng của chủng nấm mốc M4V trong việc phân giải cellulose trên
các phế phụ phẩm nông nghiệp để thu cellulase phục vụ chăn nuôi.
3 . Nội dung của đề tài
3.1. Tuyển chọn và nghiên cứu chủng nấm mốc M4V có khả năng sinh cellulase trên các phế phụ
phẩm nông nghiệp.
3.2. Bước đầu đánh giá sản phẩm lên men từ chủng nấm mốc M4V để bổ sung vào thức ăn làm
tăng năng suất vật nuôi.
4 . Ỷ nghĩa của đề tài
4.1. Ý nghĩa lý luận
Nghiên cứu nhằm đi sâu tìm hiểu tiềm năng ứng dụng của chủng nấm mốc M4V có khả
năng phân giải cellulose trên phế phụ phẩm nông nghiệp.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Bước đầu nghiên cứu nâng cao chất lượng phế phụ phẩm trong ngành nông nghiệp Việt
Nam để phục vụ chăn nuôi.
Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2
SVTH: Nguyễn Thị Dung 4 K35B - SP Sinh
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cellulose y à sự phân bố cellulose trong thực yật
1.1.1, Cellulose
Cellulose là hợp chất hữu cơ có công thức cấu tạo (CeHio05)
n

, và là thành
phần chủ yếu của thành tế bào thực vật, gồm nhiều cellobiose liên kết với nhau, 4-0-
(P-D-Glucopyranosyl)-D-glucopyranose (Hình 1.1). Cellulose cũng là hợp chất hữu
cơ nhiều nhất trong sinh quyển, hàng năm thực vật tổng hợp được khoảng 10
11
tấn
cellulose (trong gỗ,cellulose chiếm khoảng 50% và trong bông chiếm khoảng 90%)
[27].
Cellulose
Hình 1.1. Công thức hoá học của cellulose Các mạch
cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và liên kết Waals Der Waals, hình
thành hai vùng cấu trúc chính là tinh thể và vô định hình. Trong vùng tinh thể, các
phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme
cũng như hoá chất. Ngược lại, trong vùng vô định hình, cellulose không liên kết chặt
với nhau nên dễ bị tấn công [27].
Trong mô hình Fringed Fibrillar: phân tử cellulose được kéo dài và định
hướng theo chiều sợi. Vùng tinh thể có chiều dài 500 A° và xếp xen kẽ với vùng vô
định hình [27].
Trong mô hình chuỗi gập: phân tò cellulose gấp khúc theo chiều sợi. Mỗi đơn
vị lặp lại có độ trùng khớp khoảng 1000. Các đơn vị đó được sắp xếp thành chuỗi nhờ
vào các mạch glucose nhỏ, các vị trí này rất dễ bị thuỷ phân. Đối với các đơn vị lặp
lại, hai đầu là vùng vô định hình, càng vào giữa tính chất kết tinh càng cao. Trong
vùng vô định hình, các liên kết ß - glycoside giữa các monomer bị thay đổi góc liên
kết, ngay tại cuối các đoạn gấp, 3 phân tò monomer sắp xếp tạo ra sự thay đổi 180°
tri ụỉìit
Khóa luận tất nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2
SVTH: Nguyễn Thị Đung 5 K35B - SP Sinh
cho toàn mạch. Vùng vô định hình dễ bị tấn công bởi các tác nhân thuỷ phân hơn
vùng tinh thể vì sự thay đổi góc liên kết của các liên kết cộng hoá trị (ß - glycoside)
sẽ làm giảm độ bền của liên kết, đồng thời vị trí này không tạo được liên kết hydro

[27].
Cellulose có cấu tạo tương tự carbohydrate phức tạp như tinh bột và glycogen.
Các polysaccharide này đều được cấu tạo từ các đơn phân là glucose. Cellulose là
glucan không phân nhánh, trong đó các gốc glucose kết hợp với nhau qua liên kết ß-1
—>4- glycoside, đó chính là sự khác biệt giữa cellulose và các phân tử carbohydrate
phức tạp khác. Giống như tinh bột, cellulose được cấu tạo thành chuỗi dài gồm ít nhất
500 phân tử glucose. Các chuỗi cellulose này xếp đối song song tạo thành các vi sợi
cellulose có đường kính khoảng 3,5 nm. Mỗi chuỗi có nhiều nhóm - OH tự do, vì vậy
giữa các sợi ở cạnh nhau kết hợp với nhau nhờ các liên kết hydro được tạo thành giữa
các nhóm - OH của chúng. Các vi sợi lại liên kết với nhau tạo thành vi sợi lớn hơn
hay còn gọi đó là bó mixen có đường kính 20 nm, giữa các sợi trong mixen có những
khoảng trống lớn. Khi tế bào còn non, những khoảng này chứa đầy nước, ở tế bào già
thì chứa đầy lignin và hemicellulose [27].
Cellulose có cấu trúc rất bền và khó bị thuỷ phân. Người
và động vật không có enzyme phân giải cellulose
(cellulase) nên không tiêu hoá được cellulose, vì vậy
cellulose không có giá trị dinh dưỡng. Tuy nhiên, một số
nghiên cứu cho thấy cellulose có thể có vai trò điều hoà
hoạt động của hệ
Khóa luận tất nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2
SVTH: Nguyễn Thị Đung 6 K35B - SP Sinh
thống tiêu hoá. Vi khuẩn trong dạ cỏ của gia súc, các động vật nhai lại và
động vật nguyên sinh trong ruột của mối sản xuất enzyme phân giải cellulose. Nấm
cũng có thể phân huỷ cellulose, vì vậy chúng có thể sử dụng cellulose làm thức ăn
[24].
1.1.2. Sự phân bổ cellulose trong thực vật
Cellulose được tổng hợp hàng năm với khối lượng lớn. Sinh
khối thực vật của trái đất là 1800 tỷ tấn, thì cellulose
chiếm tới 720 tỷ tấn. Khối lượng cellulose khổng lồ này
ngoài việc chứa trong quần thể thực vật chủ yếu còn có

trong động vật và vi sinh vật nhưng với số lượng nhỏ.
Cùng với cellulose, hemicellulose và lignin phối hợp với
nhau tạo nên cấu trúc và quyết định tính chất hoá học và
cơ lí của nguyên liệu có nguồn gốc thực vật. Các hợp chất
này thường đi cùng với nhau, do đó người ta thường gọi là
ligno - cellulose (Bảng 1.1) [27].
Bảng 1.1. Thành phần lỉgnocellulose trong rác thải và phế phụ phẩm
nông nghiệp phổ biến
Khỏa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2
SVTH: Nguyễn Thị Dung 7 K35B - SP Sinh
Khỏa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2
SVTH: Nguyễn Thị Dung 8 K35B - SP Sinh
Nguồn lignocellulose Cellulose Hemicellulose Lignin
(%) (%) (%)
Thân gỗ cứng 40-55 24-40 18-25
/V ^
ml A Ã Ả
Thân gô mêm
45-50 25-35 25-35
Vỏ lạc 25-30 25-30 30-40
Lõi ngô 45 35 15
Giây 85-99
0
0-15
Vỏ trâu 32.1 24 18
Vỏ trâu của lúa mì 30 50 15
Rác đã phân loại 60
20 20
Lá cây 15-20 80-85
0

Hạt bông 80-95 5-20
0
Giây báo 40-55 25-40 18-30
Giây thải từ bột giây hoá học 60-70
10-20
5-10
Chất rắn nước thải ban đầu 8-15
-
24-29
Chât thải của lợn
6
28
-
Phân bón gia súc 1.6-4.7 1.4-3.3 2.1-5.1
Cỏ ở bờ biển Bermuda 25 35.7 6.4
Cỏ mềm 45 31.4
12
Các loại cỏ (trị số trung bình 25-40 25-50 10-30
cho các loại)
Bã thô 33.4 30 18.9
1.2. Cơ chế phân giải cellulose của enzyme cellulase
1.2.1. Hệ thống cellulase
Cellnl ase
Cellulose oligosaccharides, glucose
OH
Cellulose “
po Iyme r of jS-( 1
-A
)-D- gIyoũ pyran osyl un its
Cellulase là enzyme đa cấu tử gồm: endo-P-l,4-glucanase,

exoglucanase và P-glucosidase.
❖ Endo-P-l,4-glucanase được gọi là endoglucanase hoặc 1,4-P-
D-glucan- 4-glucanohydrolase hay CMCase (EC 3.2.1.4).
❖ Exoglucanase, gồm l,4-P-D-glucan-4-glucanohydrolase
(giống như cello dextrinase) (EC 3.2.1.74) và 1,4-P-D-glucan
cellobiohydrolase (cellobiohydrolase) (EC 3.2.1.91).
❖ p - glucosidase hoặc p - glucoside glucohydrolase (EC
3.2.1.21) [28].
1.2.2. Cơ chế phân giải cellulose của enzyme cellulase
Hình 1.2. Quá trình phân giải cellulose của enzyme
cellulase
Oellulase
C
C
O
< w/
Ĩ4 ỉttSi' là
etîzytfte xúc
tác chi? i/ííiĩ
trinh chttyên
/100
c'eỉ
ti4lí>se
tỉtcĩttỉ
1
cức
c-eliotii-a-
03II ulose -tcrystefl)
O
H

❖ Endocellulase: xúc tác quá trình cắt liên kết a-1,4- glucoside trong cellulose, lignin và
a- D glucan một cách ngẫu nhiên. Sản phẩm của quá trình phân giải là các cellulose
phân tử nhỏ, cellobiose và glucose.
♦♦♦ Exocellulase: cắt 2 hoặc 4 đơn vị glucose từ đầu không khử của chuỗi
cellulose tạo thành các cellobiose (disaccharide) và một số cellotetrose.
❖ Cellobiase: tham gia phân giải cellobiose (disaccharide) và cellotetrose thành glucose
[28].
1.3. ứng dụng của cellulase
1.3.1. Cellula.se với công nghiệp thực phẩm
Cellulose là thành phần cơ bản của tế bào thực vật, vì vậy nó có mặt trong mọi
loại rau quả cũng như trong các nguyên liệu, phế liệu của ngành trồng trọt và nông
nghiệp. Nhưng người và động vật không có khả năng phân giải cellulose. Nó chỉ có
giá trị làm tăng tiêu hoá, nhưng với lượng lớn nó trở nên vô ích hay cản trở tiêu hoá.
Chế phẩm cellulase thường dùng để: Tăng chất lượng thực phẩm và thức ăn gia súc,
tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật [31].
ứng dụng trước tiên của cellulase đối với chế biến thực phẩm là dùng nó để
tăng độ hấp thu, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm nhiều loại thực phẩm thực
vật. Đặc biệt là đối với thức ăn cho trẻ em và nói chung chất lượng thực phẩm được
tăng lên. Một số nước đã dùng cellulase để xử lí các loại rau quả cải bắp, hành, cà rốt,
khoai tây, táo và lương thực như gạo. Người ta còn xử lí cả chè và các loại tảo biển,
[25].
Trong sản xuất bia, dưới tác dụng của cellulase thành tế bào của hạt đại mạch
bị phá huỷ tạo điều kiện tốt cho tác động của protease và đường hoá. Trong sản xuất
agar-agar, tác dụng của chế phẩm cellulase đã làm tăng chất lượng agar-agar hơn so
với phương pháp dùng acid để phá vỡ thành tế bào. Đặc biệt là việc sử dụng chế
phẩm cellulase để tận thu các phế liệu thực vật đem thuỷ phân, dùng làm thức ăn gia
súc và công nghệ lên men. Những ứng dụng của cellulase trong công nghiệp thực
phẩm đã có kết quả rất tốt. Tuy nhiên hạn chế lớn nhất là khó thu được chế phẩm có
cellulase hoạt độ cao
[25].

1.3.2. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy
Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy, bổ sung các loại enzyme trong
khâu nghiền bột, tẩy trắng và xeo giấy có vai trò rất quan trọng. Nguyên liệu ban đầu
chứa hàm lượng cao các chất khó tan là lignin và một phần hemicellulose, nên trong
quá trình nghiền để tách riêng các sợi gỗ thành bột mịn gặp nhiều khó khăn. Trong
công đoạn nghiền bột giấy, bổ sung endoglucanase sẽ làm thay đổi nhẹ cấu hình của
sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm 20% năng lượng cho quá trình nghiền
cơ học. Trước khi nghiền hoá học, gỗ được xử lí với endoglucanase và hỗn hợp các
enzyme hemicellulase, pectinase sẽ làm tăng khả năng khuếch tán hoá chất vào phía
trong gỗ và hiệu quả khử lignin [32].
Trong công nghệ tái chế giấy, các loại giấy thải cần được tẩy mực trước khi
sản xuất các loại giấy in, giấy viết. Endoglucanase và hemicellulase đã được dùng để
tẩy trắng mực in trên giấy [12].
1.3.3. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm
Trong quá trình sản xuất các loại nước quả và nước uống không cồn dựa trên
việc trích li dịch quả từ thịt nghiền. Các loại quả sau khi tách vỏ, bỏ hạt được dịch
nhuyễn. Từ thịt quả nghiền đã ép bã thu được dịch quả. Dịch này thường chứa các
thành phần tế bào thịt quả và các thành phần của polysaccharide làm cho dịch quả có
độ nhớt cao. Đe tăng hiệu suất trích li dịch quả, giảm bớt độ nhớt, tăng mức cảm quan
nước quả và giảm bớt một số công đoạn thì việc bổ sung endoglucanase là rất quan
trọng. Enzyme này là mấu chốt cải thiện hiệu suất dịch hoá. Sự kết hợp của glucanase
và pectinase sẽ phá huỷ hoàn toàn màng tế bào. Trong quá trình sản xuất, ở giai đoạn
dịch hoá bổ sung hỗn hợp các enzyme cellulase, hemicellulase sẽ đem lại hiệu quả
của chế phẩm, làm cho độ đồng thể của nước quả có thịt sẽ tốt hơn. Trong công nghệ
sản xuất bia, các chế phẩm enzyme amylase, protease và glucanase đã được sử dụng
để ngăn chặn sự tạo thành các diacetyl, do đó giảm lượng diacetyl được tạo thành, rút
ngắn thời gian cần thiết để ủ bia [15].
Trong dịch lên men có chứa một lượng ß-glucan, chất này ảnh hưởng tới khả
năng lọc và gây đục cho bia [15].
Trong quá trình sản xuất cà phê ở Việt Nam, cà phê chủ yếu được sản xuất

bằng phương pháp khô, phương pháp này cho chất lượng cà phê không cao. Để tiến
hành nâng cao chất lượng cà phê, phương pháp lên men đã được áp dụng. Đó là quá
trình sử dụng phức hệ enzyme cellulase và pectinase để xử lí bóc vỏ cà phê và làm
tăng khả năng trích li dịch quả. Trong khâu bóc vỏ, cellulase gây hiện tượng thẫm
màu, làm giảm chất lượng sau khi sấy, đồng thời cản trở cho việc bóc vỏ. Khi sử
dụng chế phẩm A. niger có tên thương mại là Biovina-09 có hoạt tính pectinase và
cellulase cho thấy số lượng cà phê được bóc vỏ tăng, hạt cà phê được bóc vỏ bằng
chế phẩm không còn nhớt như hạt không sử dụng chế phẩm enzyme và hiệu suất bóc
vỏ khá cao. Trong quá trình trích li dịch quả, cellulose và pectin cản trở sự thoát các
chất hoà tan trong tế bào ra ngoài tế bào. Khi sử dụng chế phẩm Biotin-09 hiệu suất
trích li cao hơn mẫu không sử dụng là 46% [9].
1.3.4. Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ
Trong giai đoạn đường hoá của quá trình sản xuất ethanol, amylase là thành
phần chính trong quá trình thuỷ phân tinh bột. Tuy nhiên, bổ sung một số enzyme phá
huỷ thành tế bào như cellulase, hemicellulase có vai trò quan trọng, giúp tăng lượng
đường tạo ra và đẩy nhanh tốc độ tiếp xúc của tinh bột với amylase, dẫn tới hiệu suất
thu hồi rượu tăng lên 1,5% [27].
1.3.5. Trong công nghệ xử lí rác thải và sản xuất phân bón vỉ sinh
Thành phần hữu cơ chính trong rác thải là cellulose, nên việc sử dụng
công nghệ vi sinh trong xử lí rác thải cải thiện môi trường rất có hiệu quả. Enzyme
này có khả năng thuỷ phân chất thải chứa cellulose, chuyển hoá các hợp chất kiểu
lignocellulose và cellulose trong rác thải tạo nên nguồn năng lượng thông qua các sản
phẩm đường, ethanol, khí sinh học hay các sản phẩm giàu năng lượng khác [27].
Ngoài việc bổ sung trực tiếp vi sinh vật vào bể ủ để chứ rác thải thì việc tạo ra
các chế phẩm vi sinh có chứa các vi sinh vật sinh ra cellulase đã được nghiên cứu và
sản xuất.
Phức hệ cellulase được sử dụng để xử lí nguồn nước thải do các nhà máy giấy
tạo ra. Nguyên liệu làm giấy là gỗ (sinh khối của thực vật bậc cao). Sinh khối này
chứa rất nhiều loại polysaccharide, trong đó các polysaccharide quan trọng quyết
định tới chất lượng, số lượng giấy là cellulose. Vì vậy nước thải của các nhà máy

giấy, các cơ sở chế biến gỗ, các xưởng mộc khi bổ sung các chế phẩm chứa phức hệ
cellulase đem lại hiệu quả cao [33].
1.3.6. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi
Trong chăn nuôi, một trong những biện pháp nâng cao năng suất vật nuôi là
nâng cao hiệu suất sử dụng các chất dinh dưỡng ở thức ăn ở mức cao nhất. Để giải
quyết nhiệm vụ này, người ta có thể dùng chế phẩm enzyme bổ sung khẩu phần thức
ăn của vật nuôi. Các enzyme này cùng với các enzyme có sẵn trong đường tiêu hoá sẽ
phân giải các chất dinh dưỡng của thức ăn, giúp cho con vật tiêu hoá được tốt hơn
[3].
Cellulase là một trong số các enzyme thường được bổ sung vào thức ăn chăn
nuôi cho gia súc. Tuy nhiên, người ta không bổ sung riêng chế phẩm enzyme này mà
thường bổ sung cùng với các enzyme khác như: amylase, protease, xylanase, tạo ra
một dạng chế phẩm chứa nhiều loại enzyme. Việc bổ sung nhiều loại enzyme giúp
vật nuôi phân giải được nhiều loại cơ chất, vật nuôi sẽ hấp thu tốt hơn các nguồn thức
ăn khác nhau [3].
Khi động vật ở giai đoạn còn non, hệ enzyme tiêu hoá của chúng chưa hoàn
chỉnh, chủ yếu ở động vật ăn bột và ăn cỏ. Sử dụng enzyme trong chăn nuôi, người ta
thấy lợn con theo ổ tăng trọng 20% và giảm thức ăn 6-^14%. Thí nghiệm trên lợn 1-3
tuần tuổi thì lợn tăng trọng 8^-40%, tăng khả năng sử dụng thức ăn tò 1(H18% [3].
Người ta cũng đã dùng enzyme bổ sung vào thức ăn của trâu, bò. Quá trình
tiêu hoá thức ăn trong dạ cỏ của trâu, bò được gắn liền với hoạt động của enzyme của
các vi sinh vật sống nhờ ở đấy. Vì vậy bổ sung vào thức ăn những chế phẩm enzyme
để nâng cao khả năng tiêu hoá là điều rất cần thiết. Dùng các chế phẩm có hoạt tính
amylase, protease, cellulase, đều thu được kết quả tốt, kết quả tăng trọng của trâu,
bò có thể đạt đến 12^-17% và thậm chí còn có thể cao hơn. Trên thế giới, người ta đã
sử dụng thức ăn gia súc có chứa các enzyme tiêu hoá từ đầu những năm 1990. Hiện
nay, hàng năm người ta sản xuất khoảng 30 triệu tấn thức ăn gia súc có bổ sung chế
phẩm enzyme, chiếm khoảng 5% trong tổng số 600 triệu tấn thức ăn gia súc được sản
xuất
[14] , [15].

Như vậy, hiệu quả của việc bổ sung enzyme vào thức ăn chăn nuôi là rõ ràng
làm tăng tỉ lệ tiêu hoá cho vật nuôi và giảm chi phí. Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam
chế phẩm enzyme thường phải được nhập khấu với giá thành cao nên nghiên cứu và
sản xuất chế phẩm enzyme là vấn đề vô cùng cần thiết.
1.4. Các nhóm vi sinh vật tham gia phân giải cellulose
1.4.1. Vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens var cellulose - Acetobacter xylinum
Cellulomonos phân giải mạnh cellulose bã mỉa Cytophaga
Sporocytophaga myxococcoỉdes.
Cellvỉbrỉo gilvus, cellvỉbrio fulvus [7].
1.4.2. Xạ khuẩn loài Actimomyces (Streptomyces)
Actimỉmyces coelỉcolor; Act. sulfureus.
Act. cellulosae; Act. diastaticus.
Act. hydroscopicus; Act. themofuscus.
Act. bovis; Act. flavochromogenes, Thermonosporacurvala [7].
1.4.3. Nấm sợi
Đối tượng chủ yếu trong các nghiên cứu về cellulase hiện nay thường là nấm
(nấm mốc và nấm quả thể). Rất nhiều loài nấm đã tổng hợp cellulase có hoạt tính khá
cao trong đó đáng kể là một số chủng loại sau:
Asp. flavus; Asp. niger; Asp. oryzae; Asp. terreus;
Asp. amstelodamy; Asp. fumigates.
Chaetomium globosu
Mucor pusiỉỉus.
Pénicillium notatum, Pen. variabite; Pen. pusillum
Tricoderma koningi; Trlignorum Tr. viride.
Sporotrichum pruinosum.
Myro thecium verrucaris.
Chrysosporium lignorum [7].
1.5. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp cellulase của vi sinh vật
1.5.1. Giống vi sinh vật

Có rất nhiều nhân tố ảnh hưởng đến sự tạo thành enzyme và hoạt tính của nó
trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật. Đặc tính sinh lí, sinh hoá của nó trong quá trình
nuôi cấy của các chủng vi sinh vật có ý nghĩa quan trọng hơn cả [8].
Không phải tất cả các vi sinh vật đều có khả năng sinh enzyme như nhau, ngay
cả những chủng cùng giống, cùng loài cũng có thể rất khác nhau về lượng enzyme do
chúng sản sinh ra. Vì vậy, trong công tác nghiên cứu cần phải tiến hành tìm kiếm các
chủng, giống có hoạt lực enzyme cao bằng cách phân lập từ các điều kiện và lựa chọn
các điều kiện nuôi cấy tối thích với các cơ chất cảm ứng cũng như cần nâng cao hoạt
lực bằng cách đột biến [8].
1.5.2. Nguồn dinh dưỡng
Các yếu tố trong thành phần môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động
sống và sự tạo thành enzyme của vi sinh vật. Trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật
cần phải đảm bảo có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng và tỉ lệ các thành phần dinh
dưỡng hợp lí, phù hợp với từng nhu cầu vi sinh vật cụ thể [10].
1.5.2.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Thành phần và hàm lượng cacbon có ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp
enzyme. Đối với nấm sợi A. fumigatus và các loại nấm mốc ưa nhiệt, nguồn cacbon
thích hợp nhất là rơm nghiền và bột giấy lọc. Môi trường cám bã và củ cải đường là
môi trường thích hợp nhất với T. reesei [10].
Bã mía là nguồn cellulose tự nhiên tốt cho quá trình sinh tổng hợp cellulase
của A. niger, A. elipticus và A. fumigatus, T. reesi kết hợp với A. phoenicis,
Penicilium sp, A. terreus còn lõi ngô, vỏ cà phê, xơ cọ dừa lại là nguồn cellulose
thích hợp cho các chủng vi sinh vật khác [10].
1.5.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Nitơ cần cho sự hình thành các axit amin để cấu tạo nên các protein cấu trúc
cũng như enzyme. Nguồn nitơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật có thể là
nitơ vô cơ hoặc hữu cơ. Việc chọn nguồn nitơ là rất cần thiết để đảm bảo được hiệu
suất tổng hợp cao và có lợi về mặt kinh tế [13].
Các nguồn nitơ vô cơ thích hợp nhất đối với các vi sinh vật sinh cellulase là
muối nitrat. Đối với các giống của bộ nấm bông Ợỉyphomycetales) nguồn nitơ tốt

nhất lại là (NIỈ4)2HP04. Nói chung các muối amon ít có tác dụng nâng cao hoạt lực
enzyme này, thậm chí còn ức chế quá trình tổng hợp, vì môi trường các muối này làm
cho môi trường axit hoá. Điều này không những ức chế quá trình tổng hợp enzyme
mà còn làm mất hoạt tính sau khi tạo thành [13].
Natri nitrat làm cho môi trường kiềm hoá, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo
thành cellulase. Các hợp chất nitơ có tác dụng khác nhau đến sinh tổng hợp cellulase.
Cao ngô và cao nấm men có tác dụng nâng cao hoạt lực cellulase của vi sinh vật. Tác
dụng kích thích của hợp chất này do sự có mặt của các axit amin, các nhân tố khoáng
và những nhân tố sinh trưởng khác
[13].
Ngoài nitơ và cacbon thì những nguyên tố khoáng như Fe, Mn, Bo, Mo, Cu,
cũng có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của vi sinh vật. Các nguyên
tố khoáng Zn, Mn, Fe có tác dụng kích thích tạo thành enzyme ở nhiều chủng [13].
1.5.3. Điều kiện nuôi cấy
1.5.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng tới sinh tổng hợp enzyme của các loài nấm khác nhau.
Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng của đa số nấm mốc trên môi trường rắn là
25^40°C. Nhiệt độ dưới 25°c hoặc trên 40°c nấm mốc phát triển chậm, thời gian nuôi
kéo dài giảm khả năng sinh tổng hợp enzyme [11], [12].
1.5.3.2. Ảnh hưởng của độ ẩm
Trong quá trình lên men bề mặt, độ ẩm 60-70% là độ ẩm tương đối thích hợp
với các chủng nấm mốc khi nuôi cấy trên các khay. Nếu để độ ẩm quá thấp 50% môi
trường sẽ khô nhanh, sinh bào tử mạnh đồng thời giảm sinh enzyme. Hơn nữa, độ ẩm
môi trường ảnh hưởng đến độ thoáng khí khi lên men bề mặt không có đảo trộn [10].
1.5.3.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng rất lớn đến sự tạo thành enzyme. Theo Lương
Đức Phẩm khi lên men bề mặt chủng mốc Asp. awamori để sản xuất enzyme nhiều
nhất vào thời điểm khoảng 36-40 giờ [13]. Đối với nấm mốc Aspergillus tạo thành
enzyme cao nhất lúc bắt đầu sinh bào tử, sau khi sinh bào tò lượng enzyme tiết ra ít
thậm chí giảm đi rất nhiều [7].

CHƯƠNG 2.
NGUYÊN LIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1. Nguyên liệu và vi sinh vật
2.1.1. Chủng vi sinh vật
Sử dụng một số chủng vi sinh vật phân hủy cellulose được phân lập từ lá cây
mục, đất mùn, gỗ cây mục, rơm rạ mục được thu thập từ các huyện Mỹ Đức, Mê
Linh- Hà Nội.
2.1.2. Nguyên liệu
❖ Lõi ngô, vỏ trấu, vỏ lạc được sấy khô và nghiền nhỏ.
♦♦♦ Carboxylmethyl cellulose (CMC)
2.1.3. Hóa chất — thiết bị
❖ Hóa chất
❖ CMC, thuốc thử Lugon 1%.
❖ KC1, NaCl,
❖ Thiết bị
Tủ ấm, tủ sấy Binder, nồi hấp, cân, của phòng thí nghiệm Yi sinh Khoa Sinh
- KTNN , trường ĐHSP Hà Nội 2.
2.1.4. Môi trường
♦> Môi trường bảo quản và giữ giống
♦> Môi trường nuôi cấy
Hóa chất Nồng độ
Đường saccarose 30g/l
NaN0
3
10g/l
MgS0
4
.7H
2
0 0,5 g/1

KC1 0,5 g/1
NaCl 1%
FeSƠ4 (dạng vết) 1-2 hạt
Thạch agar 20 g/1
H
2
o
1 lit
KH2PO4 2g/l
2.2. Phương pháp nghiền cứu
2.2.1. Phương pháp vỉ sinh
2.2.1.1. Thu thập mẫu
Môi trường Czapek-dox cơ sở thay sacaroza bằng lõi ngô ( vỏ trấu, vỏ lạc )
Hóa chất Nồng độ
NaN0
3
10g/l
MgS0
4
.7H
2
0 0,5 g/1
KC1 0,5 g/1
NaCl 1 %
FeSƠ4 (dạng vêt) 1-2 hạt
Thạch agar 20g/l
H
2
o
1 lit

KH2PO4
2g/l
❖ Môi trường thử hoạt tỉnh enzim
Môi trường Czapek-dox cơ sở thay sacaroza bằng CMC (carboxylmethyl
cellulose ).
Hóa chât Nông độ
NaN0
3
1,5 g/1
MgS0
4
.7H
2
0 0,5 g/1
KC1 0,5 g/1
NaNOg 1 %
CMC 1 %
Thạch agar 20 g/1
H
2
o
1 lit
kh
2
po
4
2 g/1
Lấy các cành, lá cây mục, rơm rạ mục, đất mùn và rác thải ở những nơi khô
ráo, mỗi loại mẫu lấy khoảng 20 gam mỗi lần, tiến hành lấy ở các vùng khác nhau.
Mẩu sau khi lấy về sẽ được cho vào túi nilon rồi đánh dấu và ghi đầy đủ thông tin,

thời gian và địa điểm mẫu được lấy.
2.2.1.2. Chuẩn bị môi trưởng phân lập và bảo quản
Khi tiến hành phân lập thì điều kiện đầu tiên là khử trùng thiết bị và dụng cụ
thí nghiệm. Sau khi vô trùng các dụng cụ xong tiến hành cân đo môi
trường, cụ thể là môi trường Czapek-Dox cơ sở để làm môi trường phân lập,
môi trường được hấp thanh trùng ở 121 °c trong 45 phút sau đó phân phối khoảng 25
ml môi trường vào hộp lồng đã vô trùng. Để có môi trường thạch nghiêng giữ giống
thì ta rót khoảng 3 - 4 ml môi trường (chưa thanh trùng) vào ống nghiệm, đậy nút
bông rồi đem thanh trùng. Sau đó đặt nghiêng ống nghiệm chứa môi trường khi còn
đang nóng.
2.2.1.3. Hoạt hoả vi sinh vật
Lấy 10 ống nghiệm, nhỏ vào mỗi ống 9 ml nước cất. Cân 1 gam mỗi mẫu đem
tán nhỏ rồi cho vào ống nghiệm đầu tiên lắc thật đều. Dùng pipet hút 1 ml dung dịch
mẫu đó nhỏ vào ống nghiệm thứ 2 lắc đều, sau đó dùng pipet hút 1 ml dung dịch ở
ống thứ 2 nhỏ vào ống thứ 3. Cứ làm như vậy cho tới ống thứ 10.
Dùng pipet hút 1 ml dung dịch mẫu ở từng ống nghiệm nhỏ vào hộp lồng
tương ứng đã chứa môi trường phân lập, lấy que trang trang đều, làm như vậy cho tới
hộp lồng thứ 10. Cứ làm lần lượt như vậy đối với từng mẫu. Sau khi chang mẫu vào
các hộp lồng xong đánh dấu rồi gói cẩn thận lại đem nuôi trong tủ ấm khoảng 30° để
theo dõi từng ngày.
Thường xuyên kiểm tra các hộp lồng mỗi ngày. Nếu thấy có khuẩn lạc
mới mọc lên thì cấy chủng đó sang môi trường thạch nghiêng rồiđánh dấu
cho vào tủ ấm để nuôi, theo dõi 3-4 ngày. Đối với những chủng không lên thì loại bỏ,
chủng nào lên thì giữ lại, bảo quản trong tủ lạnh ở 0 - 4°c để giữ giống dùng cho việc
nghiên cứu tiếp theo.
2.2.2. Phương pháp hoá sinh
2.2.2.1. Nuôi cấy chủng nấm mốc để thử hoạt tính
Các chủng nấm tuyển chọn được nuôi cấy trải dày trên môi trường giữ giống
trong đĩa petri, nuôi trong tủ ấm từ 36 đến 48 giờ.
❖ Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp cấy chẩm điểm

Định tính cellulase bằng phương pháp cấy chấm điểm. Dùng que cấy lấy một
ít chủng nuôi cấy trong môi trường thạch nghiêng. Sau đó cấy chấm một điểm vào
môi trường thạch đĩa chứa 1% cơ chất CMC, môi trường tủ ấm
3 đến 4 ngày. Hiện hình vòng phân giải bằng thuốc thử liugon đỏ 1 %. Hoạt tính
enzyme được xác định bằng hiệu số (D-d) cm.
Trong đó D: là đường kính vòng phân giải d: là đường kính khuẩn lạc.
❖ Xác đỉnh hoạt tỉnh enzyme bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch
(William, 1983)
Dùng khoan nút chai khoan một lỗ trên môi trường thử hoạt tính. Nhỏ vào mỗi
lỗ khoan một ml dung dịch enzyme đã chuẩn bị sẵn, để tủ lạnh 6-8 giờ cho enzyme
khuếch tán vào môi trường thạch, sau đó cho vào tủ ấm 30°c trong 24 giờ. Hiện hình
vòng phân giải bằng thuốc thử liugon đỏ 1%. Hoạt tính enzyme được xác định bằng
hiệu so (D-d) cm.
Trong đó D: là đường kính vòng phân giải d: là đường kính lỗ đục.
K* Nghiên cứu ảnh hưởng của yểu tố môi trường đến hoạt tỉnh của cellulase
• Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tỉnh của cellulase
Cho dịch cellulase và dung dịch 1% CMC phản ứng với nhau ở các nhiệt
độ khác nhau từ 25 đến 40°c trong 30 giờ. Hoạt tính cellulase của các dung dịch được
xác định theo phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch.
• Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Cho dung dịch cellulase và dung dịch 1% CMC phản ứng với nhau ở các mức
thời gian khác nhau từ 12 đến 48 giờ. Sau khoảng thời gian 12 giờ, xác định hoạt tính
cellulase bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch.
• Ảnh hưởng của nguồn cellulose tự nhiên
Nguồn cacbon lần lượt được sử dụng là vỏ trấu, lõi ngô, vỏ lạc, nuôi cấy chủng
trong thời gian 36 giờ, sau đó lấy dịch enzyme xác định hoạt tính
cellulase bằng phương pháp khuếch tán môi trường thạch.
• Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Nuôi cấy các chủng tuyển chọn trên môi trường Czapek-Dox thích hợp với
nguồn nitơ được sử dụng lần lượt là: NaNƠ3, NH4CI, (NĨỈ4)2S04, pepton trong thời

gian là 36 giờ. Sau đó lấy dịch enzyme xác định hoạt tính cellulase bằng phương
pháp khuếch tán trên môi trường thạch.
2.2.2.2. Phương pháp xác định hoạt tính carboxymethylcellulase
Dựa theo phương pháp của Miller.
• Nguyên lý
CMC-ase phân cắt cacboxymethylcellulose (CMC) và amylase phân cắt tinh bột
thành các oligosacaride và glucose có tính khử có khả năng bắt màu vàng cam đặc
trưng với thuốc thử DN s khi đun nóng.
❖ Tiến hành thỉ nghiệm
Pha dung dịch gốc 10 |xmol/ml D-glucose trong đệm 50 mM Na-acetate. Từ đó
pha loãng thành các nồng độ 0; 2; 4; 6; 8; 10 (^mol/ml). Lấy 50 |xl dịch D-glucose ở
mỗi nồng độ trên + 450 |J,1 dịch 0,5% CMC (hoặc 1% tinh bột ngô) + 750 (0.1 dịch
thuốc thử DNS. Đun cách thuỷ trong 5 phút, làm lạnh và đo ở bước sóng Ằ,540nm .
❖ Đường chuẩn thể hiện mối liên quan giữa nồng độ D-glucose và giá trị OD được xây
dựng nhờ chương trình Microsoft Excel thể hiện ở phương trình thể hiện mối tương
quan giữa hàm lượng D-glucose và giá trị ODs40nm là y = 18,582x+0,261.
Trong đó: y là hàm lượng D-glucose trong lml dịch X là giá trị OD54Q
nm

tương ứng Hệ số tương quan R
2
= 0,9876 chứng tỏ mối liên quan giữa X và y là rất
chặt chẽ.
❖ Xác định hoạt tính của CMCase
❖ Cân 1 gram mẫu thí nghiệm, pha loãng 10 ml nước cất, lắc đều, lọc dịch lọc thu được
mẫu cần kiểm tra. Sau đó lấy 450 |J,1 dung dịch 0,5% CMC + 50 Jil dịch enzyme đã
pha loãng thích hợp. ủ ở 50°c trong 30 phút, sau đó bổ sung 750 |J,1 dung dịch DNS
để dừng phản ứng.
❖ Mầu đối chứng: 50 |J,1 dịch enzyme đã pha loãng thích hợp + 750 |J,1 dung dịch
DNS làm bất hoạt enzyme + 450 p.1 dung dịch 0,5% CMC , ủ ở 50°c trong 30 phút.

Đun cách thuỷ mẫu thí nghiệm và đối chứng trong 5 phút, cho qua nước lạnh.
Đo độ hấp phụ ở bước sóng X540nm. Từ giá trị OD ta tính được lượng đường khử
được tạo ra nhờ đường chuẩn theo phương trình y = 18,582x+0,261.
Trong đó: y là hàm lượng D-glucose trong lml dịch
X
là giá trị OD540nm
tương ứng.
Từ kết quả thí nghiệm ta tính được IU/gam cơ chất khô [19].
2.2.2.3. Phương pháp xác định protein tống số
Dựa theo phương pháp của Bradford (1976).
♦♦♦ Nguyên lý
Phương pháp dựa trên sự bắt màu của protein khi có mặt của dịch nhuộm
Bradford (thành phần chính là Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBB- 250)) có tính
bám đặc hiệu đối với các amino acid trên bề mặt các phân tử protein cần phân tích.
Các phân tử thuốc thử có chứa 6 nhóm phenyl và 2 nhóm acid sulfunic. Do đó các
tương tác chủ yếu xảy ra đối với cácđuôi kị
nước (tryptophan, tyrosine, histidine và phenylalanine), tích điện âm
(arginine, lysine) và là các liên kết yếu hoặc không đồng hoá trị.
❖ Tiến hành thỉ nghiệm
Dựng đường chuẩn BSA, chuẩn bị dung dịch BSA hàm lượng 0,5 mg/ml bằng
cách pha loãng 2 lần dung dịch mẹ đã chuẩn bị với H2O siêu sạch. Tiến hành xây
dựng đường chuẩn kết quả thể thu được phương trình đường chuẩn y = 22,786x-
0,3047
Trong đó: y là lượng BSA có trong lml dịch
X
là giá trị OD595
nm
tương ứng
Hệ số tương quan R
2

= 0,9928 chứng tỏ mối liên hệ giữa
y
và
X
là chặt chẽ.
Cân 1 gram mẫu thí nghiệm, pha loãng 10 ml nước cất, lắc đều, lọc dịch lọc
thu được mẫu cần kiểm tra. Xác định protein tổng số, tiến hành thí nghiệm bằng cách
lấy 800 nl dung dịch protein cần kiểm tra (đã pha loãng phù hợp) và bổ sung thêm
200 (0.1 thuốc thử Bradford, ủ trong 15-20 phút ở điều kiện phòng, đo độ hấp phụ ở
A595JUI1. Xác định hàm lượng protein theo phương trình thu được y = 22,786x-
0,3047 trong đó y là lượng BSA có trong 1 ml dịch,
X
là giá trị OD595
nm
tương ứng.
Từ kết quả phân tích ta tính ra được lượng protein tổng số/ gam mẫu
[22].
2.2.2.4. Phương pháp xác định lượng đường tổng sổ
Phương pháp phenol-acid-sulfuric của Michel và Cs *1* Nguyên lý
Các loại đường đơn, oligosaccharide và dẫn xuất của chúng (bao gồm cả các
ether methyl) không hoặc có các nhóm có tính khử, sẽ tạo ra màu vàng cam khi xử lý
bằng phenol và H2SO4 đặc. Phản ứng này rất nhạy cảm và màu sắc bền.
❖ Tiến hành thỉ nghiêm
Dung dịch gốc 10 ^mol/ml D-xylose, sau đó pha loãng thành các nồng độ 0,2
đến 2,0 |a.mol/ml. Lấy 0,5 ml mỗi nồng độ D-xylose, sau đó bổ sung lần lượt 0,5 ml
dung dịch 5% phenol, 2,5 ml H2SO4 đậm đặc. Trộn đều và giữ ở nhiệt độ phòng